PEMERIKSAAN INHIBITOR FAKTOR VIII DENGAN

Tutorial Hematologi

PEMERIKSAAN INHIBITOR FAKTOR VIII DENGAN MENGGUNAKAN
SYSMEX CS2100i
Departemen Ilmu Patologi Klinik FK UH-RSUP dr.WAHIDIN SUDIROHUSODO Makassar

I.

PENDAHULUAN
Inhibitor

faktor

VIII

adalah

suatu

poliklonal

antibodi

imunoglobulin (Ig) G dengan afinitas tinggi, yang dapat menetralisasi
aktivitas faktor VIII dan berfungsi menghancurkan substansi yang tidak
dikenali. Penderita hemofilia A lebih sering membentuk inhibitor
dibandingkan hemofilia B dengan prevalensi sekitar 20-40% pada
penderita dengan hemofilia A dan 1-6% pada penderita hemofilia B. Pada
hemofilia B, inhibitor lebih jarang terjadi, kira-kira 1 diantara 100
penderita. Prevalensi pasien hemofilia A yang mengalami inhibitor dua
kali lebih banyak pada pasien kulit hitam dibanding kulit putih. Insiden
terbentuknya inhibitor pada hemofilia berkisar 20-40% pada penderita
hemofilia berat, jarang terjadi pada penderita hemofilia ringan dan
sedang.1,2
Hemofilia adalah penyakit perdarahan akibat kelainan faal
koagulasi yang bersifat herediter dan diturunkan secara X-linked
recessive sehingga hanya bermanifestasi pada laki-laki, sedangkan wanita
hanya menjadi karier atau pembawa sifat penyakit ini. Dikenal tiga tipe
hemofilia yaitu hemofilia A, B, dan C yang secara klinis ketiganya tidak
dapat dibedakan. Hemofilia terjadi oleh karena adanya defisiensi atau
gangguan fungsi salah satu faktor pembekuan yaitu faktor VIII pada

hemofilia A serta kelainan faktor IX pada hemofilia B dan faktor XI pada
hemofilia C. Hemofilia A merupakan bentuk yang paling sering dijumpai
(hemofilia A 80-85%, hemofilia B 15-20%). Prevalensi hemofilia sebesar
5000-10.000 penduduk laki laki yang lahir hidup, dengan insiden
hemofilia A di Indonesia sampai pertengahan 2001 disebutkan sebanyak

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 1

314 kasus.1,4. Salah satu komplikasi berat pada penderita hemofilia adalah
terbentuknya neutralizing alloantibody atau inhibitor.1,3,4
Penderita hemofilia A, B, atau C, inhibitor langsung melawan
faktor VIII, IX, atau XI selama diberikan terapi pengganti. Inhibitor
dapat mengenai 1 diantara 5 penderita hemofilia A berat pada suatu
ketika dalam hidupnya.1,3,4
Rerata insiden terbentuknya faktor inhibitor adalah usia 12 tahun,
namun sebagian besar inhibitor timbul ketika anak masih sangat muda
yaitu setelah ±10 kali menerima infus rekombinan faktor VIII, dengan
rerata usia 1 – 2 tahun. Inhibitor dapat timbul antara 10-20 hari
pengobatan terhadap faktor VIII, dan menghilang sendiri dalam rerata
kurun waktu 9 bulan pada sekitar 60 % penderita, sedangkan sisanya

(40%) menetap.1,3
Koagulasi dimulai dengan dua mekanisme yang berbeda, yaitu
proses aktifasi kontak dan kerja dari tissue factor. Rangkaian dimulai dari
tempat terjadinya kerusakan endotel dengan aktivasi kontak FXII
menjadi FXIIa. (aktivasi endogen). F XIIa kemudian mengaktivasi PKK
menjadi kalikrein yang meningkatkan aktivasi F.XII fase kontak dengan
umpan balik positif untuk menguatkan). FXIIa mengaktivasi FXI
menjadi FXIa. Selanjutnya faktor XIa mengaktivasi FIX menjadi FIXa,
dan seterusnya sampai akhirnya terbentuk monomer fibrin dari
fibrinogen . Monomer ini secara bersama-sama akan diikat secara
kovalen oleh F XIII (transamidase) menjadi benang fibrin . Jika lukanya
luas, trombokinase jaringan (faktor III) akan ikut mengadakan kontak
dengan darah dan mengaktivasi faktor VII yang ada dalam kompleks
bersama Ca+2 dan fosfolipid mengaktivasi faktor X seperti pada gambar 1
kaskade koagulasi.5,6
Gambar 1. Kaskade Koagulasi.5
Faktor VIII akan mengaktifkan faktor X menjadi faktor X
aktif(FXa). Faktor X aktif ini merupakan faktor utama dari rangkaian

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 2

proses hemostatis dan merupakan jalur bersama antara jalur intrinsik dan
jalur ekstrinsik. Kekurangan salah satu dari FVIIIa atau FIXa
menyebabkan penurunan aktifitas platelet tenase, pada keadaan ini maka
format klot akan melambat oleh karena pembentukan thrombin sangat
menurun, sumbat trombosit yang terjadi akan rapuh yang menyebabkan
mudah terjadi perdarahan.5,6
Pemeriksaan inhibitor faktor VIII biasa diminta oleh klinisi apabila
pasien hemofilia A mengalami peningkatan pendarahan meskipun sudah
memperoleh konsentrat faktor VIII secara rutin. Apabila hasil APTT tetap
memanjang setelah dilakukan mixing study dengan penambahan faktor
VIII konsentrat, maka dicurigai terdapat inhibitor faktor VIII.
Pemeriksaan inhibitor faktor VIII bertujuan mengetahui beratnya risiko
pendarahan pada penderita hemofilia.
Pemeriksaan inhibitor faktor VIII dapat dilakukan secara kualitatif
dan kuantitatif. Metoda kualitatif dilakukan dengan membagi plasma
normal menjadi dua, di mana yang satu dicampur dengan plasma yang
Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 3

mengandung inhibitor, dan yang lain hanya plasma normal; kemudian

diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC. 2,4,7
Tutorial ini membahas Metoda kuantitatif, umumnya dilakukan
untuk mencari inhibitor yang time dependent, yaitu jika sampel yang
mengandung inhibitor faktor VIII dicampur dengan plasma normal maka
sejumlah faktor VIII akan dinetralisasi. Jika faktor VIII yang
ditambahkan dan waktu inkubasi dapat distandardisasi maka kekuatan
faktor inhibitor dapat diukur berdasarkan jumlah aktivitas faktor VIII
yang tersisa, dan hasilnya dilaporkan dalam satuan Bethesda Unit
(BU).2,4,7
II. TUJUAN
Tutorial ini bertujuan untuk mengetahui kadar inhibitor faktor VIII pada
penderita hemofilia.2,4
III. METODE
A. Pra Analitik
1. Persiapan Pasien
Tidak ada persiapan khusus.
2. Persiapan Sampel
Sampel yang digunakan adalah plasma dengan antikoagulan
Natrium sitrat (0,109 M ) yang dicampur dengan darah vena 1: 9.
Gunakan tabung sitrat berlapis silicon, ambil darah sesuai volume

yang tercantum pada tabung. Segera sentrifugasi sedikitnya 3000
rpm selama 10 menit.4,7
Preparasi material untuk kalibrasi inhibitor F VIII:
Material
Coagulation Factor VIII

Volume
200 µl

Deficient Plasma
Kontrol Plasma Normal

200 µl

Preparasi
Campurkan,lalu

homogenisasikan

dengan baik. Kemudian inkubasi dalam

waterbath suhu 37 OC selama 2 jam.

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 4

Preparasi Sampel untuk pemeriksaan inhibitor faktor VIII:
Plasma pasien

OBS

Control

Preparasi

Tabung 1

200 µl

200 µl

Plasma N

200 µl

Campurkan,

(pengenceran ½)
Tabung 2

Ambil 200 µl dari

200 µl

200 µl

homogenisasikan dengan baik
Campurkan,
lalu

(pengenceran ½)
Tabung 3

campuran tabung 1
Ambil 200 µl dari

200 µl

200 µl

homogenisasikan dengan baik
Campurkan,
lalu

(pengenceran ½)

campuran tabung 2

homogenisasikan dengan baik

Lakukan inkubasi untuk tabung 1,2,3, dalam waterbath suhu 37 OC selama 2 jam
3. Alat dan Bahan
a) Alat yang digunakan Sysmex CS2100i

b) Sentrifus
c) Waterbath
d) Tabung reaksi
e) Mikropipet 200 µl
f) Reagen Coagulation Factor VIII Deficient Plasma
g) Reagen Pathrombin SL
h) CaCl2 0,025mol/L
i) Owrens Veronal Buffer (OVB)
j) NaCl 0,9 %
k) Ca Clean I
l) Kontrol Plasma N
m) Kontrol Plasma P
n) Standar Human Plasma (SHP) 7

u

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 5

lalu

Sysmex CS2100i

Unit komputer

Sentrifus

Dalam alat Sysmex 2100i

Waterbath

Mikropipet
Coag. FVIII

Pathrombin

Kontrol N

CaCl2

Kontrol P

OVB Buffer

Ca Clean

SHP

Sampel
Gambar 2. Alat dan bahan Tes Inhibitor Faktor VIII menggunakan CS2100i
(Sumber: Pribadi dan Package insert kit Sysmex CS2100i
B. Analitik
1. Prinsip Tes :
Prinsip Tes dengan menggunakan Multi-Wavelength Detection
System yang diukur pada pemeriksaan inhibitor faktor VIII adalah
residu aktivitas faktor VIII pada sampel (satuan %). Apabila faktor

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 6

VIII ditambah ke plasma yang mengandung inhibitor

dan

diinkubasi maka faktor VIII tersebut akan dinetralisasi. Sisa faktor
VIII yang tidak dinetralisasi merupakan residu faktor VIII yang
diukur. Hasil tersebut kemudian dikonfirmasi menggunakan kurva
Bethesda untuk mendapat nilai Bethesda Unit (BU). Bethesda Unit
dikenal juga sebagai inhibitor unit, dimana 1 BU menyatakan
terdapat sejumlah inhibitor faktor VIII yang menyebabkan
berkurangnya aktivitas faktor VIII sebesar 50%. 2,4

Gambar 3 : Multi-Wavelength Detection System2
F VIII sampel + (FIXa-PL-Ca++)

FVIIIa-FIXa-PL- Ca++complex

FVIIIa-FIXa-PL- Ca++complex
FX
2. Cara Kerja :
a) Pemeriksaan awal

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 7

F Xa

(1) Periksalah ketersediaan aquadest, reaction tube, kertas
printer, isi kembali bila kurang.
(2) Periksalah keadaan botol limbah, kosongkan bila perlu.
(3) Siapkan reagent secukupnya.
(4) Periksalah saluran selang, power connection, pastikan
kabel power menempel pada stop kontak dengan benar.2
b)

Prosedur menghidupkan alat
(1) Hidupkan komputer, printer dan power pada Main Unit.
(2) Selama melakukan self check, splash screen akan menutup
otomatis
(3) Klik Lab, ketik lab lalu Enter
(5) Masukkan reaction tube ke dalam tempatnya2

c)

Preparasi Reagen
(1) Klik Reagen pada toolbar , akan muncul tampilan seperti
ini:

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 8

(2) Letakkan semua reagen yang diperlukan dan Ca clean di
dalam rack reagen

(6) Tutup cover reagent tabel lalu kunci posisi tersebut,
kemudian tutup cover alat.

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 9

(7) Klik OK untuk scannning barcode reagent.
(8) Bila scanning barcode gagal, akan muncul tampilan
seperti dibawah ini.

(9) Setelah seluruh reagen terbaca pada reagen scan, klik pad
tiap icon reagent lalu klik Lot Group Setting, lalu isi
cecklist pada kotak yang tersedia.

(10) Penambahan reagen : letakkan kursor pada tempat reagen
yang akan ditambah, lalu klik [Change/Add].2

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 10

d)

Cara kalibrasi / mencari kurva standar F VIII residual
(1) Campurkan Coagulation factor VIII Deficient Plasma 200
ul dengan Kontrol Plasma Normal 200 ul, lalu
homogenisasikan dengan baik. Kemudian inkubasi dalam
waterbath suhu 37 0C selama 2 jam.
(2) Setelah inkubasi selama 2 jam, letakkan material untuk
kalibrasi inhibitor faktor VIII di posisi reagen.
(3) Jika reagen yang dibutuhkan sudah terscan dengan benar ,
tekan [Order].
(4) Tekan [Switch Order], lalu pilih [Holder Calib Curve].
(5) Pilih pemeriksaan INH8.
(6) Tekan No. lot reagen dan material yang akan digunakan
dan isi assay value dengan konsentrasi 100 %.
(7) Tekan [Ok] lalu tekan [Regist].
(8) Tekan [Job List] , pastikan order sudah ada pada Job List,
jika sudah, Tekan START.
(9) Setelah proses kalibrasi selesai, tekan menu [Calibration
curve].
(10) Tekan [Change], pilih parameter INH8, dan pilih no lot
reagen yang digunakan, lalu tekan

[Validate] untuk

melakukan validasi kurva.
(11) Kalibrasi / kurva standar baru harus dilakukan setiap kali
sebelum pengerjaan sampel F VIII residual. Kurva bisa
digunakan untuk sampel yang lain dalam hari pengerjaan
yang sama.2,7
e). Quality Control
(1) Siapkan Kontrol Plasma P dan Kontrol Plasma N minimal
250µl dalam sampel cup conical, letakkan dalam rak.
(2) Pilih posisi rak yang sesuai dengan penempatan CPP dan
CPN.

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 11

(3) Tekan [Order] lalu tekan [Order Entry] lalu pilih QC
kemudian pilih jenis QC dan no.lot QC serta pilih
parameter F VIII.
(4) Tekan [OK] lalu tekan [Save] dan order tersebut akan
masuk ke job list.
(5) Tekan [Job List], pastikan order QC sudah ada pada Job
list, lalu tekan START.
(6) Hasil QC akan secara otomatis disimpan pada alat . Hasil
di dapat dari alat : sec dan % aktivitas.
f) Pengerjaan Sampel
(1) Setelah pengerjaan kalibrasi residual faktor VIII, letakkan
3 tabung pengeceran sampel pemeriksaan inhibitor F VIII
di rak.
(2) Pilih posisi pada rak yang sesuai dengan penempatan
tabung
(3) Tekan [Order] lalu tekan [Order Entry] lalu pilih ID. No.
Sampel kemudian input identitas sampel serta pilih
parameter INH8
(4) Tekan [OK] lalu tekan [Save] dan order tersebut akan
masuk ke job list.
(5) Tekan [Job List], pastikan order sampel sudah ada pada job
list, lalu tekan START.
(6) Hasil sampel akan secara otomatis disimpan pada alat .
Hasil didapat dari alat : sec dan %

aktivitas F VIII

residual.
(7) Bandingkan hasil % aktivitas F VIII residual dari ketiga
tabung. Ambil hasil % aktivitas F VIII residual paling
mendekati 50 % (rentang 30-60 %). Residual FVIII < 25
% atau >75 % tidak boleh dipakai untuk menghitung
inhibitor.

Tutor Hematologi Inhibitor faktor VIII Page 12

(8) Plotkan hasil % aktivitas FVIII residual yang paling
mendekati 50 % tersebut ke grafik Bethesda Curve.
(9) Hasil Bethesda Unit yang didapat dikalikan dengan
pengenceran sampel tersebut .
(10) Jika kandungan inhibitor di dalam sampel terlalu tinggi,
maka pengenceran awal harus diperbesar (>1/8 )2,
(11) Manual dalam alat :
10 l sampel + 40 l OVB + 50 l Deficient Factor VIII
+ 50 l Prathrombin SL + 50 l CaCl2.
a. Reagen I (40 l OVB): ditambahkan pada detik ke 30”,
kemudian diinkubasi
b. Reagen II(50l Deficient Factor VIII): ditambahkan pada
detik ke 60”, kemudian diinkubasi
c. Reagen III(50l Prathrombin): ditambahkan pada detik ke
60”, kemudian diinkubasi
d. Reagen IV(50l CaCl2) ditambahkan pada detik ke 60”,
kemudian di inkubasi , hasil dapat di baca setelah 240 detik
kemudian.

C. PASCA ANALITIK
Interpretasi hasil pemeriksaan berdasarkan aktivitas residual faktor
VIII adalah sebagai berikut :


Residu F VIII 80-100% : sampel tidak mengandung inhibitor



Residu F VIII 60-80 % : borderline, artinya perlu dilakukan
pengulangan

dengan

sampel

baru

sebelum

menentukan

diagnosis


Residu F VIII