Penetapan Kadar Cefadroxil Dalam Sediaan Kapsul Dengan Nama Dagang Dan Generik Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Cefadroxil
2.1.1 Sifat fisikokimia
Menurut USP (2007), sifat fisikokimia cefadroxil adalah sebagai berikut:
Rumus struktur :
Gambar 1 Struktur cefadroxil
Nama Kimia
: 5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-1-carbocylic acid,7-[[amino(4hydroxyphenyl) acetyl] amino]-3-methyl-8-oxo-,monohydrate
[6R- [6α,7β(R*)]]-
Rumus Molekul
: C 16 H 17 N 3 O 5 S
Berat Molekul
: 381,40
Pemerian
: Serbuk kristal putih, melebur pada 1970
Kelarutan
: Larut dalam air, tidak larut dalam alkohol, kloroform dan eter
2.1.2 Farmakologi
Cefadroxil termasuk golongan antibiotik ß-laktam generasi pertama dari
sefalosporin dan digunakan untuk pengobatan radang kerongkongan atau sakit
tenggorokan, infeksi saluran kemih dan infeksi kulit (Tjay dan Rahardja, 2007).
Universitas Sumatera Utara
2.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau dalam bentuk molekul kecil atau dalam
bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding
kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan (Rohman, 2009).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan
paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kualitatif, kuantitatif, atau
preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Penggunaan Kromatografi
Menurut Gritter, dkk., (1991) penggunaan kromatografi adalah sebagai berikut:
- Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya
senyawa tertentu dalam cuplikan.
-
Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing
komponen campuran.
- Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran
dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor
yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan
Universitas Sumatera Utara
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Ditjen POM, 1995).
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson,
1991).
Menurut De Lux Putra (2007), kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
− Resolusinya baik
− Mudah melaksanakannya
− Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
− Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya
tidak
begitu
tergantung
pada
keahlian
operator
dan
reprodusibilitasnya lebih baik
− Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
− Waktu analisis umumnya singkat
2.3.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam
fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
Universitas Sumatera Utara
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis
kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.3.2 Komponen KCKT
Gambar 2 Instrument Dasar KCKT
2.3.3 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman,
2007).
2.3.4 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
Universitas Sumatera Utara
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.5 Injektor
Menurut De Lux Putra (2007), ada 3 jenis dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Hentikan aliran/stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak, umumnya sama dengan
yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarutpelarut kromatografi cair. Di samping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran (loop valve)
Injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan
Universitas Sumatera Utara
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak
ke dalam kolom.
Gambar 3 Tipe Injektor Putaran
2.3.6 Kolom
Menurut De Lux Putra (2007), kolom adalah jantung kromatografi.
Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan
kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : diameter khas adalah 2 – 6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat,
umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 – 100 cm.
2.3.7 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan
dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
Universitas Sumatera Utara
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1991).
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacammacam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi
populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa
dalam rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer,
detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan
(Johnson dan Stevenson, 1991).
2.3.8 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan
Stevenson, 1991).
Guna kromatogram:
1. Kualitatif : waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi
yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif : Luas puncak
proporsional dengan jumlah sampel
yang
diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
2.3.9 Fase Gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat
Universitas Sumatera Utara
yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak
(De Lux Putra, 2007).
Menurut De Lux Putra (2007), fase gerak harus:
• Murni, tidak ada pencemar/kontaminan
• Tidak bereaksi dengan pengemas
• Sesuai dengan detektor
• Melarutkan cuplikan
• Mempunyai viskositas rendah
• Tersedia di perdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur
pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara (degassing)
yang ada harus dihilangkan dari pelarut karena udara yang keluar melewati
detektor dapat menghasilkan banyak gangguan sehingga data tidak dapat
digunakan.
2.3.10 Fase Diam
Oktadesil silika (ODS atau C 18 ) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Sekarang ini, gel silika ODS atau fase-fase sejenis seperti gel silika oktil
digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fase-fase lain hanya digunakan
jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat
mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting
Universitas Sumatera Utara
karena matriks sampel
tersebut
menghasilkan
banyak
puncak
yang
mengganggu (Watson, 2009).
2.3.11 Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut De Lux Putra (2007), elusi pada kromatografi cair kinerja
tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).
2. Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya
berubah-ubah
dalam waktu tertentu (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi).
2.3.12 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Menurut Munson (1991), jenis pemisahan KCKT berdasarkan jenis fase
gerak dan fase diamnya dibedakan atas:
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya
silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b. Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang
banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8).
Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril.
2.4 Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
Universitas Sumatera Utara
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut
memenuhi
persyaratan untuk
penggunaannya
(Harmita, 2004).
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi
untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk
mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada
validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi,
linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness).
2.4.1 Akurasi (Kecermatan)
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan
kembali (% recovery) (Harmita, 2004).
2.4.2 Presisi (Keseksamaan)
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diperoleh
dari beberapa kali pengukuran pada sampel yang sama dan biasanya diekspresikan
sebagai Relatif Standar Deviasi (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.3 Batas Deteksi (limit of detection, LOD)
Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan
apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.4 Batas Kuantitasi (limit of quantitation, LOQ)
Universitas Sumatera Utara
Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Cefadroxil
2.1.1 Sifat fisikokimia
Menurut USP (2007), sifat fisikokimia cefadroxil adalah sebagai berikut:
Rumus struktur :
Gambar 1 Struktur cefadroxil
Nama Kimia
: 5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-1-carbocylic acid,7-[[amino(4hydroxyphenyl) acetyl] amino]-3-methyl-8-oxo-,monohydrate
[6R- [6α,7β(R*)]]-
Rumus Molekul
: C 16 H 17 N 3 O 5 S
Berat Molekul
: 381,40
Pemerian
: Serbuk kristal putih, melebur pada 1970
Kelarutan
: Larut dalam air, tidak larut dalam alkohol, kloroform dan eter
2.1.2 Farmakologi
Cefadroxil termasuk golongan antibiotik ß-laktam generasi pertama dari
sefalosporin dan digunakan untuk pengobatan radang kerongkongan atau sakit
tenggorokan, infeksi saluran kemih dan infeksi kulit (Tjay dan Rahardja, 2007).
Universitas Sumatera Utara
2.2 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau dalam bentuk molekul kecil atau dalam
bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding
kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan (Rohman, 2009).
Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan
paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis kualitatif, kuantitatif, atau
preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya.
Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam
(stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.2.1 Penggunaan Kromatografi
Menurut Gritter, dkk., (1991) penggunaan kromatografi adalah sebagai berikut:
- Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya
senyawa tertentu dalam cuplikan.
-
Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing
komponen campuran.
- Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran
dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor
yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan
Universitas Sumatera Utara
secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran (Ditjen POM, 1995).
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson,
1991).
Menurut De Lux Putra (2007), kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
− Resolusinya baik
− Mudah melaksanakannya
− Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
− Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya
tidak
begitu
tergantung
pada
keahlian
operator
dan
reprodusibilitasnya lebih baik
− Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
− Waktu analisis umumnya singkat
2.3.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam
fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan
Universitas Sumatera Utara
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis
kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu
kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.3.2 Komponen KCKT
Gambar 2 Instrument Dasar KCKT
2.3.3 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman,
2007).
2.3.4 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
Universitas Sumatera Utara
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa
dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan (Gandjar
dan Rohman, 2007).
2.3.5 Injektor
Menurut De Lux Putra (2007), ada 3 jenis dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Hentikan aliran/stop flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada sistem tertutup dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum
Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak, umumnya sama dengan
yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarutpelarut kromatografi cair. Di samping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran (loop valve)
Injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan
Universitas Sumatera Utara
adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan
atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak
ke dalam kolom.
Gambar 3 Tipe Injektor Putaran
2.3.6 Kolom
Menurut De Lux Putra (2007), kolom adalah jantung kromatografi.
Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan
kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : diameter khas adalah 2 – 6 mm. Panjang kolom
tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pellikular, panjang yang
umumnya adalah 50 – 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat,
umumnya 10 – 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar
dan panjang kolom 25 – 100 cm.
2.3.7 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan
dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
Universitas Sumatera Utara
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang
luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1991).
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern
kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacammacam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi
populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa
dalam rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer,
detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan
(Johnson dan Stevenson, 1991).
2.3.8 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan
Stevenson, 1991).
Guna kromatogram:
1. Kualitatif : waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi
yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif : Luas puncak
proporsional dengan jumlah sampel
yang
diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
2.3.9 Fase Gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat
Universitas Sumatera Utara
yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak
(De Lux Putra, 2007).
Menurut De Lux Putra (2007), fase gerak harus:
• Murni, tidak ada pencemar/kontaminan
• Tidak bereaksi dengan pengemas
• Sesuai dengan detektor
• Melarutkan cuplikan
• Mempunyai viskositas rendah
• Tersedia di perdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur
pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara (degassing)
yang ada harus dihilangkan dari pelarut karena udara yang keluar melewati
detektor dapat menghasilkan banyak gangguan sehingga data tidak dapat
digunakan.
2.3.10 Fase Diam
Oktadesil silika (ODS atau C 18 ) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Sekarang ini, gel silika ODS atau fase-fase sejenis seperti gel silika oktil
digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fase-fase lain hanya digunakan
jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat
mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting
Universitas Sumatera Utara
karena matriks sampel
tersebut
menghasilkan
banyak
puncak
yang
mengganggu (Watson, 2009).
2.3.11 Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut De Lux Putra (2007), elusi pada kromatografi cair kinerja
tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase
gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).
2. Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang
perbandingannya
berubah-ubah
dalam waktu tertentu (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi).
2.3.12 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Menurut Munson (1991), jenis pemisahan KCKT berdasarkan jenis fase
gerak dan fase diamnya dibedakan atas:
a. Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya
silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b. Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang
banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8).
Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril.
2.4 Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
Universitas Sumatera Utara
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut
memenuhi
persyaratan untuk
penggunaannya
(Harmita, 2004).
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi
untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk
mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada
validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi,
linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness).
2.4.1 Akurasi (Kecermatan)
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan
kembali (% recovery) (Harmita, 2004).
2.4.2 Presisi (Keseksamaan)
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diperoleh
dari beberapa kali pengukuran pada sampel yang sama dan biasanya diekspresikan
sebagai Relatif Standar Deviasi (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.3 Batas Deteksi (limit of detection, LOD)
Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan
apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.4 Batas Kuantitasi (limit of quantitation, LOQ)
Universitas Sumatera Utara
Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara