Pengaruh Kombinasi NAA dan Kinetin Terhadap Pertumbuhan dan Perubahan Planlet dari Tunas Apikal Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.)
31
LAMPIRAN
Lampiran 1.Diagram Alir Tahapan Penelitian
Mulai
Induksi Kalus
Eksplan Tunas Apikal
Sterilisasi Eksplan
Eksplan Steril
Inokulasi Ekplan Steril ke Media Induksi Kalus
Sel Kalus
Induksi Embrio
Subkultur Kalus ke Media Induksi Embrio
(Y3 + 0,1 mg/L 2,4 D + 0,5 mg/L kasein)
Embrio Somatik
Analisa Perubahan Genetik
Planlet Kelapa Sawit
Perlakuan Induksi Planlet
(Y3 + Kombinasi NAA (0; 0,5; 1; 1,15
mg/L) + Kinetin (0; 0,05; 0,1; 0,15 mg/L))
Analisis Morfologi
Analisis Molekuler
- Waktu Inisiasi Planlet
- Persantase Embrio yang
Membentuk Planlet
- Tinggi Planlet
- Jumlah Daun
- Jumlah Akar
- Berat Kering Daun
- Berat Kering Akar
Isolasi DNA
Uji Kualitas dan Kuantitas
Amplifikasi DNA dengan
Teknik SSR
Verifikasi Perubahan
Genetik
Selesai
Universitas Sumatera Utara
32
Lampiran 2. Komposisi Media Y3(Eeuwens, 1976)
Bahan Kimia
Makro Nutrien
KNO3
KCl
NH4Cl
NaH2PO4.2H2O
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
Mikro Nutrien
Fe-EDTA
MnSO4.4H2O
KI
ZnSO4.7H2O
H3BO3
CoCl2.5H2O
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
NiCl2.6H2O
Konsentrasi dalam Media
(mg/L)
2020
1492
535
312
294
247
32,5
11,2
8,3
7,2
3,1
0,24
0,24
0,16
0,024
Universitas Sumatera Utara
33
Lampiran 3. Protokol Penggunaan GoTaq® Green Master Mix (Promega, USA)
Bahan Campuran
GoTaq® Green Master Mix, 2X
Forward Primer, 10 µM
Reverse Primer, 10 µM
Template DNA
ddH2O
PCR Cycle
Initial Denaturation
40 cycle Denaturation
40 cycle Annealing
40 cycle Extention
Final Extension
Jumlah
12,5 µL
0,25-2,5µL
0,25-2,5µL
1-5 µL
≈ 25 µL
Temperatur
95oC
95oC
50-55oC
72-74oC
72-74oC
Waktu
2 min
30 sec – 1 min
30 sec – 1 min
1 min
5 min
Universitas Sumatera Utara
34
Lampiran 4. Data Pengamatan Waktu Inisiasi Organ (Hari)
Konsentrasi ZPT
NAA (mg/L) Kinetin (mg/L)
0
0
0
0,1
0
0,2
0,05
0
0,05
0,1
0,05
0,2
0,1
0
0,1
0,1
0,1
0,2
1
17
6
83
32
28
18
Ulangan
2
3
22
30
12
20
85
92
35
41
33
37
24
30
Uji Statistik Waktu Inisiasi Organ
Type III Sum of
Source
Squares
Corrected Model
10306,500
Intercept
27832,288
Kinetin
4121,417
NAA
954,972
Kinetin * NAA
2,083
Error
384,00
Total
33803,000
Corrected Total
10690,500
df
5
1
2
2
1
12
18
17
Rata-Rata
SD
23,00
12,67
84,00
36,00
30,50
24,00
4,72
6,56
4,51
7,02
4,58
6,00
Mean
Square
2061,300
27832,288
2060,708
477,486
2,083
32,000
F
Sig.
64,416
869,759
64,397
14,921
0,065
,000
,000
,000
,001
,803
Uji Duncan 5% Perlakuan Kinetin
Konsentrasi Kinetin
0 mg/L
0,1 mg/L
0,2 mg/L
Sig.
Subset
N
1
3
6
9
27,8333
24,2222
0,337
Uji Duncan 5% Perlakuan NAA
Subset
Konsentrasi
N
NAA
1
2
0 mg/L
6
17,8333
0,05 mg/L
6
28,3333
0,1 mg/L
6
Sig.
1,000
1,000
2
86,6667
1,000
3
61,3333
1,000
Universitas Sumatera Utara
35
Kombinasi
N
1
12,6667
Subset for alpha = 0.05
2
3
K2N0
3
K1N0
3
23,0000
K2N2
3
24,0000
K1N2
3
32,6667
32,6667
K2N1
3
36,0000
K0N1
3
Sig.
1,000
,069
,484
Uji Duncan 5% Perlakuan Kombinasi NAA dan Kinetin
4
86,6667
1,000
Universitas Sumatera Utara
36
Lampiran 5. Data Pengamatan Jumlah Akar
Ulangan
1
2
0
0
K0N0
2
3
K0N1
0
0
K0N2
2
5
K1N0
0
0
K1N1
6
2
K1N2
7
2
K2N0
2
3
K2N1
3
3
K2N2
Total Botol Perlakuan
Perlakuan
Total Rata-rata
3
0
2
0
3
0
3
3
2
2
0
7
0
10
0
11
12
7
8
55
Uji Statistik Jumlah Akar
Type III Sum of
Source
Squares
Corrected Model
7,611a
Intercept
154,821
Kinetin
,083
NAA
2,750
Kinetin * NAA
2,083
Error
29,333
Total
205,000
Corrected Total
36,944
Persentase
SD
0,0%
12,7%
0,0%
18,1%
0,0%
20%
21,8%
12,7%
14,5%
0,000
0,577
0,000
1,527
0,000
2,081
2,645
0,577
0,577
0,00
2,34
0,00
3,34
0,00
3,67
4,00
2,34
2,67
df
5
1
2
2
1
12
18
17
Mean
Square
1,522
154,821
,042
1,375
2,083
2,444
F
Sig.
,623
63,336
,017
,563
,852
,686
,000
,983
,583
,374
Uji Duncan 5% Perlakuan Kinetin
Konsentrasi Kinetin
N
0 mg/L
0,1 mg/L
0,2 mg/L
Sig.
3
6
9
Subset
1
2,3333
3,5000
3,0000
0,288
Uji Duncan 5% Perlakuan NAA
Konsentrasi NAA
N
0 mg/L
6
0,05 mg/L
6
0,1 mg/L
6
Sig.
Uji Duncan 5% Perlakuan Kombinasi NAA dan Kinetin
Subset
1
3,6667
3,1667
2,3333
0,185
Universitas Sumatera Utara
37
Subset for alpha = 0.05
Kombinasi
K0N1
N
3
1
2,3333
K2N1
3
3
3
23333
2,6667
3,3333
3
3
3,6667
K2N2
K1N0
K1N2
K2N0
Sig.
4,0000
,259
Universitas Sumatera Utara
38
Lampiran 6. Data Pengamatan Jumlah Tunas
Ulangan
1
2
0
0
K0N0
0
0
K0N1
0
0
K0N2
1
1
K1N0
0
0
K1N1
1
1
K1N2
0
0
K2N0
2
1
K2N1
0
0
K2N2
Total Botol Perlakuan
Perlakuan
3
0
0
0
1
0
1
0
2
0
Total Rata-rata
0
0
0
3
0
3
0
5
0
11
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,67
0,00
Persentase
SD
0,0%
0,0%
0,0%
27,2%
0,0%
27,2%
0,0%
45,4%
0,0%
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,577
0,000
Universitas Sumatera Utara
39
Lampiran 7.Kualitas dan kuantitas DNA kultur tunas apikal kelapa sawit pada
beberapa tingkat konsentrasi NAA dan Kinetin
Tabel 4.4.Kualitas dan kuantitas DNA kalus tunas apikal kelapa sawit pada
Konsentrasi ZPT
NAA (mg/L)
Kinetin (mg/L)
Tanaman Induk
Tanaman Hasil Kultur
Kalus
Embrio
0
0
0,05
0
0,1
0
0
0,1
0,05
0,1
0,1
0,1
0
0,2
0,05
0,2
0,1
0,2
Konsentrasi
(ng/µL)
Kemurnian
(A260/280)
466
285
27,7
820
422
741
763
18,5
437
591
379
11,3
392
1,720
1,326
1,307
1,640
1,617
1,876
1,655
1,814
1,668
1,813
1,541
1,728
1,675
beberapa tingkat konsentrasi NAA dan kinetin
Universitas Sumatera Utara
40
Lampiran 8. Data biner dan matriks kemiripan genetik pita DNA hasil amplifikasi
dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6
Data biner pita DNA hasil amplifikasi dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6.
No.
Ciri
1
2
3
4
5
6
7
8
TI
0
0
0
0
0
0
0
1
TK
0
0
0
0
0
0
0
1
K
0
0
0
0
0
1
0
1
E
0
0
0
0
0
0
0
1
Perlakuan
D1 D2 D3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
D4
0
0
0
0
0
0
0
1
D5
1
0
0
0
0
0
0
0
D6
0
0
0
1
0
0
0
1
D7
0
0
0
0
1
0
0
1
D8
0
0
1
0
1
1
1
1
D9
0
1
0
0
1
0
0
1
Universitas Sumatera Utara
4
Matriks kemiripan genetik berdasarkan pita hasil amplifikasi dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6
TI
TK
K
E
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
TI
1,00
1,00
0,67
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
TK
K
E
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
1,00
0,67
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,67
0,67
0,67
0,67
0,67
0,00
0,50
0,50
0,57
0,40
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,50
0,28
0,40
1,00
0,57
0,80
1,00
0,50
1,00
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN
Lampiran 1.Diagram Alir Tahapan Penelitian
Mulai
Induksi Kalus
Eksplan Tunas Apikal
Sterilisasi Eksplan
Eksplan Steril
Inokulasi Ekplan Steril ke Media Induksi Kalus
Sel Kalus
Induksi Embrio
Subkultur Kalus ke Media Induksi Embrio
(Y3 + 0,1 mg/L 2,4 D + 0,5 mg/L kasein)
Embrio Somatik
Analisa Perubahan Genetik
Planlet Kelapa Sawit
Perlakuan Induksi Planlet
(Y3 + Kombinasi NAA (0; 0,5; 1; 1,15
mg/L) + Kinetin (0; 0,05; 0,1; 0,15 mg/L))
Analisis Morfologi
Analisis Molekuler
- Waktu Inisiasi Planlet
- Persantase Embrio yang
Membentuk Planlet
- Tinggi Planlet
- Jumlah Daun
- Jumlah Akar
- Berat Kering Daun
- Berat Kering Akar
Isolasi DNA
Uji Kualitas dan Kuantitas
Amplifikasi DNA dengan
Teknik SSR
Verifikasi Perubahan
Genetik
Selesai
Universitas Sumatera Utara
32
Lampiran 2. Komposisi Media Y3(Eeuwens, 1976)
Bahan Kimia
Makro Nutrien
KNO3
KCl
NH4Cl
NaH2PO4.2H2O
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
Mikro Nutrien
Fe-EDTA
MnSO4.4H2O
KI
ZnSO4.7H2O
H3BO3
CoCl2.5H2O
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
NiCl2.6H2O
Konsentrasi dalam Media
(mg/L)
2020
1492
535
312
294
247
32,5
11,2
8,3
7,2
3,1
0,24
0,24
0,16
0,024
Universitas Sumatera Utara
33
Lampiran 3. Protokol Penggunaan GoTaq® Green Master Mix (Promega, USA)
Bahan Campuran
GoTaq® Green Master Mix, 2X
Forward Primer, 10 µM
Reverse Primer, 10 µM
Template DNA
ddH2O
PCR Cycle
Initial Denaturation
40 cycle Denaturation
40 cycle Annealing
40 cycle Extention
Final Extension
Jumlah
12,5 µL
0,25-2,5µL
0,25-2,5µL
1-5 µL
≈ 25 µL
Temperatur
95oC
95oC
50-55oC
72-74oC
72-74oC
Waktu
2 min
30 sec – 1 min
30 sec – 1 min
1 min
5 min
Universitas Sumatera Utara
34
Lampiran 4. Data Pengamatan Waktu Inisiasi Organ (Hari)
Konsentrasi ZPT
NAA (mg/L) Kinetin (mg/L)
0
0
0
0,1
0
0,2
0,05
0
0,05
0,1
0,05
0,2
0,1
0
0,1
0,1
0,1
0,2
1
17
6
83
32
28
18
Ulangan
2
3
22
30
12
20
85
92
35
41
33
37
24
30
Uji Statistik Waktu Inisiasi Organ
Type III Sum of
Source
Squares
Corrected Model
10306,500
Intercept
27832,288
Kinetin
4121,417
NAA
954,972
Kinetin * NAA
2,083
Error
384,00
Total
33803,000
Corrected Total
10690,500
df
5
1
2
2
1
12
18
17
Rata-Rata
SD
23,00
12,67
84,00
36,00
30,50
24,00
4,72
6,56
4,51
7,02
4,58
6,00
Mean
Square
2061,300
27832,288
2060,708
477,486
2,083
32,000
F
Sig.
64,416
869,759
64,397
14,921
0,065
,000
,000
,000
,001
,803
Uji Duncan 5% Perlakuan Kinetin
Konsentrasi Kinetin
0 mg/L
0,1 mg/L
0,2 mg/L
Sig.
Subset
N
1
3
6
9
27,8333
24,2222
0,337
Uji Duncan 5% Perlakuan NAA
Subset
Konsentrasi
N
NAA
1
2
0 mg/L
6
17,8333
0,05 mg/L
6
28,3333
0,1 mg/L
6
Sig.
1,000
1,000
2
86,6667
1,000
3
61,3333
1,000
Universitas Sumatera Utara
35
Kombinasi
N
1
12,6667
Subset for alpha = 0.05
2
3
K2N0
3
K1N0
3
23,0000
K2N2
3
24,0000
K1N2
3
32,6667
32,6667
K2N1
3
36,0000
K0N1
3
Sig.
1,000
,069
,484
Uji Duncan 5% Perlakuan Kombinasi NAA dan Kinetin
4
86,6667
1,000
Universitas Sumatera Utara
36
Lampiran 5. Data Pengamatan Jumlah Akar
Ulangan
1
2
0
0
K0N0
2
3
K0N1
0
0
K0N2
2
5
K1N0
0
0
K1N1
6
2
K1N2
7
2
K2N0
2
3
K2N1
3
3
K2N2
Total Botol Perlakuan
Perlakuan
Total Rata-rata
3
0
2
0
3
0
3
3
2
2
0
7
0
10
0
11
12
7
8
55
Uji Statistik Jumlah Akar
Type III Sum of
Source
Squares
Corrected Model
7,611a
Intercept
154,821
Kinetin
,083
NAA
2,750
Kinetin * NAA
2,083
Error
29,333
Total
205,000
Corrected Total
36,944
Persentase
SD
0,0%
12,7%
0,0%
18,1%
0,0%
20%
21,8%
12,7%
14,5%
0,000
0,577
0,000
1,527
0,000
2,081
2,645
0,577
0,577
0,00
2,34
0,00
3,34
0,00
3,67
4,00
2,34
2,67
df
5
1
2
2
1
12
18
17
Mean
Square
1,522
154,821
,042
1,375
2,083
2,444
F
Sig.
,623
63,336
,017
,563
,852
,686
,000
,983
,583
,374
Uji Duncan 5% Perlakuan Kinetin
Konsentrasi Kinetin
N
0 mg/L
0,1 mg/L
0,2 mg/L
Sig.
3
6
9
Subset
1
2,3333
3,5000
3,0000
0,288
Uji Duncan 5% Perlakuan NAA
Konsentrasi NAA
N
0 mg/L
6
0,05 mg/L
6
0,1 mg/L
6
Sig.
Uji Duncan 5% Perlakuan Kombinasi NAA dan Kinetin
Subset
1
3,6667
3,1667
2,3333
0,185
Universitas Sumatera Utara
37
Subset for alpha = 0.05
Kombinasi
K0N1
N
3
1
2,3333
K2N1
3
3
3
23333
2,6667
3,3333
3
3
3,6667
K2N2
K1N0
K1N2
K2N0
Sig.
4,0000
,259
Universitas Sumatera Utara
38
Lampiran 6. Data Pengamatan Jumlah Tunas
Ulangan
1
2
0
0
K0N0
0
0
K0N1
0
0
K0N2
1
1
K1N0
0
0
K1N1
1
1
K1N2
0
0
K2N0
2
1
K2N1
0
0
K2N2
Total Botol Perlakuan
Perlakuan
3
0
0
0
1
0
1
0
2
0
Total Rata-rata
0
0
0
3
0
3
0
5
0
11
0,00
0,00
0,00
1,00
0,00
1,00
0,00
1,67
0,00
Persentase
SD
0,0%
0,0%
0,0%
27,2%
0,0%
27,2%
0,0%
45,4%
0,0%
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,577
0,000
Universitas Sumatera Utara
39
Lampiran 7.Kualitas dan kuantitas DNA kultur tunas apikal kelapa sawit pada
beberapa tingkat konsentrasi NAA dan Kinetin
Tabel 4.4.Kualitas dan kuantitas DNA kalus tunas apikal kelapa sawit pada
Konsentrasi ZPT
NAA (mg/L)
Kinetin (mg/L)
Tanaman Induk
Tanaman Hasil Kultur
Kalus
Embrio
0
0
0,05
0
0,1
0
0
0,1
0,05
0,1
0,1
0,1
0
0,2
0,05
0,2
0,1
0,2
Konsentrasi
(ng/µL)
Kemurnian
(A260/280)
466
285
27,7
820
422
741
763
18,5
437
591
379
11,3
392
1,720
1,326
1,307
1,640
1,617
1,876
1,655
1,814
1,668
1,813
1,541
1,728
1,675
beberapa tingkat konsentrasi NAA dan kinetin
Universitas Sumatera Utara
40
Lampiran 8. Data biner dan matriks kemiripan genetik pita DNA hasil amplifikasi
dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6
Data biner pita DNA hasil amplifikasi dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6.
No.
Ciri
1
2
3
4
5
6
7
8
TI
0
0
0
0
0
0
0
1
TK
0
0
0
0
0
0
0
1
K
0
0
0
0
0
1
0
1
E
0
0
0
0
0
0
0
1
Perlakuan
D1 D2 D3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
D4
0
0
0
0
0
0
0
1
D5
1
0
0
0
0
0
0
0
D6
0
0
0
1
0
0
0
1
D7
0
0
0
0
1
0
0
1
D8
0
0
1
0
1
1
1
1
D9
0
1
0
0
1
0
0
1
Universitas Sumatera Utara
4
Matriks kemiripan genetik berdasarkan pita hasil amplifikasi dengan primer P1A0, P4T12a dan P1T6
TI
TK
K
E
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
TI
1,00
1,00
0,67
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
TK
K
E
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
1,00
0,67
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,67
0,67
0,67
0,67
0,67
0,00
0,50
0,50
0,57
0,40
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,00
0,67
0,67
0,33
0,50
1,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,00
0,50
0,28
0,40
1,00
0,57
0,80
1,00
0,50
1,00
Universitas Sumatera Utara