Penetapan Kadar Cefadroxil Dalam Sediaan Kapsul Dengan Nama Dagang Dan Generik Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan pada Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara pada bulan Februari sampai Mei tahun 2012.
3.2 Alat-alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen
KCKT lengkap (Shimadzu) dengan pompa, degasser, penyuntik mikroliter (50µl),
kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis, wadah fase gerak,
vial, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA – P604 – BN), neraca
analitik (Mettler Toledo), membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose
nitrate membran filter 0,45 µm.
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah metanol grade for HPLC (E.Merck®),
akuabides (Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU), cefadroxil BPFI,
cefadroxil baku pabrik, kapsul cefadroxil 500 mg (PT Dexa Medica), kapsul
cefadroxil 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul cefadroxil 500 mg (PT
Bernofarm), kapsul cefadroxil 500 mg (PT Sanbe Farma), kapsul Longcef 500
mg (PT Dankos), kapsul Librocef 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul Alxil 500
mg (PT Bernofarm), kapsul Cefat 500 mg (PT Sanbe Farma).
Universitas Sumatera Utara
3.4 Pengambilan Sampel
Menurut Sudjana (2005), pengambilan sampel dilakukan secara purposif
yaitu tanpa membandingkan satu tempat dengan tempat yang lain karena semua
sampel dianggap homogen. Pengambilan sampel di Apotek K-24 dan Apotek
Serdang Farma Medan.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Pembuatan Fase Gerak
Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5
µ m dan diawaudarakan selama 30 menit. Akuabides 500 ml disaring dengan
menggunakan cellulose nitrate membrane filter 0,45 µm dan diawaudarakan
selama 30 menit.
3.5.2 Prosedur Analisis
3.5.2.1 Penyiapan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimadzu VP-ODS
(250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan
mengalir selama 30 menit dengan laju alir 1 ml/menit sampai diperoleh garis alas
yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
3.5.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak yang Optimum
Pada kondisi kromatografi komposisi fase gerak divariasikan untuk
mendapatkan hasil analisis yang optimum. Perbandingan fase gerak metanol:air
yang divariasikan adalah 50:50, 60:40, 70:30 dengan laju alir 1 ml/menit. Kondisi
kromatografi yang memberikan tailing faktor paling kecil dan theoretical plate
paling besar yang akan dipilih dan digunakan dalam penelitian ini.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Analisis Kualitatif Menggunakan KCKT
3.5.3.1 Uji Identifikasi cefadroxil menggunakan KCKT
Sampel cefadroxil dengan konsentrasi 10 µg/ml diinjeksikan sebanyak 20
µ l, dianalisis pada kondisi KCKT dengan perbandingan fase gerak metanol:air
(60:40) dan laju alir 1 ml/menit serta panjang gelombang 264 nm. Selanjutnya
untuk identifikasi, pada larutan sampel cefadroxil tersebut ditambahkan sedikit
larutan cefadroxil BPFI (spiking) kemudian diinjeksikan dan dianalisis kembali
pada kondisi KCKT yang sama. Diamati kembali luas area dan dibandingkan
antara kromatogram hasil spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum
spiking. Sampel dinyatakan mengandung cefadroxil, jika terjadi peningkatan
tinggi puncak dan luas area pada kromatogram hasil spiking.
3.5.4 Analisis Kuantitatif
3.5.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Cefadroxil BPFI
Ditimbang seksama sejumlah 50,0 mg cefadroxil BPFI, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga
garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 µg/ml (LIB I).
3.5.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Cefadroxil BPFI
Dipipet LIB I sebanyak 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; dan 0,6 ml,
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis
tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20
µg/ml 25 µg/ml, dan 30 µg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan
membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µ l
dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm. Dari luas area yang diperoleh
pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi kemudian dihitung persamaan garis
Universitas Sumatera Utara
regresi dan faktor korelasinya.
3.5.4.3 Penetapan Kadar Sampel
Ditimbang 20 kapsul untuk masing-masing jenis kapsul, kemudian digerus
homogen dan ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 500 mg
cefadroxil, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan
dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan
konsentrasi 10000 µg/ml, dikocok ± 5 menit, kemudian disaring dengan kertas
saring, ± 5 ml filtrat pertama dibuang. Dipipet 0,05 ml filtrat, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 50 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga diperoleh
larutan dengan konsentrasi 10 µg/ml. Dikocok ± 5 menit lalu disaring dengan
membran filter PTFE 0,2 µm. Diinjeksikan sebanyak 20 µ l ke sistem KCKT dan
dideteksi pada panjang gelombang 264 nm dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40), laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali perlakuan
untuk setiap sampel.
Kadar dapat dihitung dengan mensubstitusikan luas area sampel pada Y
dari persamaan regresi : Y = ax + b.
3.5.4.4 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Menurut Harmita (2004), rumus yang digunakan untuk menghitung Standar
Deviasi (SD) adalah :
SD =
∑ (X − X )
2
n −1
Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk
menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
Universitas Sumatera Utara
t hitung =
X−X
SD / n
Dengan dasar penolakan apabila t hitung
≥ t tabel , pada taraf kepercayaan 99%
dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1.
Keterangan :
SD
= Standar deviasi
X
= Kadar dalam satu perlakuan
X
= Kadar rata-rata dalam satu sampel
n
= Jumlah perlakuan
Menurut Wibisono (2005), untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan
rumus:
µ = X ± t (1−1 / 2α ) dk x
SD
n
Keterangan:
μ = Kadar sebenarnya
X = Kadar sampel
n = Jumlah perlakuan
t = Harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan
dk= Derajat kebebasan
3.5.5 Validasi Metode
3.5.5.1 Akurasi (kecermatan)
Ditimbang 20 kapsul cefadroxil yang mengandung kadar zat berkhasiat
500 mg/kapsul kemudian ditentukan pada rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%.
Ditimbang serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat lalu
dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Ditimbang
Universitas Sumatera Utara
lagi serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat dan 30% bahan
baku lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel.
Dilakukan 3 kali replikasi untuk masing-masing rentang spesifik tersebut.
Menurut Harmita (2004), hasil dinyatakan dalam persen perolehan
kembali (% recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:
% Perolehan kembali =
CF − CA
x 100 %
C*A
Keterangan :
C F = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran
(µg/ml)
C A = konsentrasi sampel sebenarnya (µg/ml)
C* A = konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml)
3.5.5.2 Presisi (keseksamaan)
Untuk menguji data presisi (RSD), diambil rata-rata dari data % perolehan
kembali (9 kali replikasi) kemudian dihitung standar deviasi. Setelah itu, dihitung
% RSD dengan cara standar deviasi dibagi rata-rata dari % perolehan kembali
kemudian dikali 100%.
Menurut Gandjar dan Rohman (2007), nilai RSD dirumuskan dengan:
RSD =
SD
x 100%
X
Keterangan:
RSD
= Relatif Standar Deviasi (%)
SD
= Standar deviasi
X
= Kadar rata-rata sampel
Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :
Universitas Sumatera Utara
SD =
∑ (X − X )
2
(n − 1)
Dimana :
X
= nilai dari masing-masing pengukuran
X
= rata-rata (mean) dari pengukuran
n
= banyaknya data
3.5.5.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung dari
persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Menurut Ephstein (2004),
Batas Deteksi (Limit Of Detection/ LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of
Quantitation/ LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Sy / x =
∑
(Y − Yi) 2
n− 2
LOD =
3 x Sy / x
Slope
LOQ =
10 x Sy / x
Slope
Keterangan:
Sy/x
= Standar Deviasi
Slope = Derajat Kemiringan
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan komposisi fase gerak untuk mendapatkan kondisi kromatogra
fi yang optimal
Pada awal penelitian ini dilakukan optimasi untuk mendapatkan kondisi
kromatografi yang optimal. Adapun perbandingan fase gerak yang dioptimasi
adalah metanol:air dengan perbandingan 50:50, 60:40, 70:30, pada laju alir 1
ml/menit, deteksi dilakukan pada panjang gelombang 264 nm. Dari hasil optimasi
menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) diperoleh perbandingan
fase gerak yang terbaik yaitu pada perbandingan metanol:air (60:40). Pemilihan
fase gerak yang terbaik ini didasarkan pada faktor tailing yang paling kecil dan
nilai theoretical plate yang paling besar. Hubungan antara pengaruh komposisi
fase gerak terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah
ini. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tabel 1 Pengaruh Komposisi Fase Gerak terhadap Parameter Kromatogram
Perbandingan Fase
Gerak
Metanol:Air
50:50
Waktu Retensi
(menit)
Area
Theoretical
plate
Tailing
factor
3,235
2663879
3699,270
1,460
60:40
3,174
306853
5700,789
1,128
70:30
3,155
84218
4456,366
1,206
4.2 Analisis Kualitatif
Dari hasil optimasi pada penentuan kondisi kromatografi yang terbaik
untuk cefadroxil diperoleh komposisi fase gerak metanol:air 60:40, laju alir 1
ml/menit. Untuk mengetahui bahwa sampel yang dianalisis mengandung
Universitas Sumatera Utara
cefadroxil maka dilakukan spiking yaitu menambahkan bahan baku ke dalam
sampel pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara:
Pertama, dilakukan proses kromatografi sampel tanpa penambahan baku. Kedua,
sampel dengan penambahan bahan baku dilakukan proses kromatografi. Hasil
kromatogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 4 Kromatogram kapsul cefadroxil secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20
µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 5
Kromatogram hasil spike secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase
gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume
penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Dari kromatogram diatas dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan luas area
dan tinggi puncak pada kromatogram setelah penambahan baku dibandingkan
dengan sebelum penambahan bahan baku maka dapat diidentifikasi bahwa sampel
mengandung cefadroxil (Johnson dan Stevenson, 1991).
4.3 Analisis Kuantitatif
4.3.1 Penentuan Kurva Kalibrasi
Penentuan kurva kalibrasi cefadroxil BPFI ditentukan berdasarkan luas
area pada konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, 30 µg/ml, diperoleh hubungan yang linier
dengan koefisien korelasi, r = 0,9996 dan persamaan regresi Y = 25204,99429 X
+ 24450,59993. Nilai r ≥ 0,995 menunjukkan adanya korelasi linier yang
Universitas Sumatera Utara
menyatakan adanya hubungan antara X dan Y (Moffat, dkk., 2005). Hasil
penentuan kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.
Gambar 6 Kurva kalibrasi Cefadroxil BPFI secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20
µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
4.3.2 Penetapan Kadar Analit dalam Sampel yang dianalisis
Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama
dagang dan generik dapat dilihat pada Tabel 2 di bawah ini.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2 Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama
dagang dan generik
Nama Sediaan
Kadar Cefadroxil (%)
1
Kapsul Cefadroxil (PT Dexa Medica)
118,06 ± 1,51
2
Kapsul Cefadroxil (PT Hexpharm Jaya)
117,56 ± 0,97
3
Kapsul Cefadroxil (PT Bernofarm)
114.41 ± 1,34
4
Kapsul Cefadroxil (PT Sanbe Farma)
118,87 ± 0,64
5
Kapsul Longcef (PT Dankos)
96,25 ± 0,58
6
Kapsul Librocef ( PT Hexpharm Jaya)
102,94 ± 1,57
7
Kapsul Alxil (PT Bernofarm)
116,03 ± 1,24
8
Kapsul Cefat (PT Sanbe Farma)
110,88 ± 1,62
Dalam perdagangan, sediaan kapsul cefadroxil dengan nama dagang
mempunyai harga yang bisa 5 sampai 10 kali lebih mahal dibandingkan dengan
nama generik. Dari hasil analisis, diperoleh bahwa sediaan kapsul cefadroxil baik
nama dagang maupun nama generik yang ditentukan kadarnya berdasarkan luas
area, keseluruhannya memenuhi persyaratan yang ditetapkan dalam USP Edisi 30
tahun 2007 yaitu mengandung cefadroxil tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih
dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Namun, terdapat satu jenis
sediaan kapsul cefadroxil yang mempunyai kadar yang paling mendekati batas
minimal yang ditetapkan dalam USP Edisi 30 Tahun 2007.
4.4 Hasil Uji Validasi
Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode dengan metode standar
adisi terhadap sampel kapsul Librocef (PT Hexpharm Jaya) yang meliputi uji
akurasi dengan parameter % recovery dan uji presisi dengan parameter RSD
Universitas Sumatera Utara
(Relative Standard Deviasi), LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of
Quantitation).
Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan dengan membuat tiga
konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masingmasing dengan tiga replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit
dan 30% baku pembanding (Harmita, 2004).
Data hasil uji validasi, parameter akurasi dan presisi cefadroxil dengan
metode adisi standar dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3
N
o
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Rentang
Spesifik
(%)
Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter Akurasi, Presisi, Batas
Deteksi (LOD), Batas Kuantitasi (LOQ) Cefadroxil pada Kapsul Libro
cef ( PT Hexpharm Jaya) dengan Menggunakan Metode Adisi Standar
Baku yang
ditambahkan
( µg/ml )
Luas Area
Konsentrasi ( µg/ml )
Sebelum
Penambah
an
Sesudah
Penambah
an
Sebelum
Penambaha
n
Setelah
Penambaha
n
80
2,3815
190671
80
2,3815
191920
80
2,3815
194298
100
2,9769
226923
100
2,9769
231778
100
2,9769
232275
120
3,5723
243132
120
3,5723
243855
120
3,5723
250770
Kadar rata – rata (%) Recovery
Standar Deviasi
Relative Standar Deviasi (%)
Batas Deteksi (LOD) (µg/ml)
Batas Kuantitasi (LOQ) (µg/ml)
250185
250962
254171
301968
307053
307263
332493
334905
341527
6,5947
6,6443
6,7386
8,0330
8,2256
8,2454
8,6761
8,7048
8,9791
8,9559
8,9868
9,1141
11,0104
11,2122
11,2205
12,2215
12,3172
12,5799
Recovery
(%)
99,15
98,36
99,75
100,02
100,33
99,94
99,25
101,12
100,79
= 99,86
= 0,8558
= 0,86
= 0,8974
= 2,9915
Dari tabel di atas diperoleh hasil pengujian akurasi dengan kadar rata-rata
% recovery 99,86%. Hasil ini dapat diterima karena memenuhi syarat uji akurasi,
bahwa rentang rata-rata % recovery ialah 98-102%. Maka dapat disimpulkan
bahwa metode ini mempunyai akurasi yang baik (Epshtein, 2004).
Universitas Sumatera Utara
Hasil uji presisi dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi)
diperoleh 0,86%, persyaratan nilai RSD yang ditentukan adalah < 2%. Maka dapat
disimpulkan bahwa metode analisis mempunyai presisi yang baik (Harmita,
2004).
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang
diperoleh dalam kurva kalibrasi. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LOD
0,8974 µg/ml dan nilai LOQ 2,9915 µg/ml.
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penetapan kadar Cefadroxil dalam sediaan kapsul dapat dilakukan secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menggunakan kolom Shimadzu VPODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40), laju
alir 1 ml/ menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Kadar cefadroxil dalam kapsul yang dianalisis dari sediaan kapsul yang
terdapat di pasaran dengan kondisi kromatografi yang terpilih diperoleh hasil yang
memenuhi persyaratan kadar pada USP edisi 30 Tahun 2007 yaitu mengandung
cefadroxil tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 120,0 % dari jumlah yang
tertera pada etiket.
5.2 Saran
Disarankan kepada industri farmasi dan Badan Pengawasan Obat dan
Makanan (BPOM) untuk menggunakan perbandingan fase gerak ini sebagai fase
gerak alterrnatif dalam menetapkan kadar cefadroxil.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan pada Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara pada bulan Februari sampai Mei tahun 2012.
3.2 Alat-alat
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen
KCKT lengkap (Shimadzu) dengan pompa, degasser, penyuntik mikroliter (50µl),
kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis, wadah fase gerak,
vial, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA – P604 – BN), neraca
analitik (Mettler Toledo), membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm, cellulose
nitrate membran filter 0,45 µm.
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah metanol grade for HPLC (E.Merck®),
akuabides (Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU), cefadroxil BPFI,
cefadroxil baku pabrik, kapsul cefadroxil 500 mg (PT Dexa Medica), kapsul
cefadroxil 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul cefadroxil 500 mg (PT
Bernofarm), kapsul cefadroxil 500 mg (PT Sanbe Farma), kapsul Longcef 500
mg (PT Dankos), kapsul Librocef 500 mg (PT Hexpharm Jaya), kapsul Alxil 500
mg (PT Bernofarm), kapsul Cefat 500 mg (PT Sanbe Farma).
Universitas Sumatera Utara
3.4 Pengambilan Sampel
Menurut Sudjana (2005), pengambilan sampel dilakukan secara purposif
yaitu tanpa membandingkan satu tempat dengan tempat yang lain karena semua
sampel dianggap homogen. Pengambilan sampel di Apotek K-24 dan Apotek
Serdang Farma Medan.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Pembuatan Fase Gerak
Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5
µ m dan diawaudarakan selama 30 menit. Akuabides 500 ml disaring dengan
menggunakan cellulose nitrate membrane filter 0,45 µm dan diawaudarakan
selama 30 menit.
3.5.2 Prosedur Analisis
3.5.2.1 Penyiapan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimadzu VP-ODS
(250 x 4,6 mm), detektor UV-Vis dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan
mengalir selama 30 menit dengan laju alir 1 ml/menit sampai diperoleh garis alas
yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
3.5.2.2 Penentuan Perbandingan Fase Gerak yang Optimum
Pada kondisi kromatografi komposisi fase gerak divariasikan untuk
mendapatkan hasil analisis yang optimum. Perbandingan fase gerak metanol:air
yang divariasikan adalah 50:50, 60:40, 70:30 dengan laju alir 1 ml/menit. Kondisi
kromatografi yang memberikan tailing faktor paling kecil dan theoretical plate
paling besar yang akan dipilih dan digunakan dalam penelitian ini.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Analisis Kualitatif Menggunakan KCKT
3.5.3.1 Uji Identifikasi cefadroxil menggunakan KCKT
Sampel cefadroxil dengan konsentrasi 10 µg/ml diinjeksikan sebanyak 20
µ l, dianalisis pada kondisi KCKT dengan perbandingan fase gerak metanol:air
(60:40) dan laju alir 1 ml/menit serta panjang gelombang 264 nm. Selanjutnya
untuk identifikasi, pada larutan sampel cefadroxil tersebut ditambahkan sedikit
larutan cefadroxil BPFI (spiking) kemudian diinjeksikan dan dianalisis kembali
pada kondisi KCKT yang sama. Diamati kembali luas area dan dibandingkan
antara kromatogram hasil spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum
spiking. Sampel dinyatakan mengandung cefadroxil, jika terjadi peningkatan
tinggi puncak dan luas area pada kromatogram hasil spiking.
3.5.4 Analisis Kuantitatif
3.5.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Cefadroxil BPFI
Ditimbang seksama sejumlah 50,0 mg cefadroxil BPFI, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga
garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 µg/ml (LIB I).
3.5.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Cefadroxil BPFI
Dipipet LIB I sebanyak 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; dan 0,6 ml,
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis
tanda. Kocok sehingga diperoleh konsentrasi 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20
µg/ml 25 µg/ml, dan 30 µg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan
membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µ l
dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm. Dari luas area yang diperoleh
pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi kemudian dihitung persamaan garis
Universitas Sumatera Utara
regresi dan faktor korelasinya.
3.5.4.3 Penetapan Kadar Sampel
Ditimbang 20 kapsul untuk masing-masing jenis kapsul, kemudian digerus
homogen dan ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 500 mg
cefadroxil, lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan
dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan
konsentrasi 10000 µg/ml, dikocok ± 5 menit, kemudian disaring dengan kertas
saring, ± 5 ml filtrat pertama dibuang. Dipipet 0,05 ml filtrat, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 50 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga diperoleh
larutan dengan konsentrasi 10 µg/ml. Dikocok ± 5 menit lalu disaring dengan
membran filter PTFE 0,2 µm. Diinjeksikan sebanyak 20 µ l ke sistem KCKT dan
dideteksi pada panjang gelombang 264 nm dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40), laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali perlakuan
untuk setiap sampel.
Kadar dapat dihitung dengan mensubstitusikan luas area sampel pada Y
dari persamaan regresi : Y = ax + b.
3.5.4.4 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Menurut Harmita (2004), rumus yang digunakan untuk menghitung Standar
Deviasi (SD) adalah :
SD =
∑ (X − X )
2
n −1
Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk
menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
Universitas Sumatera Utara
t hitung =
X−X
SD / n
Dengan dasar penolakan apabila t hitung
≥ t tabel , pada taraf kepercayaan 99%
dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1.
Keterangan :
SD
= Standar deviasi
X
= Kadar dalam satu perlakuan
X
= Kadar rata-rata dalam satu sampel
n
= Jumlah perlakuan
Menurut Wibisono (2005), untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan
rumus:
µ = X ± t (1−1 / 2α ) dk x
SD
n
Keterangan:
μ = Kadar sebenarnya
X = Kadar sampel
n = Jumlah perlakuan
t = Harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan
dk= Derajat kebebasan
3.5.5 Validasi Metode
3.5.5.1 Akurasi (kecermatan)
Ditimbang 20 kapsul cefadroxil yang mengandung kadar zat berkhasiat
500 mg/kapsul kemudian ditentukan pada rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%.
Ditimbang serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat lalu
dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Ditimbang
Universitas Sumatera Utara
lagi serbuk yang mengandung 70% analit dari kadar zat berkhasiat dan 30% bahan
baku lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel.
Dilakukan 3 kali replikasi untuk masing-masing rentang spesifik tersebut.
Menurut Harmita (2004), hasil dinyatakan dalam persen perolehan
kembali (% recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:
% Perolehan kembali =
CF − CA
x 100 %
C*A
Keterangan :
C F = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran
(µg/ml)
C A = konsentrasi sampel sebenarnya (µg/ml)
C* A = konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml)
3.5.5.2 Presisi (keseksamaan)
Untuk menguji data presisi (RSD), diambil rata-rata dari data % perolehan
kembali (9 kali replikasi) kemudian dihitung standar deviasi. Setelah itu, dihitung
% RSD dengan cara standar deviasi dibagi rata-rata dari % perolehan kembali
kemudian dikali 100%.
Menurut Gandjar dan Rohman (2007), nilai RSD dirumuskan dengan:
RSD =
SD
x 100%
X
Keterangan:
RSD
= Relatif Standar Deviasi (%)
SD
= Standar deviasi
X
= Kadar rata-rata sampel
Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :
Universitas Sumatera Utara
SD =
∑ (X − X )
2
(n − 1)
Dimana :
X
= nilai dari masing-masing pengukuran
X
= rata-rata (mean) dari pengukuran
n
= banyaknya data
3.5.5.3 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung dari
persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Menurut Ephstein (2004),
Batas Deteksi (Limit Of Detection/ LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of
Quantitation/ LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Sy / x =
∑
(Y − Yi) 2
n− 2
LOD =
3 x Sy / x
Slope
LOQ =
10 x Sy / x
Slope
Keterangan:
Sy/x
= Standar Deviasi
Slope = Derajat Kemiringan
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan komposisi fase gerak untuk mendapatkan kondisi kromatogra
fi yang optimal
Pada awal penelitian ini dilakukan optimasi untuk mendapatkan kondisi
kromatografi yang optimal. Adapun perbandingan fase gerak yang dioptimasi
adalah metanol:air dengan perbandingan 50:50, 60:40, 70:30, pada laju alir 1
ml/menit, deteksi dilakukan pada panjang gelombang 264 nm. Dari hasil optimasi
menggunakan kolom Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) diperoleh perbandingan
fase gerak yang terbaik yaitu pada perbandingan metanol:air (60:40). Pemilihan
fase gerak yang terbaik ini didasarkan pada faktor tailing yang paling kecil dan
nilai theoretical plate yang paling besar. Hubungan antara pengaruh komposisi
fase gerak terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah
ini. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 1.
Tabel 1 Pengaruh Komposisi Fase Gerak terhadap Parameter Kromatogram
Perbandingan Fase
Gerak
Metanol:Air
50:50
Waktu Retensi
(menit)
Area
Theoretical
plate
Tailing
factor
3,235
2663879
3699,270
1,460
60:40
3,174
306853
5700,789
1,128
70:30
3,155
84218
4456,366
1,206
4.2 Analisis Kualitatif
Dari hasil optimasi pada penentuan kondisi kromatografi yang terbaik
untuk cefadroxil diperoleh komposisi fase gerak metanol:air 60:40, laju alir 1
ml/menit. Untuk mengetahui bahwa sampel yang dianalisis mengandung
Universitas Sumatera Utara
cefadroxil maka dilakukan spiking yaitu menambahkan bahan baku ke dalam
sampel pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara:
Pertama, dilakukan proses kromatografi sampel tanpa penambahan baku. Kedua,
sampel dengan penambahan bahan baku dilakukan proses kromatografi. Hasil
kromatogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 4 Kromatogram kapsul cefadroxil secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20
µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 5
Kromatogram hasil spike secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase
gerak metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume
penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Dari kromatogram diatas dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan luas area
dan tinggi puncak pada kromatogram setelah penambahan baku dibandingkan
dengan sebelum penambahan bahan baku maka dapat diidentifikasi bahwa sampel
mengandung cefadroxil (Johnson dan Stevenson, 1991).
4.3 Analisis Kuantitatif
4.3.1 Penentuan Kurva Kalibrasi
Penentuan kurva kalibrasi cefadroxil BPFI ditentukan berdasarkan luas
area pada konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, 30 µg/ml, diperoleh hubungan yang linier
dengan koefisien korelasi, r = 0,9996 dan persamaan regresi Y = 25204,99429 X
+ 24450,59993. Nilai r ≥ 0,995 menunjukkan adanya korelasi linier yang
Universitas Sumatera Utara
menyatakan adanya hubungan antara X dan Y (Moffat, dkk., 2005). Hasil
penentuan kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.
Gambar 6 Kurva kalibrasi Cefadroxil BPFI secara KCKT menggunakan kolom
Shimadzu VP-ODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak
metanol:air (60:40) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20
µl dan deteksi pada panjang gelombang 264 nm.
4.3.2 Penetapan Kadar Analit dalam Sampel yang dianalisis
Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama
dagang dan generik dapat dilihat pada Tabel 2 di bawah ini.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2 Hasil penetapan kadar cefadroxil dalam sediaan kapsul dengan nama
dagang dan generik
Nama Sediaan
Kadar Cefadroxil (%)
1
Kapsul Cefadroxil (PT Dexa Medica)
118,06 ± 1,51
2
Kapsul Cefadroxil (PT Hexpharm Jaya)
117,56 ± 0,97
3
Kapsul Cefadroxil (PT Bernofarm)
114.41 ± 1,34
4
Kapsul Cefadroxil (PT Sanbe Farma)
118,87 ± 0,64
5
Kapsul Longcef (PT Dankos)
96,25 ± 0,58
6
Kapsul Librocef ( PT Hexpharm Jaya)
102,94 ± 1,57
7
Kapsul Alxil (PT Bernofarm)
116,03 ± 1,24
8
Kapsul Cefat (PT Sanbe Farma)
110,88 ± 1,62
Dalam perdagangan, sediaan kapsul cefadroxil dengan nama dagang
mempunyai harga yang bisa 5 sampai 10 kali lebih mahal dibandingkan dengan
nama generik. Dari hasil analisis, diperoleh bahwa sediaan kapsul cefadroxil baik
nama dagang maupun nama generik yang ditentukan kadarnya berdasarkan luas
area, keseluruhannya memenuhi persyaratan yang ditetapkan dalam USP Edisi 30
tahun 2007 yaitu mengandung cefadroxil tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih
dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Namun, terdapat satu jenis
sediaan kapsul cefadroxil yang mempunyai kadar yang paling mendekati batas
minimal yang ditetapkan dalam USP Edisi 30 Tahun 2007.
4.4 Hasil Uji Validasi
Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode dengan metode standar
adisi terhadap sampel kapsul Librocef (PT Hexpharm Jaya) yang meliputi uji
akurasi dengan parameter % recovery dan uji presisi dengan parameter RSD
Universitas Sumatera Utara
(Relative Standard Deviasi), LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of
Quantitation).
Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan dengan membuat tiga
konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%, masingmasing dengan tiga replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit
dan 30% baku pembanding (Harmita, 2004).
Data hasil uji validasi, parameter akurasi dan presisi cefadroxil dengan
metode adisi standar dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3
N
o
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Rentang
Spesifik
(%)
Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter Akurasi, Presisi, Batas
Deteksi (LOD), Batas Kuantitasi (LOQ) Cefadroxil pada Kapsul Libro
cef ( PT Hexpharm Jaya) dengan Menggunakan Metode Adisi Standar
Baku yang
ditambahkan
( µg/ml )
Luas Area
Konsentrasi ( µg/ml )
Sebelum
Penambah
an
Sesudah
Penambah
an
Sebelum
Penambaha
n
Setelah
Penambaha
n
80
2,3815
190671
80
2,3815
191920
80
2,3815
194298
100
2,9769
226923
100
2,9769
231778
100
2,9769
232275
120
3,5723
243132
120
3,5723
243855
120
3,5723
250770
Kadar rata – rata (%) Recovery
Standar Deviasi
Relative Standar Deviasi (%)
Batas Deteksi (LOD) (µg/ml)
Batas Kuantitasi (LOQ) (µg/ml)
250185
250962
254171
301968
307053
307263
332493
334905
341527
6,5947
6,6443
6,7386
8,0330
8,2256
8,2454
8,6761
8,7048
8,9791
8,9559
8,9868
9,1141
11,0104
11,2122
11,2205
12,2215
12,3172
12,5799
Recovery
(%)
99,15
98,36
99,75
100,02
100,33
99,94
99,25
101,12
100,79
= 99,86
= 0,8558
= 0,86
= 0,8974
= 2,9915
Dari tabel di atas diperoleh hasil pengujian akurasi dengan kadar rata-rata
% recovery 99,86%. Hasil ini dapat diterima karena memenuhi syarat uji akurasi,
bahwa rentang rata-rata % recovery ialah 98-102%. Maka dapat disimpulkan
bahwa metode ini mempunyai akurasi yang baik (Epshtein, 2004).
Universitas Sumatera Utara
Hasil uji presisi dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi)
diperoleh 0,86%, persyaratan nilai RSD yang ditentukan adalah < 2%. Maka dapat
disimpulkan bahwa metode analisis mempunyai presisi yang baik (Harmita,
2004).
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang
diperoleh dalam kurva kalibrasi. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LOD
0,8974 µg/ml dan nilai LOQ 2,9915 µg/ml.
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penetapan kadar Cefadroxil dalam sediaan kapsul dapat dilakukan secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menggunakan kolom Shimadzu VPODS (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak metanol:air (60:40), laju
alir 1 ml/ menit, dan dideteksi pada panjang gelombang 264 nm.
Kadar cefadroxil dalam kapsul yang dianalisis dari sediaan kapsul yang
terdapat di pasaran dengan kondisi kromatografi yang terpilih diperoleh hasil yang
memenuhi persyaratan kadar pada USP edisi 30 Tahun 2007 yaitu mengandung
cefadroxil tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 120,0 % dari jumlah yang
tertera pada etiket.
5.2 Saran
Disarankan kepada industri farmasi dan Badan Pengawasan Obat dan
Makanan (BPOM) untuk menggunakan perbandingan fase gerak ini sebagai fase
gerak alterrnatif dalam menetapkan kadar cefadroxil.
Universitas Sumatera Utara