Potensi Antioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid
POTENSI ANTIOKSIDAN EKSTRAK NANOPARTIKEL
KULIT KAYU MAHONI PADA TIKUS DENGAN
PRAKONDISI DIET KAYA LIPID
DITA MEISYARA
DEPARTEMEN BIOKIMA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antioksidan
Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet
Kaya Lipid adalah bagian dari proyek penelitian Program Strategis Unggulan IPB
tahun 2012 atas nama Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dkk dengan judul Tablet
Ekstrak nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Tersalut Kitosan sebagai Suplemen
Antihiperkolesterolemia untuk Pemanfaatan Hasil Samping Industri Pengolahan
Kayu dan Perikanan. Proyek penelitian ini didanai oleh DIPA IPB dengan nomor
kontrak 62/I3.24.4/SPK-PUS/IPB/2012. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Dita Meisyara
NIM G84080037
ABSTRAK
DITA MEISYARA. Potensi Antioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu
Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid. Dibimbing oleh
SULISTIYANI dan SYAMSUL FALAH.
Penelitian ini bertujuan menguji potensi antioksidan ekstrak nanopartikel air
kulit kayu mahoni secara in vivo. Tikus sebanyak 35 ekor dibagi menjadi 3
kelompok, yaitu tikus normal (5 ekor), tikus yang diberikan ekstrak nanopartikel
dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni (masing-masing 15 ekor). Kelompok ekstrak
nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni mengalami prakondisi dengan
diet kaya lipid selama 12 minggu dan masa perpanjangan percobaan selama 15
minggu sehingga tikus berusia dewasa tua (41 minggu). Ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni masing-masing diberikan dengan dosis 300
mg/KgBB selama 14 hari. Parameter biokimia yang dianalisis adalah lipid
peroksida serum darah tikus dengan metode asam tiobarbiturat (TBA)
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 533 nm. Ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni terbukti memiliki potensi antioksidan, ditunjukkan
oleh penurunan konsentrasi lipid peroksida darah tikus sebesar 44% sedangkan
ekstrak kasarnya hanya 35%.
Kata kunci: antioksidan, kulit kayu mahoni, nanopartikel
ABSTRACT
DITA MEISYARA. The Antioxidant Potency of Nanoparticles Extracts of
Mahogany Bark In Rats Pretreated With High-Lipid Diet. Supervised by
SULISTIYANI and SYAMSUL FALAH.
The aim of this research is to explore the antioxidant potency of
nanoparticles of mahogany bark extracts in vivo. Thirty five rats were divided into
three groups: normal rats (5), nanoparticle extracts- and crude extracts-treated rats
(15 rats for each groups). Nanoparticle extracts- and crude extratcs- treated rats
were preconditioned with high-lipid diet for 12 weeks. The research period was
extended for 15 weeks hence the rats were all old animals (41 weeks old). Crude
extracts and nanoparticles extracts groups were gavaged orally with dose of 300
mg/Kg BW. Lipid peroxide of blood serum was analyzed with thiobarbituric acid
method (TBA) using spectrophotometer at 553 nm. Antioxidant potency of
nanoparticles extracts of mahogany’s bark is showed by 44% reduction of rat’s
blood lipid peroxide whereas the crude extracts only reduce 35%.
Keywords: antioxidant, mahogany bark, nanoparticles
POTENSI ANTIOKSIDAN EKSTRAK NANOPARTIKEL
KULIT KAYU MAHONI PADA TIKUS DENGAN
PRAKONDISI DIET KAYA LIPID
DITA MEISYARA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Potensi Antioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni
Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid
Nama
: Dita Meisyara
NIM
: G84080037
Disetujui oleh
drh Sulistiyani, MSc, PhD
Pembimbing I
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi : Potensi Aniioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni
Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid
: Dita :\Ieis\·ara
Nama
. NIM
: G84080037
Disetujui oleh
drh
Tanggal Lulus:
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
tl 5 FEB 2Gi4
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
petunjuk-Nya sehingga penyusunan skripsi yang berjudul Potensi Antioksidan
Ekstrak nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet
Kaya Lipid dapat diselesaikan. Penelitian ini didanai oleh Program Strategis
Unggulan IPB 2012 atas nama Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dkk.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberi
dukungan dalam penyelesaian usulan penelitian ini. Ucapan terima kasih terutama
kepada drh. Sulistiyani, MSc, PhD dan Dr.Syamsul Falah, SHut, MSi selaku
dosen pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, bimbingan, serta
semangat selama berlangsungnya penelitian dan penyusunan skripsi ini. Ucapan
terima kasih penulis juga sampaikan kepada orang tua dan keluarga atas doa dan
dukungan yang selalu diberikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak
Endang, Bu Merry, Bu Martini, Bu Tuti, Mba Eli, Pak Arya, Pak Nana, Pak Yadi,
juga kepada Banda, Aji, Bia, Isul, Shelly, Yoan, Aros, Nur, Esti, Balsyuk, Nina,
Rian, Faris, Anis, Elisa dan semua pihak yang selalu memberi semangat dan
bantuan kepada penulis.
Demikianlah skripsi ini saya susun. Semoga dapat memberikan manfaat
dalam bidang ilmu pengetahuan, khususnya biokimia kedepannya.
Bogor, Februari 2014
Dita Meisyara
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode
2
HASIL
6
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
6
Stres Oksidatif Pada Hewan Model Berusia Dewasa Tua
7
Bobot Badan dan Lipid Peroksida Darah Hewan Model Selama
Perlakuan Ekstrak Kulit Kayu Mahoni
8
PEMBAHASAN
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
9
9
Stres Oksidatif Pada Hewan Model Berusia Dewasa Tua
10
Bobot Badan Dan Lipid Peroksida Darah Hewan Model Selama
Perlakuan Ekstrak Kulit Kayu Mahoni
11
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
19
DAFTAR TABEL
1 Rerata bobot badan tikus masa pemberian diet kaya lipid
2 Rerata konsentrasi kolesterol serum darah tikus selama
pemberian diet kaya lipid
3 Rerata bobot badan tikus pada masa perpanjangan percobaan
4 Rerata bobot badan tikus selama perlakuan ekstrak
6
6
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Kurva standar TMP
3 Analisis statistik konsentrasi lipid peroksida serum darah sebelum dan
sesudah perlakuan ekstrak antara kelompok normal, ekstrak
nanopartikel, dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni
4 Analisis statistik (T-test) perbandingan nilai lipid peroksida serum
darah sebelum dan sesudah perlakuan ekstrak masing-masing
kelompok
5 Rerata bobot badan tikus selama masa perpanjangan percobaan
6 Perhitungan total zat aktif pada ekstrak nanopartikel
16
18
18
19
20
20
PENDAHULUAN
Gaya hidup yang berkembang di tengah masyarakat saat ini mengakibatkan
kecenderungan untuk memilih makanan cepat saji. Pola makan tersebut dapat
meningkatkan resiko hiperkolesterolemia. Polusi dikota besar dan bertambahnya
usia yang berkaitan erat dengan meningkatnya radikal bebas di dalam tubuh akan
memperparah kondisi hiperkolesterolemia tersebut. Bertumpuknya kolesterol dan
radikal bebas di dalam tubuh akan bereaksi menghasilkan lipid peroksida yang
berbahaya bagi kesehatan dan dapat menimbulkan berbagai penyakit degeneratif,
salah satu contohnya adalah penyakit jantung koroner. Antioksidan merupakan
senyawa yang dapat menghambat atau bahkan menghentikan reaksi pembentukan
lipid peroksida tersebut (Belsare et al. 2010).
Saat ini, pemanfaatan tanaman obat sebagai sumber antioksidan cenderung
dipilih masyarakat karena mudah didapatkan, mudah untuk diolah, dan relatif
lebih ekonomis. Salah satu contohnya adalah mahoni berdaun lebar (Swietenia
macrophylla King.). Kulit kayu mahoni merupakan limbah dari pengolahan kayu
mahoni sehingga pemanfaatannya dapat mengurangi penumpukan limbah di
lingkungan. Falah et al. (2008) melaporkan bahwa kulit kayu mahoni
mengandung senyawa bioaktif, antara lain swietemakrofilanin, katekin, dan,
epikatekin. Senyawa swietemakrofilanin dari kulit kayu mahoni memiliki
aktivitas antioksidan yang tinggi, ditandai dengan nilai IC50 adalah 56 g/mL
(Falah et al. 2008). Menurut Mardisadora (2010), ekstrak air kulit kayu mahoni
dapat menghambat proses autooksidasi asam linoleat dengan nilai hambat terbesar
54.6% pada dosis 200 ppm. Selain itu, ekstrak air kulit kayu mahoni mampu
menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati tikus hiperurisemia sebesar 32.25%
(Nasution 2011). Ekstrak air kulit kayu mahoni juga dapat menurunkan lipid
peroksida hati tikus hiperkolesterolemia sebesar 15.54% pada dosis 300
mg/KgBB (Mutaqin 2012).
Pengujian khasiat ekstrak kulit kayu mahohi sebagai antioksidan secara in
vivo diperlukan hewan model dengan konsentrasi lipid peroksida yang memadai.
Telah terbukti bahwa tikus tua cenderung mengalami penurunan pada antioksidan
endogen utama, yaitu superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase
(Hamid et al. 2010). Hal ini akan mengakibatkan penumpukan radikal bebas pada
tubuh hewan model dan pada kondisi hiperkolesterolemia akan menyerang
kolesterol dan asam lemak tidak jenuh sehingga meningkatkan konsentrasi lipid
peroksida. Menurut Giri (2008), terjadi peningkatan konsentrasi lipid peroksida
secara signifikan sebesar 78.8% pada tikus umur 8 bulan yang diinduksi
hiperkolesterolemia selama 13 minggu. Oleh karena itu, pada penelitian ini
digunakan tikus berusia dewasa tua yang diprakondisikan dengan diet kaya lipid
dengan harapan konsentrasi lipid peroksidanya meningkat. Selanjutnya dilakukan
pengujian terhadap potensi antioksidan ekstrak kulit kayu mahoni dalam
menurunkan lipid peroksida serum darah tikus tersebut.
Ekstrak air kulit kayu mahoni telah terbukti mempunyai aktivitas
antioksidan secara in vivo dan in vitro. Namun hingga saat ini belum dilakukan
upaya peningkatan potensi antioksidan tersebut. Peningkatan potensi kulit kayu
mahoni sebagai antioksidan dalam penelitian ini dilakukan dengan membuatnya
menjadi ekstrak nanopartikel. Nanopartikel dari ekstrak air kulit kayu mahoni
2
diharapkan dapat meningkatkan absorbsi dan spesifikasi obat di dalam darah dan
organ target sehingga dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida darah secara
signifikan (Monharaj & Chen 2006). Penelitian ini bertujuan untuk menguji
potensi antioksidan ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni secara in vivo.
Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni dapat
menurunkan konsentrasi lipid peroksida serum darah tikus dewasa tua melebihi
ekstrak kasarnya. Manfaat penelitian ini yaitu memberikan informasi mengenai
khasiat ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni sebagai suplemen antioksidan
terutama untuk manula.
METODE
Bahan dan Alat
Penelitian ini menggunakan 35 ekor tikus jantan galur Sprague Dawley
berumur 2 bulan yang berasal dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran
Hewan IPB serta kulit batang kayu berumur 30 tahun yang tumbuh di daerah
Sumedang. Kit enzim kolesterol (Cypress Diagnostics) dan reagen asam
tiobarbiturat (TBA) diperoleh dari Laboratorium Penelitian Biokimia, Departemen
Biokimia IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni, standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP),
propiltiourasil (PTU), pakan standar (protein 18%), dan pakan kaya lipid
(kolesterol 1.5%).
Pemeliharaan hewan model bertempat di di Laboratorium Penelitian dan
Kandang Hewan model Departemen Biokimia IPB. Hewan model ditempatkan di
dalam kandang individual terbuat dari plastik lengkap dengan wadah makan dan
minum serta diberi sekam padi sebagai alas. Peralatan yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain, sonde dari bahan stainless steel, rotary vacuum
evaporator, sentrifus klinis buatan Hettich Universal, mikrosentrifus Beckman,
dan spektrofotometer Genesys dari Thermo.
Metode
Preparasi Ekstrak Kasar (Mardisadora 2010) dan Nanopatikel Ekstrak Kulit
Kayu Mahoni (Hermanus 2012)
Sampel ekstrak kasar dan ekstrak nanopartikel kulit kayu mahoni pada
penelitian ini berasal dari penelitian Lusianawati (2012). Ekstrak kasar kulit kayu
mahoni didapatkan dengan cara ekstraksi tradisional, yaitu dengan metode
perebusan dengan air (Mardisadora 2010). Sebelumnya kulit batang mahoni
dibuat serbuk berukuran 40-60 mesh. Serbuk tersebut ditimbang dan ditambah
dengan air (perbandingan 1 gr:10 mL air), lalu dipanaskan pada suhu 100°C
selama 2 jam. Ekstrak yang diperoleh disaring dan filtratnya diuapkan dengan
rotavapor pada suhu 60°C selama 1 jam.
Selanjutnya ekstrak kasar kulit kayu mahoni dibuat menjadi ekstrak
nanopartikel. Prinsip pembuatan nanopartikel adalah usaha mengecilkan ukuran
3
suatu zat menjadi ukuran nano (10-9 meter). Pembuatan nanopartikel pada
penelitian ini menggunakan metode gelasi ionik dengan perlakuan pengecilan
ukuran menggunakan pengaduk magnetik (BPPT 2010). Prinsip pembuatan
nanopartikel dengan metode gelasi ionik adalah terjadinya interaksi elektrostatik
antara campuran dua zat yang berbeda muatan dalam fase cair sehingga
membentuk matriks tiga dimensi dalam ukuran nanometer.
Pada penelitian ini digunakan kitosan yang berperan sebagai muatan positif
dan sodium tripolifosfat (STPP) sebagai muatan negatif. Prosedur lengkapnya
adalah sebagai berikut, sebanyak 4 g kitosan dilarutkan dalam 400 mL asam asetat
1% sehingga diperoleh konsentrasi kitosan 1% (b/v). Larutan diaduk dengan
pengaduk magnetik pada kecepatan 1000 rpm selama 60 menit. Sebanyak 200 L
Tween 80 0.1% ditambahkan sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama
30 menit pada kecepatan 1000 rpm. Setelah itu, ditambahkan 200 mL STPP 1.5%
dengan pipet tetes sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik selama 30
menit. Kemudian sebanyak 4 mL ekstrak 5% ditambahkan ke dalam larutan
sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 15 menit pada kecepatan 1000
rpm. Larutan dikeringkan dengan pengering semprot hingga diperoleh dalam
bentuk serbuk. Kemudian didapatkan rendemen nanopartikel hasil pengeringan
sebesar 3.83 gram dengan zat aktif (ekstrak kasar) yang terkandung dalam tiap
gram nanopartikelnya adalah 0.052 gram. Maka, pencekokan ekstrak nanopartikel
dengan dosis 300 mg/kgBB untuk bobot tikus 300 gram mengandung zat aktif
sebesar 0.0046 gram. Menurut Hosokawa et al. (2007), nanopartikel adalah partikel
dengan ukuran yang lebih kecil dari 400 nm. Bedasarkan analisis ukuran partikel
(particle size analyzer atau PSA) yang telah dilakukan Hermanus (2012), ukuran
ekstrak nanopartikel kulit kayu mahoni adalah 101.11 nm dengan sebaran ukuran
partikel berkisar antara 40.75-338.93 nm.
Hewan Model dan Rancangan Percobaan
Tikus sebagai hewan model diadaptasikan selama 6 minggu untuk
menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Pengukuran bobot badan dilakukan
satu minggu sekali dan sisa pakan ditimbang setiap hari. Kemudian pada hari
terakhir masa adaptasi, tikus dibagi secara acak menjadi 2 kelompok, yaitu
kelompok normal sebanyak 5 ekor dan kelompok perlakuan (hiperkolesterolemia)
sebanyak 30 ekor. Tikus kelompok perlakuan diberikan diet kaya lipid selama 12
minggu kemudian dibagi lagi masing-masing 15 ekor ke dalam dua kelompok
perlakuan ekstrak yaitu, ekstrak nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni.
Kelompok normal hanya diberi pakan standar dan dicekok akuades sampai
akhir masa percobaan. Kelompok perlakuan diberi diet kaya lipid dengan
komposisi, antara lain kolesterol 1.5% (dari tepung kuning telur), lemak kambing
10%, minyak goreng curah 1%, serta dicekok propiltiourasil (PTU) dengan dosis
5 mg/KgBB selama 12 minggu. Pakan standar dan diet kaya lipid diberikan
sebanyak 20 gram/hari. Oleh karena pemberian pakan kaya lipid selama 12
minggu ternyata tidak menghasilkan kondisi hiperkolesterolemia, maka tikus
dipelihara terus sampai berusia dewasa tua disertai dengan wash out yaitu tikus
diberikan pakan standar (20 gram/hari) tanpa kolesterol dan PTU selama 15
minggu. Pemeliharaan tikus sampai berusia dewasa tua bertujuan untuk
memperoleh kondisi stres oksidatif yang diikuti dengan peningkatan konsentrasi
lipid peroksida darah. Sedangkan wash out dilakukan untuk memperoleh kondisi
4
konsentrasi kolesterol yang seragam pada semua kelompok percobaan serta
menghilangkan efek pemberian diet kaya lipid sebelumnya terhadap konsentrasi
lipid peroksida darah.
Selanjutnya kelompok tikus yang telah mengalami stres oksidatif tersebut
dibagi menjadi dua kelompok perlakuan ekstrak yaitu, ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni. Sebagai pembanding digunakan kelompok
normal dari awal percobaan yang tidak diberikan pakan kaya lipid. Pencekokan
ekstrak dilakukan selama 14 hari. Dosis yang diberikan untuk masing-masing
ekstrak adalah 300 mg/KgBB/hari. Penggunaan dosis 300 mg/kgBB untuk kedua
kelompok karena dapat menurunkan konsentrasi kolesterol dengan persentase
terbaik, yaitu 17.53% pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
Ferdiansyah (2012). Penelitian lanjutan oleh Mutaqin (2012) juga menunjukkan
banwa dosis 300 mg/kgBB dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati
tikus hiperkolesterolemia sebesar 15.54%.
Pengambilan Sampel Darah (Richmond 1973) Dan Pengukuran Kolesterol
Darah Total (Allain et al. 1974)
Sebelum dilakukan pengambilan darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu
selama ±16 jam karena puasa akan merangsang katabolisme kolesterol dari pakan.
Oleh karena itu, kolesterol darah tikus normal akan rendah jika dipuasakan
sedangkan tikus dengan kelainan hiperkolesterolemia tidak bisa memecah
kolesterol dari makanan sehingga kolesterol darah akan tetap tinggi meskipun
telah berpuasa (National Cholesterol Education Program 2001). Pengambilan
darah dilakukan setiap dua minggu sekali selama 12 minggu induksi
hiperkolesterolemia kemudian hari terakhir wash out dan perlakuan ekstrak.
Darah tikus diambil dengan cara menyayat ujung ekor tikus. Sebelumnya, ekor
tikus dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70% dan disuntikkan obat
bius lokal lidokain pada daerah subkutan. Darah kemudian ditampung dalam
tabung Eppendorf sebanyak ± 1 mL per tikus. Darah diinkubasi pada 4°C
semalaman kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm dengan jari-jari
rotor 12 cm selama 10 menit. Serum darah digunakan untuk penentuan
konsentrasi kolesterol total dan lipid peroksida.
Konsentrasi kolesterol total darah diukur dengan metode enzimatik
cholesterol oxidase phenol amino phenanzone (CHOD-PAP) menggunakan kit
diagnostik komersial (Cypress Diagnostics). Prinsip pengukuran kolesterol
dengan metode ini melibatkan enzim yang mempunyai kemampuan untuk
mengoksidasi kolesterol dan reaksi berikutnya menghasilkan perubahan warna
yang dapat diukur dengan spektrofotometer. Indikator warna kolorimetri
quinoneimin terbentuk dari reaksi hidrogen peroksida dan fenol yang dikatalisis
oleh enzim peroksidase. Sebanyak 10 l serum darah dicampur dengan 1 mL kit
pereaksi. Larutan dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang (25°C)
sampai terbentuk warna merah muda. Pengukuran kurva standar dibuat dengan
tahapan yang sama dengan pengukuran kolesterol darah. Namun, sampel darah
diganti dengan standar kolesterol dengan konsentrasi 25, 50, 100, 150, dan 200
mg/dL. Blanko dibuat dari 1 mL kit pereaksi tanpa penambahan apapun.
Pengukuran absorban menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
505 nm.
5
Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah (Modifikasi Yagi 1994)
Penentuan Kurva Standar. Kurva standar dibuat menggunakan larutan
1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) yang diasumsikan sebagai malondialdehida
(MDA) yang terbentuk di dalam darah tikus. Malondialdehida adalah senyawa
produk hasil peroksidasi lipid yang akan berikatan dengan asam tiobarbiturat.
Konsentrasi TMP yang diperlukan adalah 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 3 dan 6.0 μM.
Masing-masing konsentrasi standar dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan 0.5
mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam asetat glasial 50%. Campuran
dipanaskan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama 60 menit dan didinginkan
pada suhu ruang. Setiap tabung ditambahkan 0.5 mL akuades dan 2.5 mL larutan
campuran n-butanol:piridin (15:1 v/v) lalu dikocok dengan kuat. Kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Fase organik
yang terdapat pada lapisan atas diambil dan diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum 533 nm menggunakan spektrofotometer. Persamaan garis
yang didapatkan adalah y= 0.0947x + 0.0292.
Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah Tikus. Sebanyak 0.3 mL
serum darah ditempatkan di dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 1.2 mL
H2SO4 1/12N lalu dicampur. Kemudian ditambahkan 0.15 mL asam fosfotungstat
10%. Setelah itu, larutan didiamkan pada suhu ruang selama 5 menit lalu
disentrifus pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 20 menit. Peletnya
dicampur dengan 1.2 mL H2SO4 1/12N, kemudian didiamkan selama 10 menit
pada suhu ruang. Lalu, sebanyak 0.15 mL asam fosfotungstat 10% ditambahkan
dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang kemudian disentrifus pada
kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Peletnya disuspensi dengan 2 mL
akuades dan ditambahkan 0.5 mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam asetat
glasial 50%. Campuran dipanaskan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama
60 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Setiap tabung ditambahkan 0.5 mL
akuades dan 2.5 mL larutan campuran n-butanol:piridin (15:1 v/v) lalu dikocok
dengan kuat. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama
15 menit. Fase organik yang terdapat pada lapisan atas diambil dan diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum 533 nm menggunakan
spektrofotometer. Persamaan garis yang didapatkan adalah y= 0.0947x + 0.0292.
Analisis Data (Mattjik & Sumertajaya 2000)
Rancangan acak lengkap digunakan pada rancangan penelitian ini. Data
yang diperoleh dianalisis dengan metode ANOVA (analysis of variance) pada
tingkat kepercayaan λ5% dan taraf α = 0.05. Model rancangan tersebut menurut
Mattjik & Sumertajaya (2000) adalah Yij = + τ + εi
Keterangan:
Yij
= Konsentrasi lipid peroksida serum darah tikus pada konsentrasi
ekstrak kulit kayu mahoni ke-i dan ulangan ke-j.
= Rataan umum.
τ
= Pengaruh konsentrasi kulit kayu mahoni ke-i, i = 1,2,
εi
= Pengaruh galat pada konsentrasi kulit kayu mahoni ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1,2,...,15
Uji lanjut yang digunakan bila ada perbedaan nyata adalah uji Duncan pada
selang kepercayaan λ0%, taraf α = 0.1. Data dianalisis dengan program SPSS 11.
6
HASIL
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
Bobot badan semua tikus selama masa adaptasi mengalami kenaikan yang
signifikan (p0.05) (Tabel 4). Setelah 7 hari perlakuan ekstrak, rerata bobot badan
menurun pada tikus kelompok ekstrak nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu
mahoni. Namun pada hari ke-14 perlakuan ekstrak, rerata bobot badan kedua
kelompok tersebut mengalami kenaikan. Sedangkan rerata konsumsi pakan tikus
selama masa perlakuan ekstrak masih dalam kondisi normal dengan rerata 17.94
gram. Meskipun adanya penurunan bobot badan pada minggu pertama pemberian
ekstrak namun konsumsi pakan masih dalam kisaran normal. Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian ekstrak mempengaruhi proses penyerapan nutrisi
tikus namun tidak mempengaruhi nafsu makan tikus.
Analisis statistik rerata konsentrasi lipid peroksida darah tikus pada akhir
perpanjangan masa percobaan menjadi data awal (hari ke-0) pada masa perlakuan
ekstrak. Rerata konsentrasi lipid peroksida serum darah pada hari ke-0 kelompok
normal, ekstrak kasar, dan ekstrak nanopartikel masing-masing adalah 7.06±3.42
nmol/mL, 4.90±1.61 nmol/mL, dan 6.7±2.49 nmol/mL. Secara statistik,
konsentasi lipid peroksida ketiganya sama (p>0.05). Analisis lipid peroksida
darah hari ke-14 pemberian ekstrak menunjukkan konsentrasi lipid peroksida
serum darah cenderung menurun pada semua kelompok tikus (Gambar 1). Namun,
secara statistik penurunan yang tejadi pada kelompok normal tidak signifikan
(p>0.05) sehingga dapat dikatakan konsentrasi lipid peroksida serum darah
kelompok normal pada hari ke-0 dan hari ke-14 adalah sama. Penurunan
konsentrasi lipid peroksida serum darah secara signifikan (p
KULIT KAYU MAHONI PADA TIKUS DENGAN
PRAKONDISI DIET KAYA LIPID
DITA MEISYARA
DEPARTEMEN BIOKIMA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Antioksidan
Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet
Kaya Lipid adalah bagian dari proyek penelitian Program Strategis Unggulan IPB
tahun 2012 atas nama Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dkk dengan judul Tablet
Ekstrak nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Tersalut Kitosan sebagai Suplemen
Antihiperkolesterolemia untuk Pemanfaatan Hasil Samping Industri Pengolahan
Kayu dan Perikanan. Proyek penelitian ini didanai oleh DIPA IPB dengan nomor
kontrak 62/I3.24.4/SPK-PUS/IPB/2012. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Dita Meisyara
NIM G84080037
ABSTRAK
DITA MEISYARA. Potensi Antioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu
Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid. Dibimbing oleh
SULISTIYANI dan SYAMSUL FALAH.
Penelitian ini bertujuan menguji potensi antioksidan ekstrak nanopartikel air
kulit kayu mahoni secara in vivo. Tikus sebanyak 35 ekor dibagi menjadi 3
kelompok, yaitu tikus normal (5 ekor), tikus yang diberikan ekstrak nanopartikel
dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni (masing-masing 15 ekor). Kelompok ekstrak
nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni mengalami prakondisi dengan
diet kaya lipid selama 12 minggu dan masa perpanjangan percobaan selama 15
minggu sehingga tikus berusia dewasa tua (41 minggu). Ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni masing-masing diberikan dengan dosis 300
mg/KgBB selama 14 hari. Parameter biokimia yang dianalisis adalah lipid
peroksida serum darah tikus dengan metode asam tiobarbiturat (TBA)
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 533 nm. Ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni terbukti memiliki potensi antioksidan, ditunjukkan
oleh penurunan konsentrasi lipid peroksida darah tikus sebesar 44% sedangkan
ekstrak kasarnya hanya 35%.
Kata kunci: antioksidan, kulit kayu mahoni, nanopartikel
ABSTRACT
DITA MEISYARA. The Antioxidant Potency of Nanoparticles Extracts of
Mahogany Bark In Rats Pretreated With High-Lipid Diet. Supervised by
SULISTIYANI and SYAMSUL FALAH.
The aim of this research is to explore the antioxidant potency of
nanoparticles of mahogany bark extracts in vivo. Thirty five rats were divided into
three groups: normal rats (5), nanoparticle extracts- and crude extracts-treated rats
(15 rats for each groups). Nanoparticle extracts- and crude extratcs- treated rats
were preconditioned with high-lipid diet for 12 weeks. The research period was
extended for 15 weeks hence the rats were all old animals (41 weeks old). Crude
extracts and nanoparticles extracts groups were gavaged orally with dose of 300
mg/Kg BW. Lipid peroxide of blood serum was analyzed with thiobarbituric acid
method (TBA) using spectrophotometer at 553 nm. Antioxidant potency of
nanoparticles extracts of mahogany’s bark is showed by 44% reduction of rat’s
blood lipid peroxide whereas the crude extracts only reduce 35%.
Keywords: antioxidant, mahogany bark, nanoparticles
POTENSI ANTIOKSIDAN EKSTRAK NANOPARTIKEL
KULIT KAYU MAHONI PADA TIKUS DENGAN
PRAKONDISI DIET KAYA LIPID
DITA MEISYARA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Potensi Antioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni
Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid
Nama
: Dita Meisyara
NIM
: G84080037
Disetujui oleh
drh Sulistiyani, MSc, PhD
Pembimbing I
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi : Potensi Aniioksidan Ekstrak Nanopartikel Kulit Kayu Mahoni
Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet Kaya Lipid
: Dita :\Ieis\·ara
Nama
. NIM
: G84080037
Disetujui oleh
drh
Tanggal Lulus:
Dr Syamsul Falah, SHut, MSi
Pembimbing II
tl 5 FEB 2Gi4
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
petunjuk-Nya sehingga penyusunan skripsi yang berjudul Potensi Antioksidan
Ekstrak nanopartikel Kulit Kayu Mahoni Pada Tikus Dengan Prakondisi Diet
Kaya Lipid dapat diselesaikan. Penelitian ini didanai oleh Program Strategis
Unggulan IPB 2012 atas nama Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dkk.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberi
dukungan dalam penyelesaian usulan penelitian ini. Ucapan terima kasih terutama
kepada drh. Sulistiyani, MSc, PhD dan Dr.Syamsul Falah, SHut, MSi selaku
dosen pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, bimbingan, serta
semangat selama berlangsungnya penelitian dan penyusunan skripsi ini. Ucapan
terima kasih penulis juga sampaikan kepada orang tua dan keluarga atas doa dan
dukungan yang selalu diberikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak
Endang, Bu Merry, Bu Martini, Bu Tuti, Mba Eli, Pak Arya, Pak Nana, Pak Yadi,
juga kepada Banda, Aji, Bia, Isul, Shelly, Yoan, Aros, Nur, Esti, Balsyuk, Nina,
Rian, Faris, Anis, Elisa dan semua pihak yang selalu memberi semangat dan
bantuan kepada penulis.
Demikianlah skripsi ini saya susun. Semoga dapat memberikan manfaat
dalam bidang ilmu pengetahuan, khususnya biokimia kedepannya.
Bogor, Februari 2014
Dita Meisyara
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode
2
HASIL
6
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
6
Stres Oksidatif Pada Hewan Model Berusia Dewasa Tua
7
Bobot Badan dan Lipid Peroksida Darah Hewan Model Selama
Perlakuan Ekstrak Kulit Kayu Mahoni
8
PEMBAHASAN
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
9
9
Stres Oksidatif Pada Hewan Model Berusia Dewasa Tua
10
Bobot Badan Dan Lipid Peroksida Darah Hewan Model Selama
Perlakuan Ekstrak Kulit Kayu Mahoni
11
SIMPULAN DAN SARAN
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
19
DAFTAR TABEL
1 Rerata bobot badan tikus masa pemberian diet kaya lipid
2 Rerata konsentrasi kolesterol serum darah tikus selama
pemberian diet kaya lipid
3 Rerata bobot badan tikus pada masa perpanjangan percobaan
4 Rerata bobot badan tikus selama perlakuan ekstrak
6
6
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Kurva standar TMP
3 Analisis statistik konsentrasi lipid peroksida serum darah sebelum dan
sesudah perlakuan ekstrak antara kelompok normal, ekstrak
nanopartikel, dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni
4 Analisis statistik (T-test) perbandingan nilai lipid peroksida serum
darah sebelum dan sesudah perlakuan ekstrak masing-masing
kelompok
5 Rerata bobot badan tikus selama masa perpanjangan percobaan
6 Perhitungan total zat aktif pada ekstrak nanopartikel
16
18
18
19
20
20
PENDAHULUAN
Gaya hidup yang berkembang di tengah masyarakat saat ini mengakibatkan
kecenderungan untuk memilih makanan cepat saji. Pola makan tersebut dapat
meningkatkan resiko hiperkolesterolemia. Polusi dikota besar dan bertambahnya
usia yang berkaitan erat dengan meningkatnya radikal bebas di dalam tubuh akan
memperparah kondisi hiperkolesterolemia tersebut. Bertumpuknya kolesterol dan
radikal bebas di dalam tubuh akan bereaksi menghasilkan lipid peroksida yang
berbahaya bagi kesehatan dan dapat menimbulkan berbagai penyakit degeneratif,
salah satu contohnya adalah penyakit jantung koroner. Antioksidan merupakan
senyawa yang dapat menghambat atau bahkan menghentikan reaksi pembentukan
lipid peroksida tersebut (Belsare et al. 2010).
Saat ini, pemanfaatan tanaman obat sebagai sumber antioksidan cenderung
dipilih masyarakat karena mudah didapatkan, mudah untuk diolah, dan relatif
lebih ekonomis. Salah satu contohnya adalah mahoni berdaun lebar (Swietenia
macrophylla King.). Kulit kayu mahoni merupakan limbah dari pengolahan kayu
mahoni sehingga pemanfaatannya dapat mengurangi penumpukan limbah di
lingkungan. Falah et al. (2008) melaporkan bahwa kulit kayu mahoni
mengandung senyawa bioaktif, antara lain swietemakrofilanin, katekin, dan,
epikatekin. Senyawa swietemakrofilanin dari kulit kayu mahoni memiliki
aktivitas antioksidan yang tinggi, ditandai dengan nilai IC50 adalah 56 g/mL
(Falah et al. 2008). Menurut Mardisadora (2010), ekstrak air kulit kayu mahoni
dapat menghambat proses autooksidasi asam linoleat dengan nilai hambat terbesar
54.6% pada dosis 200 ppm. Selain itu, ekstrak air kulit kayu mahoni mampu
menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati tikus hiperurisemia sebesar 32.25%
(Nasution 2011). Ekstrak air kulit kayu mahoni juga dapat menurunkan lipid
peroksida hati tikus hiperkolesterolemia sebesar 15.54% pada dosis 300
mg/KgBB (Mutaqin 2012).
Pengujian khasiat ekstrak kulit kayu mahohi sebagai antioksidan secara in
vivo diperlukan hewan model dengan konsentrasi lipid peroksida yang memadai.
Telah terbukti bahwa tikus tua cenderung mengalami penurunan pada antioksidan
endogen utama, yaitu superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase
(Hamid et al. 2010). Hal ini akan mengakibatkan penumpukan radikal bebas pada
tubuh hewan model dan pada kondisi hiperkolesterolemia akan menyerang
kolesterol dan asam lemak tidak jenuh sehingga meningkatkan konsentrasi lipid
peroksida. Menurut Giri (2008), terjadi peningkatan konsentrasi lipid peroksida
secara signifikan sebesar 78.8% pada tikus umur 8 bulan yang diinduksi
hiperkolesterolemia selama 13 minggu. Oleh karena itu, pada penelitian ini
digunakan tikus berusia dewasa tua yang diprakondisikan dengan diet kaya lipid
dengan harapan konsentrasi lipid peroksidanya meningkat. Selanjutnya dilakukan
pengujian terhadap potensi antioksidan ekstrak kulit kayu mahoni dalam
menurunkan lipid peroksida serum darah tikus tersebut.
Ekstrak air kulit kayu mahoni telah terbukti mempunyai aktivitas
antioksidan secara in vivo dan in vitro. Namun hingga saat ini belum dilakukan
upaya peningkatan potensi antioksidan tersebut. Peningkatan potensi kulit kayu
mahoni sebagai antioksidan dalam penelitian ini dilakukan dengan membuatnya
menjadi ekstrak nanopartikel. Nanopartikel dari ekstrak air kulit kayu mahoni
2
diharapkan dapat meningkatkan absorbsi dan spesifikasi obat di dalam darah dan
organ target sehingga dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida darah secara
signifikan (Monharaj & Chen 2006). Penelitian ini bertujuan untuk menguji
potensi antioksidan ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni secara in vivo.
Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni dapat
menurunkan konsentrasi lipid peroksida serum darah tikus dewasa tua melebihi
ekstrak kasarnya. Manfaat penelitian ini yaitu memberikan informasi mengenai
khasiat ekstrak nanopartikel air kulit kayu mahoni sebagai suplemen antioksidan
terutama untuk manula.
METODE
Bahan dan Alat
Penelitian ini menggunakan 35 ekor tikus jantan galur Sprague Dawley
berumur 2 bulan yang berasal dari Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran
Hewan IPB serta kulit batang kayu berumur 30 tahun yang tumbuh di daerah
Sumedang. Kit enzim kolesterol (Cypress Diagnostics) dan reagen asam
tiobarbiturat (TBA) diperoleh dari Laboratorium Penelitian Biokimia, Departemen
Biokimia IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni, standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP),
propiltiourasil (PTU), pakan standar (protein 18%), dan pakan kaya lipid
(kolesterol 1.5%).
Pemeliharaan hewan model bertempat di di Laboratorium Penelitian dan
Kandang Hewan model Departemen Biokimia IPB. Hewan model ditempatkan di
dalam kandang individual terbuat dari plastik lengkap dengan wadah makan dan
minum serta diberi sekam padi sebagai alas. Peralatan yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain, sonde dari bahan stainless steel, rotary vacuum
evaporator, sentrifus klinis buatan Hettich Universal, mikrosentrifus Beckman,
dan spektrofotometer Genesys dari Thermo.
Metode
Preparasi Ekstrak Kasar (Mardisadora 2010) dan Nanopatikel Ekstrak Kulit
Kayu Mahoni (Hermanus 2012)
Sampel ekstrak kasar dan ekstrak nanopartikel kulit kayu mahoni pada
penelitian ini berasal dari penelitian Lusianawati (2012). Ekstrak kasar kulit kayu
mahoni didapatkan dengan cara ekstraksi tradisional, yaitu dengan metode
perebusan dengan air (Mardisadora 2010). Sebelumnya kulit batang mahoni
dibuat serbuk berukuran 40-60 mesh. Serbuk tersebut ditimbang dan ditambah
dengan air (perbandingan 1 gr:10 mL air), lalu dipanaskan pada suhu 100°C
selama 2 jam. Ekstrak yang diperoleh disaring dan filtratnya diuapkan dengan
rotavapor pada suhu 60°C selama 1 jam.
Selanjutnya ekstrak kasar kulit kayu mahoni dibuat menjadi ekstrak
nanopartikel. Prinsip pembuatan nanopartikel adalah usaha mengecilkan ukuran
3
suatu zat menjadi ukuran nano (10-9 meter). Pembuatan nanopartikel pada
penelitian ini menggunakan metode gelasi ionik dengan perlakuan pengecilan
ukuran menggunakan pengaduk magnetik (BPPT 2010). Prinsip pembuatan
nanopartikel dengan metode gelasi ionik adalah terjadinya interaksi elektrostatik
antara campuran dua zat yang berbeda muatan dalam fase cair sehingga
membentuk matriks tiga dimensi dalam ukuran nanometer.
Pada penelitian ini digunakan kitosan yang berperan sebagai muatan positif
dan sodium tripolifosfat (STPP) sebagai muatan negatif. Prosedur lengkapnya
adalah sebagai berikut, sebanyak 4 g kitosan dilarutkan dalam 400 mL asam asetat
1% sehingga diperoleh konsentrasi kitosan 1% (b/v). Larutan diaduk dengan
pengaduk magnetik pada kecepatan 1000 rpm selama 60 menit. Sebanyak 200 L
Tween 80 0.1% ditambahkan sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama
30 menit pada kecepatan 1000 rpm. Setelah itu, ditambahkan 200 mL STPP 1.5%
dengan pipet tetes sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik selama 30
menit. Kemudian sebanyak 4 mL ekstrak 5% ditambahkan ke dalam larutan
sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 15 menit pada kecepatan 1000
rpm. Larutan dikeringkan dengan pengering semprot hingga diperoleh dalam
bentuk serbuk. Kemudian didapatkan rendemen nanopartikel hasil pengeringan
sebesar 3.83 gram dengan zat aktif (ekstrak kasar) yang terkandung dalam tiap
gram nanopartikelnya adalah 0.052 gram. Maka, pencekokan ekstrak nanopartikel
dengan dosis 300 mg/kgBB untuk bobot tikus 300 gram mengandung zat aktif
sebesar 0.0046 gram. Menurut Hosokawa et al. (2007), nanopartikel adalah partikel
dengan ukuran yang lebih kecil dari 400 nm. Bedasarkan analisis ukuran partikel
(particle size analyzer atau PSA) yang telah dilakukan Hermanus (2012), ukuran
ekstrak nanopartikel kulit kayu mahoni adalah 101.11 nm dengan sebaran ukuran
partikel berkisar antara 40.75-338.93 nm.
Hewan Model dan Rancangan Percobaan
Tikus sebagai hewan model diadaptasikan selama 6 minggu untuk
menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Pengukuran bobot badan dilakukan
satu minggu sekali dan sisa pakan ditimbang setiap hari. Kemudian pada hari
terakhir masa adaptasi, tikus dibagi secara acak menjadi 2 kelompok, yaitu
kelompok normal sebanyak 5 ekor dan kelompok perlakuan (hiperkolesterolemia)
sebanyak 30 ekor. Tikus kelompok perlakuan diberikan diet kaya lipid selama 12
minggu kemudian dibagi lagi masing-masing 15 ekor ke dalam dua kelompok
perlakuan ekstrak yaitu, ekstrak nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu mahoni.
Kelompok normal hanya diberi pakan standar dan dicekok akuades sampai
akhir masa percobaan. Kelompok perlakuan diberi diet kaya lipid dengan
komposisi, antara lain kolesterol 1.5% (dari tepung kuning telur), lemak kambing
10%, minyak goreng curah 1%, serta dicekok propiltiourasil (PTU) dengan dosis
5 mg/KgBB selama 12 minggu. Pakan standar dan diet kaya lipid diberikan
sebanyak 20 gram/hari. Oleh karena pemberian pakan kaya lipid selama 12
minggu ternyata tidak menghasilkan kondisi hiperkolesterolemia, maka tikus
dipelihara terus sampai berusia dewasa tua disertai dengan wash out yaitu tikus
diberikan pakan standar (20 gram/hari) tanpa kolesterol dan PTU selama 15
minggu. Pemeliharaan tikus sampai berusia dewasa tua bertujuan untuk
memperoleh kondisi stres oksidatif yang diikuti dengan peningkatan konsentrasi
lipid peroksida darah. Sedangkan wash out dilakukan untuk memperoleh kondisi
4
konsentrasi kolesterol yang seragam pada semua kelompok percobaan serta
menghilangkan efek pemberian diet kaya lipid sebelumnya terhadap konsentrasi
lipid peroksida darah.
Selanjutnya kelompok tikus yang telah mengalami stres oksidatif tersebut
dibagi menjadi dua kelompok perlakuan ekstrak yaitu, ekstrak kasar dan ekstrak
nanopartikel kulit kayu mahoni. Sebagai pembanding digunakan kelompok
normal dari awal percobaan yang tidak diberikan pakan kaya lipid. Pencekokan
ekstrak dilakukan selama 14 hari. Dosis yang diberikan untuk masing-masing
ekstrak adalah 300 mg/KgBB/hari. Penggunaan dosis 300 mg/kgBB untuk kedua
kelompok karena dapat menurunkan konsentrasi kolesterol dengan persentase
terbaik, yaitu 17.53% pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
Ferdiansyah (2012). Penelitian lanjutan oleh Mutaqin (2012) juga menunjukkan
banwa dosis 300 mg/kgBB dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida hati
tikus hiperkolesterolemia sebesar 15.54%.
Pengambilan Sampel Darah (Richmond 1973) Dan Pengukuran Kolesterol
Darah Total (Allain et al. 1974)
Sebelum dilakukan pengambilan darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu
selama ±16 jam karena puasa akan merangsang katabolisme kolesterol dari pakan.
Oleh karena itu, kolesterol darah tikus normal akan rendah jika dipuasakan
sedangkan tikus dengan kelainan hiperkolesterolemia tidak bisa memecah
kolesterol dari makanan sehingga kolesterol darah akan tetap tinggi meskipun
telah berpuasa (National Cholesterol Education Program 2001). Pengambilan
darah dilakukan setiap dua minggu sekali selama 12 minggu induksi
hiperkolesterolemia kemudian hari terakhir wash out dan perlakuan ekstrak.
Darah tikus diambil dengan cara menyayat ujung ekor tikus. Sebelumnya, ekor
tikus dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70% dan disuntikkan obat
bius lokal lidokain pada daerah subkutan. Darah kemudian ditampung dalam
tabung Eppendorf sebanyak ± 1 mL per tikus. Darah diinkubasi pada 4°C
semalaman kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm dengan jari-jari
rotor 12 cm selama 10 menit. Serum darah digunakan untuk penentuan
konsentrasi kolesterol total dan lipid peroksida.
Konsentrasi kolesterol total darah diukur dengan metode enzimatik
cholesterol oxidase phenol amino phenanzone (CHOD-PAP) menggunakan kit
diagnostik komersial (Cypress Diagnostics). Prinsip pengukuran kolesterol
dengan metode ini melibatkan enzim yang mempunyai kemampuan untuk
mengoksidasi kolesterol dan reaksi berikutnya menghasilkan perubahan warna
yang dapat diukur dengan spektrofotometer. Indikator warna kolorimetri
quinoneimin terbentuk dari reaksi hidrogen peroksida dan fenol yang dikatalisis
oleh enzim peroksidase. Sebanyak 10 l serum darah dicampur dengan 1 mL kit
pereaksi. Larutan dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang (25°C)
sampai terbentuk warna merah muda. Pengukuran kurva standar dibuat dengan
tahapan yang sama dengan pengukuran kolesterol darah. Namun, sampel darah
diganti dengan standar kolesterol dengan konsentrasi 25, 50, 100, 150, dan 200
mg/dL. Blanko dibuat dari 1 mL kit pereaksi tanpa penambahan apapun.
Pengukuran absorban menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
505 nm.
5
Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah (Modifikasi Yagi 1994)
Penentuan Kurva Standar. Kurva standar dibuat menggunakan larutan
1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) yang diasumsikan sebagai malondialdehida
(MDA) yang terbentuk di dalam darah tikus. Malondialdehida adalah senyawa
produk hasil peroksidasi lipid yang akan berikatan dengan asam tiobarbiturat.
Konsentrasi TMP yang diperlukan adalah 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 3 dan 6.0 μM.
Masing-masing konsentrasi standar dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan 0.5
mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam asetat glasial 50%. Campuran
dipanaskan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama 60 menit dan didinginkan
pada suhu ruang. Setiap tabung ditambahkan 0.5 mL akuades dan 2.5 mL larutan
campuran n-butanol:piridin (15:1 v/v) lalu dikocok dengan kuat. Kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Fase organik
yang terdapat pada lapisan atas diambil dan diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum 533 nm menggunakan spektrofotometer. Persamaan garis
yang didapatkan adalah y= 0.0947x + 0.0292.
Pengukuran Lipid Peroksida Serum Darah Tikus. Sebanyak 0.3 mL
serum darah ditempatkan di dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 1.2 mL
H2SO4 1/12N lalu dicampur. Kemudian ditambahkan 0.15 mL asam fosfotungstat
10%. Setelah itu, larutan didiamkan pada suhu ruang selama 5 menit lalu
disentrifus pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 20 menit. Peletnya
dicampur dengan 1.2 mL H2SO4 1/12N, kemudian didiamkan selama 10 menit
pada suhu ruang. Lalu, sebanyak 0.15 mL asam fosfotungstat 10% ditambahkan
dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang kemudian disentrifus pada
kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama 15 menit. Peletnya disuspensi dengan 2 mL
akuades dan ditambahkan 0.5 mL asam tiobarbiturat (TBA) 1% dalam asam asetat
glasial 50%. Campuran dipanaskan di dalam penangas air bersuhu 95˚C selama
60 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Setiap tabung ditambahkan 0.5 mL
akuades dan 2.5 mL larutan campuran n-butanol:piridin (15:1 v/v) lalu dikocok
dengan kuat. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1600 g (3000 rpm) selama
15 menit. Fase organik yang terdapat pada lapisan atas diambil dan diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum 533 nm menggunakan
spektrofotometer. Persamaan garis yang didapatkan adalah y= 0.0947x + 0.0292.
Analisis Data (Mattjik & Sumertajaya 2000)
Rancangan acak lengkap digunakan pada rancangan penelitian ini. Data
yang diperoleh dianalisis dengan metode ANOVA (analysis of variance) pada
tingkat kepercayaan λ5% dan taraf α = 0.05. Model rancangan tersebut menurut
Mattjik & Sumertajaya (2000) adalah Yij = + τ + εi
Keterangan:
Yij
= Konsentrasi lipid peroksida serum darah tikus pada konsentrasi
ekstrak kulit kayu mahoni ke-i dan ulangan ke-j.
= Rataan umum.
τ
= Pengaruh konsentrasi kulit kayu mahoni ke-i, i = 1,2,
εi
= Pengaruh galat pada konsentrasi kulit kayu mahoni ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1,2,...,15
Uji lanjut yang digunakan bila ada perbedaan nyata adalah uji Duncan pada
selang kepercayaan λ0%, taraf α = 0.1. Data dianalisis dengan program SPSS 11.
6
HASIL
Bobot Badan dan Kolesterol Darah Hewan Model Selama Prakondisi
Dengan Diet Kaya Lipid
Bobot badan semua tikus selama masa adaptasi mengalami kenaikan yang
signifikan (p0.05) (Tabel 4). Setelah 7 hari perlakuan ekstrak, rerata bobot badan
menurun pada tikus kelompok ekstrak nanopartikel dan ekstrak kasar kulit kayu
mahoni. Namun pada hari ke-14 perlakuan ekstrak, rerata bobot badan kedua
kelompok tersebut mengalami kenaikan. Sedangkan rerata konsumsi pakan tikus
selama masa perlakuan ekstrak masih dalam kondisi normal dengan rerata 17.94
gram. Meskipun adanya penurunan bobot badan pada minggu pertama pemberian
ekstrak namun konsumsi pakan masih dalam kisaran normal. Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian ekstrak mempengaruhi proses penyerapan nutrisi
tikus namun tidak mempengaruhi nafsu makan tikus.
Analisis statistik rerata konsentrasi lipid peroksida darah tikus pada akhir
perpanjangan masa percobaan menjadi data awal (hari ke-0) pada masa perlakuan
ekstrak. Rerata konsentrasi lipid peroksida serum darah pada hari ke-0 kelompok
normal, ekstrak kasar, dan ekstrak nanopartikel masing-masing adalah 7.06±3.42
nmol/mL, 4.90±1.61 nmol/mL, dan 6.7±2.49 nmol/mL. Secara statistik,
konsentasi lipid peroksida ketiganya sama (p>0.05). Analisis lipid peroksida
darah hari ke-14 pemberian ekstrak menunjukkan konsentrasi lipid peroksida
serum darah cenderung menurun pada semua kelompok tikus (Gambar 1). Namun,
secara statistik penurunan yang tejadi pada kelompok normal tidak signifikan
(p>0.05) sehingga dapat dikatakan konsentrasi lipid peroksida serum darah
kelompok normal pada hari ke-0 dan hari ke-14 adalah sama. Penurunan
konsentrasi lipid peroksida serum darah secara signifikan (p