Transformasi Genetik Tanaman dengan Agro
Transformasi Genetik Tanaman dengan Agrobacterium rhizogenes
Rulik Oktaviani1)
1) Laboratorium Fisiologi, Kultur Jaringan, dan Mikroteknik, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia. Email:
[email protected]
ABSTRAK
Transformasi genetik pada tanaman memperkenalkan gen asing (transgen) ke dalam spesies
lain. Metode transformasi genetik tidak langsung diperkenalkan melalui plasmid dengan mentransfer
gen di dalamnya ke tanaman tingkat tinggi. Agrobacterium rhizogenes sebagai media transformasi Riplasmid ke dalam genom tanaman target yang menyebabkan munculnya akar rambut. Metode yang
digunakan meliputi persiapan isolat A. rhizogenes, persiapan eksplan hipokotil/akar kecambah,
transformasi A. rhizogenes pada eksplan, serta seleksi dan perbanyakan akar rambut transforman pada
media selektif kanamisin. Hasil yang diperoleh dari jumlah total eksplan yang terbentuk paling besar
adalah eksplan hipokotil yang ditransformasi. Jumlah akar yang terbentuk tiap eksplan menghasilkan
hanya eksplan akar dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang dapat membentuk
akar dengan jumlah akar lebih banyak terbentuk pada eksplan hipokotil. Persentase pembentukan akar
rambut menunjukkan eksplan yang membentuk akar rambut adalah eksplan akar dan hipokotil kontrol
dengan periode ko-kultivasi 7 hari dengan eksplan akar yang lebih besar membentuk rambut akar.
Kata Kunci: A. rhizogenes, akar rambut, Ri-plasmid, transformasi
ABSTRACT
Genetic transformation in plant introduce foreign genes (transgenes) into other species.
Indirect genetic transformation method introduced through plasmid with transfering genes to higher
plant. Agrobacterium rhizogenes as transformation media of Ri-plasmid into genom of plant target that
cause appearance of hairy roots. Methods used include A. rhizogenes isolate preparation,
hypocotyl/root sprout explants preparation, A. rhizogenes transformation in explants, and the selection
and propagation of transformed hairy roots on kanamycin selective media. The results obtained from
the total number of explants that the most formed is transformed hypocotyl explants. The number of
roots formed per explant produce only roots and hypocotyl control explants with co-cultivation period
of 7 days to form roots with more number of roots formed on hypocotyl explants. The percentage of
explants showed the formation of hairy roots that form hairy roots is root and hypocotyl control
explants with co-cultivation period of 7 days with more number of roots formed on root explants.
Key Words: A. rhizogenes, hairy root, Ri-plasmids, transformation
PENDAHULUAN
Teknologi genetik telah membuka gaya baru
dalam modifikasi tanaman pertanian dan
menyediakan solusi baru untuk mengkreasikan
berbagai macam gen dan seleksi sifat yang
diinginkan. Transformasi genetik menyediakan
alternatif yang berpotensi lebih cepat untuk
pembiakan konvensional [1]. Sekarang ini,
tanaman transgenik mencapai 10% dari jumlah
tanaman pertanian di dunia [2].
Transformasi genetik pada tanaman
merupakan alat fundamental untuk menghasilkan
perbaikan genetik dengan cara memperkenalkan
gen asing (transgen) ke dalam spesies yang tidak
hanya memiliki hubungan kekerabatan tetapi
juga bisa pada lintas kingdom seperti jamur,
virus, bakteri, maupun hewan [3]. Metode
transformasi
genetik
dibedakan
menjadi
transformasi langsung atau tidak langsung.
Metode biologis menggunakan bakteri termasuk
dalam metode tidak langsung [4].
Metode transformasi genetik tidak langsung
diperkenalkan melalui plasmid, yaitu molekul
DNA sirkuler milik bakteri yang terpisah dengan
kromosomnya ke dalam sel target dengan
mentransfer gen ke tanaman tingkat tinggi.
Mikroorganisme populer yang digunakan adalah
Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium
rhizogenes. Plasmid membawa beberapa gen
yang direplikasi sama seperti kromosom bakteri
dimana mereka akan mereplikasi diri secara
mandiri dalam inangnya. Sebuah sel tunggal
dapat berisi 50 atau lebih plasmid [5].
4
Penggunaan Agrobacterium rhizogenes
sebagai media transformasi memungkinkan
pengembangan tanaman transgenik melalui
seleksi penanda berupa munculnya morfologi
akar rambut sebagai indikator tanaman tersebut
telah tertransformasi gen yang dibawa oleh
plasmid. Jaringan tanaman terinfeksi oleh
integrasi satu atau lebih dua DNA yang
tertransfer (TL dan TR) dari Ri-plasmid ke dalam
genom tanaman target [6]. Berdasarkan uraian
diatas maka perlu adanya pengetahuan serta
keterampilan
tentang
cara
melakukan
transformasi genetik pada tanaman menggunakan
vektor
Ri-plasmid
dari
Agrobacterium
rhizogenes.
METODE PERCOBAAN
Persiapan Isolat Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes diremajakan
dengan mengambil satu ose steril lalu distreak
secara continuous pada medium Yeast Manitol
Agar (YMA) dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 48 jam dalam kondisi gelap. Isolat
dikultur pada medium Yeast Manitol Broth
(YMB) dan diinkubasi dalam shaker 100 rpm
pada suhu ruang selama 24 jam. Penentuan nilai
optical density (OD) A. rhizogenes dilakukan
dengan mengambil satu ose koloni tunggal dan
dicampurkan ke dalam ± 35 ml, diinkubasi dalam
shaker 100 rpm pada suhu ruang selama 16-24
jam. Pengukuran OD dilakukan dengan
spektrofotometri pada panjang gelombang 600
nm. Suspensi A. rhizogenes dengan nilai OD
yang telah diketahui lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Pelet
disuspensikan kembali pada medium MS cair
sehingga diperoleh suspensi A. rhizogenes pada
medium MS dengan OD 0,5 masing-masing
sebanyak 20 ml dengan konsentrasi bakteri 105
sel/ml.
Persiapan Eksplan Hipokotil/Akar Kecambah
Biji tomat disterilisasi dengan larutan
pemutih komersial 20% (0,25% NaCl) selama 15
menit lalu dibilas dengan akuades steril 2 kali
masing-masing selama 5 menit. biji steril
dikecambahkan pada media agar. Hipokotil/akar
kecambah berumur 10 hari digunakan sebagai
eksplan transformasi.
Transformasi A. rhizogenes pada Eksplan
Hipokotil/akar kecambah tomat umur 10
hari dipotong dengan ukuran 0,5 cm, dilukai
dengan jarum steril dan dimasukkan ke dalam
suspensi A. rhizogenes 20 ml dengan nilai OD
0,5. Campuran eksplan dan A. rhizogenes dalam
media MS cair digojok dengan shaker kecepatan
70 rpm selama 60 menit. Eksplan yang telah
diinokulasi dengan A. rhizogenes diletakkan di
atas kertas saring steril yang tealh dibasahi
dengan medium MS cair. Sebagai kontrol,
hipokotil/akar tanpa diinokulasi dengan A.
rhizogenes. Eksplan diko-kultivasi pada media
MS padat tanpa ZPT selama 5 dan 7 hari dalam
kondisi gelap. Eksplan dicuci dengan antibiotik
cefotaxim 500 ppm selama 5 menit lalu
dikulturkan pada media MS padat yang telah
ditambah cefotaxim 500 ppm selama 7 hari.
Seleksi dan Perbanyakan Akar Rambut
Transforman pada Media Selektif Kanamisin
Eksplan pada kultur setelah 7 hari
dipindahkan pada media selektif MS yang
mengandung kanamisin. Kultur diinkubasi oada
suhu 25OC dalam kondisi terang. Eksplan yang
membentuk akar rambut menandakan bahwa
eksplan telah tertransformasi dengan Ri-plasmid
dari A. rhizogenes. Diamati kecepatan
pembentukan akar, persentase eksplan yang
membentuk akar, jumlah akar yang terbentuk
tiap eksplan, panjang akar, serta berat basah akar
setiap minggu selama 4 minggu.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah Total Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan akar dan hipokotil dihitung
banyaknya akar yang terbentuk selama 4 minggu
dan didapatkan hasil pada gambar 1.
Gambar 1. Jumlah total eksplan yang berhasil
tumbuh pada tiap botol kultur
Eksplan akar kontrol pada periode ko-kultivasi 5
hari mengalami peningkatan jumlah eksplan
pada minggu II, sedangkan pada periode kokultivasi 7 hari tidak mengalami perubahan
jumlah hingga pengamatan minggu IV. Periode
ko-kultivasi 7 hari menunjukkan jumlah total
eksplan yang lebih banyak tumbuh. Eksplan
hipokotil kontrol pada periode ko-kultivasi 5 hari
4
juga
mengalami
peningkatan
jumlah
eksplan.pada minggu II, sedangkan pada wakti
ko-kultivasi 7 hari tidak mengalami peningkatan
jumlah eksplan hingga pengamatan minggu IV.
Berbeda dengan eksplan akar, eksplan hipokotil
memiliki jumlah total eksplan yang lebih banyak
pada periode ko-kultivasi 5 hari. Sementara
eksplan akar yang ditransformasi dengan A.
rhizogenes menunjukkan jumlah total yang tidak
mengalami peningkatan jumlah total eksplan
pada periode ko-kultivasi 5 hari, begitupun juga
dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang diamati
hingga minggu IV. Namun, jumlah total eksplan
hipokotil akar transforman lebih tinggi pada
periode ko-kultivasi 7 hari. Eksplan hipokotil
yang ditransformasi dengan A. rhizogenes
menunjukkan kasus yang sama seperti eksplan
hipokotil kontrol, dengan jumlah total eksplan
yang lebih tinggi pada periode ko-kultivasi 5
hari. Proses ko-kultivasi dan jenis eksplan
kecambah yang digunakan dapat menjadi faktor
lebih banyaknya jumlah total eksplan pada
periode ko-kultivasi 5 hari dari pada periode kokultivasi 7 hari. Menurut Forbes dan Watson
(1992) kemampuan eksplan untuk beregenerasi
sangat ditentukan oleh media dan komposisi zat
pengatur tumbuh dalam media. Zat pengatur
tumbuh merupakan komponen kritikal dalam
menentukan alur perkembangan sel tanaman. Zat
pengatur tumbuh yang banyak digunakan dalam
kultur sel atau jaringan adalah auksin dan
sitokinin. Eksplan akar dan hipokotil yang
ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah
total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan
kontrol.
Jumlah Akar yang Terbentuk pada Tiap
Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan yang ditumbuhkan pada media MS
dengan antibiotik membentuk akar primer
terlebih dahulu sebelum membentuk akar
rambut.
Eksplan yang berhasil membentuk akar
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi
masing-masing 7 hari. Eksplan akar kontrol
membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I
dan tidak mengalami perubahan hingga minggu
IV. Sementara eksplan hipokotil kontrol
membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I
dan meningkat menjadi 6 akar pada minggu II
serta tidak mengalami perubahan jumlah akar
hingga minggu IV. Eksplan yang tidak berhasil
membentuk akar dapat disebabkan oleh beberapa
faktor salah satunya adalah tidak ditambahkan
zat pengatur tumbuh pada media MS.
Kurangnya lama waktu infeksi dapat
menghasilkan eksplan transforman dalam jumlah
kecil, dimana jangka waktu lebih lama untuk
eksplan dalam medium infeksi mungkin
menyebabkan kondisi hipertonik dan membuat
sel pecah keluar jaringan, atau mungkin karena
aktivitas
berlebihan
dalam
mekanisme
pertahanan yang menyebabkan kematian pada sel
sehingga jumlah eksplan transforman menjadi
rendah. Sel tanaman membutuhkan beberapa
waktu untuk mengadopsi DNA asing membuat
periode waktu menjadi sangat penting [8].
Kurangnya periode waktu ko-kultivasi kurang
memaksimalkan integrasi dan kerja transfer
DNA. Sementara periode waktu yang lebih lama
juga dapat mematikan eksplan karena
pertumbuhan berlebih dari Agrobacterium yang
bersifat parasit pada eksplan dan menyebabkan
pengurangan kandungan nutrisi dalam media [9].
Persentase Eksplan yang Membentuk Akar
Rambut
Persentase eksplan yang membentuk akar
diketahui dengan membandingkan jumlah akar
pada tiap eksplan dan jumlah eksplan yang
membentuk akar rambut, sehingga didapatkan
hasil pada gambar 1.
Gambar 3. Persentase eksplan hipokotil dan akar
yang membentuk akar rambut
Eksplan yang membentuk akar rambut
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7
4
hari. Eksplan akar kontrol membentuk akar
rambut dengan persentase sebesar 40% pada
minggu I dan tidak mengalami peningkatan
hingga pengamatan sampai minggu IV.
Sementara eksplan hipokotil kontrol memiliki
persentase membentuk akar rambut sebesar 10%
pada minggu I lalu meningkat menjadi 20% pada
minggu II dan tidak mengalami peningkatan
hingga pengamatan minggu IV. Persentase
tertinggi eksplan yang membentuk akar rambut
didapatkan pada eksplan akar kontrol dengan
periode ko-kultivasi 7 hari, yakni 40%.
AR
AR
AR
c
a
b
Gambar 4. Pengamatan minggu I eksplan (a)
akar kontrol, pengamatan minggu II
eksplan (b) hipokotil kontrol dan (c)
akar kontrol dengan periode kokultivasi 7 hari yang membentuk akar
rambut (AR: Akar Rambut)
Pengamatan eksplan hipokotil kontrol minggu I
membentuk empat akar dan terdapat satu eksplan
yang membentuk akar rambut. Pengamatan pada
eksplan hipokotil kontrol minggu II terdapat
enam akar pada masing-masing eksplan dengan
tiga eksplan yang berhasil membentuk akar
rambut. Eksplan akar kontrol didapatkan empat
akar pada masing-masing eksplan dan semua
akar berhasil membentuk akar rambut.
Eksplan yang membentuk akar rambut
semuanya didapatkan pada eksplan dengan
periode ko-kultivasi 7 hari. Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan oleh Zia dkk., (2010)
transformasi menggunakan Agrobacterium pada
kedelai. Periode ko-kultivasi yang digunakan
adalah 3 hari, 4 hari, dan 5 hari. Hasil maksimal
ditunjukkan pada periode 5 hari. Sehingga
periode ko-kultivasi mempengaruhi hasil eksplan
yang membentuk rambut akar [10]. Eksplan yang
paling banyak membentuk akar rambut adalah
eksplan akar kontrol.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan yang telah
dilakukan, eksplan akar dan hipokotil yang
ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah
total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan
kontrol. Eksplan yang berhasil membentuk akar
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi
masing-masing 7 hari. Pembentukan akar lebih
banyak pada eksplan hipokotil. Eksplan yang
membentuk akar rambut didapatkan pada
eksplan akar kontrol dan hipokotil kontrol
dengan periode ko-kultivasi 7 hari. Pembentukan
akar rambut lebih banyak pada eksplan akar.
DAFTAR PUSTAKA
[1] de Padua, V.L.M., Pestana M.C., MargisPinheiro M., de Oliveira D.E., dan Mansur
E. 2000. Electroporation of intact
embryonic leaflets of peanut: gene transfer
and stimulation of regeneration capacity. In
Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 36(5): 374-8.
[2] Schlegel, R.H.J. 2007. Introduction to the
history of crop development: theories,
methods, achievements, institutions, and
persons. Binghamton. New York.
[3] Ow, D.W., K.V. Wood, M. Deluca, De Wet
J.R., Helinski D.R., dan Howell S.H. 1986.
Transient and stable expression of the firefly
luciferaceae gene in plant cells and
transgenic plants. Science. 234(4778): 856859.
[4] Qayyum, A., Bakhsh A., Kiani S., Shahzad
K., Ali Shahid A., dan Husnain T. 2009. The
myth of plant transformation. Biotechnology
Adv. 27(6): 753-63.
[5] Broothaerts, W., Mitchell H.J., Weir B.,
Kaines S., Smith L.M.A., dan Yang W.
2005. Gene transfer to plants by diverse
species of bacteria. Nature. 433(7026):
629-633.
[6] Tepfer, D. 1984. Transformation of several
species of higher plants by agrobacterium
rhizogenes: sexual transmission of the
transformed genotype and phenotype. Cell.
37(3): 959-967.
[7] Forbes, J.C. dan R.D. Watson. 1992. Plant in
agriculture. Great Britain at the University
Press. Crambrige.
[8] Mannan, A., Tooba N.S. dan Bushra M. 2009.
Factors affecting agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of Artemisia
absinthium L. Pak. J. Bot. 41(6): 3239-3246
[9] Vergauwe, A., E. Van Geldre, D. Inze, M. Van
Montagu dan E. Vanden. 1998. Factors
influencing Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of Artemisia annua
L. Plant Cell Rep. 18: 105-110.
[10] Zia, M. Zarrin F.R., Riaz-Ur-Rehman, dan
M. Fayyaz C. 2010. Agrobacterium
mediated transformation of soybean
(Glycine max L.): some conditions
4
standardization. Pak. J Bot. 42(4): 22692279.
4
Rulik Oktaviani1)
1) Laboratorium Fisiologi, Kultur Jaringan, dan Mikroteknik, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia. Email:
[email protected]
ABSTRAK
Transformasi genetik pada tanaman memperkenalkan gen asing (transgen) ke dalam spesies
lain. Metode transformasi genetik tidak langsung diperkenalkan melalui plasmid dengan mentransfer
gen di dalamnya ke tanaman tingkat tinggi. Agrobacterium rhizogenes sebagai media transformasi Riplasmid ke dalam genom tanaman target yang menyebabkan munculnya akar rambut. Metode yang
digunakan meliputi persiapan isolat A. rhizogenes, persiapan eksplan hipokotil/akar kecambah,
transformasi A. rhizogenes pada eksplan, serta seleksi dan perbanyakan akar rambut transforman pada
media selektif kanamisin. Hasil yang diperoleh dari jumlah total eksplan yang terbentuk paling besar
adalah eksplan hipokotil yang ditransformasi. Jumlah akar yang terbentuk tiap eksplan menghasilkan
hanya eksplan akar dan hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang dapat membentuk
akar dengan jumlah akar lebih banyak terbentuk pada eksplan hipokotil. Persentase pembentukan akar
rambut menunjukkan eksplan yang membentuk akar rambut adalah eksplan akar dan hipokotil kontrol
dengan periode ko-kultivasi 7 hari dengan eksplan akar yang lebih besar membentuk rambut akar.
Kata Kunci: A. rhizogenes, akar rambut, Ri-plasmid, transformasi
ABSTRACT
Genetic transformation in plant introduce foreign genes (transgenes) into other species.
Indirect genetic transformation method introduced through plasmid with transfering genes to higher
plant. Agrobacterium rhizogenes as transformation media of Ri-plasmid into genom of plant target that
cause appearance of hairy roots. Methods used include A. rhizogenes isolate preparation,
hypocotyl/root sprout explants preparation, A. rhizogenes transformation in explants, and the selection
and propagation of transformed hairy roots on kanamycin selective media. The results obtained from
the total number of explants that the most formed is transformed hypocotyl explants. The number of
roots formed per explant produce only roots and hypocotyl control explants with co-cultivation period
of 7 days to form roots with more number of roots formed on hypocotyl explants. The percentage of
explants showed the formation of hairy roots that form hairy roots is root and hypocotyl control
explants with co-cultivation period of 7 days with more number of roots formed on root explants.
Key Words: A. rhizogenes, hairy root, Ri-plasmids, transformation
PENDAHULUAN
Teknologi genetik telah membuka gaya baru
dalam modifikasi tanaman pertanian dan
menyediakan solusi baru untuk mengkreasikan
berbagai macam gen dan seleksi sifat yang
diinginkan. Transformasi genetik menyediakan
alternatif yang berpotensi lebih cepat untuk
pembiakan konvensional [1]. Sekarang ini,
tanaman transgenik mencapai 10% dari jumlah
tanaman pertanian di dunia [2].
Transformasi genetik pada tanaman
merupakan alat fundamental untuk menghasilkan
perbaikan genetik dengan cara memperkenalkan
gen asing (transgen) ke dalam spesies yang tidak
hanya memiliki hubungan kekerabatan tetapi
juga bisa pada lintas kingdom seperti jamur,
virus, bakteri, maupun hewan [3]. Metode
transformasi
genetik
dibedakan
menjadi
transformasi langsung atau tidak langsung.
Metode biologis menggunakan bakteri termasuk
dalam metode tidak langsung [4].
Metode transformasi genetik tidak langsung
diperkenalkan melalui plasmid, yaitu molekul
DNA sirkuler milik bakteri yang terpisah dengan
kromosomnya ke dalam sel target dengan
mentransfer gen ke tanaman tingkat tinggi.
Mikroorganisme populer yang digunakan adalah
Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium
rhizogenes. Plasmid membawa beberapa gen
yang direplikasi sama seperti kromosom bakteri
dimana mereka akan mereplikasi diri secara
mandiri dalam inangnya. Sebuah sel tunggal
dapat berisi 50 atau lebih plasmid [5].
4
Penggunaan Agrobacterium rhizogenes
sebagai media transformasi memungkinkan
pengembangan tanaman transgenik melalui
seleksi penanda berupa munculnya morfologi
akar rambut sebagai indikator tanaman tersebut
telah tertransformasi gen yang dibawa oleh
plasmid. Jaringan tanaman terinfeksi oleh
integrasi satu atau lebih dua DNA yang
tertransfer (TL dan TR) dari Ri-plasmid ke dalam
genom tanaman target [6]. Berdasarkan uraian
diatas maka perlu adanya pengetahuan serta
keterampilan
tentang
cara
melakukan
transformasi genetik pada tanaman menggunakan
vektor
Ri-plasmid
dari
Agrobacterium
rhizogenes.
METODE PERCOBAAN
Persiapan Isolat Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes diremajakan
dengan mengambil satu ose steril lalu distreak
secara continuous pada medium Yeast Manitol
Agar (YMA) dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 48 jam dalam kondisi gelap. Isolat
dikultur pada medium Yeast Manitol Broth
(YMB) dan diinkubasi dalam shaker 100 rpm
pada suhu ruang selama 24 jam. Penentuan nilai
optical density (OD) A. rhizogenes dilakukan
dengan mengambil satu ose koloni tunggal dan
dicampurkan ke dalam ± 35 ml, diinkubasi dalam
shaker 100 rpm pada suhu ruang selama 16-24
jam. Pengukuran OD dilakukan dengan
spektrofotometri pada panjang gelombang 600
nm. Suspensi A. rhizogenes dengan nilai OD
yang telah diketahui lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Pelet
disuspensikan kembali pada medium MS cair
sehingga diperoleh suspensi A. rhizogenes pada
medium MS dengan OD 0,5 masing-masing
sebanyak 20 ml dengan konsentrasi bakteri 105
sel/ml.
Persiapan Eksplan Hipokotil/Akar Kecambah
Biji tomat disterilisasi dengan larutan
pemutih komersial 20% (0,25% NaCl) selama 15
menit lalu dibilas dengan akuades steril 2 kali
masing-masing selama 5 menit. biji steril
dikecambahkan pada media agar. Hipokotil/akar
kecambah berumur 10 hari digunakan sebagai
eksplan transformasi.
Transformasi A. rhizogenes pada Eksplan
Hipokotil/akar kecambah tomat umur 10
hari dipotong dengan ukuran 0,5 cm, dilukai
dengan jarum steril dan dimasukkan ke dalam
suspensi A. rhizogenes 20 ml dengan nilai OD
0,5. Campuran eksplan dan A. rhizogenes dalam
media MS cair digojok dengan shaker kecepatan
70 rpm selama 60 menit. Eksplan yang telah
diinokulasi dengan A. rhizogenes diletakkan di
atas kertas saring steril yang tealh dibasahi
dengan medium MS cair. Sebagai kontrol,
hipokotil/akar tanpa diinokulasi dengan A.
rhizogenes. Eksplan diko-kultivasi pada media
MS padat tanpa ZPT selama 5 dan 7 hari dalam
kondisi gelap. Eksplan dicuci dengan antibiotik
cefotaxim 500 ppm selama 5 menit lalu
dikulturkan pada media MS padat yang telah
ditambah cefotaxim 500 ppm selama 7 hari.
Seleksi dan Perbanyakan Akar Rambut
Transforman pada Media Selektif Kanamisin
Eksplan pada kultur setelah 7 hari
dipindahkan pada media selektif MS yang
mengandung kanamisin. Kultur diinkubasi oada
suhu 25OC dalam kondisi terang. Eksplan yang
membentuk akar rambut menandakan bahwa
eksplan telah tertransformasi dengan Ri-plasmid
dari A. rhizogenes. Diamati kecepatan
pembentukan akar, persentase eksplan yang
membentuk akar, jumlah akar yang terbentuk
tiap eksplan, panjang akar, serta berat basah akar
setiap minggu selama 4 minggu.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah Total Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan akar dan hipokotil dihitung
banyaknya akar yang terbentuk selama 4 minggu
dan didapatkan hasil pada gambar 1.
Gambar 1. Jumlah total eksplan yang berhasil
tumbuh pada tiap botol kultur
Eksplan akar kontrol pada periode ko-kultivasi 5
hari mengalami peningkatan jumlah eksplan
pada minggu II, sedangkan pada periode kokultivasi 7 hari tidak mengalami perubahan
jumlah hingga pengamatan minggu IV. Periode
ko-kultivasi 7 hari menunjukkan jumlah total
eksplan yang lebih banyak tumbuh. Eksplan
hipokotil kontrol pada periode ko-kultivasi 5 hari
4
juga
mengalami
peningkatan
jumlah
eksplan.pada minggu II, sedangkan pada wakti
ko-kultivasi 7 hari tidak mengalami peningkatan
jumlah eksplan hingga pengamatan minggu IV.
Berbeda dengan eksplan akar, eksplan hipokotil
memiliki jumlah total eksplan yang lebih banyak
pada periode ko-kultivasi 5 hari. Sementara
eksplan akar yang ditransformasi dengan A.
rhizogenes menunjukkan jumlah total yang tidak
mengalami peningkatan jumlah total eksplan
pada periode ko-kultivasi 5 hari, begitupun juga
dengan periode ko-kultivasi 7 hari yang diamati
hingga minggu IV. Namun, jumlah total eksplan
hipokotil akar transforman lebih tinggi pada
periode ko-kultivasi 7 hari. Eksplan hipokotil
yang ditransformasi dengan A. rhizogenes
menunjukkan kasus yang sama seperti eksplan
hipokotil kontrol, dengan jumlah total eksplan
yang lebih tinggi pada periode ko-kultivasi 5
hari. Proses ko-kultivasi dan jenis eksplan
kecambah yang digunakan dapat menjadi faktor
lebih banyaknya jumlah total eksplan pada
periode ko-kultivasi 5 hari dari pada periode kokultivasi 7 hari. Menurut Forbes dan Watson
(1992) kemampuan eksplan untuk beregenerasi
sangat ditentukan oleh media dan komposisi zat
pengatur tumbuh dalam media. Zat pengatur
tumbuh merupakan komponen kritikal dalam
menentukan alur perkembangan sel tanaman. Zat
pengatur tumbuh yang banyak digunakan dalam
kultur sel atau jaringan adalah auksin dan
sitokinin. Eksplan akar dan hipokotil yang
ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah
total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan
kontrol.
Jumlah Akar yang Terbentuk pada Tiap
Eksplan Akar dan Hipokotil
Eksplan yang ditumbuhkan pada media MS
dengan antibiotik membentuk akar primer
terlebih dahulu sebelum membentuk akar
rambut.
Eksplan yang berhasil membentuk akar
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi
masing-masing 7 hari. Eksplan akar kontrol
membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I
dan tidak mengalami perubahan hingga minggu
IV. Sementara eksplan hipokotil kontrol
membentuk akar sebanyak 4 akar pada minggu I
dan meningkat menjadi 6 akar pada minggu II
serta tidak mengalami perubahan jumlah akar
hingga minggu IV. Eksplan yang tidak berhasil
membentuk akar dapat disebabkan oleh beberapa
faktor salah satunya adalah tidak ditambahkan
zat pengatur tumbuh pada media MS.
Kurangnya lama waktu infeksi dapat
menghasilkan eksplan transforman dalam jumlah
kecil, dimana jangka waktu lebih lama untuk
eksplan dalam medium infeksi mungkin
menyebabkan kondisi hipertonik dan membuat
sel pecah keluar jaringan, atau mungkin karena
aktivitas
berlebihan
dalam
mekanisme
pertahanan yang menyebabkan kematian pada sel
sehingga jumlah eksplan transforman menjadi
rendah. Sel tanaman membutuhkan beberapa
waktu untuk mengadopsi DNA asing membuat
periode waktu menjadi sangat penting [8].
Kurangnya periode waktu ko-kultivasi kurang
memaksimalkan integrasi dan kerja transfer
DNA. Sementara periode waktu yang lebih lama
juga dapat mematikan eksplan karena
pertumbuhan berlebih dari Agrobacterium yang
bersifat parasit pada eksplan dan menyebabkan
pengurangan kandungan nutrisi dalam media [9].
Persentase Eksplan yang Membentuk Akar
Rambut
Persentase eksplan yang membentuk akar
diketahui dengan membandingkan jumlah akar
pada tiap eksplan dan jumlah eksplan yang
membentuk akar rambut, sehingga didapatkan
hasil pada gambar 1.
Gambar 3. Persentase eksplan hipokotil dan akar
yang membentuk akar rambut
Eksplan yang membentuk akar rambut
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi 7
4
hari. Eksplan akar kontrol membentuk akar
rambut dengan persentase sebesar 40% pada
minggu I dan tidak mengalami peningkatan
hingga pengamatan sampai minggu IV.
Sementara eksplan hipokotil kontrol memiliki
persentase membentuk akar rambut sebesar 10%
pada minggu I lalu meningkat menjadi 20% pada
minggu II dan tidak mengalami peningkatan
hingga pengamatan minggu IV. Persentase
tertinggi eksplan yang membentuk akar rambut
didapatkan pada eksplan akar kontrol dengan
periode ko-kultivasi 7 hari, yakni 40%.
AR
AR
AR
c
a
b
Gambar 4. Pengamatan minggu I eksplan (a)
akar kontrol, pengamatan minggu II
eksplan (b) hipokotil kontrol dan (c)
akar kontrol dengan periode kokultivasi 7 hari yang membentuk akar
rambut (AR: Akar Rambut)
Pengamatan eksplan hipokotil kontrol minggu I
membentuk empat akar dan terdapat satu eksplan
yang membentuk akar rambut. Pengamatan pada
eksplan hipokotil kontrol minggu II terdapat
enam akar pada masing-masing eksplan dengan
tiga eksplan yang berhasil membentuk akar
rambut. Eksplan akar kontrol didapatkan empat
akar pada masing-masing eksplan dan semua
akar berhasil membentuk akar rambut.
Eksplan yang membentuk akar rambut
semuanya didapatkan pada eksplan dengan
periode ko-kultivasi 7 hari. Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan oleh Zia dkk., (2010)
transformasi menggunakan Agrobacterium pada
kedelai. Periode ko-kultivasi yang digunakan
adalah 3 hari, 4 hari, dan 5 hari. Hasil maksimal
ditunjukkan pada periode 5 hari. Sehingga
periode ko-kultivasi mempengaruhi hasil eksplan
yang membentuk rambut akar [10]. Eksplan yang
paling banyak membentuk akar rambut adalah
eksplan akar kontrol.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan yang telah
dilakukan, eksplan akar dan hipokotil yang
ditransformasi A. rhizogenes lebih besar jumlah
total eksplan yang tumbuh dari pada eksplan
kontrol. Eksplan yang berhasil membentuk akar
didapatkan pada eksplan akar kontrol dan
hipokotil kontrol dengan periode ko-kultivasi
masing-masing 7 hari. Pembentukan akar lebih
banyak pada eksplan hipokotil. Eksplan yang
membentuk akar rambut didapatkan pada
eksplan akar kontrol dan hipokotil kontrol
dengan periode ko-kultivasi 7 hari. Pembentukan
akar rambut lebih banyak pada eksplan akar.
DAFTAR PUSTAKA
[1] de Padua, V.L.M., Pestana M.C., MargisPinheiro M., de Oliveira D.E., dan Mansur
E. 2000. Electroporation of intact
embryonic leaflets of peanut: gene transfer
and stimulation of regeneration capacity. In
Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 36(5): 374-8.
[2] Schlegel, R.H.J. 2007. Introduction to the
history of crop development: theories,
methods, achievements, institutions, and
persons. Binghamton. New York.
[3] Ow, D.W., K.V. Wood, M. Deluca, De Wet
J.R., Helinski D.R., dan Howell S.H. 1986.
Transient and stable expression of the firefly
luciferaceae gene in plant cells and
transgenic plants. Science. 234(4778): 856859.
[4] Qayyum, A., Bakhsh A., Kiani S., Shahzad
K., Ali Shahid A., dan Husnain T. 2009. The
myth of plant transformation. Biotechnology
Adv. 27(6): 753-63.
[5] Broothaerts, W., Mitchell H.J., Weir B.,
Kaines S., Smith L.M.A., dan Yang W.
2005. Gene transfer to plants by diverse
species of bacteria. Nature. 433(7026):
629-633.
[6] Tepfer, D. 1984. Transformation of several
species of higher plants by agrobacterium
rhizogenes: sexual transmission of the
transformed genotype and phenotype. Cell.
37(3): 959-967.
[7] Forbes, J.C. dan R.D. Watson. 1992. Plant in
agriculture. Great Britain at the University
Press. Crambrige.
[8] Mannan, A., Tooba N.S. dan Bushra M. 2009.
Factors affecting agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of Artemisia
absinthium L. Pak. J. Bot. 41(6): 3239-3246
[9] Vergauwe, A., E. Van Geldre, D. Inze, M. Van
Montagu dan E. Vanden. 1998. Factors
influencing Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of Artemisia annua
L. Plant Cell Rep. 18: 105-110.
[10] Zia, M. Zarrin F.R., Riaz-Ur-Rehman, dan
M. Fayyaz C. 2010. Agrobacterium
mediated transformation of soybean
(Glycine max L.): some conditions
4
standardization. Pak. J Bot. 42(4): 22692279.
4