Sitotoksisitas terhadap sel Hela dan Identifikasi Taksol pada Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatarana

SITOTOKSISITAS TERHADAP SEL HeLa DAN IDENTIFIKASI
TAKSOL PADA METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT
Taxus sumatrana

AFFAN IQBAL

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Sitotoksisitas
terhadap sel HeLa dan Identifikasi Taksol pada Metabolit Sekunder Kapang
Endofit Taxus sumatrana adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Maret 2015

Affan Iqbal
NIM G84080022

ABSTRAK
AFFAN IQBAL. Sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan Identifikasi Taksol pada
Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatrana. Dibimbing oleh HASIM
dan I MADE ARTIKA.
Taxus sumatrana adalah tanaman langka yang diketahui ekstrak batangnya
mengandung Taksol, suatu senyawa antikanker. Faktor kelangkaan populasi
tanaman T. sumatrana ini menjadi alasan pemanfaatkan kapang endofitnya untuk
memproduksi taksol. Tujuan penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik
metabolit sekunder hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana
terhadap sel HeLa dan mengidentifikasi keberadaan senyawa Taksol pada
metabolit tersebut. Sebanyak 9 isolat kapang endofit berhasil diisolasi dari batang
tanaman T. sumatrana. Setelah melalui proses fermentasi pada medium PDB

selama 3 pekan, campuran ekstrak diklorometana media cair (PDB) hasil
fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari
biomassanya, diuji aktivitas sitotoksik dan dilakukan identifikasi keberadaan
senyawa Taksol pada campuran ekstrak tersebut. Campuran ekstrak dengan label
kapang 3, 5, dan 7 memiliki aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 terhadap larva
udang Artemia salina Leach berturut-turut 13.03 ppm, 3.08 ppm, dan 74.88 ppm.
Ekstrak kapang label 3, 5, dan 7 terbukti menghambat pertumbuhan sel kanker
Serviks (HeLa) pada uji MTT dengan nilai inhibisi pada kisaran 50 %. Pada uji
LC-MS, Ekstrak kapang tidak mengandung Senyawa Taksol.
Kata kunci: kapang endofit, metabolit sekunder, sitotoksik, taksol, T. sumatrana
ABSTRACT
AFFAN IQBAL. Cytotoxicity againt HeLa cells and Identification of Taxol on
Secondary Metabolites of Taxus sumatrana’s Endophytic Fungus Supervised by
HASIM and I MADE ARTIKA.
Taxus sumatrana is a rare plant that it's stem can produce taxol, an
anticancer compound. Scarcity of the plant become the reason for using of it's
endophyte fungus to produce Taxol. The purpose of this research is to test the
cytotoxicity againts HeLa cells of Secondary Metabolites of Taxus sumatrana’s
Endophytic fungus and to identify the presence of Taxol. A total of 9 isolates of
endophytic fungi were isolated from the stems of the plant Taxus sumatrana.

After going through the process of fermentation in PDB medium for 3 weeks, a
mixture of dichloromethane extract liquid medium (PDB) and 80 % ethanol
extract of biomass, tested cytotoxic activity and to identify the presence of Taxol
compounds in the extract mixture. Extract mixture with fungi label 3, 5, and 7
have cytotoxic activity in BSLT test with LC50 values 13:03 ppm 3:08 ppm and
74.88 ppm. Extract fungi label 3, 5, and 7 shown to inhibit the growth of cervical
cancer cells (HeLa) in MTT test with inhibition values in the range of 50 %. At
LC-MS test, no Taxol compound detected
Keyword : cytotoxic, endophytic fungi, secondary metabolite, taxol, Taxus
sumatrana,

SITOTOKSISITAS TERHADAP SEL HeLa DAN
IDENTIFIKASI TAKSOL PADA METABOLIT SEKUNDER
KAPANG ENDOFIT Taxus sumatrana

AFFAN IQBAL

Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains

pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Judul Skripsi : Sitotoksisitas terhadap sel Hela dan Identifikasi Taksol pada
Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatarana.
Nama
: Affan Iqbal
NIM
: G84080022

Disetujui oleh

Dr. drh. Hasim, DEA
Pembimbing I

Dr. Ir. I Made Artika M.App. Sc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr.Ir. I Made Artika, M.App. Sc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, Sang Maha
Pembolak-balik Hati. Dengan Kuasa dan Karunia-Nya telah memberikan pada
penulis kemantapan hati dan kekuatan tekad untuk menghadapi segala hambatan
dan rintangan sehingga proses penyusunan Skripsi ini dapat terselesaikan.
Sholawat serta salam semoga terlimpahkan kepada junjungan nabi besar
Muhammad SAW, yang secara tidak langsung membimbing penulis untuk selalu
berkarya demi kemaslahatan umat manusia.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. drh Hasim, DEA sebagai

dosen pembimbing utama dan Dr. Ir. I Made Artika,M.App.Sc sebagai
pembimbing kedua yang banyak memberi bimbingan dan arahan kepada penulis
dalam melakukan penulisan dan penelitian. Ucapan terimakasih juga penulis
sampaikan kepada DIKTI melalui program PKMP (Program Kreativitas
Mahasiswa Penelitian) telah mendanai penelitian ini dengan judul Produksi Taxol
dengan Kemurnian Tinggi melalui Pemanfaatan Kapang Endofit Tanaman Taxus
sumatrana untuk Skala Industri atas nama Affan Iqbal, Mujiburrahman, dan
Muhammad Syukri. Terima kasih kepada kedua orang tua dan keluarga yang
selalu memberikan dukungan, perhatian dan doa yang sangat berarti bagi penulis.
Terima kasih kepada rekan-rekan selama penelitian, Azmi, Ridho, Kak
Mujib, Bambang, Wira, Bobbi dan seluruh teknisi laboratorium atas masukan,
saran, dan kritik yang membantu dalam penelitian ini. Terima kasih juga penulis
sampaikan kepada seluruh sahabat seperjuangan di Biokimia 45, teman-teman
sebimbingan Puji dan Daviq, teman-teman satu lab Laita, Ines, Didit, Aros Anisa
Utami, Yoan, Dian, Rian, Daniel, Vita, teman-teman Crebs Akos, Tati, Esti,
Ihsan, Ucup, keluarga Resimen Mahasiswa IPB, kawan-kawan Pendekar
PPSDMS Bogor, sedulur PAD 45, dan seluruh sahabat penulis yang tidak dapat
disebutkan satu-persatu atas segala bantuan, motivasi dan semangat yang
diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi para pembaca dan dapat
berkontribusi dalam kemajuan ilmu pengetahuan khususnya di bidang biokimia.

Bogor, Maret 2015

Affan Iqbal

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

vii

DAFTAR GAMBAR

vii

DAFTAR LAMPIRAN

vii

PENDAHULUAN

1

METODE PENELITIAN

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur Penelitian

2

HASIL

5

Isolat Kapang Endofit

5

Ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana.

6

Toksisitas terhadap Larva Udang A. salina Leach (BSLT)

6

Sitotoksisitas terhadap sel HeLa

8

Identifikasi senyawa dengan LC-MS

8

PEMBAHASAN

10

Isolat kapang endofit dan ekstrak metabolit sekunder

10

Toksisitas terhadap larva udang A. salina Leach (BSLT)

11

Sitotoksisitas terhadap sel HeLa

12

Identifikasi senyawa dengan LC-MS

13

SIMPULAN DAN SARAN

16

Simpulan

16

Saran

16

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

19

RIWAYAT HIDUP

30

DAFTAR TABEL
1 Bobot campuran ekstrak diklorometana 1:1 (media PDB) dan ekstrak
etanol 80 % (biomassa kapang endofit Taxus sumatrana) hasil
fermentasi.
2 Persentase (%) kematian larva udang A. salina setelah ditambahkan
ekstrak fermentasi kapang endofit Taxus sumatrana dalam waktu 24
jam
3 Nilai LC50 ekstrak 1,3,5, dan 7 .
4 Sitotoksisitas dengan Metode MTT campuran ekstrak diklorometana
media cair hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana
dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya terhadap pertumbuhan sel
HeLa

6

6
7

8

DAFTAR GAMBAR
1 Kapang endofit hasil isolasi dari batang tanaman Taxus sumatrana pada
media PDA
2 Kurva Hasil Uji Toksisitas BSLT Larva udang A. salina terhadap
ekstrak kapang endofit
3 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus sumatrana label kapang 3 (waktu retensi: 13±0.1 menit)
4 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus sumatrana label kapang 5 (waktu retensi: 15±0.1 menit)
5 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus sumatrana label kapang 7 (waktu retensi: 11±0.1 menit)
6 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus chinensis(waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) (Guo et al.
2006
7 Spektrum massa Taksol (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) (Guo et al.
2006

5
7
9
9
10

13
14

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Strategi Penelitian
Bagan Alir Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Bagan Alir Proses Fermentasi dan Ekstraksi metabolit Sekunder
Kapang Endofit
Bagan Alir Proses Uji BSLT
Perhitungan LC50 BSLT
Tabel Lengkap Hasil Uji MTT
Dokumentasi Foto Fermentasi dan Ekstraksi
Dokumentasi Foto sel HeLa
Perkiraan molekul yang terkandung pada ekstrak kapang endofit
tanaman T. sumatrana

21
22
23
24
25
26
27
28
29

1

PENDAHULUAN
Tiap tahun penderita kanker di Indonesia terus bertambah. Berdasarkan data
rangkuman hasil seluruh pusat patologi di Indonesia mulai tahun 2005 hingga
2009, pasien positif penderita kanker yang tercatat mengalami penambahan ratarata sekitar 2000 penderita pertahun. Tercatat sebanyak 13374 penderita kanker
pada tahun 2005 naik menjadi 22647 penderita pada tahun 2009 (Yayasan Kanker
Indonesia, 2009). Sumber lain adalah dari data Departeman Kesehatan RI (2008)
yang disajikan dalam Profil Kesehatan Indonesia Tahun 2008, pada tahun 2007
prevalensi penyakit kanker di Indonesia mencapai 0.43 %, tiap tahunnya terjadi
200.000 kasus baru yang dilaporkan.
Besarnya jumlah penderita kanker berhubungan erat dengan besarnya
kebutuhan akan obat penyembuhnya. Pengobatan utama saat ini untuk penyakit
kanker adalah operasi dan terapi kimia (Chemotherapy) (DeVita dan Walker
2008). Terapi kimia bertujuan untuk menuntaskan pembersihan sel-sel kanker
setelah operasi. Dalam terapi kimia digunakan senyawa Paclitaxel. Paclitaxel
merupakan nama generik dari merek dagang Taxol produksi perusahaan Bristol
Myer Squibb (NCI 2015). Obat ini cukup mahal dengan harga sekitar Rp.1 juta
tiap 30 mg. Mahalnya Paclitaxel/Taksol karena produk ini merupakan produk
impor dan proses produksi yang sulit. Dengan kondisi seperti ini, diperlukan
usaha untuk memproduksi obat ini secara mandiri untuk menekan harga sehingga
dapat meringankan beban para penderita kanker di Indonesia.
Indonesia berpotensi untuk bisa memproduksi Taksol secara mandiri.
Terdapat tanaman yang tumbuh di indonesia yaitu Taxus sumatrana yang
berpotensi menghasilkan senyawa Taksol. Trisnamurti et al. (2003) dalam
Artanti et al. (2003) berhasil mengidentifikasi senyawa Taksol yang diekstrak dari
batang tanaman T. Sumatrana dengan menggunakan LC-MS (Kromatografi Cair –
Spektrofotometri Massa). Permasalahannya adalah jika senyawa Taksol langsung
diekstrak dari pohonnya akan mengganggu populasi karena tanaman ini tergolong
tanaman langka di habitatnya (Rachmat 2008).
Pemanfaatan kapang endofit dapat menjadi pilihan solusi untuk
memproduksi senyawa Taksol dari tanaman T. sumatrana. Kapang endofit hidup
di dalam jaringan tumbuhan inang dan dapat menghasilkan metabolit sekunder
yang sama atau mirip dengan tanaman inangnya (Strobe et al. 2004). Hal ini
dapat menjawab permasalahan langkanya tanaman T. sumatrana di habitatnya.
Selain itu pengembangan kapang endofit memiliki prospek yang menjanjikan ke
arah industri yang ramah lingkungan, biaya produksi rendah serta terjamin mutu
dan kontinuitas produksinya (Margono 2008). Pada penelitian ini dilakukan isolasi
metabolit sekunder dari kapang endofit yang ditumbuhkan dari tanaman Taxus
sumatrana, uji aktivitas antikanker, serta identifikasi senyawa antikanker dari
metobolit sekunder yang didapat.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas sitotoksik metabolit
sekunder hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana terhadap sel
HeLa dan mengidentifikasi keberadaan senyawa Taksol pada metabolit tersebut.
Manfaat dari penelitian adalah diketahuinya aktivitas sitotoksik dan kandungan
senyawa yang terdapat pada metabolit sekunder hasil produksi kapang endofit
tanaman Taxus sumatrana.

2

METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan utama pada penelitian adalah tumbuhan T. sumatrana yang berasal
dari Kebun Raya Cibodas Bogor. Tanaman ini diambil dari bagian batang untuk
diisolasi kapang endofitnya. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah PDA,
PDB, etanol 70 %, etanol 80 %, etanol 99 %, diklorometana 99 %, larva udang,
air laut, sel kanker, pereaksi MTT, DMSO, dalam HCl 0.1 N, dan akuades.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sentrifus Beckman J
21, kertas alumunium, laminar air flow cabinet, penangas air, lemari es, neraca
analitik, mikropipet, tabung Eppendorf, jarum Ose, kaca sebar, autoklaf, kapas,
vortex, dan seperangkat alat gelas, seperangkat plate BSLT, aerator, 96-well plate,
microplate reader, seperangkat instrumen analisis MTT assay, dan LC-MS
Biospectrometry sistem ESI (Electrospray Ionisation).
Prosedur Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimen laboratorium dengan
menguji aktifitas sitotoksik ekstrak kapang endofit yang disolasi dari batang
tanaman T. sumatrana. Setelah diperoleh ekstrak kapang yang berpotesi memiliki
aktifitas sititoksik, selanjutnya dilakukan identifikasi senyawa yang terkandung
dalam ekstrak dengan instrument LC-MS untuk mendapatkan berat molekul
senyawa dalam ekstrak. Berat molekul yang didapat akan dibandingkan dengan
berat molekul senyawa antikanker Taksol (Paclitaxel) komersil. Secara sistematis
metode penelitian ini terdiri atas isolasi dan pemurnian kapang endofit,
peremajaan kapang, penumbuhan kapang pada media cair, ekstraksi crude
metabolit dari media cair, penapisan awal dengan uji toksisitas BSLT (Brine
Shrimp Letality Test), uji potensi antikanker dengan MTT Assay, dan identifikasi
senyawa taksol dengan LC-MS. Alur metodologi dapat dilihat pada Lampiran 1.
Penelitian ini pada tahap isolasi kapang endofit sampai uji BSLT
dilakukan di Laboratorium Departemen Biokimia IPB pada bulan April-Oktober
2012, sedangkan uji MTT dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata
IPB pada bulan Maret 2013 dan tahap identifikasi senyawa dengan instrumen
LCMS dilakukan di Laboratorium Kimia Puspitek Serpong pada bulan November
2012.
Isolasi dan pemurnian kapang endofit (Croizer et al. 2006)
Batang tanaman T. sumatrana dengan panjang 2 cm dan lebar 1 cm
diambil dari pangkal, tengah dan ujung tanaman, dicuci dengan air mengalir, lalu
dicelupkan berturut-turut ke dalam etanol 70 % selama 1 menit, natrium hipoklorit
5,3 % selama 5 menit, dan etanol 75 % selama 0,5 menit. Di dalam laminar,
bagian batang dibelah dua secara longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan Petri
berisi Media PDA yang telah dicampur dengan kloramfenikol 0,05 mg/mL,
selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada suhu 25 oC. Setelah 3 hari koloni yang

3

tumbuh dipindahkan ke Media PDA baru untuk diinkubasi kembali pada
temperatur yang sama. Pengecekan koloni baru dilakukan setiap 24 jam untuk
pemurnian lebih lanjut.
Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat (Pelczar dan Chan 2008)
Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan secara aseptis di dalam laminar.
Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1
jam kemudian seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar kaca disemprot
dengan etanol teknis. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam
media PDA kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar. Setelah tumbuh,
kapang disimpan kembali dalam agar miring untuk stok penyimpanan selama 3
bulan pada suhu -20 oC.
Penumbuhan Kapang Endofit pada Media Cair (modifikasi Guo et al. 2006)
Isolat kapang yang telah diremajakan masing-masing diinokulasikan ke
dalam labu Erlenmeyer berisi 250 ml media PDB. Tiap labu Erlenmeyer dibiarkan
pada suhu kamar selama 21 hari (Fermentasi statis). Tiap 3 atau 4 hari tabung
dikocok agar udara diatas media dalam tabung tersebar merata.
Ekstraksi Metabolit (modifikasi Guo et al. 2006)
Setelah dilakukan tahap penumbuhan kapang (Fermentasi statis), media cair
dan miselia dipisahkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 g selama 10
menit. Pelet yang merupakan miselia kemudian diresuspensi dengan dengan 100
ml etanol dan digerus dengan glass bead selama 20 menit. Sentrifugasi dilakukan
kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama untuk mengambil supernatannya.
Media cair kultur awal (setelah dipisahkan dengan miselia) diekstraksi dengan
diklorometana pada volume yang sama (250 ml) sebanyak dua kali. Fase organik
yang didapat kemudian dicampurkan dengan supernatan miselia. Campuran
tersebut kemudian diuapkan pada suhu ruang hingga tertinggal residunya. Bobot
ekstrak diperoleh dari selisih antara bobot botol kosong dan bobot botol berisi
ekstrak. Ekstrak didalam botol dipindahkan ke vial yang lebih kecil dengan
dilarutkan terlebih dahulu dengan 1 ml metanol. Stok ekstrak disediakan dalam
bentuk residu kering dan dapat dilarutkan kembali saat akan digunakan dalam ujiuji selanjutnya.
Uji Toksisitas Ekstrak terhadap A. salina Leach (modifikasi Mc Laughlin et
al. 1998)
Penetasan kista A. salina Leach.
Kista A. salina Leach diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB. Kista
ditimbang sebanyak 20 mg kemudian dimasukkan ke dalam wadah khusus yang
berisi air laut yang sudah disaring, setelah diaerasi kista dibiarkan selama 48 jam
dibawah pencahayaan lampu pijar 25 watt agar menetas sempurna. Larva yang
sudah menetas dan memiliki motilitas yang baik (sehat) diambil untuk digunakan
dalam uji toksisitas.

4

Uji toksisitas terhadap A. salina Leach.
Sebanyak 10 ekor larva A. salina Leach yang sehat (berdasarkan motilitas
dan kemampuan larva mencari cahaya) dimasukkan ke dalam vial uji yang berisi
100 L air laut. Larutan ekstrak kapang ditambahkan pada masing-masing vial uji
dengan konsenterasi larutan uji terdiri atas 10, 100, 500 dan 1000 ppm sedangkan
untuk kontrol tidak ditambahkan larutan ekstrak. Masing-masing dibuat dua
ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva
yang mati dari total larva yang dimasukkan dalam vial uji. Penghitungan memakai
bantuan kaca pembesar. Pada uji ini keluaran yang didapat adalah nilai LC50 pada
ekstrak metabolit yang diuji. Untuk memperoleh LC50 pada BSLT sebelumnya
harus didapat nilai % mortalitas (kematian) larva udang terhadap ekstrak.
% Mortalitas =

�

�

�ℎ � � �
�
�ℎ � �

%

Grafik antara log konsentrasi terhadap % mortalitas dibuat sehingga
diperoleh persamaan regresi linier y = ax + b. Nilai LC50 diperoleh dengan
memasukkan nilai y = 50, maka diperoleh konsentrasi senyawa uji yang
menyebabkan kematian 50 % larva.
Uji Potensi antikanker dengan MTT Assay ( modifikasi Kumala et al . 2009)
Kultur sel kanker leher rahim (HeLa) yang telah konfluen yaitu kondisi sel
yang telah merata sebagai sel monolayer sampai menutupi tissue disk, dipanen
dan dipindahkan ke dalam sumur uji (5000 sel/sumur). Selama 24 jam,
normalisasi sel dilakukan dengan inkubasi sel di dalam inkubator CO2 5%
sehingga sel siap untuk diberi perlakukan. Inkubator CO2 5% digunakan untuk
menciptakan lingkungan yang optimal bagi pertumbuhan sel. Sel kemudian dicuci
dengan PBS (Phosphat Buffer Saline). Pencucian dilakukan dengam cara
menambahkan PBS 100 L pada semua sumur kemudian PBS tersebut dibuang
dengan membalikkan plate sumur . Tahap selanjutnya adalah perlakuan sampel
secara triplo dengan seri konsentrasi 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25
ppm, 3.125 ppm dan 1.562 ppm. Selanjutnya, sel diinkubasi selama 48 jam dalam
inkubator CO2 5% kemudian ditambahakan pereaksi MTT (3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,4-difenil tetrazolium bromida) 0,5 mg/mL PBS sebanyak 10 L/sumur
selama 4 jam pada suhu 37o C sampai terbentuk kristal formazan. Sel yang hidup
akan mengkonversi reagen MTT menjadi kristal formazan yang berwarna biru
tua. Setelah formazan terbentuk, reaksi dihentikan dengan stopper 100 L SDS
10% dalam 0,1 N HCl. Formazan yang terbentuk dilarutkan dalam 100 L etanol
96%. Nilai absorbansi atau Optical Density (OD) tiap sumur diukur dengan
microplate reader pada 562 nm. Keluaran yang diperoleh adalah nilai inhibisi
ekstrak uji terhadap pertumbuhan sel kanker HeLa pada konsentrasi tertentu.
% Inhibisi =

�� �� ��
− �� �� �� �
�� �� �� � �

�

�

%

5

Identifikasi berat molekul senyawa ekstak dengan LC-MS (Modifikasi
Ballero et al. 2003.)
Analisis
LC-MS
dilakukan
dengan
menggunakan
instrumen
Biospektrometri Mariner LC: Hitachi L 6200 yang dilengkapi dengan pompa
biner. Instrumen tersebut dikombinasikan dengan sistem ESI (Electrospray
Ionisation). Spesifikasi kolom HPLC untuk analisis adalah Supelco 5 C18, 250 ×
2 mm i.d. Pelarut atau solvent yang digunakan ada dua yaitu solvent A dan B.
Solvent A adalah air dengan 0.3 % asam asetat, dan solvent B adalah metanol
dengan 0.3% asam asetat. Solvent diaplikasikan pada kecepatan alir 0.5 mL/min.
Volume injeksi sampel sebanyak 20 L. Elusi dilakukan dengan cara isokratik
yaitu elusi yang menggunakan perbandingan komponen pelarut yang tetap dari
awal sampai dengan akhir proses.

HASIL
Isolat Kapang Endofit
Kapang endofit mulai tumbuh setelah masa inkubasi selama tiga hari, di
sekitar media tumbuh kapang-kapang dengan variasi warna dan bentuk hifa.
Pemurnian dilakukan untuk memperoleh beberapa isolat yang dibedakan
berdasarkan warna, bentuk, dan morfologi hifa kapang. Pada tahapan ini
diperoleh 9 isolat kapang endofit yang berbeda (Gambar 1). Kesembilan kapang
tersebut diberi label dengan penomoran 1 hingga 9 untuk keperluan tahapan
selanjutnya. Secara morfologi kapang berbeda dengan bakteri. Pada media agar,
bakteri akan tumbuh sebagai materi berlendir sedangkan kapang tidak berlendir,
maka dapat dipastikan organisme tak berlendir yang tumbuh pada media PDA
tersebut adalah kapang.

Gambar 1 Kapang endofit hasil isolasi dari batang tanaman Taxus sumatrana pada
media PDA

6

Ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana.
Berdasarkan prosedur penilitian, ekstrak diperoleh dari hasil fermentasi
kapang endofit dalam 250 mL media cair PDB. Ekstrak tersebut merupakan
campuran dari dua ekstrak yaitu ekstrak diklorometana 1:1 media fermentasi
(media cair PDB) dan ekstrak 80 % etanol biomassa kapang. Berikut ini adalah
sajian data hasil ekstrak kapang label 1 hingga 9 yang diperoleh dari penimbangan
campuran ekstrak yang telah diuapkan (Tabel 1).
Tabel 1 Bobot campuran ekstrak diklorometana 1:1 (media PDB) dan ekstrak
etanol 80 % (biomassa kapang endofit T. sumatrana) hasil fermentasi.
No Kapang

Bobot (g/250
ml kultur)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.224

0.463

0.516

0.344

0.36

0.254

0.197

0.427

0.33

Kesembilan kapang menghasilkan bobot ekstrak yang bervariasi. Bobot
ekstrak paling kecil adalah ekstrak kapang label 1 yaitu 0.224 gram dan yang
paling besar adalah ekstrak kapang label 3 dengan bobot 0.516 gram.
Toksisitas terhadap Larva Udang A. salina Leach (BSLT)
Berikut ini adalah data presentase kematian larva udang A. salina Leach
terhadap masing-masing ekstrak kapang (Tabel 2). Parameter kematian larva
udang dilihat dari motilitasnya. Larva udang yang masih aktif bergerak setelah
masa inkubasi dihitung hidup dan yang tidak bergerak dihitung mati.
Tabel 2 Persentase (%) kematian larva udang A. salina setelah ditambahkan ekstrak
fermentasi kapang endofit T. sumatrana dalam waktu 24 jam
Konsentrasi (ppm)

No kapang
10

50

100

500

1

0

5

25

95

2

0

0

0

0

3

45

70

80

100

4

0

0

0

0

5

60

80

90

100

6

0

0

0

0

7

0

45

60

90

8

0

0

0

0

9

0

0

0

0

7

% Mortalitas

Perolehan data persentase mortalitas larva udang terhadap masing-masing
ekstrak dikelompokkan menjadi dua. Kelompok pertama adalah ekstrak dengan
label 1,3,5, dan 7 yang memiliki bioaktivitas karena dapat menyebabkan
kematian larva udang pada variasi konsentrasi ekstrak yang diujikan. Kelompok
kedua adalah ekstrak dengan label 2, 4, 6, 8, dan 9 yang tidak memiliki
bioaktivitas karena tidak dapat menyebabkan kematian larva udang pada semua
variasi konsentrasi ekstrak yang diujikan.
Kelompok ekstrak yang memiliki bioaktivitas diolah lebih lanjut untuk
dicari nilai LC50-nya. Dibuat kurva garis antara Log K (konsentrasi) dan %
mortalitas larva udang untuk mencari persamaan garis linier dari keempat ekstrak
yang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap larva udang A. salina Leach (Gambar
2).
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10 0

y1 = 47.101x2 - 117.32x + 69.991
y3 = 32.535x + 13.723

kapang 1

y5 = 23.948x + 38.315
kapang 3

y7 = 53.096x - 49.212

kapang 5
kapang 7

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Log K

Gambar 2 Kurva Hasil Uji Toksisitas BSLT Larva udang A. salina terhadap ekstrak
kapang endofit
Nilai LC50 masing-masing ekstrak diperoleh dengan memasukkan nilai y =
50 dari persamaan garis tersebut. Nilai LC50 berturut-turut dari ekstrak kapang
label 1, 3. 5, dan 7 adalah 202 ppm, 13 ppm, 3 ppm, dan 75 ppm (Tabel 3). Tiga
ekstrak dengan toksisitas tertinggi yaitu 3, 5, dan 7 dipilih untuk diujikan pada
uji-uji selanjutnya.
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak 1,3,5, dan 7
no ekstrak kapang
1
3
5
7

LC50 (ppm)
202.7
13.03
3.08
74.88

8

Sitotoksisitas terhadap sel HeLa
Tiga ekstrak kapang dengan toksisitas tertinggi yang telah melalui proses
penapisan awal BSLT yaitu ekstrak kapang 3, 5, 7 diuji aktivitas sitotoksiknya
dengan MTT menggunakan sel Kanker Serviks (HeLa). Hasil uji MTT ini
disajikan dalam Tabel 4 dibawah ini.
Tabel 4 Sitotoksisitas campuran ekstrak diklorometana media cair hasil
fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dan ekstrak etanol
80 % dari biomassanya terhadap pertumbuhan sel HeLa
No ekstrak
kapang

Konsentrasi
(ppm)

Rata-rata OD
(Optical Density)

% Inhibisi

3

100
50
25
12.5
6.25
3.125
1.562
100
50
25
12.5
6.25
3.125
1.562
100
50
25
12.5
6.25
3.125
1.562

0.305
0.371
0.482
0.563
0.678
0.679
0.727
0.368
0.553
0.587
0.591
0.588
0.64
0.728
0.413
0.588
0.538
0.674
0.664
0.527
0.687

58.2
49
33.8
22.7
6.87
6.68
0.14
49.5
24.1
19.4
18.8
19.3
12.1
0
43.3
19.2
26.1
7.4
8.7
27.7
5.7

5

7

Identifikasi senyawa dengan LC-MS
Berikut hasil identifikasi massa senyawa yang terkandung pada campuran
ekstrak diklorometana media cair hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus
sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya dari ekstrak label 3, 5, dan
7.

9

Mariner Spec /69:70 (T /2.60:2.64) -58:60 (T -2.60:2.64) ASC=>NR(2.00)[BP = 144.1, 236]

144.1148

100

235.9

90

% Intensity

80
70
60

50
40
30
261.1074

20

381.0353

10
70.0536

287.0695
235.1097

156.0575
162.1152

0

381.9480

262.0260
231.2

39.0

461.0418

545.9370

423.4

645.0809
615.6

928.4733
0
1000.0

807.8

Mass (m/z)

Gambar 3 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang
Taxus sumatrana label kapang 3 (waktu retensi: 13±0.1 menit)
Mariner Spec /63:64 (T /2.37:2.41) -53:54 (T -2.37:2.41) ASC=>NR(2.00)[BP = 230.8, 17]

230.8483

100

16.8

90

257.9504

% Intensity

80
70
60
50
40

175.0561

30

244.8524
20
221.9170
10
0
39.0

144.0916
163.1316
93.9499

232.9130
231.7902
231.2

299.9210
327.9062

380.7608
397.9928
403.9853

476.7711

423.4

569.3934
615.6

649.5279

750.7224

869.0921

807.8

Mass (m/z)

Gambar 4 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus sumatrana label kapang 5 (waktu retensi: 15±0.1 menit)
Ekstrak kapang label 3 mengandung satu senyawa dengan kelimpahan
terbanyak yaitu senyawa dengan berat molekul 144.11 m/z (Gambar 3).
Senyawa-senyawa lain dengan kelimpahan yang lebih kecil juga terdeteksi.
Senyawa-senyawa tersebut memiliki berat molekul antara 70 m/z hingga 381 m/z.
Satuan m/z adalah satuan yang umum digunakan dalam penentuan massa
senyawa berdasarkan analisis LC-MS. Huruf “m” menunjukkan jumlah massa
atom yang terkandung dalam senyawa dan huruf “z” adalah muatan ion
(McNaught dan Wilkinson 1997). Pada Gambar 4, ekstrak kapang label 5
mengandung 2 senyawa dengan kelimpahan terbanyak yaitu senyawa dengan
berat molekul 230.8 m/z dan 257 m/z. Senyawa - senyawa lain dengan
kelimpahan yang lebih kecil memiliki berat molekul antara 144 m/z hingga 380
m/z. Selanjutnya pada Gambar 5, ekstrak kapang label 7 teridentifikasi 3 senyawa

0

1000.0

10

yang paling melimpah, yaitu senyawa dengan berat molekul 234.85 m/z 207.19
m/z dan 332.82 m/z. Senyawa-senyawa lain dengan kelimpahan yang lebih kecil
teridentifikasi memiliki berat molekul antara 136 m/z hingga 392 m/z. Perlu
diketahui bahwa berat molekul yang tersaji pada spektrum adalah berat molekul
sebenarnya ditambah ion H+ . maka apabila terbaca 144 m/z artinya bobot
molekulnya adalah 143 + ion H+.
Mariner Spec /57:58 (T /2.14:2.18) -51:53 (T -2.14:2.18) ASC=>NR(2.00)[BP = 234.9, 12]

234.8545

100

11.8

90
80

% Intensity

207.1998

70
60

332.8254

50
40
30
20

316.8420

218.9107

136.9760

236.9127

10
0

42.4047

39.0

138.9749

208.1824
231.2

278.8593
281.2355

392.7535
380.9492
353.2385
430.7004

506.2779

569.4071

657.2227 742.6446

615.6

807.8

423.4

836.0870

923.6250

Mass (m/z)

Gambar 5 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak
kapang Taxus sumatrana label kapang 7 (waktu retensi: 11±0.1 menit)

PEMBAHASAN
Isolat kapang endofit dan ekstrak metabolit sekunder
Kapang endofit adalah jenis kapang yang hidup dalam jaringan makhluk
hidup lainnya (Margono 2008). Kapang endofit diketahui mampu memproduksi
metabolit sekunder dengan diversitas yang tinggi. Dalam dua dasawarsa
belakangan ini, berbagai golongan metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid,
kuinon, turunan isokumarin, fenilpropanoid, fenolik, dan senyawa alifatik
berhasil diisolasi dari kultur in vitro kapang endofit (Tan dan Zou 2001; Zhang et
al. 2006). Produksi metabolit sekunder kapang endofit tergolong unik, sebab
kapang ini mampu meniru metabolit yang diproduksi oleh inangnya (Strobe et.al
2004). Target kapang endofit yang diisolasi pada penelitian ini adalah dari
tanaman Taxus sumatrana. Ekstrak batang T. sumatrana diketahui memiliki
potensi antikanker dan senyawa Taksol berhasil diidentifikasi dari ekstrak
tanaman tersebut (Trisnamurti et al. 2003 dalam Artanti et al. 2003). Stierle et al.
(1993) dalam penelitiannya berhasil memproduksi taksol secara in vitro dengan
kapang endofit Taxomyces andreanae yang berasosiasi dengan tumbuhan Taxus
brevifolia. Guo et al. (2006) juga berhasil mengidentifikasi senyawa taksol yang
diekstrak dari kapang endofit hasil isolasi dari tanaman T. chinensis.
Pada penelitian ini, isolasi kapang endofit dilakukan pada batang tanaman
T. sumatrana. Hal ini berdasarkan pada penelitian Artanti et al. (2003) bahwa
ekstrak T. sumatrana yang memiliki aktivitas antikanker terbaik adalah pada

0

1000.0

11

batangnya, dibandingkan dengan bagian tanaman lainnya yaitu ranting dan daun.
Penggunaan Kloramfenikol pada media penumbuhan kapang bertujuan untuk
menghambat pertumbuhan bakteri, karena targetnya adalah kapang. Dari batang
tanaman, setelah melalui tahap pemurnian, diperoleh 9 kapang yang berbeda
morfologi dan warnanya (Gambar 1). Dengan adanya perbedaan morfologi,
warna, dan bentuk hifa kapang, diasumsikan akan menghasilkan variasi hasil
metabolit yang diproduksinya.
Tahap selanjutnya adalah produksi metabolit sekunder dengan metode
fermentasi statis. Kapang-kapang yang sebelumnya tumbuh pada media PDA
diinokulasikan pada media cair PDB. Metabolit sekunder adalah senyawa
metabolit yang
tidak esensial bagi pertumbuhan namun penting untuk
kelangsungan organisme dari ancaman lingkungannya. Metabolit sekunder dapat
ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu
dan lainnya. Senyawa ini tidak selalu dihasilkan, tetapi hanya pada saat
dibutuhkan saja atau pada fase-fase tertentu. Fungsi metabolit sekunder adalah
untuk mempertahankan diri dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan,
misalnya untuk mengatasi hama dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai
molekul sinyal. Singkatnya, metabolit sekunder digunakan organisme untuk
berinteraksi dengan lingkungannya (Verpoorte dan Alfermann 2000). Fermentasi
statis yang dilakukan selama 3 pekan didesain agar kapang endofit mencapai
tahap pertumbuhan stasioner yang mana pada tahap tersebut kapang dapat
memproduksi metabolit sekunder secara optimal.
Setelah 3 pekan masa fermentasi, menurut metode Guo et al. (2006) media
cair PDB dipisahkan dari biomassanya yaitu miselia kapang yang tumbuh selama
massa fermentasi. Media cair diekstrak dengan pelarut diklorometana dan
biomassa diekstrak dengan dengan etanol 80 %. Kedua hasil ekstrak lalu
dicampur. Pencampuran kedua ekstrak ini bertujuan untuk mengumpulkan baik
produk ekstraseluler (media cair) maupun intraseluler (biomassa). Hasil
pencampuran ekstrak diuapkan menjadi residu ekstrak yang dapat ditimbang
untuk persiapan proses uji selanjutnya (Tabel 1).
Toksisitas terhadap larva udang A. salina Leach (BSLT)
BSLT (Brine Shrimp Letahality Test) adalah salah satu metode awal yang
banyak digunakan untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas sitotoksik suatu
senyawa dan ini merupakan metode penapisan bioaktivitas senyawa antikanker
pada ekstrak tanaman. BSLT menggunakan tingkat mortalitas larva udang
Artemia salina L terhadap paparan ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dihitung
sebagai nilai LC50 (letal concentration) ekstrak uji, yaitu konsentrasi ekstrak uji
yang dapat menyebabkan 50% kematian larva udang setelah 24 jam masa
inkubasi. Berdasarkan metode Meyer jika senyawa dengan LC50 < 1000 µg/ml
dapat dianggap sebagai suatu senyawa aktif (Meyer 1982). Artanti et al.(2003)
dalam penelitiannya melaporkan bahwa ekstrak etanol tanaman T. sumatrana pada
bagian kulit batang, ranting, dan daunnya memiliki nilai toksisitas yang cukup
tinggi yaitu 1 ppm pada kulit batang, 25.2 ppm pada ranting,dan 3.7 ppm pada
daunnya.
Pada uji tahap ini, dilakukan sedikit modifikasi pada variasi dosis yag
diberikan. Dosis terbesar yang digunakan adalah 500 ppm. Dosis 1000 ppm tidak
digunakan karena hasil residu ekstrak sangat sedikit (Tabel 1). Berdasarkan Tabel

12

2 yang menyajikan data % persen kematian larva udang terhadap variasi
konsentrasi ekstrak yang diberikan, terlihat bahwa ekstrak kapang 1, 3, 5, dan 7
memiliki bioaktivitas dengan mampu membunuh larva udang pada variasi
konsentrasi yang diberikan, sedangkan ekstrak kapang 2, 4, 6, 8, dan 9 tidak
mampu membunuh larva udang pada semua variasi konsentrasi. Hasil ini dapat
ditafsirkan lebih jelas dengan mengkonversikannya pada nilai LC50.
Nilai LC50 diperoleh dengan membuat persamaan garis antara Log
konsentrasi ekstrak kapang yang memiliki bioaktivitas dengan % kematian larva
udang (Gambar 5). Berdasarkan pada persamaan garis keempat ekstrak, dihitung
nilai LC50-nya dengan memasukkan nilai y = 50. Hasilnya dapat dilihat pada
Tabel 3. Menurut klasifikasi Meyer ekstrak kapang 1 yang memiliki nilai LC50
202.7 ppm termasuk senyawa dengan toksisitas rendah. Ekstrak kapang 3 dan 7
memiliki nilai LC50 sedang (13.3 ppm dan 74.88 ppm) dan ekstrak kapang 5
toksisitasnya tinggi (3.08 ppm).
Sitotoksisitas terhadap sel HeLa
Uji sitotoksisitas adalah evaluasi terstandarisasi untuk menentukan tingkat
bahaya (toksisitas) kandungan bahan yang terkandung dalam suatu material secara
biologis. Dalam pengembangan obat-obatan baru, termasuk agen-agen
kemoterapi, uji sitotoksik digunakan untuk evaluasi preklinik yang penting agar
diketahui potensi bioaktivitasnya. Salah satu uji sitotoksik yang umum digunakan
dalam pengembangan agen kemoterapi adalah MTT assay. MTT assay telah
memenuhi syarat-syarat dalam uji sitotoksisitas antara lain sistem pengujiannya
dapat menghasilkan kurva dosis respon yang reprodusibel dengan viabilitas
rendah, kriteria respon menunjukkan hubungan linier dengan jumlah sel serta
informasi yang didapat dari kurva dosis respon sejalan dengan efek yang muncul
pada in vivo. Prinsip MTT assay adalah terjadinya reduksi garam kuning
tetrazolium MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh
sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam
mitokondria sel-sel yang hidup mereduksi reagen garam kuning MTT larut air
membentuk kristal formazan berwarna biru tua atau ungu yang tidak larut air.
Penambahan reagen stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal
berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan microplate
reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel
hidup, sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel
hidup semakin banyak (Cancer Chemoprevention Research Center 2000).
Uji sitotoksisitas ekstrak kapang dilakukan terhadap pertumbuhan sel
HeLa. Sel HeLa adalah sel yang diisolasi dari seorang wanita bernama Henrietta
Lacks yang meninggal pada usia 31 tahun karena menderita kanker serviks pada
tahun 1950-an. Sel tersebut dikultur dalam laboratorium dan menjadi sel manusia
pertama yang imortal (abadi). Sel HeLa telah banyak membantu para peneliti
dalam penelitan kanker, kloning, pemetaan gen, AIDS, dan penelitan virus (Jiang
et al. 2012).
Hasil dari uji MTT dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai inhibisi terhadap sel
Hela lebih dari 50 % pada kapang label 3. Ekstrak kapang label 5 dan 7 nilai
inhibisinya mendekati 50 %. Ini menyatakan bahwa kapang endofit yang diisolasi
dari batang tanaman T. sumatrana dapat memproduksi senyawa yang aktif dalam
penghambatan pertumbuhan sel HeLa. Penghambatan terbaik pada sel HeLa

13

terjadi dengan penambahan dosis ekstrak label kapang 3. Pada ekstrak kapang 3
dan kapang 5 nilai inhibisi (hambatan) terhadap pertumbuhan sel HeLa terlihat
bersifat dose dependent, yang berarti persentase inhibisi atau hambatan
pertumbuhan sel semakin besar dengan semakin tinggi dosis ekstrak kapang yang
diberikan. Namun pada ekstrak kapang 7 terlihat ada pola yang berbeda, dimana
nilai inhibisi terhadap pertumbuhan sel HeLa tidak linier terhadap dosis yang
diberikan. Pola hambatan yang tidak linier terhadap dosis ekstrak uji pernah
dilaporkan oleh Sumaryono dan Wibowo (2010), yang menguji ekstrak etanol
daun Aglaia elliptica dari fraksi n-heksana dan fraksi air. Inhibisi non linier
terhadap dosis menurut Sumaryono terjadi karena ada dual effect, yaitu senyawa
yang dapat mendorong dan menghambat proliferasi sel, tergantung pada besarnya
konsentrasi senyawa tersebut.
Jika diperhatikan kembali nilai toksisitas terhadap larva udang A. salina
Leach yang tinggi, yang mana larva udang tersebut adalah organisme normal dan
sehat, maka ekstrak kapang yang dihasilkan pada penelitian ini cukup toksik.
Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode invivo untuk mengetahui
potensi lebih lanjut ekstrak kapang dari tanaman T. sumatrana ini dalam
menghambat sel kanker pada hewan coba.
Identifikasi senyawa dengan LC-MS
Taksol adalah senyawa inhibitor mitosis yang memiliki aktivitas yang
sangat baik dalam melawan berbagai macam kanker. Senyawa ini pertama kali
diisolasi dari kulit batang pohon cemara pasifik (Taxus brefivolia) dan lolos uji
keamanan oleh FDA (Food and Drug Administration) pada tahun 1992 ( Wani et
al. 1971; Kohler dan Goldspiel 1994). Senyawa taksol umumnya diproduksi oleh
tanaman bergenus Taxus. Di Indonesia sendiri terdapat tanaman bergenus Taxus
yaitu Taxus sumatrana. Senyawa Taksol berhasil diidentifikasi dari ekstrak batang
tanaman T. sumatrana menggunakan LC-MS (Trisnamurti et al. 2003 didalam
Artanti et al. 2003). Selain dari tanaman bergenus Taxus, senyawa Taksol dapat
diproduksi oleh organisme lain, yaitu kapang endofit. Hal ini pertama kali

Gambar 6. Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang
Taxus chinensis (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) Lingkaran biru adalah
Taksol (M+ H+) dan lingkaran merah adalah Taksol (M+ Na+) (Guo et al.
2006).

14

dilaporkan oleh Stierle et al. (1993) yang mampu memproduksi Taksol dari
kapang endofit Taxomyces andreanae yang disolasi dari batang tanaman Taxus
brevifolia. Guo et al. (2006) juga melaporkan bahwa kapang endofit dari Taxus
chinensis teridentifikasi mampu memproduksi Taksol.
Setelah melalui proses penapisan dan uji toksisitas terhadap sel kanker
HeLa, ekstrak yang diperoleh dari hasil fermentasi perlu dilakukan identifikasi
senyawanya apakah terdapat senyawa taksol atau tidak. Metode identifikasi pada
penelitian ini merujuk pada hasil penelitian Guo et al. (2006) yang
membandingkan hasil uji LC-MS ekstrak kapang dari T. chinensis dengan hasil
LC-MS senyawa taksol komersil.
Hasil analisis LC-MS ekstrak kapang label 3,5, dan 7 pada Gambar 3,
Gambar 4, dan Gambar 5 menunjukkan kandungan senyawa berdasarkan
kelimpahan dan bobot molekulnya. Hasil data ini dibandingkan dengan data
yang diperoleh Guo et al. (2006). Hasil identifikasi Guo merupakan perbandingan
hasil running ekstrak kapang dari T. chinensis dengan senyawa Taksol komersil
yang memiliki bobot molekul 853 m/z (Gambar 6 dan Gambar 7).

Gambar 7. Spektrum massa Taksol (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) Lingkaran
biru adalah Taksol (M+ H+) dan lingkaran merah adalah Taksol (M+
Na+) (Guo et al. 2006).
Penjelasan dari Gambar 6 dan Gambar 7 adalah bahwa pada hasil analisis
spektrum massa senyawa Taksol, teridentifikasi bobot molekul ionnya adalah
854,3 (M+H)+ dan 876,3 (M+Na)+. Tanda M+H dan M+ Na adalah molekul
senyawa yang terikat dengan ion H+ dan ion Na+ jadi bobot molekul Taksol
adalah M yaitu 853.3 m/z (854.3 – 1 atau 876.3 -23). Bobot molekul ion H+ dan
ion Na+ adalah 1 m/z dan 23 m/z.
Dengan membandingkan hasil identifikasi bobot molekul senyawa pada
ekstrak hasil fermentasi kapang endofit T. sumatrana (Gambar 3, Gambar 4, dan
Gambar 5) dengan bobot molekul senyawa taksol (Gambar 7) dan bobot
melokul yang diperoleh Guo et al. (2006) (Gambar 6), tidak teridentifikasi
senyawa dengan bobot molekul 853 m/z atau yang mendekati. Bobot molekul

15

terbesar berturut-turut yang teridentifikasi pada ekstrak kapang label 3, 5, dan 7
berturut-turut pada kisaran 381 m/z, 380 m/z, dan 392 m/z. Tidak
teridentifikasinya senyawa pada bobot molekul 853 m/z menunjukkan tidak ada
senyawa taksol pada ekstrak hasil fermentasi kapang endofit T. sumatrana.
Bobot molekul senyawa-senyawa yang terdeteksi pada spektrum LC-MS
dapat digunakan untuk memperkirakan jenis senyawa yang terkandung di dalam
ekstrak kapang, yaitu dengan menggunakan database massa molekul yang telah
dipublikasikan secara umum. Pada analisis ini digunakan database dari Massbank
(2015), suatu situs online yang menyajikan secara cukup lengkap dan akurat
nama-nama senyawa berdasarkan bobot molekulnya. Hasilnya adalah terdapat
beberapa senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati bobot molekul
senyawa yang terdeteksi pada analisis LC-MS ekstrak kapang yang tersaji pada
Gambar 3, Gambar 4, dan Gambar 5 (dapat dilihat pada Lampiran 9). Misalnya
ekstrak kapang label 3 yang memiliki puncak (peak) spektrum LC-MS pada
144.1148 m/z, dengan memasukkan nilai puncak tersebut pada database,
terdeteksi 3 senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati nilai puncak yaitu
senyawa 1-naphthylamine (BM 143.07350 4) Methyl-5-thiazoleethanol (BM
143.04048) dan Valpromide (BM 143.13101). Ketiga senyawa tersebut setelah
ditelusuri profilnya pada situs NCBI (National Center for Biotechnology
Information) dengan fitur PubChem diketahui bukan senyawa antikanker.
Senyawa-senyawa lain yang memiliki bobot molekul mendekati tiga nilai puncak
spektrum ekstrak kapang label 7 juga tidak ada yang teridentifikasi sebagai agen
antikanker. Penelusuran pada ekstrak kapang label 5 yang memiliki 2 nilai
puncak, teridentifikasi 3 senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati salah
satu nilai puncak dengan bobot molekul 257.9504 m/z yang mana salah satu
senyawa tersebut yaitu 5-Methylcytidine. Senyawa bobot molekul 257.10117
tersebut menurut data PubChem (2015) pernah diujikan untuk menghambat
proliferasi sel kanker Leukemia, walaupun hasilnya tidak signifikan. Perkiraan
kandungan senyawa berdasarkan bobot molekul ini belum dapat digunakan secara
pasti untuk mengidentifikasi jenis senyawanya. Perlu diketahui dahulu golongan
metabolit sekunder dengan uji fitokimia dengan dilanjutkan dengan identifikasi
strukstur senyawanya dengan analisis NMR atau yang lainnya agar diketahui
secara detail jenis senyawa yang ada pada ekstrak kapang endofit.
Tidak teridentifikasinya keberadaan senyawa Taksol pada ekstrak hasil
fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana kemungkinan karena kondisi
lingkungan pertumbuhan kapang tidak memungkinkan untuk memproduksi
Taksol. Substrat-substrat yang tersedia pada media tumbuh kapang mungkin
kurang optimal mendukung produksi metabolit sekunder dari kapang endofit
tanaman T. sumatrana. Kemungkinan lain adalah kapang endofit tersebut tidak
memiliki gen penyandi Taksol yang hanya dimiliki oleh tanaman inangnya saja
atau memiliki gen tapi tidak terekspresi.

16

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Metabolit sekunder dalam campuran ekstrak diklorometana media cair
(PDB) hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana dan ekstrak
metanol 80 % dari biomassanya memiliki potensi aktivitas sitotoksik. Sebanyak
3 dari 9 isolat kapang memiliki kisaran LC50 > 100 ppm terhadap larva udang
Artemia salina Leach dan mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serviks
(HeLa) hingga 50 %. Pada uji identifikasi bobot molekul senyawa dengan LCMS, tidak ditemukan keberadaan senyawa Taksol pada ekstrak hasil fermentasi
kapang endofit tanaman T. sumatrana.

Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi jenis dan
spesies kapang yang diperoleh dari hasil isolasi dari batang tanaman T.
sumatrana. Perlu juga dilakukan pengembangan metode fermentasi dengan
modifikasi media kapang yang bertujuan untuk mengoptimalkan target produk
yang diinginkan. Uji sitotoksisitas ekstrak hasil fermentasi kapang endofit
tanaman Taxus sumatrana terhadap sel kanker dengan mengujikannya secara in
vivo diharapkan dapat memberi informasi lebih lanjut dari potensi ekstrak kapang
endofit untuk dikembangkan menjadi obat antikanker. Terakhir, diperlukan
identifikasi lebih lanjut golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak hasil
fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dengan uji fitokimia kemudian
dilanjutkan dengan analisis struktur molekulnya agar diperoleh profil lengkap dari
senyawa aktif yang diperoleh.

17

DAFTAR PUSTAKA
Artanti N, Djamilah, Lotulung PD, Liswidowati, Minarti, Hanafi M,Kardono
LBS, dan Darmawan A. 2003. Evaluasi potensi ekstrak Taxus sumatrana
dan benalu sebagai anti kanker. Pemaparan Hasil Litbang. Pusat Penelitian
Informatika. LIPI
Ballero M, Loi MC, van Rozendaal EL, van Beek TA, van de Haar C, Poli F, dan
Appendino G. 2003. Analysis of pharmaceutically relevant 17 taxoids inwild
yew trees from Sardinia. Fitoterapia 74:34-39
Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. SOP Uji Sitotoksik metode
MTT. No Dukumen: CCRC-02-010-00. Fakultas Farmasi UGM.
Croizer J, Thomas SE, Aime ME, Evan HC, dan Holmes KA. 2006. Molecular
characterization of fungal endophytic morphospecies isolated from stem and
pods of Theobroma cacao. Plant pathol. 55:783-791
Croteau R, Kutchan TM, dan Lewis NG. 2000. Natural products (secondary
metabolites). Dalam B. Buchanan, W Gruissem, dan R. Joneas edisi
Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant
Biologists, Rockville, MD. 1250–1268.
Curtis L, Lieberman A, Tark MS, Rea W, dan Vetter M. 2004. Adverse healt
effect of indoor molds. Journal of Nutritional & Environment 14(3):261–
274.
Depkes RI 2008. Profil kesehatan Indonesia 2008. [terhubung
berkala].http://www.depkes.go.id/downloads/publikasi/Profil_Kesehatan_In
donesia_2008.pdf [28 Agustus 2012]
DeVita VT dan Walker JE. 2008. A history of cancer chemotherapy. Cancer Res.
68(21)
:
8643-8653
[terhubung
berkala]
http://cancerres.
aacrjournals.org/content/68/21/8643 [14 Maret 2015]
Goodman J dan Walsh V. 2001. The Story of Taxol: Nature and Politics in the
Pursuit of an Anti-Cancer Drug. Cambridge University Press.
Guo BH, Wang YC, Zhou XW, Hu K, Tan F, dan Tang KX. 2006. An endophyte
Taxol-producing fungus BT2 isolated from Taxus chinensis var. mairei.
African Jaournal of Biotechnology 5: 875-877
Jiang H dan Gordon B. 2012. The immortal live of Henrietta Lack and beyond.
[terhubung berkala] http://u.osu.edu/gordon.3/files/2012/06/Hui-Jiang-834spr.-2012.pdf [20 juni 2014]
Kohler J. dan Goldspiel BR. 1994. Evaluation of new drug Paclitaxel (Taxol).
Pharmacotherapy 14: 3-34
Kumala S, Septisetyani EP, dan Meiyanto E. 2009. Fraksi n-butanolik kapang
endofit Buah Makasar meningkatkan efek apoptosis doxorubusin pada sel
MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia. 20:42-47
Margiono S. 2008. Produksi metabolit sekunder (antibiotik) oleh isolat jamur
endofit indonesia. Majalah Farmasi Indonesia. 19(2): 86-94.
MassBank. 2015. High quality mass spectral database [terhubung berkala]
http://www.massbank.jp/index.html [17 Maret 2015]
McNaught AD dan Wilkinson A. 1997. IUPAC. Compendium of Chemical
Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Oxford: Blackwell Scientific
Publications.
Meyer, H.N. 1982. Brine Shrimp Lethality Test: Med. Plant Research. 45: 31-34

18

Mc Laughlin, dan Rogers L. 1998. The use of biological assays to evaluate
botanicals. Drug Information Journal. 32:513-524.
[NCBI] National Centre of Biotechnology Information. 2015. PubChem
[terhubung berkala] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ [18 Maret 2015]
[NCI]
National
Cancer
Institute.
2015.
Taxol
[terhubung
berkala].http://dtp.nci.nih.gov/timeline/flash/success_stories/S2_taxol.htm
[14 Maret 2015]
Pelczar MJ dan Chan EC. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press
PubChem. 2015. Deposited Record (SID 103271758) [terhubung berkala]
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=103271758 [18
Maret 2015]
Rahmat HH. 2008. Variasi genetik dan teknik perbanyakan vegetatif cemara
sumatra (Taxus sumatrana) [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Stierle A, Strobel G, dan Stierle D. 1993. Taxol and taxane production by
Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pasific yew. Sci.260:214216
Strobe G, Daisy, Castill