Sitotoksisitas fraksi protein Umbi Teki [Cyperus rotundus L.] FP20, FP40, dan FP80 terhadap kultur Sel Myeloma - USD Repository
SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI (Cyperus rotundus L.) FP 20 , FP 40 , FP 60 , DAN FP
80 TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Milana Fedelia NIM: 038114090
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007
SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN UMBI TEKI (Cyperus rotundus L.) FP 20 , FP 40 , FP 60 , DAN FP
80 TERHADAP KULTUR SEL MYELOMA
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Milana Fedelia NIM: 038114090
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007
Ukuran utama seorang manusia bukanlah ditentukan ketika ia bertahan pada saat-saat yang baik dan menyenangkan, namun ketika ia bertahan pada saat- saat yang penuh tantangan dan persengketaan
(Martin Luther King) Kupersembahkan karya ini untuk Allah Bapa, Yesus Kristus, dan Bunda Maria
Papa dan Mama yang selalu mendukung dalam doa dan cinta, Adik-adikku Filan, Sieling, dan Ilan yang kusayangi, serta almamaterku
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Bapa yang Maha Kuasa atas segala karunia, kemudahan, dan kebaikan-Nya sehingga skripsi dengan judul “Sitotoksisitas Fraksi Protein Umbi Teki (Cyperus rotundus L.) FP
20 , FP 40 , FP 60 ,
dan FP terhadap Kultur Sel Myeloma” dapat terselesaikan. Skripsi ini disusun
80
untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.
Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi USD.
2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu, tenaga, dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji atas pengarahan dan kesediannya menguji.
4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas pengarahan dan kesediannya menguji.
5. Ign. Y. Kristio B., M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan serta atas diskusi-diskusinya.
6. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
7. Mbak Istini, Mbak Heni, Anton KG, dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.
8. Papa, Mama, serta adik-adikku tercinta, Filan, Sieling, dan Ilan atas segala dukungan, doa restu, dan cinta kasih yang berlimpah selama ini.
9. Torimaru, si kura-kura, yang menghadirkan kembali semangat dan keceriaan tersendiri di saat-saat terberat.
10. Agnes, Ratih, dan Wati atas kerjasama, canda tawa, keluh kesah, dan semangat selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
11. Teman-teman kosku, Yeyen, Mbak Ika, Ci Novi, Mbak Uun, Mbak Enny, Marlin, Melon, Avi, Ica, Shinta, Vita, dan Mbak Desy.
12. Teman-teman kelas B angkatan 2003, khususnya kelompok praktikum D atas kebersamaan dan suka-dukanya selama menjalani tahun-tahun kuliah di Farmasi .
13. Arry, Robby, dan Candra atas semua diskusi dan bantuannya.
14. Teman-teman kerjaku, Iqbal, Putra, Ignas, dan Ady atas semua pengertian dan kegembiraan yang dibagikan.
15. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang tak dapat disebutkan satu-persatu.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan skripsi ini tak lepas dari segala keterbatasan dan kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk penyempurnaan skripsi ini. Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan dalam perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
INTISARI
Kanker menempati urutan kedua penyebab kematian di Amerika Serikat setelah penyakit kardiovaskular. Saat ini, penelitian yang ada cenderung mengembangkan obat-obat antikanker yang berasal dari tanaman. Salah satu tanaman yang akan digunakan untuk terapi antikanker adalah rumput teki (Cyperus rotundus L.). Di negara Cina penggunaan rumput teki sebagai salah satu alternatif terapi antikanker sudah mulai dilakukan.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) FP
20 , FP 40 , FP 60 , dan
FP
80 terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero. Protein umbi teki diendapkan
dengan penambahan amonium sulfat dalam konsentrasi yang berbeda. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT {3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromida}. Hasil uji berupa persentase kematian sel dianalisis secara statistik dan harga LC
50 dihitung menggunakan analisis probit. Harga LC
50 kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan uji t-independent.
Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero. Nilai LC
50 dari FP 20 , FP 40 , FP 60 , dan FP 80 untuk kultur sel
myeloma berturut-turut adalah 72,15 μg/ml, 144,77 μg/ml, 150,19 μg/ml, dan 168,69 μg/ml. Sedangkan LC
50 untuk sel Vero adalah 35,1 μg/ml, 27,4 μg/ml,
14,7 μg/ml, dan 16,4 μg/ml. Fraksi protein umbi teki mempunyai efek sitotoksik yang lebih besar terhadap sel Vero dibandingkan terhadap sel myeloma.
Kata kunci: umbi teki, fraksi protein, aktivitas sitotoksik, sel myeloma, sel Vero
Cytotoxicity of Nutgrass Tuber (Cyperus rotundus L.) Protein Fraction : PF ,
20 PF 40 , PF 60 , and PF 80 against Myeloma Cell Culture
ABSTRACT
Cancer is the second only to cardiovascular disease to cause of mortality in USA. Nowadays, the current research develops anticancer agents from plants. One of these plants that can be used as an anticancer agent is nutgrass (Cyperus
rotundus L.). In China, nutgrass has been used as an alternative for cancer
treatments.This research is an experimental research with one way pattern complete random design. This research is aimed to determine the cytotoxic activity of nutgrass tuber protein fraction : PF , PF , PF , and PF against myeloma and
20
40
60
80 Vero cell culture. The protein fraction of nutgrass tuber was precipitated by
adding ammonium sulfate in various concentration. The cytotoxic activity was determined using the MTT method {3-(4,5-dimethyl-thiazole-2-yl)-2,5- dipheniltetrazolium bromide} method. The results which were in percentage of death were analyzed statistically. The values of LC were calculated using probit
50
analysis. The values of LC 50 were then analyzed using t-independent test.
The results of cytotoxicity test determined that nutgrass tuber protein fractions had cytotoxicity activities against myeloma and Vero cell culture. The values of LC of PF , PF , PF , and PF for myeloma cell culture respectively
50
20
40
60
80
are 72,15 µg/ml, 144,77 µg/ml, 150,19 µg/ml, and 168,69 µg/ml. While for Vero cell culture respectively are 35,1 µg/ml¸ 27,4 µg/ml¸ 14,7 µg/ml¸ and 16,4 µg/ml. The nutgrass tuber protein fraction has the bigger cytotoxic activity against Vero cell culture than myeloma cell culture.
Keywords : nutgrass tuber, protein fraction, cytotoxic activity, myeloma cell culture, Vero cell culture
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................. iii HALAMAN PENGESAHAN............................................................... ivHALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... v
PRAKATA ............................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................... viiiINTISARI .............................................................................................. ix ABSTRACT ............................................................................................
x
DAFTAR ISI.......................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ................................................................................. xv DAFTAR GAMBAR............................................................................. xvii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................... xviii ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING .................................... xx BAB I PENGANTAR............................................................................1 A. Latar Belakang ...................................................................................
1 1. Permasalahan ..............................................................................
2 2. Keaslian Penelitian......................................................................
3 3. Manfaat Penelitian ......................................................................
3 B. Tujuan Penelitian................................................................................
3 1. Tujuan Umum ...............................................................................
3
2. Tujuan Khusus ..............................................................................
3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ..................................................
5 A. Rumput Teki (Cyperus rotundus L.) ................................................. 5 1. Keterangan botani ........................................................................
5 2. Nama daerah.................................................................................
5 3. Deskripsi umbi teki ......................................................................
5 4. Habitat ..........................................................................................
6 5. Kandungan kimia ..........................................................................
6 6. Khasiat dan penggunaan ..............................................................
6 7. Penelitian mengenai rumput teki..................................................
7 ` B. Kanker ...............................................................................................
7 C. Protein ...............................................................................................
9 D. Sel Myeloma .....................................................................................
10 E. Sel Vero.............................................................................................
11 F. Uji Sitotoksisitas ...............................................................................
12 G. Keterangan Empiris...........................................................................
13 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..........................................
14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .........................................................
14 B. Variabel dan Definisi Operasional .....................................................
14 C. Bahan atau Materi Penelitian .............................................................
15 D. Alat-alat Penelitian.............................................................................
16
E. Tatacara Penelitian..............................................................................
16 1. Determinasi tanaman.....................................................................
16 2. Pengumpulan umbi teki ................................................................
17 3. Sterilisasi alat ................................................................................
17 4. Pembuatan fraksi protein ..............................................................
17 5. Pengukuran kadar protein dengan metode spektrofotometri UV..
19 6. Uji sitotoksisitas sel myeloma.......................................................
19 7. Uji sitotoksisitas sel Vero .............................................................
21 F. Analisis Hasil ......................................................................................
22 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................
24 A. Determinasi Tumbuhan ...................................................................... 24 B. Pengumpulan Umbi Teki....................................................................
24 C. Sterilisasi Alat ....................................................................................
24 D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Teki ......................................
25 E. Pengukuran Kadar Protein dengan Spektrofotometer UV..................
27 F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................
28 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................
37 A. Kesimpulan ........................................................................................
37 B. Saran ...................................................................................................
37
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................
39 LAMPIRAN........................................................................................... 42 BIOGRAFI PENULIS ..........................................................................
82
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel Myeloma ............................................................................ 31
Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel Vero.................................................................................... 33
Tabel III. LC
50 hasil interpolasi analisis probit untuk sel myeloma dan sel Vero .......................................................................
35 Tabel IV. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP
20 terhadap kultur sel myeloma.............................................................
43 Tabel V. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP terhadap
40 kultur sel myeloma.............................................................
43 Tabel VI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP
60 terhadap kultur sel myeloma.............................................................
43 Tabel VII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP
80 terhadap kultur sel myeloma.............................................................
44 Tabel VIII. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP
20 terhadap kultur sel Vero....................................................................
45 Tabel IX. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP
40 terhadap kultur sel Vero....................................................................
45 Tabel X. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP terhadap
60 kultur sel Vero....................................................................
45 Tabel XI. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki FP terhadap
80 kultur sel Vero....................................................................
46
Tabel XII. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm.....................................................................................47
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Sel myeloma dan sel Vero sehat .....................................30 Gambar 2. Kurva hubungan antara fraksi protein umbi teki dengan persen kematian sel myeloma .........................................
31 Gambar 3. Morfologi sel myeloma dengan perlakuan (a) FP , (b) FP ,
20
40
(c) FP
60 , (d) FP 80 30 ......................................................... 32
Gambar 4. Kurva hubungan antara fraksi protein umbi teki dengan persen kematian sel Vero ................................................
33 Gambar 5. Morfologi sel Vero dengan perlakuan (a) FP
20 , (b) FP 40 ,
(c) FP , (d) FP 34 60 80 .............................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat FP
20 , FP 40 , FP 60 , dan FP 80..................................................................................................................
42 Lampiran 2. Absorbansi sel dengan metode MTT...............................
43 Lampiran 3. Cara perhitungan kadar protein .......................................
47 Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus
rotundus L.) terhadap kultur sel myeloma dengan metode
MTT ................................................................................ 48 Lampiran 5. Uji distribusi data sel myeloma dengan Kolmogorov-
Smirnov ........................................................................... 58 Lampiran 6. Hasil analisis probit fraksi protein umbi teki (Cyperus
rotundus L.) terhadap kultur sel Vero dengan metode
MTT ................................................................................ 60 Lampiran 7. Uji distribusi data sel Vero dengan Kolmogorov-
Smirnov ........................................................................... 71 Lampiran 8. Perhitungan nilai korelasi LC
50 sel myeloma dan sel Vero pada taraf kepercayaan 90%...................................
73 Lampiran 9. Hasil uji signifikansi LC
50 antara sel myeloma dan sel Vero dengan analisis statistik..........................................
75 Lampiran 10. Foto Sentrifuge K PLC Series.........................................
77 Lampiran 11. Foto Spektrofotometer UV CECIL Series 2 ...................
77 Lampiran 12. Foto Inkubator Memmer .................................................
78 Lampiran 13. Foto ELISA reader SLT 340 ATC .................................
78
Lampiran 14. Foto seluruh bagian tumbuhan Cyperus rotundus L. ......
79 Lampiran 15. Foto umbi Cyperus rotundus L. ......................................
79 Lampiran 16. Foto tumbuhan rumput teki (Cyperus rotundus L.) ........
80 Lampiran 17. Hasil determinasi rumput teki (Cyperus rotundus L.) ....
81
ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING
continuous cell lines : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus-
menerus FBS : Foetal Bovine Serum FP (PF) : Fraksi Protein (Protein Fraction)
haemocytometer : alat yang digunakan untuk membantu menghitung jumlah
sel MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida ) reagen stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N RPMI : Rosswell Park Memorial Institute SDS : Sodium Dodesil Sulfat
tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan
leher bengkok 96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker menempati urutan kedua penyebab kematian di Amerika Serikat
setelah penyakit kardiovaskular. Sampai saat ini pengobatan kanker dilakukan dengan cara pembedahan, penyinaran (radiasi), kemoterapi, dan imunoterapi (DiPiro et al, 2005). Pada umumnya obat-obat antikanker menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit (Nafrialdi dan Sulistia, 1995). Selain itu, obat-obat antikanker ini justru malah menekan respon sistem imun yang timbul serendah mungkin (Bowman dan Rand, 1980). Faktor keterbatasan biaya dan peralatan untuk terapi kanker pun turut mendorong peneliti untuk mengembangkan obat-obat antikanker dari tanaman yang ada.
Di Indonesia, teki (Cyperus rotundus L.) telah dikenal sebagai obat tradisional yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat. Bagian tumbuhan yang biasa digunakan sebagai obat adalah umbi atau akar. Teki berkhasiat menormalkan siklus haid, analgesik, sedatif. Selain itu, bermanfaat untuk mengatasi gangguan sakit dada, sakit gigi, gangguan fungsi pencernaan seperti mual, muntah, nyeri lambung, dan sakit perut, diare, haid tidak teratur, sakit waktu haid, keputihan, menyuburkan kandungan (Wijayakusuma, 2005).
Ada dugaan sementara bahwa protein yang terkandung dalam tanaman mempunyai potensi untuk diteliti sebagai antikanker. Di Cina, rumput teki digunakan dalam pengobatan kanker (Hanks, 2000). Rumput teki merupakan salah satu tumbuhan obat yang dapat merangsang produksi interferon, yakni suatu protein terlarut yang dihasilkan dari sel saat terinfeksi DNA atau RNA yang mengandung virus. Interferon juga bersifat sebagai stimulan makrofag dan mempunyai aktivitas membunuh sel (Hoffman, 2006).
Dalam penelitian ini, umbi teki diujikan pada sel kanker dan juga pada sel normal (Vero cell line). Namun, sampai saat ini belum ada laporan penelitian resmi yang menyatakan keefektifan rumput teki dalam terapi pengobatan myeloma. Atas dasar tersebut maka perlu diadakan penelitian untuk mengetahui efek sitotoksik rumput teki terhadap sel myeloma. Dengan demikian akan diperoleh gambaran yang lebih jelas mengenai potensi rumput teki untuk dikembangkan sebagai alternatif pengobatan multiple myeloma.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a. , FP , FP , dan FP memiliki efek apakah fraksi protein umbi teki FP
20
40
60
80
sitotoksik terhadap kultur sel myeloma dan sel Vero?
b. fraksi protein umbi teki FP , FP , FP , dan seberapa besar nilai LC
50
20
40
60 FP 80 terhadap sel myeloma dan sel Vero ?
c. apakah fraksi protein umbi teki mempunyai daya sitotoksik lebih besar terhadap sel myeloma daripada sel Vero?
2. Keaslian penelitian
Sejauh yang diketahui penulis belum pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein umbi teki (Cyperus rotundus L.) FP , FP ,
20
40 FP 60 , dan FP 80 terhadap kultur sel myeloma.
3. Manfaat penelitian
Penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein umbi teki ini diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain: a. Manfaat teoretis
Penelitian ini dapat memberikan informasi penting dalam dunia kefarmasian tentang efek sitotoksik umbi teki terhadap sel myeloma dan sel Vero.
b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif baru obat antikanker dari umbi teki.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan umum : untuk mengetahui apakah fraksi protein umbi teki FP , FP , FP , dan FP
20
40
60
80 berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.
Tujuan khusus : 1. untuk mengetahui efek sitotoksisitas fraksi protein umbi teki terhadap sel myeloma dan sel Vero.
2. untuk mengetahui seberapa besar nilai LC
50 fraksi protein umbi teki FP 20 ,
FP
40 , FP 60 , dan FP
80 terhadap sel myeloma dan sel Vero.
3. untuk mengetahui apakah LC
50
fraksi protein umbi teki terhadap sel myeloma lebih besar daripada sel Vero.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Rumput Teki (Cyperus rotundus L.)
1. Keterangan botani
Rumput teki dapat diklasifikasikan ke dalam famili Cyperaceae, genus
Cyperus dan spesies Cyperus rotundus L. (Backer dan Bakhuizen van den Brink,
1968). Rumput teki yang digunakan juga dikenal dengan nama purple nutsedge.2. Nama daerah Nama daerah: Jawa: Teki, tekan (Jawa), motta (Madura). Sulawesi:
Rukut teki wuta (Minahasa). Bulih manggasa buai (Buol), Nusatenggara: Kareha wai (Sumba). Maluku: Rukut teki wuta (Alfuru) (Anonim, 1980).
3. Deskripsi umbi teki
Umbi Cyperus rotundus L. berbau khas aromatik, rasa agak pedas dan pahit, menimbulkan rasa tebal di lidah. Umbi rumput teki utuh berbentuk jorong atau bulat panjang sampai bulat telur memanjang, bagian pangkal dan ujung umumnya meruncing seperti beras, sukar dipatahkan; panjang 1 - 5,5 cm, garis tengah 7 mm – 1,5 cm; warna coklat muda sampai coklat kehitaman, kadang- kadang berbintik-bintik putih, permukaan beruas-ruas, jarak antara tiap ruas sampai lebih kurang 4 mm. Pada permukaan rimpang terdapat tunas-tunas, pangkal akar, sisa pelepah daun yang telah koyak; sisa pelepah daun berupa lembaran-lembaran tipis berbentuk tidak beraturan berwarna coklat muda, coklat sampai kehitaman, terdapat terutama di bagian pertengahan sampai bagian ujung umbi. Bagian patahan tidak rata, warna putih kotor. Batas antara korteks dan silinder pusat jelas (Anonim, 1980).
4. Habitat
Rumput teki tumbuh di dataran rendah sampai ketinggian 1000 meter di atas permukaan laut. Tumbuhan ini banyak tumbuh liar di Afrika Selatan, Korea, Cina, Jepang, Taiwan, Malaysia, Indonesia dan kawasan Asia Tenggara pada umumnya. Tumbuhan ini umumnya tumbuh di lahan pertanian yang tidak terlalu kering (tanahnya tidak berbencah-bencah), di ladang dan kebun (Sudarsono, 1996).
5. Kandungan kimia
Terdapat banyak zat kimia yang terkandung dalam rumput teki. Rimpang dan umbi teki mengandung 4alpha, 5alpha-oxidoeudesm-11-en-3-alpha-ol, beta-
cyperone, kalsium, tembaga, cyperolone, besi, isocyperol, isokobusone, kobusone,
asam linoleat, asam linolenat, magnesium, mangan, asam miristat, asam oleanolat, kalium, natrium,asam oleat, patchoulenone,
oleanolic-acid-3-o-neohesperidoside, asam stearat, sugetriol, sugenol, sugeonol, seng (Duke, 2001).
6. Khasiat dan penggunaan
Khasiat rumput teki, yakni untuk diuretik, stomakik (Anonim, 1980), analgesik, anti inflamasi, sedatif, diaforetik, karminatif. Kegunaannya untuk busung air, haid tidak teratur, mencret, nyeri haid, pencernaan tidak baik, rematik, sakit perut (Soedibyo, 1998). Kegunaan lainnya adalah anthelmintik, antibakteria, antibiotik, antimalaria, anti tumor (tumor payudara, kanker leher rahim) (Anonim, 2006a).
7. Penelitian mengenai rumput teki
Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya antara lain adalah efek anthelmintik dari umbi teki (Rahayu, 1989) yang hasilnya menunjukkan kemungkinan adanya senyawa terpen, fenol, dan fenolat yang berkhasiat anthelmintik. Penelitian lainnya adalah isolasi dan identifikasi flavonoid dari umbi teki (Rahardjo, 1990) yang berhasil menemukan paling sedikit tiga senyawa flavonoid golongan auron. Penelitian ketiga adalah identifikasi mikroskopis umbi teki serta efek anti inflamasi ekstrak etanolnya (Hartini, 1993) yang menyatakan bahwa umbi teki memberikan efek antiinflamasi pada tikus. Penelitian keempat adalah khasiat anti radang dari ekstrak etanol umbi teki (Rahardja, 1994) yang menyatakan bahwa umbi teki memberikan daya antiinflamasi secara per oral dan intraperitoneal. Sedangkan penelitian lainnya adalah daya melarutkan minyak atsiri dan infus umbi teki terhadap batu ginjal kalsium secara in vitro (Suhartiningsih, 1996) yang hasilnya menunjukkan kemampuan melarutkan batu ginjal tersebut. Penelitian ini memiliki persamaan objek uji dengan penelitian- penelitian yang sudah disebutkan di atas. Hal yang membedakan penelitian ini dengan penelitian-penelitian sebelumnya adalah pada subjek uji yang digunakan.
Subjek uji yang digunakan untuk penelitian ini adalah kultur sel myeloma.
B. Kanker
Kanker didefinisikan sebagai penyakit yang berasal dari kerusakan genetik dan menyebabkan distorsi ekspresi atau fungsi biokimia gen. Tumor terbagi menjadi dua jenis yaitu benigna dan malignan (kanker). Benigna adalah tumor yang terbungkus kapsula, berproliferasi secara lokal, morfologi selnya mirip dengan morfologi sel asalnya, dan kecepatan pertumbuhannya lambat.
Sedangkan tumor malignan (kanker) tidak terbungkus kapsula, pertumbuhannya sangat cepat dan bersifat sangat invasif serta relatif resisten terhadap pengobatan.
Sel-sel tumor malignan ini cenderung mengalami metastasis dan dapat muncul kembali walaupun tumor utama telah dibuang (DiPiro et al, 2005).
Patologi kanker disebabkan oleh akumulasi mutasi DNA yang berefek negatif berupa pembentukan protein supresor tumor atau menghasilkan efek positif berupa pembentukan protein pengendali siklus sel. Zat yang menyebabkan mutasi dikenal sebagai mutagen. Sedangkan mutagen yang menyebabkan kanker disebut karsinogen (Anonim, 2006b).
Mekanisme terjadinya kanker atau karsinogenesis tidak dapat dipahami sepenuhnya. Namun proses terjadinya kanker dapat disederhanakan menjadi tiga tahap. Tahap-tahap tersebut adalah tahap inisiasi, promosi, dan progresi. Tahap inisiasi menandakan adanya paparan karsinogen yang merusak sel-sel normal secara genetis. Tahap kedua adalah promosi yang memungkinkan perubahan lingkungan untuk mendukung perkembangan sel yang bermutasi. Tahap promosi adalah tahap yang ireversibel sehingga sering dijadikan sebagai target strategi kemopreventif. Tahap terakhir karsinogenesis adalah progresi. Tahap progresi meliputi perubahan genetik lebih lanjut yang meningkatkan proliferasi sel neoplastik. Titik kritis tahap ini adalah invasi tumor ke jaringan sekitarnya dan perkembangan metastasis (DiPiro et al, 2005).
C. Protein
Protein adalah makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L- asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein memiliki bobot molekul yang tinggi, mulai dari 5000 sampai berjuta-juta (Girindra, 1993).
Protein dalam tanaman terbagi menjadi dua yaitu protein biji dan protein daun. Beberapa protein biji memiliki sifat sebagai protein racun. Protein beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan penyakit lain yang disebabkan oleh virus. Jenis cara kerja yang dipilih untuk mengisolasi protein dari tanaman harus memenuhi kondisi tertentu yang tidak menyebabkan denaturasi protein. Oleh karena itu, dianjurkan untuk bekerja pada suhu rendah dan menghindari perubahan pH yang ekstrem. Pemilihan dapar basa sebagai pelarut mampu mengekstraksi lebih banyak protein dalam bentuk terlarut dan membantu penetralan cairan yang bersifat asam (Robinson, 1991).
Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat. Cara ini dilakukan terutama bila diinginkan satu macam protein saja, sedangkan protein lain tidak diperlukan. Pemurnian protein dengan amonium sulfat dapat dilakukan secara bertingkat (fraksinasi). Fraksinasi protein dimaksudkan agar diperoleh pemisahan protein murni yang diinginkan ada dalam fraksi tertentu. Pengendapan dengan amonium sulfat dapat terjadi karena penurunan kelarutan protein akibat garam yang ditambahkan pada konsentrasi tinggi disebut peristiwa salting out (Poedjiadi, 1994).
Proses salting out digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Garam yang digunakan umumnya adalah amonium sulfat karena kelarutannya tinggi, relatif murah, dan dapat menstabilkan protein (Anonim, 2006c).
D. Sel Myeloma
Multiple myeloma (juga dikenal sebagai myeloma atau myeloma
sel plasma) adalah penyakit hematologi yang progresif. Multiple myeloma sendiri dikategorikan sebagai kanker sel plasma. Multiple myeloma ditandai dengan jumlah sel plasma yang berlebihan pada sumsum tulang atau kelebihan produksi imunoglobulin monoklonal (IgG, IgA, IgD, atau IgE) atau protein Bence-Jones.
Manifestasi klinis yang umum ditemui pada penderita multiple myeloma adalah hiperkalsemia, anemia, kerusakan ginjal, rentan terkena infeksi bakteri, dan kurangnya jumlah imunoglobulin yang diproduksi (Anonim, 2006d).
Usia rata-rata pasien didiagnosis menderita multiple myeloma adalah 66 tahun. Langkah awal yang penting dilakukan untuk menentukan pilihan terapi terbaik adalah menentukan jumlah dan stadium kanker di dalam tubuh melalui serangkaian uji. Uji-uji ini meliputi pengambilan sumsum tulang dan biopsi, uji urin dan darah untuk mengukur protein yang abnormal (Anonim, 2006e).
Ada tiga tahap perkembangan penyakit multiple myeloma. Tahap-tahap ini ditentukan secara spesifik dengan kadar protein M dan protein Bence-Jones.
Tahap pertama menunjukkan adanya tumor dalam jumlah kecil. Tahap kedua merupakan perkembangan menengah tumor. Sedangkan tahap ketiga menunjukkan adanya tumor dalam jumlah besar. Pada tahap ketiga ini ditemukan protein M dan protein Bence-Jones dalam jumlah besar. Selain itu, juga ditemukan tiga atau lebih lesi pada tulang (Anonim, 2006f).
Morfologi sel myeloma adalah berupa lymphoblast yang menghasilkan IgM. Sel myeloma ditumbuhkan dalam continuous culture dengan bentuk suspensi. Medium yang digunakan untuk pertumbuhan sel myeloma adalah medium RPMI 1640 ditambah dengan 10% FBS, 2mM L-glutamin. Ke dalam medium pertumbuhan dialirkan 5% gas CO
2 dan suhu optimum untuk O
pertumbuhan sel adalah 37 C (Anonim, 2006g).
RPMI 1640 mengandung 20 asam amino misalnya : asparagin, glutamin, histidin, metionin, dan serin; 11 vitamin antara lain biotin, tiamin HCl, inositol, riboflavin, dan vitamin B
12 ; 6 garam anorganik misalnya; NaCl, KCl, NaHCO 3 ,
dan MgSO
4 ; serta komponen-komponen lain antara lain glukosa, glutation, fenol merah, dan natrium piruvat (Anonim, 2006h).
E. Sel Vero
Sel Vero ditemukan pertama pada tahun 1962 oleh Yasumura dan Kawakita di Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel Vero diambil dari ginjal kera dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat. Sel Vero juga sering digunakan untuk mendeteksi verotoksin dan memproduksi vaksin. Saat ini, sel Vero telah banyak digunakan untuk mengembangkan pengobatan berbagai macam penyakit, salah satu diantaranya yaitu diabetes (Anonim, 2006i).
F.
Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas merupakan perkembangan untuk mengidentifikasi obat sitotoksik baru atau deteksi obat dengan aktivitas antitumor. Sistem uji sitotoksisitas berdasarkan pada hubungan antara dosis dan respon berupa kematian sel kanker. Sitotoksisitas merupakan syarat aktivitas antikanker (Snell and Mullock, 1958; cit Hariadi, 2006).
Viabilitas sel pada uji sitotoksisitas dapat ditentukan dengan metode MTT. Metode ini didasarkan pada perubahan garam MTT {3-(4,5-dimetil-tiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida} menjadi formazan oleh enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam mitokondria sel. Konsentrasi dari formazan yang berwarna merah dapat ditentukan secara spektrofotometri visibel, dan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup. Metode MTT ini dikenal aman, dan merupakan alternatif uji sitotoksisitas yang akurat (Anonim, 2006j).
Reaksi reduksi MTT menjadi formazan dapat digambarkan sebagai berikut :
Br NADH N N
NH CH 3 N N N N N
CH 3 N
- N S
NAD CH 3 S CH 3 Formazan MTT Uji sitotoksisitas pada umumnya menggunakan parameter nilai LC 50 . Nilai LC
50 adalah besaran konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian 50%
pada subjek uji. Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antikanker bila memiliki nilai LC
50 lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991; cit Hariadi, 2006).
G. Keterangan Empiris
Penelitian ini bersifat trial dan error yang diharapkan dapat mengetahui hubungan empiris antara pengaruh pemberian fraksi protein umbi teki FP
20 , FP 40 ,
FP
60 dan FP 80 terhadap sel myeloma dan sel Vero.
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian efek sitotoksik fraksi protein umbi teki terhadap kultur sel
myeloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel a.
Variabel bebas ialah konsentrasi fraksi protein umbi teki FP
20 , FP 40 , FP 60 , dan
FP
80 dengan seri kadar 125µg/ml ; 250µg/ml ; 500 µg/ml ; 1000 µg/ml ; 2000 µg/ml dan 4000 µg/ml.
b. Variabel tergantung ialah persentase kematian sel myeloma dan sel Vero.
c.
Variabel pengacau terkendali 1) Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640 yang mengandung FBS 10% untuk sel myeloma dan medium M199 untuk sel Vero. 2) Tempat tumbuh dan waktu pemanenan umbi teki dikendalikan dengan mengambil umbi pada waktu dan tempat yang sama.
3) pH serta suhu pembuatan dan penyimpanan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu ± 4
O C. d.
Variabel pengacau tidak terkendali ialah kematian sel myeloma dan sel Vero secara alami, serta umur tanaman rumput teki.
2. Definisi operasional
a. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur sel myeloma yang diberi perlakuan dengan fraksi-fraksi protein.
b. FP adalah bagian tanaman yang berisi protein yang didapat dengan cara menambahkan amonium sulfat untuk mencapai derajat kejenuhan tertentu.
c. LC
50
adalah konsentrasi fraksi protein umbi teki yang dapat mengakibatkan kematian 50% sel myeloma yang dinyatakan dalam µg/ml.
C. Bahan atau Materi Penelitian
1. Umbi teki yang diambil di daerah Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi Sungai Progo) pada bulan Juli 2006.
2. Kultur sel myeloma dan sel Vero dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada. c.
3. Pereaksi untuk isolasi dan penetapan konsentrasi protein dari umbi teki:
a. Larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 b.
Larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl
c. Amonium sulfat 4. Pereaksi untuk uji sitotoksisitas pada sel myeloma
a. Medium pencuci : RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes
b. Medium penumbuh : RPMI 1640, FBS 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco)
Reagen stopper : SDS dalam HCl 0,01 N (Merck)
d. Larutan MTT dalam media RPMI 1640 untuk sel myeloma dan media M199 untuk sel Vero (Sigma)
e. Bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,25%
D. Alat-Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: timbangan analitik (AND ER-400 H), magnetic stirrer, tabung conical, kain monel, gloves, masker, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge (PLC), inkubator Memmer, mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin, freezer, cell
counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-292),
ELISA Reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Nebauer), dan alat-alat gelas lainnya.
E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu umbi teki (Cyperus rotundus L.). Umbi teki ini telah diidentifikasi dan determinasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Umbi teki ini dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku determinasi (Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1968)
2. Pengumpulan umbi teki
Umbi teki yang digunakan diambil dari Sumberarum, Moyudan, Sleman (tepi Sungai Progo), pada bulan Juli 2006.
3. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan dulu untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan. Setelah itu dibungkus dengan aluminium foil dan
O disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C (Anonim, 1995).
4. Pembuatan fraksi protein
Umbi tanaman rumput teki dikumpulkan segar, diseleksi lalu dicuci bersih dengan air mengalir. Umbi dan sisiknya dipotong kecil-kecil lalu ditimbang sebanyak 400 g, dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan dalam freezer. Bahan ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu 4ºC. Bahan diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril.
Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 2010 x G selama 20 menit. Supernatan dikumpulkan dalam beaker glass 1000 ml dan diendapkan proteinnya dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 79,8 g, aduk dengan pengaduk magnetik selama semalam. Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan (1) ditampung dalam beaker glass 1000 ml, sedangkan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 ; kemudian didialisis dengan tubing dialisis dalam larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 selama semalam. Hasil dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet kemudian dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel FP 20.
Supernatan (1) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 74,2 g, aduk dengan pengaduk magnetik semalam.
O
Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Supernatan (2) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam.
O
Hasil dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP
40. Supernatan (2) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 87,22 g, aduk dengan pengaduk magnetik semalam.
O
Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Supernatan (3) ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam.
O
Hasil dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP
60 .
Supernatan (3) yang ditampung tadi kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak 98,8 g, aduk dengan pengaduk magnetik semalam.
O
Kemudian disentrifus lagi 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Supernatan ditampung dan pelet yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2; kemudian didialisis selama semalam. Hasil
O
dialisis disentrifus 2010 x G selama 20 menit pada suhu 4
C. Pelet dibuang dan supernatan merupakan sampel FP
80.
5. Pengukuran kadar protein dengan metode spektrofotometri UV
Fraksi protein umbi teki FP
20 , FP
40 , FP 60 , dan FP 80 , masing-masingsebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapar natrium fosfat 5 mM. Ukur serapan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat.
- -1