Deteksi Metilasi Asam Propanoat,2-trimetilsililOksi Trimetilsilil Ester HAsil Derivatisasi 8OHdG dengan GC-=MS.
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
DETEKSI METILASI- ASAM PROPANOAT, 2- TRIMETILSILIL
OKSI TRIMETILSILIL ESTER
HASIL DERIVATISASI 8OHDG DENGAN GC-MS
Suaniti, NM1., Wrasiati, L.P 2., Astitiasih, I.A.R1., Sukmaningsih, A.A.S.A3.
1
Jurusan Kimia FMIPA, 2Teknologi Industri Pertanian FTP, 3Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Udayana,
Kampus Bukit Jimbaran Badung, Bali
e-mail: suanitisr@yahoo.com
ABSTRAK
Kerusakan oksidatif terjadi karena DNA (Deoksiribosa Nukleic Acid) termetilasi dan
sebagai marker adalah 8 hidroksi 2 deoksiguanosin (8OHdG) merupakan senyawa dengan
rumus molekul C10H13N5O5, dan berat molekul 283,24 g/mol. Salah satu pengotor yang
terdeteksi adalah sebagai asam propanoat atau trimetil silil ester setelah mengalami
derivatisasi dengan N,O-Bis (trimetilsilil) asetamida (BSTFA). Tujuan penelitian ini adalah
untuk mengetahui fragmentasi senyawa asam propanoat trimetilsilil ester. Metode penelitian
yang digunakan adalah observasional study dengan cara membandingkan fragmen ion dalam
hasil spektrometri massa. Waktu retensi asam propanoat muncul pada 8,27 menit pada
pemisahan dengan kromatografi gas dan hasil fragmentasi yang diperoleh dalam penelitian ini
dengan puncak dasar adalah m/z 233 (M+). Fragmen spesifik metil muncul pada m/z 219
sebagai M-CH3. fragmen lainnya adalah m/z 191,147, 117, 73, 45.
Kata kunci
Asam propanoat, 8OHdG, GC-MS
PENDAHULUAN
Salah satu senyawa penanda kerusakan oksidatif adalah 8 Hidroksi 2 Deoksiguanosin
(8OHdG). Analisis senyawa tersebut digunakan kromatografi gas spektrometri massa (GCMS). GC-MS dapat digunakan setelah optimasi senyawa standar 8OHdG, dengan cara
derivatisasi dengan bis trimetilsilil trifluoroacetamida (BSTFA) untuk mendapatkan senyawa
yang menguap (Rohman, 2007). Guanosin yaitu nukleosida purin terdiri dari guanin yang
melekat pada sebuah cincin ribose (ribofuranose) melalui ikatan
-N9-glikosidik, yang
diperlukan dalam splicing RNA (mRNA). Selanjutnya guanosin dapat terfosforilasi menjadi
guanosin monofosfat (GMP), guanosin monofosfat siklik (cGMP), dan guanosin trifosfat
(GTP). Ketika guanin terpasang dengan N9 nitrogen terhadap karbon C 1 dari cincin
deoksiribosa ini dikenal sebagai deoksiguanosin. Gula berkarbon 5 (pentosa), basa organik
heterosiklik (mengandung karbon, nitrogen dan berbentuk datar) dan gugus fosfat bermuatan
negatif disebut sebagai satu nukleotida. Metilasi terjadi karena adanya pecahan-pecahan
gugus metil, hasil framentasi 8OHdG yang mengandung basa DNA (basa guanin), gula
10
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
pentosa, dan ikatan fosfat, yang dalam spektrometri massa akan terlihat salah satunya sebagai
M+-CH3. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui fragmentasi senyawa asam propanoat
trimetilsilil ester.
METODE PENELITIAN
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
8Hidroksi 2 Deoksiguanosin
(8OHdG) standar, Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA), Kolom Solid Phase
Extraction (SPE) (Gambar 1). metanol, KH2PO4, pH 7,5, asetonitril (CH3CN), kafein sebagai
standar internal.
Kolom SPE di kalibrasi dengan 10 mL metanol, 10 mL air, dan 10 mL 5 mM
KH2PO4, pH 7 (bufer A). Selanjutnya kolom dicuci dengan 3 mL buffer A dan 8OHdG dan
dielusi dengan 3 mL metanol 15% dalam buffer A. Eluat kemudian dicampur dengan 6 mL
CH3CN dan disentrifuge 2000g selama 5 menit dan diuapkan sampai kering di bawah vakum
pada 39-40oC, residu dilarutkan dengan 0,5 mL metanol (Surong et al., 2001).
Gambar 1. Solid phase extraction
. Standar 8OHdG dalam metanol tersebut diderivatisasi dengan campuran 50 µL BSTFA
dan CH3CN (2:1,v/v) serta ditambahkan 250 µg kafein dalam 1 mL CH3CN kemudian
dipanaskan selama 30 menit pada 100oC. Selanjutnya dianalisis dengan GC-MS seperti
Gambar 2.
11
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
Gambar 2. Insreumentasi GC-MS
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kromatogram pemisahan 8OHdG hasil derivatisasi dengan bis trimetilsilil trifluoro
asetamida dan standar internal kafein dengan kromatografi gas spektrometri massa
menunjukkan bahwa senyawa 8OHdG secara spesifik muncul pada waktu retensi 7,07 dan
28,47 menit sedangkan kafein sebagai standar internal muncul pada waktu retensi 19,31.
Puncak lainnya adalah puncak asam propanoat muncul pada waktu retensi 8,267
menit.. Hal ini menunjukkan bahwa 8OHdG yang tidak volatil berhasil dianalisis dengan GCMS, walaupun muncul beberapa hasil samping.seperti asam propanoat. Menurut Rohman,
2007 bahwa derivat silil ini digunakan untuk analisis sampel yang bersifat polar yang tidak
mudah menguap, dengan urutan reaktivitas gugus-gugus penerima silil adalah sebagai
berikut: alkohol > fenol > asam karboksilat > amina > amida.
Metilasi ditunjukkan oleh terdeteksi senyawa asam propanoat trimetilsilil ester pada
waktu retensi 8,267 dengan rumus molekul C9H23O3Si2 dan berat molekul 235. Fragmentasi
muncul dengan m/z 234, 219, 191, 147, 117,73, dan 45 berturut-turut adalah M+, M+-CH3,
M+-C3H8, M+-C6H16, M+-C8H22, M+-SiC3H9, dan M+-C3H9. Hal ini didukung oleh penelitian
Lin et al., 2004 Sehingga (M+-CH3) muncul dalam kromatogram 8OHdG dengan standar
internal piren.
12
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
Gambar 3.
KESIMPULAN
Waktu Retensi asam propanoat trimetilsilil ester muncul pada 8,267 menit, sebagai hasil
samping atau pengotor hasil derivatisasi 8 Hidroksi 2 Deoksiguanosin dengan bis trimetilsilil
trifluoroacetamida.
Kemungkinan rumus molekul adalah C9H23O3Si2 sebagai hasil dari spektrometri massa,
dengan fragmentasi muncul pada m/z 234, 219, 191, 147, 117,73, dan 45 berturut-turut
kemungkinan analisis adalah M+, M+-CH3, M+-C3H8, M+-C6H16, M+-C8H22, M+-SiC3H9, dan
M+-C3H9.
13
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih kepada Rektor Universitas Udayana,
Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Kepada Masyarakat atas dana penelitian yang diberikan untuk penelitian ini
melalui
penelitian Hibah Unggulan Udayana 2012. Ucapan terima kasih kepada berbagai
pihak yang telah membantu terlaksananya penelitian ini sehingga berhasil dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Lin, H.S., Jenner, A.M., Ong, C.N., Hijang, S.H., Whiteman, M., and Halliwell, B. 2004. A
High-throughput and sensitive methodology for the quantification of urinary 8hidroxy-2 deoxyguanosine:
measurement
with
gas
chromatography-mass
spectrometry after single solid-phase extraction. Journal Biochem. Britain. 380:541548.
Rohman, A. (Pengantar Sudjadi). 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
E-mail: pustakapelajar@telkom.net . ISBN: 978-979-1277-57-0
Surong, M., Guowang, X., Jun, X., and Caiying W., 2001. Method for analysis of 8-Hidroxy2 -deoxyguanosine in Urine by Gas Chromatography. Journal Analytical Sciences.
June 2001. 17: 779-781.
14
Teknologi Agroindustri (APTA)
DETEKSI METILASI- ASAM PROPANOAT, 2- TRIMETILSILIL
OKSI TRIMETILSILIL ESTER
HASIL DERIVATISASI 8OHDG DENGAN GC-MS
Suaniti, NM1., Wrasiati, L.P 2., Astitiasih, I.A.R1., Sukmaningsih, A.A.S.A3.
1
Jurusan Kimia FMIPA, 2Teknologi Industri Pertanian FTP, 3Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Udayana,
Kampus Bukit Jimbaran Badung, Bali
e-mail: suanitisr@yahoo.com
ABSTRAK
Kerusakan oksidatif terjadi karena DNA (Deoksiribosa Nukleic Acid) termetilasi dan
sebagai marker adalah 8 hidroksi 2 deoksiguanosin (8OHdG) merupakan senyawa dengan
rumus molekul C10H13N5O5, dan berat molekul 283,24 g/mol. Salah satu pengotor yang
terdeteksi adalah sebagai asam propanoat atau trimetil silil ester setelah mengalami
derivatisasi dengan N,O-Bis (trimetilsilil) asetamida (BSTFA). Tujuan penelitian ini adalah
untuk mengetahui fragmentasi senyawa asam propanoat trimetilsilil ester. Metode penelitian
yang digunakan adalah observasional study dengan cara membandingkan fragmen ion dalam
hasil spektrometri massa. Waktu retensi asam propanoat muncul pada 8,27 menit pada
pemisahan dengan kromatografi gas dan hasil fragmentasi yang diperoleh dalam penelitian ini
dengan puncak dasar adalah m/z 233 (M+). Fragmen spesifik metil muncul pada m/z 219
sebagai M-CH3. fragmen lainnya adalah m/z 191,147, 117, 73, 45.
Kata kunci
Asam propanoat, 8OHdG, GC-MS
PENDAHULUAN
Salah satu senyawa penanda kerusakan oksidatif adalah 8 Hidroksi 2 Deoksiguanosin
(8OHdG). Analisis senyawa tersebut digunakan kromatografi gas spektrometri massa (GCMS). GC-MS dapat digunakan setelah optimasi senyawa standar 8OHdG, dengan cara
derivatisasi dengan bis trimetilsilil trifluoroacetamida (BSTFA) untuk mendapatkan senyawa
yang menguap (Rohman, 2007). Guanosin yaitu nukleosida purin terdiri dari guanin yang
melekat pada sebuah cincin ribose (ribofuranose) melalui ikatan
-N9-glikosidik, yang
diperlukan dalam splicing RNA (mRNA). Selanjutnya guanosin dapat terfosforilasi menjadi
guanosin monofosfat (GMP), guanosin monofosfat siklik (cGMP), dan guanosin trifosfat
(GTP). Ketika guanin terpasang dengan N9 nitrogen terhadap karbon C 1 dari cincin
deoksiribosa ini dikenal sebagai deoksiguanosin. Gula berkarbon 5 (pentosa), basa organik
heterosiklik (mengandung karbon, nitrogen dan berbentuk datar) dan gugus fosfat bermuatan
negatif disebut sebagai satu nukleotida. Metilasi terjadi karena adanya pecahan-pecahan
gugus metil, hasil framentasi 8OHdG yang mengandung basa DNA (basa guanin), gula
10
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
pentosa, dan ikatan fosfat, yang dalam spektrometri massa akan terlihat salah satunya sebagai
M+-CH3. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui fragmentasi senyawa asam propanoat
trimetilsilil ester.
METODE PENELITIAN
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
8Hidroksi 2 Deoksiguanosin
(8OHdG) standar, Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA), Kolom Solid Phase
Extraction (SPE) (Gambar 1). metanol, KH2PO4, pH 7,5, asetonitril (CH3CN), kafein sebagai
standar internal.
Kolom SPE di kalibrasi dengan 10 mL metanol, 10 mL air, dan 10 mL 5 mM
KH2PO4, pH 7 (bufer A). Selanjutnya kolom dicuci dengan 3 mL buffer A dan 8OHdG dan
dielusi dengan 3 mL metanol 15% dalam buffer A. Eluat kemudian dicampur dengan 6 mL
CH3CN dan disentrifuge 2000g selama 5 menit dan diuapkan sampai kering di bawah vakum
pada 39-40oC, residu dilarutkan dengan 0,5 mL metanol (Surong et al., 2001).
Gambar 1. Solid phase extraction
. Standar 8OHdG dalam metanol tersebut diderivatisasi dengan campuran 50 µL BSTFA
dan CH3CN (2:1,v/v) serta ditambahkan 250 µg kafein dalam 1 mL CH3CN kemudian
dipanaskan selama 30 menit pada 100oC. Selanjutnya dianalisis dengan GC-MS seperti
Gambar 2.
11
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
Gambar 2. Insreumentasi GC-MS
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kromatogram pemisahan 8OHdG hasil derivatisasi dengan bis trimetilsilil trifluoro
asetamida dan standar internal kafein dengan kromatografi gas spektrometri massa
menunjukkan bahwa senyawa 8OHdG secara spesifik muncul pada waktu retensi 7,07 dan
28,47 menit sedangkan kafein sebagai standar internal muncul pada waktu retensi 19,31.
Puncak lainnya adalah puncak asam propanoat muncul pada waktu retensi 8,267
menit.. Hal ini menunjukkan bahwa 8OHdG yang tidak volatil berhasil dianalisis dengan GCMS, walaupun muncul beberapa hasil samping.seperti asam propanoat. Menurut Rohman,
2007 bahwa derivat silil ini digunakan untuk analisis sampel yang bersifat polar yang tidak
mudah menguap, dengan urutan reaktivitas gugus-gugus penerima silil adalah sebagai
berikut: alkohol > fenol > asam karboksilat > amina > amida.
Metilasi ditunjukkan oleh terdeteksi senyawa asam propanoat trimetilsilil ester pada
waktu retensi 8,267 dengan rumus molekul C9H23O3Si2 dan berat molekul 235. Fragmentasi
muncul dengan m/z 234, 219, 191, 147, 117,73, dan 45 berturut-turut adalah M+, M+-CH3,
M+-C3H8, M+-C6H16, M+-C8H22, M+-SiC3H9, dan M+-C3H9. Hal ini didukung oleh penelitian
Lin et al., 2004 Sehingga (M+-CH3) muncul dalam kromatogram 8OHdG dengan standar
internal piren.
12
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
Gambar 3.
KESIMPULAN
Waktu Retensi asam propanoat trimetilsilil ester muncul pada 8,267 menit, sebagai hasil
samping atau pengotor hasil derivatisasi 8 Hidroksi 2 Deoksiguanosin dengan bis trimetilsilil
trifluoroacetamida.
Kemungkinan rumus molekul adalah C9H23O3Si2 sebagai hasil dari spektrometri massa,
dengan fragmentasi muncul pada m/z 234, 219, 191, 147, 117,73, dan 45 berturut-turut
kemungkinan analisis adalah M+, M+-CH3, M+-C3H8, M+-C6H16, M+-C8H22, M+-SiC3H9, dan
M+-C3H9.
13
Prosiding Seminar Nasional, Program Studi Teknologi Industri Pertanian bekerjasama dengan Asosiasi Profesi
Teknologi Agroindustri (APTA)
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih kepada Rektor Universitas Udayana,
Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Kepada Masyarakat atas dana penelitian yang diberikan untuk penelitian ini
melalui
penelitian Hibah Unggulan Udayana 2012. Ucapan terima kasih kepada berbagai
pihak yang telah membantu terlaksananya penelitian ini sehingga berhasil dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Lin, H.S., Jenner, A.M., Ong, C.N., Hijang, S.H., Whiteman, M., and Halliwell, B. 2004. A
High-throughput and sensitive methodology for the quantification of urinary 8hidroxy-2 deoxyguanosine:
measurement
with
gas
chromatography-mass
spectrometry after single solid-phase extraction. Journal Biochem. Britain. 380:541548.
Rohman, A. (Pengantar Sudjadi). 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
E-mail: pustakapelajar@telkom.net . ISBN: 978-979-1277-57-0
Surong, M., Guowang, X., Jun, X., and Caiying W., 2001. Method for analysis of 8-Hidroxy2 -deoxyguanosine in Urine by Gas Chromatography. Journal Analytical Sciences.
June 2001. 17: 779-781.
14