Uji antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa - USD Repository

  UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Sarjana Farmasi

  Oleh : Dedy

  NIM : 018114027

  Oleh : Aprilliana Sari Dewi NIM : 028114176 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

  

UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR

EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU

MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL

DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

  

Program Sarjana Farmasi

  Oleh : Dedy

  NIM : 018114027

  

Oleh :

Aprilliana Sari Dewi

NIM : 028114176

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

UJI ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT DAN FRAKSI AIR EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU MELALUI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA

  Yang diajukan oleh : Aprilliana Sari Dewi

  NIM : 028114176 Skripsi ini telah disetujui oleh:

  Pembimbing Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt.

  Kupersembahkan skripsi ini untuk: Tuhan Yesus yang selalu memberiku kasih, kekuatan, dan penghiburan

  Bapak dan Ibuku yang sangat aku sayangi

  Adikku Daniel yang selalu mendukungku

  Almamaterku

  

PRAKATA

  Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala kasih dan rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Etanol Teh Hijau Melalui Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Selama perkuliahan, penelitian, dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak berupa bimbingan, nasehat, dorongan, pengarahan, kritik, saran, dan sarana. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaiakan penghargaan dan ucapan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas segala masukan, kritik, semangat, dan sarannya.

  3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen Penguji atas bimbingan, saran, dan pengarahannya baik selama penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini.

  4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen Penguji atas bimbingan, saran, dan pengarahannya baik selama penelitian dan dalam penyusunan

  5. Enade Istyastono, S.F., Apt. atas dukungan, perhatian, waktu, semangat, saran dan kritiknya.

  6. Romo Drs. P. Sunu H. S.J., atas bimbingan, nasehat, semangat, waktu, saran, dan bantuannya.

  7. Segenap dosen atas kesabarannya dalam membimbing penulis selama perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  8. Segenap laboran dan karyawan atas bantuan dan kerjasamanya selama penulis menempuh perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  9. PT. Pagilaran Yogyakarta atas informasi yang diberikan tentang proses pembuatan teh.

  10. Bapak, Ibu, dan adikku Daniel yang sangat aku sayangi.

  11. Teman-teman “Skripsi Ceria” (Riri, Leny, Vini, dan Ardhyan), atas persahabatan, semangat, bantuan, dan kerjasamanya.

  12. Teman-teman kost Davita dan almamaternya (Mbak Yanti, Mbak Siska, Mbak Utin, Mbak Wulan, Aris, Clara, Yosi, I’ie), Bapak & Ibu kost, dik Ana dan dik Anik, atas cinta dan kasih sayang kalian.

  13. Teman-teman KKN-ku (Mbak Ade, Kak Enzo, Mas Chandra, Tisa, Ndus, Reni, Ika, Wida, Lambok) atas waktu sejenak yang berarti buatku.

  14. Arya, Kristian, Danang, Heri, Mas Made, Mas Sam, Mas Hendri, Yuni, Duma, Rinta, Santi, Mas Koko, Bang Agus, Ponco, Duta, Mas Christ, Mas Rocky, Nono, Yon, Mas Pras, Kak Sani, Dik Kus, dan Ina atas bantuan

  15. Teman-teman kelas C terutama kelompok F angkatan 2002, atas persahabatan, kebersamaan, dan kerjasama kita selama ini.

  16. Semua pihak yang telah memberi bantuan, semangat, dan dukungan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

  Akhir kata, penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna mengingat keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang dimiliki. Oleh sebab itu, kritik dan saran yang membangun sangat diperlukan oleh penulis demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 13 Februari 2007 Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 13 Februari 2007 Penulis

  Aprilliana Sari Dewi

  INTISARI

  Teh hijau mengandung kira-kira 30 % senyawa polifenol terutama dari golongan flavonoid. Komponen flavonoid dalam teh hijau dengan gugus hidroksi fenoliknya, memungkinkan teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan dengan mekanisme penangkapan radikal hidroksil. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas dan nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa.

  Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental karena subyek uji diberi perlakuan. Metode yang digunakan adalah metode deoksiribosa, dengan reagen Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil. Penyerangan radikal hidroksil terhadap deoksiribosa menghasilkan malondialdehid (MDA), yang kemudian direaksikan dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam dan dengan pemanasan membentuk kromogen berwarna merah muda. Absorbansi dari kromogen ini kemudian diukur pada panjang gelombang 532 nm. Aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dari fraksi etil asetat dan fraksi air diketahui dari nilai % scavenging. Nilai aktivitas antioksidan kedua fraksi

  50

  tersebut diketahui dengan cara menetapkan ES (penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 %) melalui analisis regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi fraksi etil asetat dan konsentrasi fraksi air dengan % scavenging .

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dan fraksi air mempunyai aktivitas antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat berbeda tidak bermakna dibanding aktivitas antioksidan fraksi air dengan nilai ES

  50 fraksi etil

  asetat sebesar 0,22 (mg/ml) (hasil ekstrapolasi) dan nilai ES

  50 fraksi air sebesar 0,23 (mg/ml) (hasil ekstrapolasi).

  Kata kunci : antioksidan, fraksi etil asetat, fraksi air, ekstrak etanol teh hijau, radikal hidroksil, metode deoksiribosa.

  ABSTRACT

  Green tea contains approximately 30 % polyphenols especially from the flavonoid compound. Hydroxy phenolic group of flavonoid component in green tea makes green tea have antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging mechanism. The aim of this research is to know antioxidant activity and value of the activity of ethyl acetate fraction and water fraction of green tea ethanolic extract by hydroxyl radical scavenging with deoxyribose method..

  This research is an experimental research since the subject tested was given treatment. Method used is deoxyribose method, with Fenton’s reagent to produce hydroxyl radical that attack deoxyribose produce malondialdehid (MDA) then reacts with thiobarbituric acid (TBA) in acid condition and with heating produce pink chromogen. The absorbance of this chromogen measured at 532 nm. Antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging from ethyl acetate and water fraction expressed as % scavenging value. The antioxidant activity value is known

  50

  by count ES (50 % hydroxyl radical effective scavenging) through linear regression analysis from relation between ethyl acetate and water fraction concentration and % scavenging.

  The result of this research revealed that ethyl acetate and water fraction has the antioxidant activity by hydroxyl radical scavenging with deoxyribose method. Antioxidant activity of ethyl acetate fraction has insignificant difference in comparison with water fraction, ES

  50 value of ethyl acetate fraction is 0.22

  (mg/ml) (extrapolation result) and ES

  50 value of water fraction is 0.23 (mg/ml) (extrapolation result).

  Keywords: antioxidant, ethyl acetate fraction, water fraction, green tea ethanolic extract, hydroxyl radical, deoxyribose method.

  DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL...............................................................................................ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................iii HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................. v PRAKATA ............................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ix

  INTISARI................................................................................................................ x

  

ABSTRACT .............................................................................................................xi

  DAFTAR ISI .........................................................................................................xii DAFTAR TABEL ................................................................................................xvi DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xvii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................xviii

  BAB I PENGANTAR ............................................................................................. 1 A. Latar Belakang ............................................................................................ 1 B. Perumusan Masalah .................................................................................... 5 C. Keaslian Penelitian ...................................................................................... 5 D. Manfaat Penelitian ...................................................................................... 6 E. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 6 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 7

  1. Klasifikasi teh dan proses pengolahannya ........................................ 7

  2. Kandungan kimia teh hijau ............................................................... 7

  3. Khasiat teh hijau................................................................................ 8

  B. Flavonoid ...................................................................................................... 8

  1. Pengertian flavonoid ......................................................................... 8

  2. Flavonoid dalam teh hijau ................................................................. 9

  3. Sifat antioksidan flavonoid ............................................................. 10

  4. Penyarian flavonoid ........................................................................ 11

  C. Metode Penyarian ....................................................................................... 11

  1. Maserasi dan remaserasi ................................................................. 11

  2. Perkolasi .......................................................................................... 12

  3. Infundasi.......................................................................................... 12

  4. Penyarian berkesinambungan.......................................................... 13

  

  D. Radikal Hidroksil (HO )............................................................................. 13

  1. Pengertian radikal hidroksil ............................................................ 13

  2. Pembentukan radikal hidroksil........................................................ 13

  3. Metode deteksi radikal hidroksil..................................................... 14

  E. Metode Deoksiribosa .................................................................................. 15

  F. Antioksidan ................................................................................................. 17

  G. Spektrofotometri Sinar Tampak ................................................................. 20

  H. Landasan Teori ........................................................................................... 22

  I. Hipotesis ...................................................................................................... 24

  A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 25

  b. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM ........................................ 30

  ) ............................... 33

  maks

  6. Penentuan panjang gelombang maksimum ( 

  5. Penentuan OperatingTime (OT)............................................................ 32

  g. Pembuatan larutan uji fraksi air 1 mg/ml ........................................ 32

  f. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat 1 mg/ml.............................. 32

  e. Pembuatan larutan TBA 1 %........................................................... 31

  d. Pembuatan larutan TCA 5 % .......................................................... 31

  c. Pembuatan reagen Fenton ............................................................... 30

  a. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4............................................ 30

  B. Variabel Penelitian .................................................................................... 25

  4. Persiapan uji penangkapan radikal hidroksil....................................... 30

  b. Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air....................................... 28

  a. Pembuatan ekstak etanol teh hijau .................................................. 28

  3. Preparasi sampel………...................................................................... 28

  2. Pembuatan serbuk teh hijau………. ................................................... 27

  1. Pengambilan sampel………................................................................ 27

  F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 27

  E. Alat ............................................................................................................ 27

  D. Bahan......................................................................................................... 26

  C. Definisi Operasional.................................................................................. 25

  7. Pembuatan larutan kontrol .................................................................... 33

  9. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi air ................................. 34

  G. Analisis Data .............................................................................................. 35

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 36 A. Pengambilan Sampel .................................................................................. 36 B. Pembuatan Serbuk Teh Hijau ..................................................................... 37 C. Preparasi Sampel ........................................................................................ 37

  1. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau ....................................................... 37

  2. Fraksinasi ekstrak etanol teh hijau ........................................................ 38

  D. Penentuan Operating Time (OT)................................................................ 39

  E. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (  maks ) ................................... 41

  F. Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air Teh Hijau............................................................................ 45

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................................ 53 A. Kesimpulan ............................................................................................... 53 B. Saran.......................................................................................................... 53 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 54 DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... 58 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 72

  

DAFTAR TABEL

  Hal Tabel I. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil........................................ 14 Tabel II. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan sampel fraksi etil asetat dengan berbagai konsentrasi ....................................... 46 Tabel III. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan sampel fraksi air dengan berbagai konsentrasi .................................................. 46 Tabel IV. Nilai persentase penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air teh hijau ................................................ 48

  

DAFTAR GAMBAR

  Hal Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid beserta penomorannya .............................. 8 Gambar 2. Struktur kimia katekin teh dan epimernya .......................................... 9 Gambar 3. Struktur flavonol teh.......................................................................... 10 Gambar 4. Struktur deoksiribosa......................................................................... 15 Gambar 5. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa ................. 16 Gambar 6. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil ........................................ 16 Gambar 7. Struktur malondialdehid (MDA) ....................................................... 17 Gambar 8. Tingkat energi elektron molekul ....................................................... 21 Gambar 9. Skema tata cara preparasi sampel (ekstraksi dan fraksinasi) ............ 29 Gambar 10. Kurva hubungan waktu vs absorbansi pada pengukuran

  operating time (OT) .......................................................................... 40

  Gambar 11. Kurva panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA ......... 41 Gambar 12. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ..................................... 43 Gambar 13. Usulan reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA.......................... 44 Gambar 14. Struktur kromogen MDA-TBA ......................................................... 45 Gambar 15. Kurva hubungan konsentrasi fraksi etil asetat dengan

  % scavenging .................................................................................... 48 Gambar 16. Kurva hubungan konsentrasi fraksi air dengan % scavenging......... 48 Gambar 17. Kurva regresi fraksi etil asetat teh hijau (hasil konversi) .................. 49 Gambar 18. Kurva regresi fraksi air teh hijau (hasil konversi) ............................. 49 Gambar 19. Reaksi penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa flavonoid........ 51 Gambar 20. Reaksi kopling radikal fenoksil dengan radikal lain pada tahap terminasi ............................................................................................ 52

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4............................................58 Lampiran 2. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM. .......................................59 Lampiran 3. Pembuatan reagen Fenton................................................................60 Lampiran 4. Pembuatan larutan TCA 5 % dan TBA 1 %. ...................................65 Lampiran 5. Perhitungan persentase penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa uji (% scavenging). ....................................................66 Lampiran 6. Perhitungan penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar

  50

  50 % (Effective Scavenging 50 (ES )) ............................................67 Lampiran 7. Tabel koefisien korelasi (r)..............................................................70 Lampiran 8. Tabel random sampling (random numbers table). ..........................71

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Radikal bebas terutama spesies oksigen reaktif (Reactive Oxygen Species

  , ROS) merupakan radikal bebas yang umum dihasilkan dalam sistem biologi, baik melalui proses fisiologi maupun patologi. ROS dapat juga dihasilkan dari sumber eksogen misalnya dari komponen makanan, dan radiasi ultraviolet. ROS

  terdiri dari radikal superoksid (O

  2 ), radikal peroksil (ROO ), radikal alkoksil

  (RO ), radikal oksida nitrit (NO ), dan radikal hidroksil (HO ) (Ames et al., 1993

  

cit Siswono, 2003). ROS bersifat reaktif karena adanya elektron yang tidak

  berpasangan pada orbital terluarnya. Diantara beberapa jenis ROS tersebut, radikal hidroksil merupakan radikal yang paling reaktif (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Karena alasan itulah dalam penelitian ini digunakan radikal hidroksil sebagai model radikal bebas yang berbahaya.

  Secara normal radikal bebas-radikal bebas tersebut dapat diatasi oleh antioksidan endogen (misalnya enzim superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase). Apabila radikal bebas yang dihasilkan melebihi kemampuan antioksidan endogen, maka akan terjadi akumulasi radikal bebas dalam tubuh. Hal tersebut dapat menimbulkan stres oksidatif yang diketahui berperan dalam penuaan dini dan timbulnya penyakit degeneratif seperti artherosklerosis, penyakit jantung, dan kanker. Selama ini upaya pengobatan dan perawatan seringkali terbatas hanya pada penghilangan gejala daripada ke arah pencegahan penyebab penyakit (Cutler and Cutler, 2000). Berdasarkan hal tersebut, akhir-akhir ini radikal bebas mendapat perhatian cukup besar dalam bidang gizi, farmasi, dan kedokteran (Mulihal, 1991).

  Untuk mencegah terjadinya stress oksidatif tersebut diperlukan antioksidan eksogen yang efektif dan aman untuk membantu kerja antioksidan endogen dalam menangkap radikal bebas. Antioksidan eksogen dapat berupa antioksidan alami maupun antioksidan sintetik. Akhir-akhir ini diketahui bahwa beberapa senyawa antioksidan sintetik seperti butylated hydroxy anisole (BHA) dan butylated hydroxy toluene (BHT) telah diragukan keamanannya karena memiliki efek samping yang besar misalnya menyebabkan kerusakan hati. Hal tersebut mendorong tahap pengembangan antioksidan ke arah bahan-bahan alami yang diyakini mempunyai jaminan keamanan yang lebih tinggi karena memiliki efek samping yang minimal (Kikuzaki and Nakatani, 1993 cit Hertiani et al., 2001).

  Salah satu sumber antioksidan alami adalah teh hijau, yang merupakan bahan minuman hasil pengolahan tanaman teh (Camellia sinensis L.). Ekstrak teh mempunyai kemampuan yang kuat dalam menangkap ROS (Rohdiana, 2001). Kandungan zat kimia yang paling banyak dalam teh hijau adalah senyawa polifenol yaitu sekitar 30 % (Oki, 1996 cit Handajani, 2002). Aktivitas antioksidan teh hijau disebabkan oleh senyawa polifenol tersebut, terutama golongan flavonoid tipe flavanol (komponen katekin yang terdiri dari: epikatekin (EC)) dan tipe flavonol (kuersetin, kemferol, dan mirisetin). Berdasarkan hal tersebut, dalam penelitian ini ekstraksi dititikberatkan pada penyarian senyawa flavonoid dalam teh hijau. Aktivitas antioksidan flavonoid teh hijau disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Saat bereaksi dengan radikal bebas (dalam hal ini radikal hidroksil), flavonoid akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil, sehingga fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat (Cuvelier et al., 1991 cit Rohdiana, 2001).

  Pada penelitian ini teh hijau diekstraksi dengan alkohol (etanol 70 %) untuk menyari flavonoid secara optimal. Ekstrak etanol yang didapat kemudian difraksinasi dengan kloroform untuk menghilangkan lemak dan klorofil yang dapat mengganggu analisis (Markham, 1988). Fraksinasi berikutnya dilakukan menggunakan etil asetat untuk memisahkan flavonoid yang berbentuk aglikon dan flavonoid yang terikat dengan gula (bentuk glikosida) (Robinson, 1995). Proses fraksinasi tersebut menghasilkan fraksi etil asetat dan fraksi air. Berdasarkan sifat kelarutan sesuai dengan strukturnya, flavonoid dalam bentuk aglikon dimungkinkan terdistribusi ke dalam fraksi etil asetat dan flavonoid dalam bentuk glikosida terdistribusi ke dalam fraksi air. Kandungan polifenol terutama flavonoid dalam kedua fraksi tersebut akan memberikan aktivitas penangkapan radikal hidroksil.

  Penelitian ini difokuskan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh masing-masing fraksi. Belum dapat diketahui dengan pasti komponen apa saja yang ada dalam fraksi etil asetat maupun fraksi air karena tidak dilakukan uji kualitatif secara lengkap maupun pemisahan menjadi senyawa tunggal terhadap fraksi etil asetat dan fraksi air tersebut.

  Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode deoksiribosa. Metode ini dipilih dengan alasan menggunakan deoksiribosa sebagai substrat yang akan diserang radikal hidroksil. Diketahui bahwa deoksiribosa merupakan gugus gula penyusun Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) sehingga dapat memberi gambaran penyerangan radikal hidroksil di dalam tubuh. Selain itu, metode tersebut telah divalidasi untuk menguji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh suatu senyawa antioksidan, seperti vitamin C (Purwantoko, 2006). Dalam metode tersebut, deoksiribosa diserang oleh radikal hidroksil menghasilkan produk degradasi yang apabila direaksikan dengan asam tiobarbiturat dalam suasana asam dan dengan pemanasan akan menjadi suatu kromogen berwarna merah muda (pink). Kromogen ini dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 532 nm (Halliwell et al., 1987).

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa, dan untuk mengetahui nilai aktivitas penangkapannya. Aktivitas antioksidan yaitu kemampuan masing-masing fraksi dalam menangkap radikal hidroksil dinyatakan dalam % scavenging. Nilai aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai konsentrasi yang diperlukan untuk

  50 menangkap radikal hidroksil sebanyak 50 % (effective scavenging 50 (ES )).

B. Perumusan Masalah

  1. Apakah fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau mempunyai aktivitas antioksidan melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dengan % scavenging?

  2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa, yang dinyatakan sebagai effective scavenging 50 (ES 5 0 )?

C. Keaslian Penelitian

  Telah dilakukan beberapa penelitian tentang uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yaitu validasi metode deoksiribosa sebagai uji penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C secara in vitro (Purwantoko, 2006); uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak teh hitam dengan metode deoksiribosa (Setyawati, 2007).

  Uji antioksidan melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dilakukan berbeda dengan penelitian sebelumnya.

  Perbedaannya terletak pada sampel yang digunakan, yaitu fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau. Berdasarkan hal tersebut sejauh pengamatan penulis, uji antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian

  1. Manfaat teoritis Melengkapi bukti-bukti ilmiah tentang aktivitas antioksidan ekstrak etanol teh hijau terutama dari fraksi etil asetat dan fraksi air.

  2. Manfaat metodologis Memberikan informasi mengenai aplikasi penggunaan metode deoksiribosa sebagai uji antioksidan untuk bahan-bahan alam yang mengandung banyak senyawa.

  3. Manfaat praktis Memberikan tambahan informasi kepada masyarakat mengenai penggunaan teh hijau sebagai sumber antioksidan alami.

E. Tujuan Penelitian

  Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini bertujuan untuk:

  1. Mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dengan % scavenging.

  2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dan fraksi air ekstrak etanol teh hijau melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode

  50 deoksiribosa, yang dinyatakan sebagai effective scavenging 50 (ES ).

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Teh Hijau

  1. Klasifikasi teh dan proses pengolahannya

  Teh hijau berasal dari tanaman teh yaitu dari suku Theacheae dengan nama ilmiah Camellia sinensis L. (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991).

  Komoditas teh dihasilkan dari pucuk daun tanaman teh melalui proses pengolahan tertentu. Secara umum berdasarkan cara/proses pengolahannya, teh dapat diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu teh hijau, teh oolong, dan teh hitam. Teh hijau dibuat dengan cara menginaktivasi enzim oksidase/fenolase yang ada dalam pucuk daun teh segar, dengan cara pemanasan atau penguapan, sehingga oksidasi enzimatik terhadap katekin dapat dicegah. Teh hitam dibuat dengan cara memanfaatkan terjadinya oksidasi enzimatis terhadap kandungan katekin teh. Teh oolong dihasilkan melalui proses pemanasan yang dilakukan segera setelah proses

  

rolling /penggulungan daun, dengan tujuan untuk menghentikan proses fermentasi

(Hartoyo, 2003).

  2. Kandungan kimia teh hijau

  Zat kimia yang terkandung dalam teh hijau adalah polifenol 30 % (katekin 0,10 %; epikatekin 0,54 %; epigalokatekin 6,35 %; epikatekin galat 1,08

  3,31 %), kafein 4 %, gula dan getah 3 %, asam amino 7 %, mineral 4 %, protein 16 %, lemak 8 %, klorofil dan pigmen 1,5 %, pati 0,5 %, serat kasar, lignin, dan lain-lain 22% (Indrawati dan Devijanti, 1996 cit Handajani, 2002).

3. Khasiat teh hijau

  Teh hijau berkhasiat sebagai antioksidan, antimutagenik, antibakteri, hipokolesterolemik, dan pencegah kanker (Hartoyo, 2003).

B. Flavonoid

1. Pengertian flavonoid

  Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C

  6 -C 3 -C 6 yaitu dua cincin

  aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk mempermudah, cincin diberi tanda A, B, dan C (gambar 1). Atom karbon dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka beraksen untuk cincin B, tetapi khusus untuk khalkon, sistem penomorannya dimodifikasi (Markham, 1988). _{2' 3 ' 4' 7 8 O (8a) 9 1 2 1 '} B _{6' 5' 6 5 A (4a) 10} C _O

₄

₃ Gambar 1 . Kerangka dasar flavonoid beserta penomorannya

  O HO OH ^{OH OH R 1 OR 2}

  1 = R 2 = H

  1 = OH, R 2 = H

  Epikatekin galat: R

  1 = H, R 2 = X

  Epigalokatekin galat: R

  1

  = OH, R

  2

  = X Katekin: R

  Galokatekin: R

  1 = R 2 = H

  1 = OH, R 2 = H

  Katekin galat: R

  1 = H, R 2 = X

  Galokatekin galat: R

  1

  = OH, R

  2

  = X

  Gambar 2 . Struktur kimia katekin teh dan epimernya

  Epigalokatekin: R

  Epikatekin: R

  2

  X ^{O HO OH OH OH R 1 OR 2}

  1

  3

  4 4a

  5

  6

  7

  8 8a 1' 2'

  3' 4' 5' 6'

  C O ^OH _OH OH =

  2

  Zat bioaktif yang ada dalam teh, terutama merupakan polifenol golongan flavonoid yaitu flavanol tipe katekin dan flavonol (Hartoyo, 2003). Komponen katekin teh yang utama (gambar 2) adalah epigalokatekin galat (EGCG), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC), dan epikatekin (EC) (Hartoyo, 2003). Keempat komponen katekin tersebut merupakan antioksidan utama dalam teh hijau (Rohdiana, 2001).

  1

  3

  4 4a

  5

  6

  7

  8 8a 1' 2'

  3' 4' 5' 6'

  2. Flavonoid dalam teh hijau

  Flavonol utama yang ada dalam teh adalah kuersetin, kemferol, dan mirisetin (gambar 3). Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya

  (berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003). _{R 2}

  3' _OH 4' 2'

  1 1'

  8 _{H O O} 5'

  Mirisetin : R

  1 = R 2 = R 3 = OH 8a

2 R

  ₃

  7

  1

  2

  3 Kuersetin : R = R = OH, R = H 6'

  3

  1

  2

  6

  3 Kemferol : R = OH, R = R = H

  4 4a _{R 1}

5 OH O

  

Gambar 3. Struktur flavonol teh

3. Sifat antioksidan flavonoid

  Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik dan banyak menghambat reaksi oksidasi dan bertindak sebagai penangkap radikal yang baik dari radikal hidroksil dan superoksida (Robinson, 1995). Flavonoid memiliki potensial reduksi rendah (0,23 < E

  7 < 0,75) sehingga dapat mereduksi secara

  termodinamik radikal bebas dengan potensial oksidasi sebesar 2,13-1,0 V (Siswono, 2003).

  Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan oleh adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika bereaksi dengan radikal bebas, flavonoid membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Hal ini menyebabkan fase propagasi pada reaksi radikal bebas tersebut dapat dihambat (Cuvelier et al., 1991 cit Rohdiana, 2001).

4. Penyarian Flavonoid

  Pelarut-pelarut alkoholik umumnya merupakan pelarut pilihan untuk mengekstraksi semua golongan flavonoid. Biasanya digunakan metanol, etanol, dan propanol. Bahan-bahan segar dapat diekstraksi dengan pelarut alkohol absolut. Bahan-bahan kering dan berkayu dapat digunakan alkohol berair (Harborne, 1987).

  Glikosida flavonoid kurang larut dalam pelarut organik dan lebih mudah larut dalam air dibanding bentuk aglikonnya. Pengekstraksian kembali larutan dalam air dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar sering kali bermanfaat untuk memisahkan bentuk aglikon dari senyawa yang lebih polar. Etil asetat merupakan pelarut yang baik untuk menangani katekin dan proantosianidin dengan cara ini (Robinson, 1995).

C. Metode Penyarian

  Metode penyarian ada beberapa macam:

1. Maserasi dan remaserasi

  Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Pada saat proses maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang pekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi umumnya digunakan untuk simplisia yang tidak keras, dan tidak kompak (Anonim, 1986).

  Remaserasi adalah modifikasi cara penyarian maserasi. Pada proses remaserasi cairan penyari dibagi 2. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua (Anonim, 1986).

  2. Perkolasi

  Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang mempunyai konsentrasi tinggi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah sehingga akan meningkatkan derajat konsentrasi. Perkolasi umumnya digunakan untuk menyari simplisia keras dan kompak (Anonim, 1986).

  3. Infundasi

  Infundasi adalah metode penyarian yang menggunakan penyari air dengan pemanasan pada suhu 90 ºC selama 15 menit. Metode ini digunakan untuk menyari simplisia yang larut dalam air dan tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986).

  4. Penyarian berkesinambungan

  Pada metode penyarian ini cairan penyari dididihkan sehingga akan menguap dan mengembun karena adanya pendingin. Cairan penyari yang mengembun akan turun membasahi simplisia, demikian seterusnya. Metode penyarian ini sesuai untuk simplisia yang bahan aktifnya tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986).

• • D. Radikal Hidroksil (HO )

  1. Pengertian radikal hidroksil

• Radikal hidroksil (HO ) adalah radikal oksigen yang diketahui paling reaktif. Radikal hidroksil memilki standar potensial reduksi positif yang tinggi yaitu 2,31 V. Radikal hidroksil bereaksi sangat cepat dengan hampir semua tipe molekul yang ditemukan dalam sel hidup seperti gula, asam amino, fosfolipid, basa Deoxyribose Nucleic Acid (DNA), dan asam organik (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Karena sangat reaktif, efek radikal ini hanya berlangsung di daerah yang dekat dengan tempat terbentuknya, dan dalam kondisi fisiologik normal tidak ditemukan radikal hidroksil dalam kadar yang besar (Gitawati, 1995).

  2. Pembentukan radikal hidroksil

  Radikal hidroksil dapat dihasilkan dari reaksi fisi homolitik ikatan O-O

  2

  2

  pada H O yang dapat terjadi karena pengaruh panas atau radiasi ionisasi. Selain itu, radikal hidroksil juga dapat terbentuk dari H

  2 O 2 dengan adanya ion-ion logam

2 O

• 1
• 1

  EDTA merupakan ligan yang baik untuk digunakan dalam reagen Fenton (Halliwell dan Gutteridge, 1999).

  Reaksi Fenton merupakan reaksi yang penting untuk menghasilkan radikal bebas hidroksil. Dalam reaksi Fenton ion ferro (Fe

  2+

  ) akan bereaksi dengan hidrogen peroksida (H

  2

  ) menghasilkan radikal hidroksil. Kecepatan reaksi Fe

  2+

  dengan H

  2 O 2 adalah rendah yaitu kurang dari 100 M

  s

  , oleh karena itu untuk meningkatkan kecepatan reaksinya perlu ditambah dengan suatu ligan.

3. Metode deteksi radikal hidroksil

  Macam-macam metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil dapat dilihat pada tabel I di bawah ini:

  1. Metode pemucatan

• ) tetapi tidak bereaksi dengan O

  p -

  nitrosodimetilanilin (p-NDA)

  p -nitrosodimetilanilin bereaksi cepat dengan radikal

• atau

  hidroksil (HO

  2 

  singlet oksigen. Reaksi ini akan diikuti pengurangan warna kuning (pemucatan).

  2. Metode deoksiribosa Reaksi antara radikal hidroksil dengan deoksiribosa menghasilkan produk senyawa tertentu, lalu dipanaskan dengan tiobarbiturat pada pH rendah akan menghasilkan warna.

  3. Metode triptofan Reaksi antara radikal hidroksil dengan triptofan menghasilkan satu set produk yang khas.

  4. Metode dimetilsulfoksida (DMSO)

  Radikal hidroksil bereaksi dengan dimetilsulfoksida (DMSO) menghasilkan senyawa: _{H 3 C S C H O H 3 O}

  Perubahan senyawa di atas menghasilkan produk- produk antara lain gas metana yang dapat dideteksi

  

Tabel I. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil (Bors et al., 1979)

No Metode Prinsip Metode

E. Metode Deoksiribosa

  Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan unsur gula lima karbon yang terdapat dalam DNA (Page, 1989). Deoksiribosa dapat didegradasi oleh radikal hidroksil baik yang dihasilkan oleh radiasi maupun oleh reaksi Fenton (Halliwell et al., 1987). Struktur deoksiribosa dapat dilihat pada gambar 4 berikut:

  

Gambar 4. Struktur deoksiribosa

  Metode deoksiribosa terdiri dari dua tahap, yaitu (Halliwell et al., 1987): 1. Tahap pembentukan radikal hidroksil.

  Radikal hidroksil dihasilkan dari reaksi Fenton dengan inkubasi pada 37

  3

  2

  2

º C selama 30 menit. Reagen Fenton terdiri dari FeCl , EDTA, H O , dan asam

  askorbat (vitamin C). Reaksi pembentukan radikal hidroksil digambarkan sebagai berikut:

  3+ 2+

  Fe - EDTA + vitamin C - EDTA + vitamin C teroksidasi → Fe

  2+ 3+ •

  2

  → Fe Penambahan EDTA (sebagai ligan) berfungsi untuk meningkatkan

2 Fe - EDTA + H O - EDTA + OH¯ + HO

  2+

  konstante kecepatan reaksi antara Fe dengan H

  2 O 2 (Halliwell dan Gutteridge,

  1999). Vitamin C (asam askorbat) berfungsi untuk mempercepat proses reduksi

  3+ 2+ Fe menjadi Fe sehingga akan mempercepat terbentuknya radikal hidroksil.

  2. Tahap degradasi deoksiribosa Penyerangan radikal hidroksil terhadap deoksiribosa akan menyebabkan deoksiribosa terdegradasi menjadi beberapa produk karbonil. Radikal hidroksil akan menyerang deoksiribosa dengan cara abstraksi (pemisahan) hidrogen dan membentuk suatu radikal deoksiribosa (gambar 5) yang dengan adanya oksigen akan secara cepat diubah menjadi radikal gula peroksil (gambar 6). _{HO H C 2 O _ O} HO _O

  H O _{2 H 2 C O} HO _{H O H H}

• _{HO H} Deoksiribosa _HO

  

Gambar 5. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa

_{H C 2 O O H} HO _{H C O 2 O H HO} O O + _{HO OO} Radikal Gula Peroksil

  

Gambar 6. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil

  Selanjutnya, radikal gula peroksil ini akan mengalami serangkaian reaksi yang meliputi disproporsionasi, penataan ulang, eliminasi air, dan pemecahan ikatan C–C sehingga menghasilkan beberapa macam produk karbonil. Produk karbonil yang dihasilkan jika dipanaskan di bawah kondisi asam akan membentuk malondialdehid (MDA) (gambar 7). _{O O}

  

H H

Gambar 7 . Struktur malondialdehid (MDA)

  MDA dapat dideteksi melalui kemampuannya untuk bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) membentuk suatu kromogen berwarna merah muda (pink) yang absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm (Halliwell et al., 1987).

  Molekul lain yang memiliki kemampuan untuk bereaksi dengan radikal hidroksil dapat ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Molekul ini dapat berkompetisi dengan deoksiribosa supaya dapat bereaksi dengan radikal hidroksil. Hal ini sangat bergantung dari konstante kecepatan reaksinya dengan radikal hidroksil dan juga konsentrasi relatif deoksiribosa. Jika kecepatan reaksi molekul ini lebih cepat dibandingkan kecepatan reaksi deoksiribosa dengan radikal hidroksil, maka molekul ini dapat berfungsi untuk menurunkan kecepatan degradasi deoksiribosa (Halliwell et al., 1987).

F. Antioksidan

  Dalam bidang kimia yang dimaksud dengan antioksidan adalah suatu senyawa atau bahan kimia yang dapat menghambat proses oksidasi. Pada umumnya senyawa-senyawa tersebut merupakan suatu reduktan, yakni atom atau