KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) Repository - UNAIR REPOSITORY

  KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4- β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) SKRIPSI

PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012

  KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4- β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Oleh: PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI NIM 080810623 Tanggal Lulus: 7 Agustus 2012 Disetujui Oleh: Pembimbing I Pembimbing II

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P., M.Si Dr. Sri Sumarsih, M.Si

NIP. 19630615 198701 2 001 NIP. 19600110 198810 2 001

  LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

  Judul : Kloning Gen Penyandi Endo-1,4- β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E.

  coli Top10 (pET30a(+))

  Penyusun : Previta Zeizar Rahmawati NIM : 080810623 Tanggal ujian : 7 Agustus 2012

  Disetujui oleh : Pembimbing I,

  Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001

  Pembimbing II, Dr. Sri Sumarsih, M.Si

  NIP. 19600110 198810 2 001 Mengetahui,

  Ketua Departemen Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

  Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

  Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk memakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai dengan kebiasaan ilmiah.

  Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga

KATA PENGANTAR

  Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penyusun dapat menyelesaikan proposal skripsi dengan judul Kloning Gen Penyandi Endo-1,4-

  β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E.coli Top10 [pET-30a(+)] dengan tepat waktu.

  Penulisan proposal skripsi ini tidak akan selesai tanpa bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I dan Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan waktu, saran, doa dan bimbingan kepada penulis sampai terselesaikan skripsi ini.

  2. Ibu Dr. Hartati, MS selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing serta memberikan banyak masukan.

  3. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang bermanfaat kepada penulis.

  4. Papa, Mama, Kakak dan Adik yang memberikan kasih sayang, doa, semangat kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi kepada penulis selama penyusunan proposal skripsi.

  5. Ibu A.A. Istri Ratnadewi, terima kasih telah mempercayakan penulis untuk mengerjakan sebagian dari riset proyek penelitiannya.

  6. Tim proteomik TDC, mbak One, mbak Nita, mbak Laura dan mbak Titin, mas Fanani terima kasih atas segala masukan-masukan dan semangat yang diberikan kepada penulis.

  7. Para staf TDC di lab. Lepra dan lab. Malaria mbak dinar, mbak ratna, mbak agnes dan mbak wahyu, terima kasih atas bantuan dalam analisis nanodrop, PCR, dan geldoc.

  8. Teman – teman kelompok penelitian biokim blast (Tea, Amal, Amel, Luluk, Nadya, Dita, Siska, Rohis, Jo, Resti, Mumun, Ryan) yang saling memberikan semangat selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini 9. Serta pihak – pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang banyak memberikan saran, masukan dan pengalamannya.

  Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan proposal skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan proposal skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap proposal skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu bahan alam.

  Surabaya, Agustus 2012 Penyusun Previta Zeizar R.

  Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)). Skripsi ini dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departeman Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. ABSTRAK

  Endo-1,4- ß-xilanase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis hidrolisis ikatan glikosida pada xilan yang berpotensi dalam proses industri pangan, pakan, pulp dan pengolahan limbah pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4- ß-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 [pET-30a(+)] serta menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologinya terhadap gen endo-1,4-

  β-xilanase lain yang ada di GenBank. Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase isolat A dilakukan dengan menggunakan PCR dengan 30 siklus dan pada kondisi

  o

  denaturasi 94

  C, annealing 58

  C, extension 72

  C. Amplikon yang diperoleh kemudian dilakukan transformasi ke dalam plasmid pET-30a(+) dan di klon kan kedalam E.coli Top 10 dan mendapatkan rekombinan yang dinamakan pEXyl06. Dari hasil analisis sekuensing , di dapatkan urutan basa dari gen penyandi endo- 1,4- ß-xilanase pada plasmid pET-30a(+) rekombinan dengan ukuran gen 642 bp. Fragmen gen endo-1,4-

  β-xilanase asal isolat A mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4- β-xilanase Bacillus subtilis strain MWO dan termasuk ke dalam kelompok glikosida hidrolase famili 11.

  Kata kunci : Bacillus subtilis, endo-1,4-

  β-xilanase, kloning gen, sekuensing, homologi, PCR

  Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Cloning of Genes encoding endo-1,4- β- xilanase from xilanolytic bacterial isolate A of soil termite abdominal system in E.coli Top10 (pET-30a(+)). Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya. ABSTRACT

  Endo-1,4-ß-xylanase is an enzyme that can catalyze the hydrolysis of the glycoside bond on xylan that industrial processes of food, feed, pulp and agricultural waste. This study aims to amplification and cloning of genes encoding endo-1,4-ß-xylanase from abdominal system termite soil bacteria into E. coli Top10 [pET-30a (+)] and determine the sequence of nucleotide bases and the level of they homology of the else endo-1,4-

  β-xylanase genes in GenBank. The process of amplification of the gene encoding endo-1,4- β-xylanase from isolate A were performed using PCR with 30 cycle and the conditions of denaturation at

  o

  94 C, 58 C annealing, extension 72

  C. Then, amplicon was transformed into the plasmid pET-30a (+) and clone it into E. coli Top 10. The result showed that recombnant namely pEXyl06. From the results of sequencing analysis, in order to get bases of the gene encoding endo-1,4-ß-xylanase in the plasmid pET-30a (+) recombinants with gene size 642 bp. Gene fragments of endo-1 ,4-

  β-xylanase from isolate A has 99% homology with the gene endo-1 ,4- β-xylanase Bacillus subtilis strain MWO and belongs to the group of glycoside hydrolase family 11.

  Keywords: Bacillus subtilis, endo-1,4-

  β-xylanase, gene cloning, sequencing, homology, PCR

  DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN .......................................................................... ii LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................... iii LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ..................................... iv KATA PENGANTAR ................................................................................... v ABSTRAK ..................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1

  1.1 Latar Belakang Masalah ............................................................... 1

  1.2 Rumusan Masalah ......................................................................... 4

  1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................... 4

  1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................ 5

  BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 6

  2.1 Rayap ........................................................................................... 6

  2.2 Xilan ............................................................................................ 8

  2.3 Enzim-enzim xilanolitik .............................................................. 9

  2.3.1 Enzim endo- β-xilanase ........................................................ 9

  2.3.2 Enzim endo- β-xilosidase ..................................................... 10

  2.3.2 Enzim α-L-arabinofuranosidase........................................... 11

  2.4 Enzim-enzim antara untuk memanipulasI DNA ............................ 12

  2.5 Polymerase chain reaction (PCR) ................................................ 15

  2.6 Vektor kloning ............................................................................. 16

  2.6.1 Plasmid pET-30a(+) .......................................................... 17

  2.7 Kloning gen ................................................................................. 18

  2.8 Tahapan kloning gen .................................................................... 21

  2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan ................................................... 21

  2.8.2 Proses restriksi DNA insert dan DNA plasmid.................... 21

  2.8.3 Ligasi DNA insert dengan plasmid ..................................... 22

  2.8.4 Transformasi DNA rekombinan.......................................... 23

  2.8.5 Sekuensing DNA ................................................................ 24

  BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 26

  3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 26

  3.2 Sampel penelitian ......................................................................... 26

  3.3 Bahan dan Alat Penelitian ............................................................. 26

  3.2.1 Bahan penelitian ................................................................. 26

  3.2.2 Alat penelitian .................................................................... 27

  3.4 Diagram alir penelitian ................................................................. 28

  3.5 Prosedur penelitian ...................................................................... 29

  3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah dipublikasikan dalam database GenBank menggunakan program BLAST ......................................................................................... 40

  3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E.coli Top10 .... 37

  3.5.13.1 Peremajaan isolat E.coli Top10 dari stok gliserol.. 37

  3.5.13.2 Pembuatan sel kompeten E.coli Top10 ................. 38

  3.5.13.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10 ........................................................ 39

  3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid rekombinan pET-30a(+) ....................................... 39

  3.6 Sekuensing dengan metode sanger ............................................... 40

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 41

  3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ...................... 37

  4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A...................................................... 41

  4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) .................................................... 42

  4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase dengan teknik PCR . 44

  4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..................................... 49

  4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) .......................... 49

  4.4.2 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET- 30a(+) ................................................................................... 50

  3.5.12 Ligasi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) ....................................................................... 37

  3.5.10 Pemurnian amplikon .......................................................... 36

  3.5.1 Pembuatan larutan ............................................................... 29

  3.5.2.2 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ............................................................ 30

  3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM ....................... 29

  3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim ........................................ 29

  3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL.............................. 29

  3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-asetat 3M .............................. 29

  3.5.2 Pembuatan media ................................................................ 30

  3.5.2.1 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli ................ 30

  3.5.2.3 Pembuatan media padat ............................................ 30

  3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa ................. 35

  3.5.2.4 Pembuatan media padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ............................................................ 31

  3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A) .................... 31

  3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A ......................................... 31

  3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+)) ......................................... 32

  3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ....................................... 33

  3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+) ................................. 34

  3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase menggunakan teknik PCR ................................................... 35

  4.4.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) rekombinan ke E.coli

  Top10 .................................................................................... 51

  4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET- 30a(+) rekombinan ................................................................ 54

  4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET- 30a(+) rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..... 56

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 62

  5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 62

  5.2 Saran............................................................................................... 62

  DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 63 LAMPIRAN

  DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman 2.1 Koloni rayap ............................................................................

  7 2.2 Struktur xilan dan sisi pemotongannya. ....................................

  9

  2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease.... 12

  2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase......................... 13

  2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase................. 14

  2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA......... 14

  2.7 Langkah-langkah dasar dalam PCR .......................................... 16 2.8 Peta plasmid pET-30a(+) ........................................................

  17 2.9 Langkah-langkah dasar dalam kloning gen ...............................

  19 4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom .............................

  42 4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ..............

  44 4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dengan primer xynF dan xynR ...................................

  48 4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan ...............

  48 4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ................

  50

  4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan larutan CaCl

  2 ...........................................................................

  51 4.6 Hasil transformasi ...................................................................

  53

  DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman

  4.7 Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa pET-30a(+) ..............................................................................

  55

  4.8 Alignment hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan 57

  DAFTAR TABEL Nomor Judul Tabel Halaman

  4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolate A bakteri xilanolitik asal rayap tanah…………………………………………………………… 60

  DAFTAR LAMPIRAN Nomor Judul Lampiran

  1. Pembuatan Larutan TE

  2. Pembuatan Larutan Lisosim

  3. Pembuatan Larutan STEP

  4. Pembuatan Na-Asetat 3 M

  5. Pembuatan Larutan dan Bahan Untuk Elektroforesis

  6. Electropherogram hasil sekuensing

BAB I PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

  Indonesia merupakan salah satu Negara tropis di dunia yang memiliki berbagai jenis flora dan fauna. Fauna yang mempunyai tipe hidup di daerah tropis juga sangat bermacam-macam, salah satunya adalah rayap yang tergolong dalam kelas insekta. Di Indonesia, rayap mempunyai berbagai macam sebutan nama, sebagian besar menyebutnya dengan semut putih, di Sumatera digunakan istilah anai-anai, di Jawa disebut rangas, sedangkan beberapa jenis rayap di daerah Jawa Barat disebut rinyuh, sumpiyuh. Bergantung jenisnya, panjang tubuh rayap antara 4 - 11 mm. Di alam bebas, rayap berperan penting sebagai penjaga keseimbangan alam dengan cara menghancurkan kayu dan mengembalikannya sebagai "hara" ke dalam tanah. Namun di pemukiman rayap menjadi hama yang sangat merugikan dan menimbulkan kerugian ekonomis. Rayap dapat merusak bahan-bahan yang mengandung selulosa yang merupakan sumber makanan bagi rayap, karena rayap merupakan satu-satunya kelompok serangga yang mampu memanfaatkan selulosa sebagai sumber makanannya, seperti: kayu, kertas dan kain (Johnson, 1992).

  Komponen penyusun dinding sel kayu yaitu hemiselulosa, selulosa dan lignin. Kelimpahan selulosa dalam kayu adalah sebesar 40-55%, hemiselulosa sebesar 24-40% dan lignin sebesar 18-25% (Howard et al., 2003). Hemiselulosa tersusun atas xilan, sedangkan pada kayu lunak, komponen penyusunnya adalah glukomanan (Kumar et al, 2008). Karena kemampuan rayap sebagai pemakan

  1 kayu, pada sistem abdominal rayap terdapat mikroba yang bisa menghasilkan dan mensekresi enzim pendegradasi hemiselulosa seperti enzim xilanolitik. Enzim xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas endo-1,4-

  β-xilanase, β- xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam ferulat esterase (Collins et a.l, 2005). Enzim xilanolitik ini dapat digunakan untuk biobleching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus dan anggur, industri makanan dan pakan ternak (Jiang et al., 2009). Xilanase merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer dari xilosa dan xilo- oligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Richana, 2002).

  Gen penyandi xilanase dari berbagai sumber, telah dikloning ke dalam berbagai sel inang misalnya, Kloning gen penyandi xilanase termostabil dari

  Actinomandura sp. S14 diekspresikan ke E.coli dan Pichia pastoris (Sriyapai et al . 2011), gen xilanase dari Bacillus subtillis strain R5 (Jalal et al., 2009), xilanase

  dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006), xilanase dari Paecilomyces

  thermophilia di E.coli dan mengkarakterisasi xilanase rekombinan (Zhang et al, 2010).

  Ratnadewi dkk (2009) telah melakukan: isolasi bakteri-bakteri pensekresi komponen enzim xilanolitik dari rayap tanah dan mendapatkan salah satu dari kelompok enzim xilanolitik yaitu enzim endo-1,4-

  β-xilanase yang dapat diperoleh melalui overekspresi gen penyandi enzim xilanolitik dari bakteri sistem abdominal rayap. Enzim endo-1,4- β-xilanase yang diperoleh dimanfaatkan untuk produksi prebiotik xilooligosakarida dari xilan.

  Enzim endo-1,4- β-xilanase sangat penting di dunia industri dan dunia penelitian, maka perlu dilakukan adanya suatu kemampuan untuk produksi enzim endo-1,4-

  β-xilanase. Sehingga pada penelitian ini dilakukan kloning gen penyandi enzim endo-1,4- β-xilanase sehingga akan diperoleh gen penyandi endo-1,4-β- xilanase yang murni dalam jumlah yang relatif besar.

  Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4- β- xilanase yang berasal dari isolat A yang kemudian di lakukan kloning ke E. coli

  Top10 (pET-30a(+)) dan menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase asal sistem abdominal rayap tanah.

  Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase dilakukan dengan teknik

  Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer forward yang digunakan adalah

  berdasarkan dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen penyandi xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006) dan primer reverse yang digunakan adalah berdasarkan penelitian skripsi oleh Amaliah labiqah tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase pada rayap tanah.

  Proses amplifikasi gen endo-1,4- β-xilanase dilakukan proses denaturasi

  o o o o

  pada suhu 94

  C, annealing menggunaka gradien suhu yaitu 40 C; 48 C; 52, C; 58

  o o

  C dan extension pada suhu 72 C dengan jumlah siklus 30 kali. Amplikon yang diperoleh kemudian diklon ke dalam plasmid pET-30a(+). Plasmid rekombinan tersebut kemudian di transformasi ke dalam sel inang Escherichia coli dengan jenis E.coli yang digunakan disini adalah E.coli Top10.

  1.2 Rumusan Masalah

  Berdasarkan latar belakang permasalahan maka dapat diambil suatu rumusan masalah sebagai berikut :

  1. Apakah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah dapat di amplifikasi dan diklon ke dalam E.coli Top10 (pET- 30a(+))? 2. Bagaimanakah urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4-

  β-xilanase rekombinan asal bakteri sistem abdominal rayap tanah?

  1.3 Tujuan Penelitian

  Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Melakukan amplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 (pET-

  30a(+)).

  2. Menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4- β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah.

1.4 Manfaat Penelitian

  Dengan melakukan kloning gen penyandi endo-1,4- β-xilanase pada sistem abdominal rayap tanah pada E. coli Top10, diharapkan akan mendapatkan suatu rekombinan penghasil enzim endo-1,4-

  β-xilanase yang murni, selanjutnya enzim endo-1,4- β-xilanase dapat dimanfaatkan di dalam dunia industri makanan, peternakan dan lain-lain. Selain itu di penelitian ini juga memberikan informasi urutan basa nukleotida gen penyandi enzim endo-1,4-

  β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rayap

  Rayap adalah jenis serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang, yang termasuk dalam ordo Isoptera, secara relatif kelompok kecil dari serangga yang terdiri dari kurang lebih 1900 jenis di dunia. Hidup dalam jumlah kecil atau besar dengan organisasi yang sangat baik, komunitasnya membuat sejumlah kasta-kasta khusus yang memiliki pekerjaan khusus untuk kelangsungan hidup koloni. Rayap memiliki bentuk dan ukuran sayap depan yang sama dengan sayap belakang, sehingga ordonya disebut Isoptera (Iso = sama, ptera = sayap) (Johnson, 1992). Rayap mempunyai taksonomi sebagai berikut : Kerajaan : Animalia Filum : Arthropoda Kelas : Insekta Subkelas : Pterygota Ordo : Isoptera Famili : Mastotermitidae

  Kalotermitidae

   Termopsidae Hodotermitidae Rhinotermitidae Termitidae Diseluruh dunia telah dikenal sekitar 2000 spesies rayap (diidentifikasi dan dideskripsikan sekitar 120 spesies merupakan hama), sedangkan di Indonesia dari sejumlah 200 spesies yang dikenal baru sekitar 20 spesies yang diketahui berperan sebagai hama perusak kayu serta hama hutan atau pertanian (Tarumingkeng, 2001). Pada Gambar 2.1 rayap hidup di dalam habitat-habitat di bawah tanah yang lembab dan hidup di daerah kering yaitu diatas tanah. Sarang- sarang rayap dapat didalam tanah seluruhnya, atau dapat menonjol diatas permukaan. Rayap-rayap kayu kering yang hidup di atas tanah tanpa kontak dengan tanah sama sekali hidup di potongan potongan batang pohon, pohon- pohon dan bangunan yang terbuat dari kayu.

Gambar 2.1. Koloni Rayap (Anonim)

  Sumber utama kelembabannya adalah air metabolik, yaitu air yang berasal dari oksidasi makanan. Pada awalnya rayap diyakini tidak dapat mencerna lignin secara baik, akan tetapi dari perbandingan oleh Seifert (1962) dari kontens lignin pada kayu dan feses menunjukkan bahwa rayap setidaknya bisa mendemilasi lignin (Kato, 1998). Selulosa dalam makanan rayap dicerna oleh berbagai macam protista flagella yang berjumlah ribuan yang hidup didalam saluran pencernaan rayap (Johnson, 1992).

2.2 Xilan

  Xilan merupakan suatu heteropolisakarida, yaitu suatu komponen struktural utama dari hemiselulosa dari dinding sel tumbuhan. Endoxilanase (1,4- β-D-xilan xilanohidrolase; EC 3.2.1.8) (Sriyapai et al,. 2010). Xilanase adalah Komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang punggung rantai D- xilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Xilan memiliki residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang punggungnya. Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja sinergi beberapa enzim xilanolitik (Zhou, et.,al., 2008). Xilanase banyak diketahui milik dari famili GH10 dan GH11 (Howard, 2003).

  Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda, yaitu endo-1,4- (1,4- xilanohidrolase, EC.3.2.1.8) yang β-xilanase β-D-xilan menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4-

  β- D-xilosidase (1,4- EC.3.2.1.37) dan memutus

  β-D-xilanxilohidrolase, xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping yang menyusun xilan akan dibebaskan oleh

  α-L-arabinofuranosidase, β-D-glukuronidase, galaktosidase dan asetil xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat (Lee et

  al ., 2009).

Gambar 2.2. Struktur xilan dan sisi pemotongannya (Shallom, 2003)

2.3 Enzim enzim xilanolitik

  Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzim xilanolitik atau enzim xilanase. Macam-macam enzim xilanase yang bermanfaat antara lain: enzim endo-

  β-xilanase (EC.3.2.1.8), enzim β-xilosidase (EC.3.2.1.37), enzim α-L- arabinofuranosidase (EC.3.2.1.55) dan enzim ekstra, yang mampu memotong rantai sisi kelompok heteroxilan . Produk akhir hidrolisis xilan adalah xilosa dan oligosakarida, dimana mempunyai aplikasi yang potensi di industri produksi makanan, farmasi, kertas, produk pertanian dan bahan bakar terbarukan (Sriyapai et al ,. 2010).

2.3.1 Enzim endo- β-xilanase

  Endo xi lanase mampu memutus ikatan β 1-4 pada bagian dalam rantai xilan secara teratur. Ikatan yang diputus ditentukan berdasarkan panjang rantai substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus subtitusi, dan pola pemutusan dari enzim hidrolase tersebut. Enzim endo-

  β-xilanase (EC.3.2.1.8) telah banyak dideteksi pada mikroorganisme seperti bakteri dan jamur dan masing masing telah di karakterisasi dengan baik, mikroba mikroba penghasil xilanase biasanya memiliki pH optimum asam atau netral (Gupta et al, 2000). Famili GH10 (disebut juga Famili F) merupakan kelompok endo xilanase dengan massa molekul relatif tinggi dengan harga pI yang rendah. Sebaliknya Famili GH11 (disebut juga Famili G) mempunyai massa molekul relatif rendah dengan harga pI yang tinggi. Kedua famili tersebut berbeda dalam hal sifat katalitiknya.

  Famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga residu xilopiranosil non-substitusi. Berdasarkan hal tersebut, famili 10 mempunyai beberapa aktivitas katalitik yang sesuai dengan β-xilosidase (Kartika Ayu, 2006). Enzim xilanase GH famili 11, didapatkan dari Bacillus subtilis, dan

  Bacillus licheniformis. Untuk enzim xilanase GH famili 10 dijumpai pada Bacillus sp. ( http://www.CAZy.org ).

2.3.2 Enzim endo- β-xilosidase

  Endo- β-xilosidase, yaitu enzim xilanase yang mampu menghidrolisis xilo- oligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Aktivitas enzim akan menurun dengan meningkatnya rantai xilo-oligosakarida (Reilly, 1991). Xilosa selain merupakan hasil hidrolisis juga merupakan inhibitor bagi enzim endo-

  β- xilosidase. Sebagian besar enzim endo- β-xilosidase yang berhasil dimurnikan masih menunjukkan adanya aktivitas transferase yang menyebabkan enzim ini kurang dapat digunakan industri penghasil xilosa.

2.3.3 Enzim α-L-arabinofuranosidase

  Arabinosa residu ditemukan di pektin atau hemiselulosa seperti sebagai arabinans, arabinogalaktan, atau arabinoxylans di banyak dinding sel tumbuhan.

  Dalam gula bit arabinan, L-arabinosa residu terkait dalam mem bentuk α-1,5-L- arabinan dari L arabinofuranose unit yang terpasang pada posisi 2 atau 3 dalam kon figurasi α sebagai rantai samping (Sakamoto et al., 2010).

  Arabinofuranosidase (EC3.2.1.55) mengkatalisis hidrolisis α-1,2 dan α-1 ,3- arabinofuranosidik obligasi di hemiselulosa seperti arabinoxylan, arabinan, dan lainnya yang mengandung arabinosa polisakarida (Canakci et al., 2008).

  Enzim ini merupakan bagian dari glikosida hidrolase yang berperan dalm proses degradasi hemiselulosa seperti arabinoxilan, arabinogalaktan, dan L- arabinan. Adanya substituen L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat secara kuat menghambat aktivits endo-xilanase dan

  β-xilosidase yang berakibat menghalangi degradasi total dari polimer xilan (Shallom et al, 2003). Hal ini disebabkan oleh struktur L-arabinofuranosida yang cukup besar, sehingga akan terjadi halangan ruang bagi aktivitas endo-xilanase dan xilosidase. Oleh karena itu, keberadaan enzim arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi total xilan (Shallom et al, 2003).

  Arabinofuranosidase telah menerima banyak perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena aplikasi potensi mereka dalam proses industri agro, seperti pengolahan buah-buahan, sayuran, dan sereal dan konversi hemiselulosa untuk bahan bakar dan bahan kimia. Arabinofuranosidase mungkin diterapkan untuk meningkatkan aroma anggur dan jus buah serta produksi arabinosa, yang telah dilaporkan untuk menunjukkan efek antiglsemik (Canakci et al,. 2008).

2.4 Enzim-enzim Untuk Manipulasi DNA Di dalam kloning gen diperlukan enzim-enzim untuk memanipulasi DNA.

  Enzim-enzim ini dikelompokkan berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis (Brown, 2010), yaitu: 1.

  Nuklease, yaitu enzim yang memotong atau memendekkan atau mendegradasi molekul asam nukleat. Berdasarkan cara pemotongannya, nuklease dibedakan atas dua macam yaitu eksonuklease yang menghilangkan nukleotid satu persatu dari ujung molekul DNA dan endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul; DNA.

Gambar 2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease

  2. Ligase, untuk menyambungkan antar asam nukleat satu dengan yang lain seperti pada DNA insert dengan plasmid dalam salah satu tahapan kloning gen.

Gambar 2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase 3.

  Polimerase, untuk membuat kopi dari molekul DNA. Polimerase digunakan pada proses PCR, yaitu penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan dalam tabung eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen tertentu yang salah satunnya enzim polimerase. Macam-macam reaksi yang dikatalis oleh enzim polymerase meliputi 4 macam jenis reaksi, yang pertama adalah basic reaction atau reaksi perpanjangan untai DNA pada umumnya, yaitu dengan mensintesis untai-untai DNA dari 5’ hingga 3’. Kedua adalah DNA polimerase I yaitu enzim yang menambah basa nukleotida pada daerah untai DNA yang kosong dan kemudian mengganti urutan basa nukleotida pada untai DNA selanjutnya dengan komplemennya Ketiga reaksi fragmen klenow yaitu reaksi penambahan basa DNA hanya di daerah untai DNA yang kosong saja. Dan yang keempat yaitu reaksi DNA reverse transcriptase yaitu reaksi yang dapat mensintesis untai DNA yang berasal dari untai RNA.

  Gambar2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase 4. Enzim modifikasi (modifying enzymes) yaitu suatu enzim untuk menghilangkan gugus fosfat pada ujung 5’ molekul DNA, menambah gugus fosfat dari ujung 5’ atau menambah satu atau lebih deoksinukleotida pada ujung 3’ molekul DNA. Dan yang terakhir adalah topoisomerisme, yaitu suatu enzim yang mampu membentuk dan mengubah lilitan DNA dari suatu DNA sirkuler.

  .

  Gambar2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA

2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)

  Polymerase Chain Reaction (PCR) sangat berbeda dari kloning gen yaitu

  Serangkaian dari pada proses penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan dalam tabung Eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen seperti DNA template, primer forward dan primer reverse, Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH

2 O dan ditempatkan pada suatu cycler secara

  terprogram dengan serangkaian suhu yang bervariasi. Langkah-langkah dasar dalam proses PCR adalah sebagai berikut (Brown, 2010).

  1. Denaturasi DNA dilakukan pada suhu 94° C, di mana pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang pada struktur DNA semula double-standed terdenaturasi berubah menjadi struktur DNA yang single-stranded.

  2. Annealing (penempelan) primer dilakukan pada suhu 50-60

  C. Dua untai tiap molekul single-stranded dapat bergabung kembali pada suhu ini. yaitu dengan cara proses penempelan primer yang dapat menempel ke molekul DNA pada posisi yang spesifik.

  3. Proses sintesis DNA menggunakan suhu 74° C. Pada suhu 74

  C, Taq DNA polimerase bekerja dengan proses Taq DNA polimerase menempel pada ujung masing-masing primer forward dan reverse, kemudian mensintesis basa basa nukleotida sampai terbentuk untai molekul DNA yang baru

  4. Suhu di naikkan kembali ke 94° C. molekul DNA double-stranded, masing-masing terdiri dari satu untai molekul DNA asli dan salah satu untai DNA baru, kembali ke proses denaturasi ke untai tunggal untuk siklus yang kedua.

Gambar 2.7. Langkah-langkah dasar dalam PCR (Brown, 2010)

2.6 Vektor Kloning

  Vektor kloning adalah konsep molekul DNA artifisial yang mampu bereplikasi dalam organisme inang dimana sepotong DNA dipelajari secara khusus dan dapat disisipkan pada posisi yang dikenal, molekul DNA rekombinan dimasukkan ke sel inang seperti E.coli, ragi, sel hewan, atau sel tumbuhan (Russell, 1994). Dalam proses kloning, gen atau DNA yang akan diklon kedalam sel inang diperlukan suatu wahana atau vektor. Vektor ini yang akan mengantarkan DNA target untuk masuk kedalam sel inang. Terdapat tiga jenis utama dari vektor yang digunakan untuk kloning DNA dalam sel bakteri: plasmid,

  bagteriophage, dan Kosmid. Syarat sebuah vektor yang paling penting adalah

  bahwa wahana ini mampu mengadakan replikasi dalam sel tuan rumah sehingga menghasilkan banyak kopi molekul DNA rekombinan dan diturunkan pada sel anak saat terjadi pembelahan sel (Russell, 1994).

2.6.1 Plasmid pET30a(+)

Gambar 2.8. Peta plasmid pET-30a(+) (Novagen)

  Diagram dari vektor plasmid pET30a(+). Vektor ini berukuran 5422bp, vektor ini memiliki beberapa fitur berikut sehingga berguna untuk kloning DNA

  1. Origin of replicalion (ori) pada Plasmid pET30a(+) mengandung pBR322 sehingga, copy number pada pET30a(+) adalah 15-20 kopi per sel E. coli.

  2. Selectable marker pada plasmid pET30a(+) berupa kanamisin (kan).

  3. Terdapat daerah sisi restriksi yang unik dan berguna untuk memasukkan DNA sekuen yang disebut polylinker atau Multiple Cloning Sites (MCS) yang digunakan untuk membuat plasmid rekombinan.

  4. Terdapat lacI (lac repressor), dimana lacI adalah suatu gen yang dapat menghasilkan repressor. Repressor adalah suatu protein yang dapat menghalangi RNA polimerase menterjemahkan urutan gen dalam proses transkripsi. Bila RNA polymerase terhalangi oleh suatu repressor, maka DNA tidak bisa diterjemahkan oleh RNA polimerase dan protein tidak terekspresikan dalam sel inang. lacI yang bersifat alloserik dapat di non aktifkan oleh isopropil-

  β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) dan memicu ekspresi lac operon (Wall, 2009).

2.7 Kloning Gen

   Antara tahun 1971 sampai 1973 penelitian mengenai genetika mengalami

  revolusi dalam biologi modern. Suatu metode baru yang dikembangkan sehingga eksperimen eksperimen yang sebelumnya tidak dilakukan lagi. Metode- metode ini disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik yang inti dari prosesnya adalah kloning gen.

  Langkah-langkah dasar dalam kloning gen menurut Brown (2010) adalah sebagai berikut Fragmen DNA yang mengandung gen target di insersikan pada vektor kloning sehingga menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan. Vektor bertindak sebagai alat transportasi gen kedalam sel inang. Sel inang dapat berupa bakteri, ragi, jamur, tanaman tingkat tinggi, dan sel-sel mamalia. Vektor mengadakan replikasi di dalam sel inang, sehingga menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik dari vektor dan gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, Kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni dan diikuti replikasi vektor selanjutnya. Sel inang terus melakukan pembelahan sel, hingga terbentuk koloni pada media padat dan dihasilkan klon sel inang yang identik dimana tiap sel dalam satu koloni mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinan.

  Molekul DNA rekombinan Vektor Fragmen DNA Bakteri

  Bakteri yang 2. Transport kedalam membawa DNA sel host rekombinan

  3. Perbanyakan molekul DNA rekombinan 4. pembelahan sel host

  5. pembelahan sel banyak yang menghasilkan klon Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat

Gambar 2.9. Langkah langkah Dasar dalam Kloning Gen (Brown, 2010)

  Molekul DNA rekombinan perlu dimasukkan ke dalam suatu sel inang untuk dapat mengekspresikan produk DNA sisipan. Beberapa komponen yang perlu diperhatikan dalam memilih sel inang yang baik untuk pengklonan adalah sebaiknya sel inang memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada medium kultur, tidak bersifat patogen, dapat ditransformasi oleh DNA dan stabil. Sel inang dalam pengklonan umumnya berupa mikroorganisme, misalnya

  Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Saccharomyces cerevisiae (Brock et al., 1994).

  Eksperimen kloning gen pada umumnya dilakukan dalam 5 langkah: (1) generasi fragmen DNA yang cocok untuk kloning. (2) keterkaitan fragmen yang akan di kloning ke vektor plasmid atau genom virus oleh pengobatan DNA fragmen / vektor campuran dengan DNA ligase. (3) pengenalan produk ligasi DNA ke dalam sistem sel inang yang cocok, seperti E.coli, dengan transformasi, transfeksi atau infeksi. (4) diubah pembelotan klon DNA yang mengandung spesies hibrida yang dibutuhkan: dan (5) isolasi dan karakterisasi DNA dari spesies hibrida pada hasil klon (Timmis, 1984).

  Kloning merupakan suatu dorongan bagi para ilmuan karena dapat melakukan seleksi dan pemurnian suatu gen dalam jumlah besar yang bebas dari kontaminasi oleh urutan DNA lain. Kunci keberhasilan atau kegagalan suatu eksperimen kloning adalah kemampuan melakukan seleksi terhadap gen target yang akan dikloning. Bila suatu gen berhasil diklon, maka tidak akan lagi terdapat kesulitan untuk memperoleh informasi tentang struktur, fungsi, dan ekspresi pada gen tersebut (Brown, 2010).

2.8 Tahapan Kloning Gen

2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan

  Sintesis dan amplifikasi DNA sisipan yang akan diklon kan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), Prosedur ini digunakan untuk proses amplifikasi enzimatik secara invitro dari DNA sisipan dengan cara mensintesis DNA tersebut sehingga menghasilkan jumlah salinan dari fragmen DNA dengan jumlah banyak dan spesifik (Ausubel et al, 1995). Proses PCR dibutuhkan sampel DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan (template) dan reagen-reagen seperti Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH O juga primer forward dan

  2 reverse (Huang et al., 2006).