Desain DNA Probe Secara In Silico Sebagai Pendeteksi Mutasi Pada Kodon 315 Gen katG Mycobacterium tuberculosis Untuk Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction.
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
53
54
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang
Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan
Skripsi yang berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO
SEBAGAI
PENDETEKSI
katGMycobacterium
MUTASI
tuberculosis
PADA
UNTUK
KODON
METODE
315
GEN
REAL-TIME
POLYMERASE CHAIN REACTION”. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
Penulisan Skripsi ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak
secara langsung dan tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan
rasa terima kasih kepada:
1. Bapak Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si, selaku Dekan Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan
Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana.
3. Putu Sana Yustiantara, S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I yang
telah membimbing hingga akhir penyusunan Skripsi ini.
4. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II
yang membimbing dan memotivasi demi kelancaran penyusunan Skripsi ini.
5. Rasmaya Niruri, S.Si., M.Farm.Klin., Apt., Luh Putu Mirah Kusuma Dewi,
SF. M.Sc., Apt., dan Putu Oka Samirana, S.Farm., M.Sc. Apt., selaku dosen
penguji yang telah memberikan saran-saran untuk penyusunan Skripsi ini.
55
6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA,
Universitas Udayana yang telah membina penulis dan membantu memenuhi
kelengkapan administratif.
7. Kedua orang tua penulis, I Nyoman Wardana dan Ni Ketut Mariani yang tidak
berhenti memberikan dukungan moral, materiil, doa dan semangat.
8. Saudara penulis Rida Ari Anggraeni (Mida) yang selalu mendukung dan
memberikan semangat dan nasihat bagi penulis.
9. Mtb team (Dek tri, Rai, Linda, Ratih, Ebi) dan kakak kelas dari Mtb team
yang telah menjadi teman diskusi, memberi saran untuk kelancaran
penyusunan Skripsi ini.
10. Teman-teman TANPO (Tantri, Novi, Anggi, Lina, Linda, Sarah, dan Meci)
yang selalu menghibur dan memotivasi penulis.
11. Teman Dioscury Hygeia dan pihak-pihak lain yang tidak dapat penulis
sebutkan satu per satu.
Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan Skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua
pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga Skripsi ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bukit Jimbaran, 8 Juni 2016
Penulis
56
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii
KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii
DAFTAR ISI ........................................................................................................ v
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. viii
DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO .......................................................... x
DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv
ABSTRAK ....................................................................................................... xvi
ABSTRACT .................................................................................................... xvii
BAB I
PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1
Latar Belakang ............................................................................. 1
1.2
Rumusan Masalah ........................................................................ 5
1.3
Tujuan Penelitian ......................................................................... 6
1.4
Manfaat Penelitian ....................................................................... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 7
2.1
Tuberkulosis (TB) ........................................................................ 7
2.2
Genom Mycobacterium tuberculosis ........................................... 8
2.3
Gen KatG Mycobacterium tuberculosis....................................... 9
57
2.4
Mutasi Gen ................................................................................. 11
2.5
Resistensi Isoniazid (INH) ......................................................... 12
2.6
Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ........ 14
2.7
DNA Probe ................................................................................ 15
BAB III METODE PENELITIAN.................................................................... 20
3.1
Rancangan Penelitian ................................................................. 20
3.2
Batasan Operasional Penelitian ................................................. 21
3.3
Lokasi dan Waktu Penelitian ..................................................... 21
3.4
Bahan Penelitian ........................................................................ 22
3.5
Alat Penelitian ............................................................................ 23
3.6
Prosedur Penelitian .................................................................... 23
3.6.1 Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe
Mutan ................................................................................ 23
3.6.2 Perancangan DNA Probe .................................................. 25
3.6.3 Analisis Hasil Perancangan DNA Probe .......................... 25
3.7
Penyimpulan Hasil Penelitian ................................................... 27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 28
4.1
Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ..... 28
4.2
Hasil Perancangan DNA Probe ................................................. 30
4.3
Hasil Analisis Rancangan Probe Mutan .................................... 33
4.3.1 Hasil Analisis Kriteria Umum Probe Mutan ................... 33
4.3.2 Hasil Analisis Pelabelan Probe Mutan ............................ 43
58
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 51
5.1
Kesimpulan ............................................................................... 51
5.2
Saran ......................................................................................... 51
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 52
LAMPIRAN ....................................................................................................... 59
59
DAFTAR SINGKATAN
Cy3
: Cyanine-3
Cy5
: Cyanine-5
DNA
: Deoxyribonucleic acid
DNA
: Deoxyribonucleic acid
dNTP
: Deoxynucleotide triphosphates
FAM
: 6-carboxyfluorescein
FRET
: Fluorescence Resonance Energy Transfer
GC
: Guanin-Sitosin
HIV
: Human Immunodeficiency Virus
INH
: Isoniazid
MDR
: Multi-drug resistant
MIC
: Minimum Inhibitory Concentration
NADH
: Nicotinamide Adenine Dinucleotide
OAT
: Obat Anti Tuberkulosis
pb
: pasang basa
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PE
: Prolin Glutamat
PGRS
: Polymorphic GC-rich repetitive sequences
PPE
: Prolin Prolin Glutamat
ROX
: 6-Carboxyl-X-Rhodamine
TAMRA
: 6-carboxytetramethyl-rhodamine
60
Taq
: Thermus aquaticus
TB
: Tuberkulosis
Tm
: Melting temperature
tRNA
: Transfer Ribonucleic Acid
WHO
: World Health Organization
VIC
: 4,7,2’-trichloro-7’-phenyl-6-carboxyfluorescein
XDR
: Extensively-drug resistant
61
DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO
C
: Sistein
F
: Fenilalanin
G
: Glisin
N
: Asparagin
P
: Prolin
Q
: Glutamin
R
: Arginin
S
: Serin
T
: Treonin
V
: Valin
62
DAFTAR ISTILAH
Amplifikasi DNA
: Perbanyakan DNA
Asam amino
: Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan
melalui ikatan peptida
Dimer
: Primer mengalami hibridisasi secara bersama-sama
DNA polimerase
: Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA
Fluoresensi
: Pemancaran sinar oleh suatu zat yang telah menyerap
sinar atau radiasi elektromagnetik lain
Fluorophore
: Komponen kimia yang dapat mengemisikan kembali
cahaya pada proses eksitasi
Gen
: Urutan DNA yang menyandi suatu protein
H37Rv
: Galur standar yang dijadikan wild type M. tuberculosis
Hairpin
: Struktur lengkungan yang dibentuk oleh DNA tunggal
akibat adanya suatu bagian tertentu dari DNA yang
terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai
DNA yang sama
Hibridisasi
: Proses pemasangan antara DNA yang menjadi sasaran
dan DNA pelacak.
In silico
: Menggunakan komputerisasi
Kodon
: Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas
kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi
suatu asam amino tertentu
Mutan
: Agen yang mengalami mutasi
63
Mutasi DNA
: Perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari
suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan
perubahan sifat fenotip
Nukleotida
: Unit monomer pembentuk DNA
PCR (Polymerase
: Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan
Chain Reaction)
Primer
reaksi enzimatis
: Oligonukleotida pendek yang komplementer dengan
urutan nukleotida template DNA
DNA Probe
: Molekul asam nukleat berupa rantai tunggal DNA yang
memiliki afinitas kuat dengan target spesifik yang
berupa urutan DNA atau RNA.
Prodrug
: Senyawa yang tidak aktif namun di dalam tubuh dapat
menjadi aktif karena proses enzimatik
Repeat
: Pengulangan dinukleotida secara berurutan
Resistensi
: Hilangnya sensitivitas bakteri terhadap obat yang
sebelumnya dapat membunuh bakteri
Runs
: Pengulangan basa tunggal sama secara berurutan
Template DNA
: DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen
atau gen yang akan digandakan
Tetraplex
: Struktur DNA yang dibentuk dari urutan kaya G yang
terjadi antara empat basa guanin melalui ikatan hidrogen
Wild type
: Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan
sebagai sekuen pembanding terjadinya mutasi
64
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Perubahan Asam Amino Akibat Mutasi Pada Kodon 315............ 11
Tabel 3.1 Hasil Kriteria Primer Yang Telah Didesain Secara In Silico
dengan Clone Manager Suite 6 ..................................................... 22
Tabel 3.2 Perubahan Nukleotida Kodon 315 Gen katG Mycobaterium
tuberculosis Untuk Perancangan DNA Probe Mutan ................... 24
Tabel 3.3 Format Tampilan Hasil Analisis Awal Probe Mutan ................... 26
Tabel 3.4 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan .............................................. 27
Tabel 4.1 Hasil Analisis Tahap Awal Probe Mutan Untuk Kodon 315 ....... 35
Tabel 4.2 Hasil Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ................................... 46
65
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara sirkuler ........ 9
Gambar 2.2 Skema Daerah furA-katG M. tuberculosis................................... 10
Gambar 2.3 Struktur Kimia Isoniazid ............................................................. 13
Gambar 2.4 Mekanisme Kerja TaqMan Probe ............................................... 19
Gambar 3.1 Skema Alur Penelitian Desain DNA Probe Secara In Silico ...... 20
Gambar 3.2 Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis
Yang Dijadikan Target Perancangan DNA Probe ...................... 24
Gambar 4.1 Pengaruh Posisi Mutasi Terhadap Hibridisasi Probe .................. 32
Gambar 4.2 Contoh Tampilan Hasil Analisis Tahap Awal Pada Software ..... 34
Gambar 4.3 Runs Pada Desain Probe Mutan K315MR8 ................................ 40
Gambar 4.4 Hasil Analisis Dimer Pada Desain Probe Mutan K315MN23 .... 41
Gambar 4.5 Penggambaran struktur hairpin yang dibentuk oleh probe
mutan K315MT1 dengan Clone Manager Suite 6 ...................... 42
Gambar 4.6 Posisi Basa G Pada Probe K315MT4, K315MV4, dan
K315MN3 .................................................................................... 44
Gambar 4.7 Pelabelan Desain Probe K315MT1 ............................................. 47
Gambar 4.8 Pelabelan Desain Probe Mutan Untuk Deteksi Mutasi S315N .. 49
66
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Peta Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis ... 59
Lampiran 2 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315T Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 61
Lampiran 3 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315N Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 62
Lampiran 4 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315R Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 63
Lampiran 5 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315G Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 64
Lampiran 6 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315V Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 65
Lampiran 7 Hasil Analisis Probe Mutan K315MT1 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 66
Lampiran 8 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN5 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 67
Lampiran 9 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN23 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 68
Lampiran 10 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ............................................ 69
67
ABSTRAK
Resistensi tingkat tinggi terhadap isoniazid sebagai salah satu obat lini
pertama tuberkulosis dapat disebabkan oleh mutasi kodon 315 gen katG
Mycobacterium tuberculosis. Mutasi pada kodon 315 adalah mutasi yang paling
sering terjadi dengan variasi asam amino paling tinggi, dibandingkan kodon lain
pada gen katG Mycobacterium tuberculosis. Oleh karena itu, probe yang spesifik
diperlukan untuk deteksi cepat dan tepat adanya mutasi pada kodon 315. Pada
penelitian ini, perancangan urutan nukleotida probe dengan pelabelan TaqMan
dilakukan menggunakan software Clone Manager Suite 6. Probe mutan yang
diperoleh, dianalisis dua tahap. Analisis tahap awal didasarkan pada panjang
probe (22-30 basa), Tm (70ºC), %GC (35-65%), tidak terbentuk hairpin, dimer (<
5 basa), runs dan repeat (≤ 4 untuk basa A, T, C, dan < 3 untuk basa G).
Selanjutnya dilakukan analisis tahap akhir dengan kriteria, yaitu tidak terdapat
basa G pada 2 basa di ujung 5’ probe dan jumlah basa C ≥ G.
Penelitian menghasilkan 260 probe mutan. Setelah analisis tahap awal
diperoleh 11 probe mutan yang mampu mengenali mutasi pada kodon 315 gen
katG Mycobacterioum tuberculosis. Probe tersebut terdiri dari 2 probe untuk
mutasi S315T, 6 probe untuk mutasi S315N, dan 3 probe untuk mutasi S315V.
Kriteria yang dimiliki 11 probe mutan adalah panjang 22-23 basa, Tm 70ºC, %
GC 56-63%, 4 dimer, 2 runs, dan tidak memiliki repeats dan tidak membentuk
hairpin pada suhu 56ºC. Berdasarkan analisis tahap akhir, diperoleh 3 probe
mutan memenuhi kriteria pelabelan TaqMan probe, yaitu K315MT1 untuk deteksi
spesifik mutasi S→T serta K315MN5 dan K315MN23 untuk deteksi spesifik
mutasi S→N.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah urutan nukleotida probe mutan terbaik
untuk deteksi adanya mutasi pada kodon 315 gen katG Mycobacterium
tuberculosis, yaitu 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TG-TAMRA3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC G-TAMRA-3’; dan 5’FAM-C
ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA-3’. Rancangan probe mutan
yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan probe untuk real-time PCR diperoleh
sebanyak 3 probe dari 11 probe mutan terpilih pada analisis tahap awal.
Kata kunci: Tuberkulosis, mutasi gen katG, in silico, TaqMan probe, real-time
PCR.
68
ABSTRACT
High level resistance of isoniazid as one of first-line tuberculosis drugs
can be caused by mutations at codon 315th in katG gene of Mycobacterium
tuberculosis. Mutation at codon 315 is the most often case and has the highest
amino acid variations, compared to the other codons in the katG gene of
Mycobacterium tuberculosis. Therefore, specific probes required for rapid and
precisely detection of mutations at codon 315. In this study,the nucleotide
sequence with TaqMan probe was designed by using Clone Manager Suite 6
Software. Probe mutants were analyzed in two stages. Analysis of the initial
stages of the probe based on length of the probe (22-30 bases), Tm (70ºC), %GC
(35-65%), non-hairpin formed, dimer (
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
52
DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI
PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN katG
Mycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REALTIME POLYMERASE CHAIN REACTION
Skripsi
KADEK WIDYA YULIHARTATI
1208505010
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2016
53
54
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang
Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan
Skripsi yang berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO
SEBAGAI
PENDETEKSI
katGMycobacterium
MUTASI
tuberculosis
PADA
UNTUK
KODON
METODE
315
GEN
REAL-TIME
POLYMERASE CHAIN REACTION”. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
Penulisan Skripsi ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak
secara langsung dan tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan
rasa terima kasih kepada:
1. Bapak Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si, selaku Dekan Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan
Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana.
3. Putu Sana Yustiantara, S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I yang
telah membimbing hingga akhir penyusunan Skripsi ini.
4. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II
yang membimbing dan memotivasi demi kelancaran penyusunan Skripsi ini.
5. Rasmaya Niruri, S.Si., M.Farm.Klin., Apt., Luh Putu Mirah Kusuma Dewi,
SF. M.Sc., Apt., dan Putu Oka Samirana, S.Farm., M.Sc. Apt., selaku dosen
penguji yang telah memberikan saran-saran untuk penyusunan Skripsi ini.
55
6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA,
Universitas Udayana yang telah membina penulis dan membantu memenuhi
kelengkapan administratif.
7. Kedua orang tua penulis, I Nyoman Wardana dan Ni Ketut Mariani yang tidak
berhenti memberikan dukungan moral, materiil, doa dan semangat.
8. Saudara penulis Rida Ari Anggraeni (Mida) yang selalu mendukung dan
memberikan semangat dan nasihat bagi penulis.
9. Mtb team (Dek tri, Rai, Linda, Ratih, Ebi) dan kakak kelas dari Mtb team
yang telah menjadi teman diskusi, memberi saran untuk kelancaran
penyusunan Skripsi ini.
10. Teman-teman TANPO (Tantri, Novi, Anggi, Lina, Linda, Sarah, dan Meci)
yang selalu menghibur dan memotivasi penulis.
11. Teman Dioscury Hygeia dan pihak-pihak lain yang tidak dapat penulis
sebutkan satu per satu.
Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan Skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua
pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga Skripsi ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bukit Jimbaran, 8 Juni 2016
Penulis
56
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii
KATA PENGANTAR ........................................................................................ iii
DAFTAR ISI ........................................................................................................ v
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. viii
DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO .......................................................... x
DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xv
ABSTRAK ....................................................................................................... xvi
ABSTRACT .................................................................................................... xvii
BAB I
PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1
Latar Belakang ............................................................................. 1
1.2
Rumusan Masalah ........................................................................ 5
1.3
Tujuan Penelitian ......................................................................... 6
1.4
Manfaat Penelitian ....................................................................... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 7
2.1
Tuberkulosis (TB) ........................................................................ 7
2.2
Genom Mycobacterium tuberculosis ........................................... 8
2.3
Gen KatG Mycobacterium tuberculosis....................................... 9
57
2.4
Mutasi Gen ................................................................................. 11
2.5
Resistensi Isoniazid (INH) ......................................................... 12
2.6
Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ........ 14
2.7
DNA Probe ................................................................................ 15
BAB III METODE PENELITIAN.................................................................... 20
3.1
Rancangan Penelitian ................................................................. 20
3.2
Batasan Operasional Penelitian ................................................. 21
3.3
Lokasi dan Waktu Penelitian ..................................................... 21
3.4
Bahan Penelitian ........................................................................ 22
3.5
Alat Penelitian ............................................................................ 23
3.6
Prosedur Penelitian .................................................................... 23
3.6.1 Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe
Mutan ................................................................................ 23
3.6.2 Perancangan DNA Probe .................................................. 25
3.6.3 Analisis Hasil Perancangan DNA Probe .......................... 25
3.7
Penyimpulan Hasil Penelitian ................................................... 27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 28
4.1
Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ..... 28
4.2
Hasil Perancangan DNA Probe ................................................. 30
4.3
Hasil Analisis Rancangan Probe Mutan .................................... 33
4.3.1 Hasil Analisis Kriteria Umum Probe Mutan ................... 33
4.3.2 Hasil Analisis Pelabelan Probe Mutan ............................ 43
58
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 51
5.1
Kesimpulan ............................................................................... 51
5.2
Saran ......................................................................................... 51
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 52
LAMPIRAN ....................................................................................................... 59
59
DAFTAR SINGKATAN
Cy3
: Cyanine-3
Cy5
: Cyanine-5
DNA
: Deoxyribonucleic acid
DNA
: Deoxyribonucleic acid
dNTP
: Deoxynucleotide triphosphates
FAM
: 6-carboxyfluorescein
FRET
: Fluorescence Resonance Energy Transfer
GC
: Guanin-Sitosin
HIV
: Human Immunodeficiency Virus
INH
: Isoniazid
MDR
: Multi-drug resistant
MIC
: Minimum Inhibitory Concentration
NADH
: Nicotinamide Adenine Dinucleotide
OAT
: Obat Anti Tuberkulosis
pb
: pasang basa
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PE
: Prolin Glutamat
PGRS
: Polymorphic GC-rich repetitive sequences
PPE
: Prolin Prolin Glutamat
ROX
: 6-Carboxyl-X-Rhodamine
TAMRA
: 6-carboxytetramethyl-rhodamine
60
Taq
: Thermus aquaticus
TB
: Tuberkulosis
Tm
: Melting temperature
tRNA
: Transfer Ribonucleic Acid
WHO
: World Health Organization
VIC
: 4,7,2’-trichloro-7’-phenyl-6-carboxyfluorescein
XDR
: Extensively-drug resistant
61
DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO
C
: Sistein
F
: Fenilalanin
G
: Glisin
N
: Asparagin
P
: Prolin
Q
: Glutamin
R
: Arginin
S
: Serin
T
: Treonin
V
: Valin
62
DAFTAR ISTILAH
Amplifikasi DNA
: Perbanyakan DNA
Asam amino
: Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan
melalui ikatan peptida
Dimer
: Primer mengalami hibridisasi secara bersama-sama
DNA polimerase
: Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA
Fluoresensi
: Pemancaran sinar oleh suatu zat yang telah menyerap
sinar atau radiasi elektromagnetik lain
Fluorophore
: Komponen kimia yang dapat mengemisikan kembali
cahaya pada proses eksitasi
Gen
: Urutan DNA yang menyandi suatu protein
H37Rv
: Galur standar yang dijadikan wild type M. tuberculosis
Hairpin
: Struktur lengkungan yang dibentuk oleh DNA tunggal
akibat adanya suatu bagian tertentu dari DNA yang
terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai
DNA yang sama
Hibridisasi
: Proses pemasangan antara DNA yang menjadi sasaran
dan DNA pelacak.
In silico
: Menggunakan komputerisasi
Kodon
: Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas
kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi
suatu asam amino tertentu
Mutan
: Agen yang mengalami mutasi
63
Mutasi DNA
: Perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari
suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan
perubahan sifat fenotip
Nukleotida
: Unit monomer pembentuk DNA
PCR (Polymerase
: Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan
Chain Reaction)
Primer
reaksi enzimatis
: Oligonukleotida pendek yang komplementer dengan
urutan nukleotida template DNA
DNA Probe
: Molekul asam nukleat berupa rantai tunggal DNA yang
memiliki afinitas kuat dengan target spesifik yang
berupa urutan DNA atau RNA.
Prodrug
: Senyawa yang tidak aktif namun di dalam tubuh dapat
menjadi aktif karena proses enzimatik
Repeat
: Pengulangan dinukleotida secara berurutan
Resistensi
: Hilangnya sensitivitas bakteri terhadap obat yang
sebelumnya dapat membunuh bakteri
Runs
: Pengulangan basa tunggal sama secara berurutan
Template DNA
: DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen
atau gen yang akan digandakan
Tetraplex
: Struktur DNA yang dibentuk dari urutan kaya G yang
terjadi antara empat basa guanin melalui ikatan hidrogen
Wild type
: Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan
sebagai sekuen pembanding terjadinya mutasi
64
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Perubahan Asam Amino Akibat Mutasi Pada Kodon 315............ 11
Tabel 3.1 Hasil Kriteria Primer Yang Telah Didesain Secara In Silico
dengan Clone Manager Suite 6 ..................................................... 22
Tabel 3.2 Perubahan Nukleotida Kodon 315 Gen katG Mycobaterium
tuberculosis Untuk Perancangan DNA Probe Mutan ................... 24
Tabel 3.3 Format Tampilan Hasil Analisis Awal Probe Mutan ................... 26
Tabel 3.4 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan .............................................. 27
Tabel 4.1 Hasil Analisis Tahap Awal Probe Mutan Untuk Kodon 315 ....... 35
Tabel 4.2 Hasil Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ................................... 46
65
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara sirkuler ........ 9
Gambar 2.2 Skema Daerah furA-katG M. tuberculosis................................... 10
Gambar 2.3 Struktur Kimia Isoniazid ............................................................. 13
Gambar 2.4 Mekanisme Kerja TaqMan Probe ............................................... 19
Gambar 3.1 Skema Alur Penelitian Desain DNA Probe Secara In Silico ...... 20
Gambar 3.2 Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis
Yang Dijadikan Target Perancangan DNA Probe ...................... 24
Gambar 4.1 Pengaruh Posisi Mutasi Terhadap Hibridisasi Probe .................. 32
Gambar 4.2 Contoh Tampilan Hasil Analisis Tahap Awal Pada Software ..... 34
Gambar 4.3 Runs Pada Desain Probe Mutan K315MR8 ................................ 40
Gambar 4.4 Hasil Analisis Dimer Pada Desain Probe Mutan K315MN23 .... 41
Gambar 4.5 Penggambaran struktur hairpin yang dibentuk oleh probe
mutan K315MT1 dengan Clone Manager Suite 6 ...................... 42
Gambar 4.6 Posisi Basa G Pada Probe K315MT4, K315MV4, dan
K315MN3 .................................................................................... 44
Gambar 4.7 Pelabelan Desain Probe K315MT1 ............................................. 47
Gambar 4.8 Pelabelan Desain Probe Mutan Untuk Deteksi Mutasi S315N .. 49
66
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Peta Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis ... 59
Lampiran 2 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315T Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 61
Lampiran 3 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315N Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 62
Lampiran 4 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315R Dengan Clone Manager Suite 6 ......................................... 63
Lampiran 5 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315G Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 64
Lampiran 6 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi
S315V Dengan Clone Manager Suite 6 ........................................ 65
Lampiran 7 Hasil Analisis Probe Mutan K315MT1 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 66
Lampiran 8 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN5 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 67
Lampiran 9 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN23 Dengan Software
Clone Manager Suite 6 .................................................................. 68
Lampiran 10 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ............................................ 69
67
ABSTRAK
Resistensi tingkat tinggi terhadap isoniazid sebagai salah satu obat lini
pertama tuberkulosis dapat disebabkan oleh mutasi kodon 315 gen katG
Mycobacterium tuberculosis. Mutasi pada kodon 315 adalah mutasi yang paling
sering terjadi dengan variasi asam amino paling tinggi, dibandingkan kodon lain
pada gen katG Mycobacterium tuberculosis. Oleh karena itu, probe yang spesifik
diperlukan untuk deteksi cepat dan tepat adanya mutasi pada kodon 315. Pada
penelitian ini, perancangan urutan nukleotida probe dengan pelabelan TaqMan
dilakukan menggunakan software Clone Manager Suite 6. Probe mutan yang
diperoleh, dianalisis dua tahap. Analisis tahap awal didasarkan pada panjang
probe (22-30 basa), Tm (70ºC), %GC (35-65%), tidak terbentuk hairpin, dimer (<
5 basa), runs dan repeat (≤ 4 untuk basa A, T, C, dan < 3 untuk basa G).
Selanjutnya dilakukan analisis tahap akhir dengan kriteria, yaitu tidak terdapat
basa G pada 2 basa di ujung 5’ probe dan jumlah basa C ≥ G.
Penelitian menghasilkan 260 probe mutan. Setelah analisis tahap awal
diperoleh 11 probe mutan yang mampu mengenali mutasi pada kodon 315 gen
katG Mycobacterioum tuberculosis. Probe tersebut terdiri dari 2 probe untuk
mutasi S315T, 6 probe untuk mutasi S315N, dan 3 probe untuk mutasi S315V.
Kriteria yang dimiliki 11 probe mutan adalah panjang 22-23 basa, Tm 70ºC, %
GC 56-63%, 4 dimer, 2 runs, dan tidak memiliki repeats dan tidak membentuk
hairpin pada suhu 56ºC. Berdasarkan analisis tahap akhir, diperoleh 3 probe
mutan memenuhi kriteria pelabelan TaqMan probe, yaitu K315MT1 untuk deteksi
spesifik mutasi S→T serta K315MN5 dan K315MN23 untuk deteksi spesifik
mutasi S→N.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah urutan nukleotida probe mutan terbaik
untuk deteksi adanya mutasi pada kodon 315 gen katG Mycobacterium
tuberculosis, yaitu 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TG-TAMRA3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC G-TAMRA-3’; dan 5’FAM-C
ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA-3’. Rancangan probe mutan
yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan probe untuk real-time PCR diperoleh
sebanyak 3 probe dari 11 probe mutan terpilih pada analisis tahap awal.
Kata kunci: Tuberkulosis, mutasi gen katG, in silico, TaqMan probe, real-time
PCR.
68
ABSTRACT
High level resistance of isoniazid as one of first-line tuberculosis drugs
can be caused by mutations at codon 315th in katG gene of Mycobacterium
tuberculosis. Mutation at codon 315 is the most often case and has the highest
amino acid variations, compared to the other codons in the katG gene of
Mycobacterium tuberculosis. Therefore, specific probes required for rapid and
precisely detection of mutations at codon 315. In this study,the nucleotide
sequence with TaqMan probe was designed by using Clone Manager Suite 6
Software. Probe mutants were analyzed in two stages. Analysis of the initial
stages of the probe based on length of the probe (22-30 bases), Tm (70ºC), %GC
(35-65%), non-hairpin formed, dimer (