Virulensi Bakteri Streptococcus Agalactiae Pada Ikan Nila (Oreochromis Niloticus).
VIRULENSI BAKTERI Streptococcus agalactiae PADA IKAN
NILA (Oreochromis niloticus)
SRI SUPRIYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Virulensi Bakteri Streptococcus
agalactiae pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Sri Supriyanti
NIM C151120031
RINGKASAN
SRI SUPRIYANTI. Virulensi Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila
(Oreochromis niloticus). Dibimbing oleh SUKENDA dan WIDANARNI.
Streptococcus agalactiae merupakan salah satu penyebab penyakit
streptococcosis dan menyebabkan mortalitas yang signifikan pada berbagai jenis
ikan air tawar dan laut di seluruh dunia. Di Indonesia, S. agalactiae telah menyerang
budidaya ikan nila di beberapa daerah antara lain Sumatera Selatan, Jawa Tengah
dan Jawa Barat.
Bakteri yang sangat virulen akan mampu menginfeksi ikan sehat dan
menyebabkan sakit. Faktor virulensi bakteri berkaitan dengan kemampuan bakteri
menginvasi, bereplikasi dan bertahan terhadap sistem pertahanan tubuh inang, serta
kemampuan menyebabkan kerusakan sel selama perkembangan penyakit.
Pengetahuan akan karakteristik virulensi bakteri S. agalactiae akan memberikan
gambaran kemampuan bakteri dalam menginfeksi dan berkembang dalam tubuh
ikan sehingga mampu menyebabkan penyakit pada ikan. Selanjutnya informasi
terkait karakteristik faktor virulensi bakteri dan peranannya dalam patogenisitas
dapat menjadi acuan dalam mengembangkan upaya-upaya pengendalian serangan
S. agalactiae terhadap budidaya ikan nila di Indonesia. Tujuan penelitian ini adalah
untuk menguji virulensi S. agalactiae yang menginfeksi ikan nila dan
mengkarakterisasi faktor-faktor virulensinya yang berperan dalam perkembangan
penyakit.
Empat isolat bakteri (N3M, N4M, N17O dan NK1) diuji tingkat virulensinya
terhadap ikan nila dengan injeksi secara intraperitoneal. Uji in vitro dilakukan untuk
mengetahui karakteristik terkait virulensi, yaitu pengujian resistensi bakteri
terhadap whole blood killing, complement mediated killing serta oksigen reaktif.
Kemudian dilakukan deteksi gen-gen terkait virulensi yaitu suface immunogenic
protein, sip; faktor CAMP, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen binding protein,
fbsA dengan PCR.
Hasil uji virulensi menunjukkan bahwa keempat isolat bakteri bersifat
virulen. NK1 merupakan isolat paling virulen dengan dosis mematikan 50% (LD50)
104.5 CFU/ml, sementara LD50 N3M 107.75 CFU/ml, N4M >108 CFU/ml, dan N17O
106.67 CFU/ml. Keempat isolat bersifat resisten terhadap aktivitas pertahanan tubuh
dalam darah dan serum. Hasil uji blood survival yaitu viabilitas masing-masing
bakteri uji yaitu N3M mencapai 91%, N4M mencapai 158%, N17O mencapai 178%
dan NK1 mencapai 236 % dari kepadatan awalnya. Hasil uji complement mediated
killing menunjukkan semua isolat bakteri uji mampu tumbuh dengan baik dan
mencapai viabilitas lebih dari 100%, baik pada perlakuan serum aktif maupun
serum inaktif. Viabilitas bakteri pada uji sensitivitas terhadap oksigen reaktif yaitu
38% (N3M), 25% (N4M), 35% (N17O) dan 48% (NK1). NK1 merupakan isolat yang
paling resisten terhadap whole blood killing, complement mediated killing dan
pemusnahan oleh oksigen reaktif. Hasil identifikasi dengan PCR menunjukkan
bahwa N3M, N4M, N17O dan NK1 memiliki gen sip, fbsA dan cfb yang berperan
penting dalam menentukan sifat virulensinya.
Kata Kunci : Ikan nila, Streptococcus agalactiae, virulensi
SUMMARY
SRI SUPRIYANTI. Streptococcus agalactiae Virulence in Tilapia (Oreochromis
niloticus). Supervised by SUKENDA and WIDANARNI.
Streptococcus agalactiae is one of the causative agents of streptococcosis
and cause significant mortality in wild and cultured fish species including both
freshwater and marine animals in natural outbreaks throughout the world. In
Indonesia, S. agalactiae was reported causing the disease in tilapia farming in South
Sumatera, Central Java and West Java.
A virulent bacteria can infect healthy fish and cause the disease. Bacterial
virulence factors are related to the invasion, replication and evasion of the host’s
immune system, and cause injuries during pathogenesis of the disease. Study the
virulence characteristics of S. agalactiae allow us to describe the pathogenesis of
S. agalactiae infection. The information related to the virulence characteristics and
the role in the pathogenecity can be a reference in the development of control
measure of streptococcosis in tilapia farm in Indonesia.. The aim of this study was
to examine the virulence of S. agalactiae that infected tilapia (Oreochromis
niloticus) and to characterize the virulence factors that important in pathogenesis.
Four isolates namely N3M, N4M, N17O and NK1, were tested for virulence
levels in tilapia using intraperitoneal injection. In vitro assays were done to verify
the characteristics associated with virulence, such as the bacterial resistance to
whole blood killing, complement-mediated killing and reactive oxygen. The PCR
assay was done to identify genes associated to virulence factors, such as suface
immunogenic protein, sip; CAMP factor, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen
binding protein, fbsA.
The virulence assay showed that NK1 was the most virulent with 104.5
CFU/ml for LD50 value, while LD50 value for N17O, N3M and N4M were 106.67, 107.75
and more than 108 CFU/ml, respectively. In blood survival assay, viability of the
bacteria were 91%, 158%, 178%, 236% of the initial CFU for N3M, N4M, N17O and
NK1 respectively. The complement-mediated killing assay showed that all isolates
were able to grow in the active or inactivated serum, and the viability were more
than 100%. When exposed to reactive oxygen, the viabilitiy of the bacteria were
38%, 25%, 35% and 48% for N3M, N4M, N17O and NK1 respectively. The research
shows that all isolates are virulent and the level of virulence is associated with the
bacteria ability to evade the host’s immune system. NK1 isolate is the most virulent,
and most resistant to whole blood killing, complement-mediated killing and
reactive oxygen killing. The PCR assay shows that all isolates have sip, fbsA and
cfb genes that important for its virulence.
Key words : Streptococcus agalactiae, tilapia, virulence
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
VIRULENSI BAKTERI Streptococcus agalactiae PADA IKAN
NILA (Oreochromis niloticus)
SRI SUPRIYANTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Munti Yuhana, SPi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan Mei - November 2014 ini adalah virulensi
bakteri, dengan judul Virulensi Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila
(Oreochromis niloticus).
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr Ir Sukenda, MSc dan Dr Ir
Widanarni, MSi selaku Komisi Pembimbing, Dr Munti Yuhana, SPi MSi selaku
dosen penguji luar komisi, serta Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi yang telah
memberikan arahan dan masukan dalam penyusunan dan penyempurnaan tesis ini.
Di samping itu penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Agus Somantri dari
Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Ibu Zakiah Widowati,
MSi, Rizky Amalia, SStPi dan rekan-rekan dari Balai Uji Standar Karantina Ikan,
rekan-rekan S2 Ilmu Akuakultur 2012 serta semua pihak yang telah membantu
kelancaran kegiatan penelitian.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Kepala Badan Pengembangan
Sumber Daya Manusia Kementerian Kelautan Perikanan, Kepala Badan Karantina
Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan dan Kepala Pusat
Karantina Ikan atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan
pendidikan melalui program tugas belajar.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, anak-anak, orang tua
dan adik-adik yang telah memberi dukungan selama penulis menyelesaikan
pendidikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Sri Supriyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
v
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penyiapan Ikan Uji
Penyiapan Isolat S. agalactiae
Uji Virulensi Isolat S. agalactiae pada Ikan Nila
Karakterisasi Virulensi Bakteri S. agalactiae
Blood Survival Assay
Complement-mediated Killing Assay
Sensitivitas S. agalactiae terhadap Oksigen Reaktif
Deteksi Gen Terkait Virulensi dengan PCR
Parameter Kualitas Air
Analisis Data
3
3
3
3
4
6
6
6
6
7
8
8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konfirmasi Isolat S. agalactiae
Virulensi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila
Karakteristik Virulensi Bakteri S. agalactiae
Gen Terkait Virulensi Bakteri S. agalactiae
Kualitas Air Pemeliharaan
8
8
8
13
15
17
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
18
18
18
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
21
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Perlakuan dalam uji virulensi bakteri S. agalactiae
Primer yang digunakan untuk deteksi gen-gen virulensi S. agalactiae
Profil siklus amplifikasi DNA gen virulensi S. agalactiae
Waktu kemunculan gejala klinis dan kematian ikan nila pasca injeksi
Tingkat kematian ikan nila pasca injeksi S. agalactiae dan hasil
perhitungan dosis mematikan 50% (LD50)
6 Kualitas air pemeliharaan ikan nila pada uji virulensi S. agalactiae
5
7
7
9
12
17
DAFTAR GAMBAR
1 Perubahan pola berenang ikan pasca injeksi dengan isolat S. agalactiae
2 Perubahan makroskopis pada tubuh ikan pasca injeksi dengan isolat
S. agalactiae
3 Jumlah S. agalactiae isolat N3M, N4M, N17O dan NK1 dalam darah
ikan nila
4 Viabilitas S. agalactiae N3M, N4M, N17O dan NK1 terhadap serum aktif
dan inaktif ikan nila
5 Viabilitas S. agalactiae N3M, N4M, N17O dan NK1 terhadap oksigen
reaktif
6 Hasil deteksi gen virulensi S. agalactiae dengan PCR
10
11
13
14
15
16
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji karakteristik morfologi dan biokimia S. agalactiae sesuai
metode deteksi pada SNI 7545.3 : 2009
2 Hasil uji konfirmasi isolat bakteri S. agalactiae PCR
3 Perkembangan gejala klinis dan kematian ikan pasca injeksi dengan
isolat S. agalactiae
4 Perhitungan LD50 isolat bakteri uji dengan metode Reed & Muench
21
22
23
27
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Streptococcus agalactiae merupakan salah satu jenis bakteri penyebab
penyakit streptococcosis dan menyebabkan mortalitas yang signifikan pada
berbagai jenis ikan air tawar dan laut di seluruh dunia. Robinson dan Meyer (1966)
mengungkapkan bahwa S. agalactiae pertama kali dilaporkan pada tahun 1966,
menginfeksi ikan air tawar golden shiners (Notemigonus crysoleucas) di Atlanta
USA. S. agalactiae telah diisolasi dari 17 spesies ikan termasuk rainbow trout,
seabream, nila, yellow fish, catfish, killfish, menhaden, mullet, dan silver pomfret
(Amal 2011). S. agalactiae termasuk Gram positif, oksidase negatif, katalase
negatif dan isolat menunjukkan hasil negatif pada tes reaksi β-galactosidase, βglucuronidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, β-mannosidase, glycyl-tryptophane
arylamidase, sorbitol, L-arabinosa, D-arabitol, glycogen, melezitos, melibiose dan
hidrolisis starch (Evan et al. 2002).
Penyakit streptococcosis akibat infeksi S. agalactiae beberapa tahun
belakangan ini telah menjadi perhatian karena menyebabkan kerugian pada
kegiatan budidaya ikan nila di Indonesia. S. agalactiae dilaporkan telah menyerang
budidaya ikan nila di beberapa daerah antara lain Sumatera Selatan, Jawa Tengah
dan Jawa Barat (BKIPM 2014). Wabah penyakit streptococcosis ini dapat
disebabkan oleh rendahnya ketahanan tubuh ikan, lingkungan pemeliharaan yang
buruk ataupun pemberian pakan yang kurang baik. Menurut Conroy (2009), S.
agalactiae menginfeksi dan lebih virulen pada kondisi lingkungan dengan suhu
24oC – 29oC. Mengingat suhu perairan di Indonesia umumnya berada pada kisaran
tersebut, maka penyebaran serangan S. agalactiae dapat meningkat bila tidak segera
ditanggulangi.
Pada budidaya ikan secara intensif, faktor lingkungan yang buruk dapat
memicu stres dan mempengaruhi aktivitas sistem pertahanan tubuh ikan, akibatnya
ketika ada patogen dapat dengan mudah terjadi wabah penyakit. Bakteri yang
sangat virulen akan mampu menginfeksi ikan sehat dan menyebabkan sakit. Infeksi
bakteri pada ikan akan direspon pertama kali oleh sistem pertahanan tubuh
nonspesifik (Ellis 2001). Sistem pertahanan tubuh nonspesifik ikan meliputi
pertahanan mekanik dan kimiawi berupa kulit, sisik, lendir dan insang, dan
pertahanan seluler pada darah yaitu makrofag dan leukosit. Virulensi bakteri
berkaitan dengan kemampuan bakteri menginvasi, bereplikasi dan bertahan
terhadap sistem pertahanan tubuh inang, serta kemampuannya menyebabkan
kerusakan sel selama perkembangan penyakit (Vilches et al. 2004). Mempelajari
virulensi bakteri S.agalactiae dan patogenesisnya pada ikan dapat diawali dengan
mempelajari kemampuan bakteri bertahan terhadap sistem pertahanan tubuh ikan
non spesifik terutama pertahanan seluler pada darah. Buchanan et al. (2008)
mengungkapkan uji resistensi S. iniae terhadap sistem pertahanan non spesifik ikan
striped bass secara in vitro dapat menggambarkan tahap perkembangan penyakit
streptococcosis dan hasil uji tersebut dapat menjelaskan perbedaan karakteristik
strain S. iniae.
Karakteristik virulensi bakteri terkait kemampuannya menghindari sistem
pertahanan tubuh inang ditentukan oleh faktor virulensinya. Faktor virulensi bakteri
2
S. agalactiae dapat dibagi menjadi faktor virulensi struktural dan non struktural.
Faktor virulensi struktural dibentuk oleh komponen-komponen penyusun sel baik
komponen permukaan maupun komponen penyusun dinding sel bakteri. Faktor
virulensi tersebut antara lain adalah antigen kapsul polisakarida, antigen protein dan
asam lipoteikoat. Faktor virulensi non struktural (metabolit) yang merupakan
produk ekstraseluler dari bakteri ini antara lain adalah hyaluronidase, protease,
hipurikase, nuclease, C5a-ase, hemolisin dan faktor CAMP (Pritchard and Lin
1993; Edwards dan Baker 1995; Takahashi et al. 1999; Lang dan Palmer 2003).
Zhang et al. (2013) menguraikan bahwa gen terkait virulensi yang terdeteksi pada
analisis genetik S. agalactiae yang diisolasi dari ikan nila (O. niloticus) yaitu
surface immunogenic protein, faktor CAMP, protein C-β dan fibrinogen binding
protein. Sementara itu faktor virulensi C5a peptidase dan laminin-binding surface
protein hanya terdeteksi pada S. agalactiae yang diisolasi dari sapi. Keberadaan
faktor virulensi tersebut dapat diidentifikasi dengan teknik molekuler seperti
polymerase chain reaction (PCR). PCR telah terbukti akurat dan tepat dalam
mengidentifikasi agen penyebab penyakit bakterial hingga level spesies.
Perumusan Masalah
Informasi mengenai karakteristik virulensi bakteri S. agalactiae yang
menginfeksi ikan nila di Indonesia hingga saat ini masih terbatas, dan sejauh ini
yang telah banyak dilakukan adalah penelitian karakteristik faktor virulensi S.
agalactiae yang menginfeksi hewan terestrial dan manusia. Pengetahuan akan
karakterisik virulensi bakteri S. agalactiae akan memberikan gambaran
kemampuan bakteri dalam menginfeksi dan berkembang dalam tubuh ikan
sehingga mampu menyebabkan penyakit pada ikan. Kejelasan karakteristik faktor
virulensi bakteri dan peranannya dalam patogenisitas dapat menjadi acuan dalam
mengembangkan upaya-upaya pengendalian serangan S. agalactiae terhadap
budidaya ikan nila di Indonesia.
Pada penelitian ini dilakukan pengujian virulensi bakteri S. agalactiae isolat
N3M, N4M, N17O, NK1 pada ikan nila dan ketahanan hidupnya terhadap komponen
sistem pertahanan tubuh non spesifik ikan nila secara in vitro. Isolat bakteri
direaksikan dengan darah lengkap ikan nila sebagai sumber pertahanan seluler
nonspesifik, serum sebagai sumber komplemen dan oksigen reaktif yang berperan
dalam pemusnahan antigen.
Kemudian untuk mengetahui faktor virulensi S. agalactiae yang berperan
dalam menghindari sistem pertahanan tubuh inang dilakukan identifikasi gen-gen
terkait virulensi yaitu suface immunogenic protein, sip; faktor CAMP, cfb; protein
C-β, bac; dan fibrinogen binding protein, fbsA dideteksi dengan PCR.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah untuk menguji tingkat virulensi bakteri S. agalactiae
yang menginfeksi ikan nila, mengkarakterisasi virulensi S. agalactiae yang
berperan dalam perkembangan penyakit secara in vitro dan identifikasi gen-gen
terkait virulensi dengan PCR.
3
Manfaat Penelitian
Informasi terkait karakteristik virulensi berguna dalam upaya penanganan
penyakit infeksi oleh S. agalactiae antara lain untuk pengendalian streptococcosis
maupun untuk penelitian lanjutan terkait pengembangan vaksin yang lebih spesifik.
Hal ini akan mendukung upaya pengembangan manajemen kesehatan dalam
kegiatan budidaya ikan nila.
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada Mei – November 2014 di Laboratorium
Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan IPB, Laboratorium Bakteriologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan
Laboratorium Biologi Molekuler Balai Uji Standar Karantina Ikan Kementerian
Kelautan dan Perikanan.
Penyiapan Ikan Uji
Ikan uji adalah ikan nila (Oreochromis niloticus) strain NIRWANA (Nila Ras
Wanayasa) dengan bobot 20.62±0.89 gr, berasal dari Balai Pengembangan Benih
Ikan air Tawar (BPBIAT) Wanayasa. Sebelum diberi perlakuan, ikan uji
diadaptasikan selama 14 hari untuk memastikan ikan sehat dan tidak terserang
streptococcosis berdasarkan pengamatan gejala klinis dan isolasi bakteri dari organ
mata, ginjal dan otak pada media BHIA tidak ditemukan S. agalactiae. Identifikasi
bakteri pada organ ikan dilakukan secara konvensional berdasarkan SNI 7545.3 :
2009 (SNI 2009).
Ikan dipelihara dalam akuarium berukuran 60x40x30 cm3. Selama
pemeliharaan suhu air dipertahankan pada 29oC. Ikan diberi makan secara at
satiation dua kali sehari menggunakan pakan komersial. Penggantian air sebanyak
50% dilakukan dua hari sekali untuk membuang sisa pakan dan sisa metabolisme.
Penyiapan Isolat S. agalactiae
Isolat bakteri S. agalactiae diperoleh dari koleksi Instalasi Penelitian dan
Pengembangan Pengendalian Penyakit Ikan, Depok. Bakteri S. agalactiae yang
digunakan sebanyak 4 isolat yaitu N3M dan N4M yang diisolasi dari mata ikan nila
yang berasal dari Cirata, Jawa Barat, N17O yang diisolasi dari ginjal ikan nila yang
berasal dari Cirata, Jawa Barat, dan NK1 yang diisolasi dari otak ikan nila yang
berasal dari Wadas Lintang, Jawa Tengah. Uji konfirmasi spesies dilakukan dengan
dengan pengujian karakteristik morfologi dan biokima secara konvensional sesuai
SNI 7545.3 : 2009 (SNI 2009) dan dengan polymerase chain reaction (PCR)
(Wongsathein 2012; Delannoy et al. 2013). DNA bakteri diekstrak dengan
pemanasan. Proses amplifikasi DNA bakteri berlangsung dalam campuran sampel
4
25 µl yang terdiri dari 12.5 µl master mix GoTaq®Green (Promega), 8.5 µl nuclease
free water, @ 1 µl primer (reverse dan forward), dan 2 µl template DNA. Primer
spesifik Streptococcus agalactiae yang digunakan yaitu STRA-AgI: 5’-AAGGAA
ACCTGCCATTTG-3’ dan STRA-AgII: 5’-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTA
GAA-3’. Hasil amplifikasi diharapkan memiliki panjang 270bp. Setelah denaturasi
awal pada suhu 95oC selama 15 menit, campuran sampel diamplifikasi 35 siklus,
masing-masing terdiri dari denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, penempelan
primer pada suhu 55oC selama 30 detik, perpanjangan primer pada suhu 72oC
selama 25 detik pemanjangan akhir selama 10 menit pada suhu 72oC, menggunakan
T100 Thermal Cycler Biorad. Hasil amplifikasi dielektroforesis, kemudian
didokumentasikan dengan menggunakan UV documentation (UVITEC).
Stok bakteri S. agalactiae ditumbuhkan pada medium brain heart infusion
agar (BHIA, Merck). Sebelum bakteri digunakan untuk uji virulensi, dilakukan
pasase in vitro sebanyak dua kali dan pasase in vivo sebanyak tiga kali untuk
memperoleh kembali daya patogenisitasnya sesuai kondisi awalnya. Pasase in vitro
dilakukan dengan menggoreskan isolat pada media BHIA. Selanjutnya untuk
pasase in vivo, disiapkan suspensi bakteri dengan mengkultur bakteri S. agalactiae
kedalam media cair Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Merck). Satu ose biakan
bakteri dari media agar dikultur ke dalam 5 ml media BHIB, diinkubasi dalam
shaker waterbath pada suhu 29-30°C dan 140 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam,
diambil 1 ml biakan bakteri dari media kultur cair dan dimasukkan kedalam 9 ml
media BHIB, dinkubasi pada shaker waterbath pada suhu 29-30°C dan 140 rpm
selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap untuk dipergunakan.
Pasase in vivo dilakukan dengan menyuntikkan suspensi bakteri isolat N3M,
N4M, N17O dan NK1 pada ikan uji. Ikan uji disiapkan dalam lima akuarium dengan
kepadatan lima ekor per kuarium, untuk disuntik secara intraperitoneal dengan
empat suspensi isolat yang berbeda dan satu kontrol. Setelah penyuntikan, ikan
diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis atau hampir mati. Ikan sakit
diambil kemudian dilakukan isolasi bakteri dari organ ginjal, mata dan otak. Bakteri
diinokulasi dengan metode penggoresan pada media BHIA dan diinkubasi selama
24 jam. Terhadap koloni yang tumbuh dilakukan pengamatan morfologi koloni,
pewarnaan Gram dan uji karakteristik biokimia untuk memastikan bahwa bakteri
yang tumbuh adalah bakteri yang disuntikkan sebelumnya. Selanjutnya bakteri S.
agalactiae yang diperoleh digores kembali pada media agar, dikultur cair dan
disuntikkan kembali pada ikan uji dengan perlakuan seperti di atas hingga tiga kali.
Uji Virulensi Isolat S. agalactiae pada Ikan Nila
Uji virulensi dilakukan untuk membandingkan tingkat virulensi isolat bakteri
yaitu N3M, N4M, N17O dan NK1 pada ikan. Tingkat virulensi ditentukan
berdasarkan kemunculan gejala klinis, tingkat kematian dan hasil perhitungan dosis
bakteri yang menyebabkan kematian 50% dari jumlah ikan yang diamati (LD50)
(Angka et al. 1995).
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap.
Pengujian dilakukan dengan penyuntikan ikan dengan suspensi bakteri N3M, N4M,
N17O dan NK1 secara intraperitoneal dengan dosis kepadatan berbeda 104 - 108
CFU/ml sebanyak 0.1 ml/ekor dan untuk kontrol disuntik dengan PBS 0.1 ml (Tabel
1). Setiap perlakuan terdiri dari 10 ekor ikan. Perlakuan diulang tiga kali. Ikan
5
dipelihara selama 14 hari dalam akuarium dengan volume air 45 liter, diberi pakan
komersil secara at satiation. Selama pemeliharaan suhu air dipertahankan pada
29oC. Penggantian air sebanyak 50% dilakukan dua hari sekali untuk membuang
sisa pakan dan sisa metabolisme.
Tabel 1 Perlakuan dalam uji virulensi bakteri S. agalactiae
Isolat
N3M
N4M
N17O
NK1
Kepadatan bakteri
(CFU/ml)
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
Kode Perlakuan
A41, A42, A43
A51, A52, A53
A61, A62, A63
A71, A72, A73
A81, A82,A83
A01, A02, A03
B41, B42, B43
B51, B52, B53
B61, B62, B63
B71, B72, B73
B81, B82, B83
B01, B02, B03
C41, C42, C43
C51, C52, C53
C61, C62, C63
C71, C72, C73
C81, C82, C83
C01, C02, C03
D41, D42, D43
D51, D52, D53
D61, D62, D63
D71, D72, D73
D81, D82, D83
D01, D02, D03
Parameter yang diamati dalam uji virulensi ini antara lain:
1. Perubahan pola berenang: di permukaan, melayang atau di dasar akuarium,
berenang lemah atau agresif, cara berenang berputar atau tidak beraturan.
Pengamatan dilakukan selama 5 menit.
2. Perubahan yang diamati pada anatomi luar berupa kondisi mata, warna tubuh,
pendarahan atau kelainan lainnya.
3. Mortalitas dicatat dan dihitung dengan rumus berikut:
Tingkat kematian % =
Jumlah ikan mati
x
Jumlah populasi ikan
%
6
4. Penentuan dosis yang menyebabkan kematian 50% jumlah ikan yang diamati
(LD50) dihitung sesuai metode Reed & Muench (1938), yaitu:
A−
A−B
Log negatif LD50 = C + selang proporsi
Selang proporsi =
Keterangan:
A = Kematian diatas 50%
B = Kematian dibawah 50%
C = Log negatif dosis yang menyebabkan kematian di atas 50%
Karakterisasi Virulensi Bakteri S. agalactiae
Blood Survival Assay
Blood survival assay merupakan pengujian kemampuan bakteri hidup dalam
darah inang. Prosedur uji dikerjakan berdasarkan Blood survival assay yang
dilakukan oleh Buchanan et al. (2008), yaitu suspensi S. agalactiae 102 CFU dalam
700 µl PBS, ditambahkan ke dalam 300 µl darah ikan nila dan diinkubasi selama 1
jam pada suhu 28-30oC dengan agitasi. Setelah masa inkubasi, suspensi bakteri
diencerkan dan jumlah bakteri yang hidup dihitung dengan metode cawan tuang
dengan media BHIA. Perlakuan dilakukan terhadap setiap jenis bakteri dengan tiga
ulangan. Sebagai kontrol, metode cawan tuang juga dilakukan pada darah tanpa
penambahan bakteri maupun pada suspensi bakteri tanpa penambahan darah ikan.
Complement-mediated Killing Assay
Complement-mediated killing assay merupakan pengujian untuk mengetahui
kemampuan bakteri menghadapi komplemen yang terdapat dalam serum. Uji ini
dikerjakan berdasarkan Complement-mediated Killing Assay yang dilakukan oleh
Buchanan et al. (2008), yaitu sebanyak 3 ml darah diambil dari ikan nila, dibiarkan
menggumpal, dan disimpan pada suhu 4oC selama 1 jam 30 menit, kemudian
disentrifuse pada 3000 x g pada suhu 4oC selama 10 menit. Serum yang diperoleh
diambil dan disentrifus kembali. Sebagian serum diinaktivasi dengan pemanasan
pada suhu 60oC selama 30 menit. Suspensi bakteri 105 CFU/ml sebanyak 1 ml
ditambahkan ke dalam 150 µl serum aktif maupun inaktif. Sampel divorteks,
diinkubasi pada suhu 28oC selama 2 jam. Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah
bakteri yang hidup dengan metode cawan tuang pada media BHIA.
Sensitivitas S. agalactiae terhadap Oksigen Reaktif
Pengujian sensitivitas S. agalactiae terhadap oksigen reaktif dilakukan sesuai
dengan prosedur uji sensitivitas terhadap oksigen singlet yang dilakukan oleh
Buchanan et al. (2008). Suspensi S. agalactiae dengan kepadatan 107 CFU/ml
diinkubasi dengan 2 µg/ml methylene blue dan diletakkan 20 cm dari sumber
cahaya 100 Watt. Sebagai kontrol, suspensi bakteri tanpa pemberian methylene blue
juga diletakkan 20 cm dari sumber cahaya 100W dan suspensi bakteri dengan/tanpa
methylene blue dibungkus dengan aluminium foil agar tidak terpapar cahaya. Untuk
mengetahui viabilitas bakteri, setelah 1 jam masa inkubasi, dilakukan perhitungan
jumlah bakteri dengan metode cawan tuang pada media BHIA.
7
Deteksi Gen Terkait Virulensi dengan PCR
Gen-gen terkait virulensi antara lain gen surface immunogenic protein, sip;
faktor CAMP, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen binding protein, fbsA di deteksi
dengan PCR menggunakan primer spesifik.
Isolat bakteri yang digunakan telah dikultur selama 48 jam. Sebanyak 10-20
koloni diambil dan dimasukkan ke dalam mikrotube yang berisi 400 µl RNAse free
water. Ekstraksi DNA dilakukan dengan memanaskan mikrotube yang berisi koloni
bakteri dalam 400 µl RNAse free water pada suhu 98oC selama 10 menit
menggunakan thermostat dan sesekali divortex. Kemudian sampel disentrifugasi
pada 8000 x g selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil sebanyak 300
µl, ditempatkan dalam mikrotube baru dan disimpan pada suhu -20oC sampai
digunakan.
Primer yang digunakan untuk mendeteksi serta gen-gen virulensi bakteri S.
agalactiae seperti pada Tabel 2.
Tabel 2 Primer yang digunakan untuk deteksi gen-gen virulensi S. agalactiae
Primer
Panjang
(bp)
339
Sekuen
Referensi
sip
sip-F
sip-R
GTTAAACCAACTCAGACGTCAG
TTCAGGATGTGCAGCTACTGC
Zhang et
al. 2013
bac
bac-F
bac-R
TGTAAAGGACGATAGTGTGAAGAC
CATTTGTGATTCCCTTTTGC
530
Duarte et
al. 2005
cfb
cfbS
cfbA
CGACAGCATCACACGAAAAATACA
TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA
900
Ye et al.
2011
fbsA
fbsA86
ATCAAGTCCTGTATCTGCTAT
fbsA555rc TTCATTGCGTCTCAAACCG
420
Rosenau et
al. 2007
Tabel 3 Profil siklus amplifikasi DNA gen virulensi S. agalactiae
Primer
denaturasi
awal
denaturasi
annealing
elongasi
elongasi
akhir
sip-F
sip-R
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
52oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
bac-F
bac-R
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
50oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
cfbS
cfbA
94oC, 5m
30 siklus , 94oC,
30 detik
55oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
fbsA86
fbsA555rc
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
55oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
Proses amplifikasi DNA bakteri berlangsung dalam campuran sampel
sebanyak 25 µl yang terdiri dari: 12.5 µl master mix GoTaq®Green (Promega), 8.5
µl nuclease free water, @ 1 µl primer (reverse dan forward), dan 2 µl template
8
DNA. Proses amplifikasi dilakukan menggunakan T100 Thermal Cycler Biorad,
dengan profil siklus amplifikasi seperti pada Tabel 3. Untuk mendeteksi hasil
amplifikasi, 10 µl amplicon ditambah 4 µl Sybrsafe kemudian dielektroforesis pada
gel agarose 1.5% dalam buffer 1x Tris-acetate-EDTA (220V selama 30 menit).
Selanjutnya hasil elektroforesis diamati dan didokumentasikan dengan
menggunakan UV documentation (UVITEC).
Parameter Kualitas Air
Pengukuran parameter kualitas air dilakukan untuk menjamin bahwa kualitas
air pemeliharaan ikan selama uji virulensi memenuhi syarat kelayakan hidup ikan
nila (SNI 7550, 2009) dan tidak mempengaruhi hasil pengamatan. Parameter yang
diukur yaitu suhu, pH, oksigen terlarut dan amoniak.
Analisis Data
Data tingkat kematian ikan dan viabilitas bakteri diuji dengan analisis ragam
(ANOVA) dan uji lanjut Tukey dengan signifikansi 0.05 menggunakan Minitab 16.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konfirmasi Isolat S. agalactiae
Empat isolat Streptococcus agalactiae yang digunakan dalam penelitian ini,
secara fenotip memiliki memiliki ciri koloni berbentuk bulat kecil (pin point), putih,
dan sedikit berlendir (lengket). Pada agar darah, keempat isolat tidak membentuk
zona hemolisis (non-hemolitik). Uji Gram menunjukkan keempat isolat adalah
bakteri kokus gram positif dan membentuk rantai. Keempatnya bersifat
katalase/oksidasi negatif, non motil, mampu tumbuh pada media TSA+NaCl 6.5%
(Lampiran 1). Hasil uji PCR menunjukkan bahwa isolat bakteri uji adalah S.
agalactiae (Lampiran 2).
Virulensi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila
Uji tantang ikan dengan S. agalactiae isolat N3M, N4M, N17O dan NK1
menunjukkan bahwa keempat isolat bakteri bersifat virulen. Gejala klinis yang
muncul akibat infeksi keempat isolat secara umum sama yaitu diawali dengan
respon terhadap pakan yang menurun, perubahan pola berenang serta perubahan
warna permukaan tubuh menghitam. Gejala yang muncul selanjutnya adalah
berenang gasping (tegak, berusaha mengambil udara dibawah permukaan air),
whirling (berputar-putar), bentuk tubuh melengkung menyerupai huruf C, mata
mengkerut, opacity, purulen, dan eksoptalmia. Gejala ini sesuai hasil penelitian
Hardi et al. (2011) bahwa setelah diinjeksi S. agalactiae, sebelum mati, ikan nila
berenang tidak beraturan, soliter, berenang gasping dan whirling, respon terhadap
9
pakan lambat, permukaan tubuh lebih hitam, mata mengkerut, purulen, opacity, dan
eksoptalmia.
Pengamatan selama uji virulensi menunjukkan bahwa kemunculan gejala
klinis dan kematian ikan yang terjadi tergantung pada jenis isolat dan dosis bakteri
yang disuntikkan (Tabel 4). Hasil pengamatan gejala klinis dan kematian diuraikan
pada Lampiran 3. Gejala klinis pada ikan yang diinjeksi NK1 pertama kali muncul
pada hari ke-1 sampai ke-3 pasca injeksi. Gejala klinis pada ikan yang diinjeksi
dengan N3M dan N4M pertama kali muncul pada hari ke-3 sampai ke-6 pasca
injeksi. Sementara itu pada ikan yang diinjeksi dengan N17O, gejala klinis mulai
tampak pada hari ke-3 sampai ke-5 pasca injeksi.
Tabel 4 Waktu kemunculan gejala klinis dan kematian ikan nila pasca injeksi
dengan S. agalactiae
Isolat
Dosis
K
N3M
-
-
-
10
4
-
-
-
gk gk
10
5
-
-
-
10
6
-
-
gk
1
1
107
-
-
1
gk
8
-
-
gk
10
K
N4M
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
2
1
1
2
1
1
1
-
-
gk gk gk gk
2
3
3
2
2
-
1
2
gk gk gk
3
1
gk
1
1
1
1
1
1
2
gk
1
gk
1
1
2
1
1
3
1
3
3
gk gk
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
-
-
-
-
-
gk gk gk
1
1
1
1
1
-
10
5
-
-
-
-
1
gk
1
1
gk gk
2
-
-
-
106
-
-
-
-
gk gk gk
1
1
1
1
1
1
1
10
7
-
-
gk
1
gk gk
1
1
1
4
gk
1
1
-
10
8
-
-
gk
1
gk
2
2
2
3
gk
2
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
4
-
-
-
-
gk
1
2
1
2
2
2
2
-
-
10
5
-
-
-
-
gk gk gk
1
2
2
1
2
1
2
106
-
-
-
10
7
-
-
10
8
-
K
gk gk
3
1
2
4
1
2
-
-
-
gk
3
1
2
3
1
2
1
1
1
1
-
-
gk
3
3
1
2
gk
2
1
2
1
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
-
1
gk gk
1
1
2
2
1
3
1
1
gk
1
105
-
gk
10
NK1
-
4
K
N17O
Kemunculan gejala klinis dan jumlah kematian ikan (ekor)
pada hari ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
2
gk
2
2
2
1
2
1
1
1
gk
2
10
6
gk gk gk
3
1
gk
2
1
2
gk
1
1
2
4
10
7
gk gk
1
1
gk
3
3
3
1
2
3
gk
1
gk
10
8
gk gk
1
3
3
3
2
2
2
2
2
1
1
gk
keterangan: gk = gejala klinis (terinci dalam Lampiran 3), 1-4 = jumlah ikan mati
10
Perubahan pola berenang pada ikan nila pasca injeksi S. agalactiae diawali
dengan tingkah laku berenang tidak beraturan, diam di dasar atau sudut akuarium,
dan diikuti dengan gasping dan whirling (Gambar 1). Perubahan pola berenang
yang khas pada serangan S. agalactiae yaitu berenang whirling, mulai muncul pada
hari ke-5 pasca injeksi, pada ikan yang diinjeksi isolat NK1 dengan dosis 108
CFU/ml. Gejala whirling juga dapat diamati pada ikan yang diinjeksi dengan dosis
yang lebih rendah maupun pada ikan yang diinjeksi dengan isolat lainnya. Ikan
yang diinjeksi isolat N17O dan N3M dengan dosis 106, 107 dan 108 CFU/ml
menampakkan gejala whirling pada hari ke-6 pasca injeksi. Sementara ikan yang
diinjeksi dengan isolat N4M menunjukkan gejala whirling pada hari ke-8 pasca
injeksi. Ikan biasanya mati pada 12-24 jam setelah mengalami whirling. Ikan
kontrol tidak menunjukkan gejala klinis tersebut.
a
c
e
b
d
f
Gambar 1 Perubahan pola berenang ikan pasca injeksi dengan isolat S.
agalactiae. (A) Ikan berenang normal. (B) Ikan berenang lemah di
dasar/sudut akuarium. (C) Berenang tidak menentu dan sirip punggung
mengembang. (D) Ikan berkumpul di sudut akuarium. (E) Ikan
berenang gasping tepat di bawah permukaan air. (F). Ikan berenang
whirling.
Perubahan makroskopis pada organ luar ikan yang tampak selama
pengamatan pasca injeksi S. agalactiae antara lain permukaan tubuh ikan menjadi
menghitam, tubuh ikan berbentuk huruf C, mata mengalami kekeruhan (opacity),
eksoptalmia dan purulens (Gambar 2). Perubahan warna tubuh mulai tampak pada
11
hari ke-2 pasca injeksi dengan semua jenis isolat, terutama ikan yang diinjeksi
dengan dosis 103-106 CFU/ml. Sementara itu perubahan bentuk tubuh seperti huruf
C, mulai tampak pada pengamatan hari ke-10 sampai ke-14 pasca injeksi. Gejala
perubahan bentuk tubuh ini lebih banyak terjadi pada ikan-ikan yang diinjeksi
dengan isolat NK1. Perubahan pada mata mulai terjadi pada hari ke-4 dan hampir
semua ikan yang diinjeksi dengan isolat NK1, mengalami purulens dan eksoptalmia
pada pengamatan hari ke-5 pasca injeksi.
Kematian pertama kali pada ikan yang diinjeksi NK1 terjadi pada hari ke-2
sampai ke-3 pasca injeksi. Kematian ikan yang diijeksi N3M dan N17O, pertama
kali terjadi pada hari ke-3 sampai ke-6 pasca injeksi, sementara ikan yang diinjeksi
N4M, kematian ikan pertama terjadi pada hari ke-4 sampai ke-10 pasca injeksi.
a
b
d
c
e
f
Gambar 2 Perubahan makroskopis pada tubuh ikan pasca injeksi dengan isolat S.
agalactiae. (a) ikan sehat dengan warna tubuh normal dan mata normal.
(b) Permukaan tubuh ikan menghitam. (c) Tubuh ikan berbentuk huruf
C. (d) Mata keruh. (e) Eksoptalmia. (f) Mata putih.
Hasil perhitungan tingkat kematian ikan dan LD50 ditunjukkan pada Tabel 5.
Pada setiap perlakuan dosis injeksi, tingkat kematian ikan akibat injeksi NK1 lebih
tinggi dari tiga isolat bakteri lainnya (p
NILA (Oreochromis niloticus)
SRI SUPRIYANTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Virulensi Bakteri Streptococcus
agalactiae pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Sri Supriyanti
NIM C151120031
RINGKASAN
SRI SUPRIYANTI. Virulensi Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila
(Oreochromis niloticus). Dibimbing oleh SUKENDA dan WIDANARNI.
Streptococcus agalactiae merupakan salah satu penyebab penyakit
streptococcosis dan menyebabkan mortalitas yang signifikan pada berbagai jenis
ikan air tawar dan laut di seluruh dunia. Di Indonesia, S. agalactiae telah menyerang
budidaya ikan nila di beberapa daerah antara lain Sumatera Selatan, Jawa Tengah
dan Jawa Barat.
Bakteri yang sangat virulen akan mampu menginfeksi ikan sehat dan
menyebabkan sakit. Faktor virulensi bakteri berkaitan dengan kemampuan bakteri
menginvasi, bereplikasi dan bertahan terhadap sistem pertahanan tubuh inang, serta
kemampuan menyebabkan kerusakan sel selama perkembangan penyakit.
Pengetahuan akan karakteristik virulensi bakteri S. agalactiae akan memberikan
gambaran kemampuan bakteri dalam menginfeksi dan berkembang dalam tubuh
ikan sehingga mampu menyebabkan penyakit pada ikan. Selanjutnya informasi
terkait karakteristik faktor virulensi bakteri dan peranannya dalam patogenisitas
dapat menjadi acuan dalam mengembangkan upaya-upaya pengendalian serangan
S. agalactiae terhadap budidaya ikan nila di Indonesia. Tujuan penelitian ini adalah
untuk menguji virulensi S. agalactiae yang menginfeksi ikan nila dan
mengkarakterisasi faktor-faktor virulensinya yang berperan dalam perkembangan
penyakit.
Empat isolat bakteri (N3M, N4M, N17O dan NK1) diuji tingkat virulensinya
terhadap ikan nila dengan injeksi secara intraperitoneal. Uji in vitro dilakukan untuk
mengetahui karakteristik terkait virulensi, yaitu pengujian resistensi bakteri
terhadap whole blood killing, complement mediated killing serta oksigen reaktif.
Kemudian dilakukan deteksi gen-gen terkait virulensi yaitu suface immunogenic
protein, sip; faktor CAMP, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen binding protein,
fbsA dengan PCR.
Hasil uji virulensi menunjukkan bahwa keempat isolat bakteri bersifat
virulen. NK1 merupakan isolat paling virulen dengan dosis mematikan 50% (LD50)
104.5 CFU/ml, sementara LD50 N3M 107.75 CFU/ml, N4M >108 CFU/ml, dan N17O
106.67 CFU/ml. Keempat isolat bersifat resisten terhadap aktivitas pertahanan tubuh
dalam darah dan serum. Hasil uji blood survival yaitu viabilitas masing-masing
bakteri uji yaitu N3M mencapai 91%, N4M mencapai 158%, N17O mencapai 178%
dan NK1 mencapai 236 % dari kepadatan awalnya. Hasil uji complement mediated
killing menunjukkan semua isolat bakteri uji mampu tumbuh dengan baik dan
mencapai viabilitas lebih dari 100%, baik pada perlakuan serum aktif maupun
serum inaktif. Viabilitas bakteri pada uji sensitivitas terhadap oksigen reaktif yaitu
38% (N3M), 25% (N4M), 35% (N17O) dan 48% (NK1). NK1 merupakan isolat yang
paling resisten terhadap whole blood killing, complement mediated killing dan
pemusnahan oleh oksigen reaktif. Hasil identifikasi dengan PCR menunjukkan
bahwa N3M, N4M, N17O dan NK1 memiliki gen sip, fbsA dan cfb yang berperan
penting dalam menentukan sifat virulensinya.
Kata Kunci : Ikan nila, Streptococcus agalactiae, virulensi
SUMMARY
SRI SUPRIYANTI. Streptococcus agalactiae Virulence in Tilapia (Oreochromis
niloticus). Supervised by SUKENDA and WIDANARNI.
Streptococcus agalactiae is one of the causative agents of streptococcosis
and cause significant mortality in wild and cultured fish species including both
freshwater and marine animals in natural outbreaks throughout the world. In
Indonesia, S. agalactiae was reported causing the disease in tilapia farming in South
Sumatera, Central Java and West Java.
A virulent bacteria can infect healthy fish and cause the disease. Bacterial
virulence factors are related to the invasion, replication and evasion of the host’s
immune system, and cause injuries during pathogenesis of the disease. Study the
virulence characteristics of S. agalactiae allow us to describe the pathogenesis of
S. agalactiae infection. The information related to the virulence characteristics and
the role in the pathogenecity can be a reference in the development of control
measure of streptococcosis in tilapia farm in Indonesia.. The aim of this study was
to examine the virulence of S. agalactiae that infected tilapia (Oreochromis
niloticus) and to characterize the virulence factors that important in pathogenesis.
Four isolates namely N3M, N4M, N17O and NK1, were tested for virulence
levels in tilapia using intraperitoneal injection. In vitro assays were done to verify
the characteristics associated with virulence, such as the bacterial resistance to
whole blood killing, complement-mediated killing and reactive oxygen. The PCR
assay was done to identify genes associated to virulence factors, such as suface
immunogenic protein, sip; CAMP factor, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen
binding protein, fbsA.
The virulence assay showed that NK1 was the most virulent with 104.5
CFU/ml for LD50 value, while LD50 value for N17O, N3M and N4M were 106.67, 107.75
and more than 108 CFU/ml, respectively. In blood survival assay, viability of the
bacteria were 91%, 158%, 178%, 236% of the initial CFU for N3M, N4M, N17O and
NK1 respectively. The complement-mediated killing assay showed that all isolates
were able to grow in the active or inactivated serum, and the viability were more
than 100%. When exposed to reactive oxygen, the viabilitiy of the bacteria were
38%, 25%, 35% and 48% for N3M, N4M, N17O and NK1 respectively. The research
shows that all isolates are virulent and the level of virulence is associated with the
bacteria ability to evade the host’s immune system. NK1 isolate is the most virulent,
and most resistant to whole blood killing, complement-mediated killing and
reactive oxygen killing. The PCR assay shows that all isolates have sip, fbsA and
cfb genes that important for its virulence.
Key words : Streptococcus agalactiae, tilapia, virulence
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
VIRULENSI BAKTERI Streptococcus agalactiae PADA IKAN
NILA (Oreochromis niloticus)
SRI SUPRIYANTI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Munti Yuhana, SPi MSi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan pada bulan Mei - November 2014 ini adalah virulensi
bakteri, dengan judul Virulensi Bakteri Streptococcus agalactiae pada Ikan Nila
(Oreochromis niloticus).
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr Ir Sukenda, MSc dan Dr Ir
Widanarni, MSi selaku Komisi Pembimbing, Dr Munti Yuhana, SPi MSi selaku
dosen penguji luar komisi, serta Dr Dinamella Wahjuningrum, SSi MSi yang telah
memberikan arahan dan masukan dalam penyusunan dan penyempurnaan tesis ini.
Di samping itu penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Agus Somantri dari
Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Ibu Zakiah Widowati,
MSi, Rizky Amalia, SStPi dan rekan-rekan dari Balai Uji Standar Karantina Ikan,
rekan-rekan S2 Ilmu Akuakultur 2012 serta semua pihak yang telah membantu
kelancaran kegiatan penelitian.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Kepala Badan Pengembangan
Sumber Daya Manusia Kementerian Kelautan Perikanan, Kepala Badan Karantina
Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan dan Kepala Pusat
Karantina Ikan atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan
pendidikan melalui program tugas belajar.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami, anak-anak, orang tua
dan adik-adik yang telah memberi dukungan selama penulis menyelesaikan
pendidikan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2015
Sri Supriyanti
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
v
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
3
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penyiapan Ikan Uji
Penyiapan Isolat S. agalactiae
Uji Virulensi Isolat S. agalactiae pada Ikan Nila
Karakterisasi Virulensi Bakteri S. agalactiae
Blood Survival Assay
Complement-mediated Killing Assay
Sensitivitas S. agalactiae terhadap Oksigen Reaktif
Deteksi Gen Terkait Virulensi dengan PCR
Parameter Kualitas Air
Analisis Data
3
3
3
3
4
6
6
6
6
7
8
8
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konfirmasi Isolat S. agalactiae
Virulensi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila
Karakteristik Virulensi Bakteri S. agalactiae
Gen Terkait Virulensi Bakteri S. agalactiae
Kualitas Air Pemeliharaan
8
8
8
13
15
17
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
18
18
18
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
21
RIWAYAT HIDUP
28
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Perlakuan dalam uji virulensi bakteri S. agalactiae
Primer yang digunakan untuk deteksi gen-gen virulensi S. agalactiae
Profil siklus amplifikasi DNA gen virulensi S. agalactiae
Waktu kemunculan gejala klinis dan kematian ikan nila pasca injeksi
Tingkat kematian ikan nila pasca injeksi S. agalactiae dan hasil
perhitungan dosis mematikan 50% (LD50)
6 Kualitas air pemeliharaan ikan nila pada uji virulensi S. agalactiae
5
7
7
9
12
17
DAFTAR GAMBAR
1 Perubahan pola berenang ikan pasca injeksi dengan isolat S. agalactiae
2 Perubahan makroskopis pada tubuh ikan pasca injeksi dengan isolat
S. agalactiae
3 Jumlah S. agalactiae isolat N3M, N4M, N17O dan NK1 dalam darah
ikan nila
4 Viabilitas S. agalactiae N3M, N4M, N17O dan NK1 terhadap serum aktif
dan inaktif ikan nila
5 Viabilitas S. agalactiae N3M, N4M, N17O dan NK1 terhadap oksigen
reaktif
6 Hasil deteksi gen virulensi S. agalactiae dengan PCR
10
11
13
14
15
16
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil uji karakteristik morfologi dan biokimia S. agalactiae sesuai
metode deteksi pada SNI 7545.3 : 2009
2 Hasil uji konfirmasi isolat bakteri S. agalactiae PCR
3 Perkembangan gejala klinis dan kematian ikan pasca injeksi dengan
isolat S. agalactiae
4 Perhitungan LD50 isolat bakteri uji dengan metode Reed & Muench
21
22
23
27
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Streptococcus agalactiae merupakan salah satu jenis bakteri penyebab
penyakit streptococcosis dan menyebabkan mortalitas yang signifikan pada
berbagai jenis ikan air tawar dan laut di seluruh dunia. Robinson dan Meyer (1966)
mengungkapkan bahwa S. agalactiae pertama kali dilaporkan pada tahun 1966,
menginfeksi ikan air tawar golden shiners (Notemigonus crysoleucas) di Atlanta
USA. S. agalactiae telah diisolasi dari 17 spesies ikan termasuk rainbow trout,
seabream, nila, yellow fish, catfish, killfish, menhaden, mullet, dan silver pomfret
(Amal 2011). S. agalactiae termasuk Gram positif, oksidase negatif, katalase
negatif dan isolat menunjukkan hasil negatif pada tes reaksi β-galactosidase, βglucuronidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, β-mannosidase, glycyl-tryptophane
arylamidase, sorbitol, L-arabinosa, D-arabitol, glycogen, melezitos, melibiose dan
hidrolisis starch (Evan et al. 2002).
Penyakit streptococcosis akibat infeksi S. agalactiae beberapa tahun
belakangan ini telah menjadi perhatian karena menyebabkan kerugian pada
kegiatan budidaya ikan nila di Indonesia. S. agalactiae dilaporkan telah menyerang
budidaya ikan nila di beberapa daerah antara lain Sumatera Selatan, Jawa Tengah
dan Jawa Barat (BKIPM 2014). Wabah penyakit streptococcosis ini dapat
disebabkan oleh rendahnya ketahanan tubuh ikan, lingkungan pemeliharaan yang
buruk ataupun pemberian pakan yang kurang baik. Menurut Conroy (2009), S.
agalactiae menginfeksi dan lebih virulen pada kondisi lingkungan dengan suhu
24oC – 29oC. Mengingat suhu perairan di Indonesia umumnya berada pada kisaran
tersebut, maka penyebaran serangan S. agalactiae dapat meningkat bila tidak segera
ditanggulangi.
Pada budidaya ikan secara intensif, faktor lingkungan yang buruk dapat
memicu stres dan mempengaruhi aktivitas sistem pertahanan tubuh ikan, akibatnya
ketika ada patogen dapat dengan mudah terjadi wabah penyakit. Bakteri yang
sangat virulen akan mampu menginfeksi ikan sehat dan menyebabkan sakit. Infeksi
bakteri pada ikan akan direspon pertama kali oleh sistem pertahanan tubuh
nonspesifik (Ellis 2001). Sistem pertahanan tubuh nonspesifik ikan meliputi
pertahanan mekanik dan kimiawi berupa kulit, sisik, lendir dan insang, dan
pertahanan seluler pada darah yaitu makrofag dan leukosit. Virulensi bakteri
berkaitan dengan kemampuan bakteri menginvasi, bereplikasi dan bertahan
terhadap sistem pertahanan tubuh inang, serta kemampuannya menyebabkan
kerusakan sel selama perkembangan penyakit (Vilches et al. 2004). Mempelajari
virulensi bakteri S.agalactiae dan patogenesisnya pada ikan dapat diawali dengan
mempelajari kemampuan bakteri bertahan terhadap sistem pertahanan tubuh ikan
non spesifik terutama pertahanan seluler pada darah. Buchanan et al. (2008)
mengungkapkan uji resistensi S. iniae terhadap sistem pertahanan non spesifik ikan
striped bass secara in vitro dapat menggambarkan tahap perkembangan penyakit
streptococcosis dan hasil uji tersebut dapat menjelaskan perbedaan karakteristik
strain S. iniae.
Karakteristik virulensi bakteri terkait kemampuannya menghindari sistem
pertahanan tubuh inang ditentukan oleh faktor virulensinya. Faktor virulensi bakteri
2
S. agalactiae dapat dibagi menjadi faktor virulensi struktural dan non struktural.
Faktor virulensi struktural dibentuk oleh komponen-komponen penyusun sel baik
komponen permukaan maupun komponen penyusun dinding sel bakteri. Faktor
virulensi tersebut antara lain adalah antigen kapsul polisakarida, antigen protein dan
asam lipoteikoat. Faktor virulensi non struktural (metabolit) yang merupakan
produk ekstraseluler dari bakteri ini antara lain adalah hyaluronidase, protease,
hipurikase, nuclease, C5a-ase, hemolisin dan faktor CAMP (Pritchard and Lin
1993; Edwards dan Baker 1995; Takahashi et al. 1999; Lang dan Palmer 2003).
Zhang et al. (2013) menguraikan bahwa gen terkait virulensi yang terdeteksi pada
analisis genetik S. agalactiae yang diisolasi dari ikan nila (O. niloticus) yaitu
surface immunogenic protein, faktor CAMP, protein C-β dan fibrinogen binding
protein. Sementara itu faktor virulensi C5a peptidase dan laminin-binding surface
protein hanya terdeteksi pada S. agalactiae yang diisolasi dari sapi. Keberadaan
faktor virulensi tersebut dapat diidentifikasi dengan teknik molekuler seperti
polymerase chain reaction (PCR). PCR telah terbukti akurat dan tepat dalam
mengidentifikasi agen penyebab penyakit bakterial hingga level spesies.
Perumusan Masalah
Informasi mengenai karakteristik virulensi bakteri S. agalactiae yang
menginfeksi ikan nila di Indonesia hingga saat ini masih terbatas, dan sejauh ini
yang telah banyak dilakukan adalah penelitian karakteristik faktor virulensi S.
agalactiae yang menginfeksi hewan terestrial dan manusia. Pengetahuan akan
karakterisik virulensi bakteri S. agalactiae akan memberikan gambaran
kemampuan bakteri dalam menginfeksi dan berkembang dalam tubuh ikan
sehingga mampu menyebabkan penyakit pada ikan. Kejelasan karakteristik faktor
virulensi bakteri dan peranannya dalam patogenisitas dapat menjadi acuan dalam
mengembangkan upaya-upaya pengendalian serangan S. agalactiae terhadap
budidaya ikan nila di Indonesia.
Pada penelitian ini dilakukan pengujian virulensi bakteri S. agalactiae isolat
N3M, N4M, N17O, NK1 pada ikan nila dan ketahanan hidupnya terhadap komponen
sistem pertahanan tubuh non spesifik ikan nila secara in vitro. Isolat bakteri
direaksikan dengan darah lengkap ikan nila sebagai sumber pertahanan seluler
nonspesifik, serum sebagai sumber komplemen dan oksigen reaktif yang berperan
dalam pemusnahan antigen.
Kemudian untuk mengetahui faktor virulensi S. agalactiae yang berperan
dalam menghindari sistem pertahanan tubuh inang dilakukan identifikasi gen-gen
terkait virulensi yaitu suface immunogenic protein, sip; faktor CAMP, cfb; protein
C-β, bac; dan fibrinogen binding protein, fbsA dideteksi dengan PCR.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah untuk menguji tingkat virulensi bakteri S. agalactiae
yang menginfeksi ikan nila, mengkarakterisasi virulensi S. agalactiae yang
berperan dalam perkembangan penyakit secara in vitro dan identifikasi gen-gen
terkait virulensi dengan PCR.
3
Manfaat Penelitian
Informasi terkait karakteristik virulensi berguna dalam upaya penanganan
penyakit infeksi oleh S. agalactiae antara lain untuk pengendalian streptococcosis
maupun untuk penelitian lanjutan terkait pengembangan vaksin yang lebih spesifik.
Hal ini akan mendukung upaya pengembangan manajemen kesehatan dalam
kegiatan budidaya ikan nila.
2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada Mei – November 2014 di Laboratorium
Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan IPB, Laboratorium Bakteriologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan
Laboratorium Biologi Molekuler Balai Uji Standar Karantina Ikan Kementerian
Kelautan dan Perikanan.
Penyiapan Ikan Uji
Ikan uji adalah ikan nila (Oreochromis niloticus) strain NIRWANA (Nila Ras
Wanayasa) dengan bobot 20.62±0.89 gr, berasal dari Balai Pengembangan Benih
Ikan air Tawar (BPBIAT) Wanayasa. Sebelum diberi perlakuan, ikan uji
diadaptasikan selama 14 hari untuk memastikan ikan sehat dan tidak terserang
streptococcosis berdasarkan pengamatan gejala klinis dan isolasi bakteri dari organ
mata, ginjal dan otak pada media BHIA tidak ditemukan S. agalactiae. Identifikasi
bakteri pada organ ikan dilakukan secara konvensional berdasarkan SNI 7545.3 :
2009 (SNI 2009).
Ikan dipelihara dalam akuarium berukuran 60x40x30 cm3. Selama
pemeliharaan suhu air dipertahankan pada 29oC. Ikan diberi makan secara at
satiation dua kali sehari menggunakan pakan komersial. Penggantian air sebanyak
50% dilakukan dua hari sekali untuk membuang sisa pakan dan sisa metabolisme.
Penyiapan Isolat S. agalactiae
Isolat bakteri S. agalactiae diperoleh dari koleksi Instalasi Penelitian dan
Pengembangan Pengendalian Penyakit Ikan, Depok. Bakteri S. agalactiae yang
digunakan sebanyak 4 isolat yaitu N3M dan N4M yang diisolasi dari mata ikan nila
yang berasal dari Cirata, Jawa Barat, N17O yang diisolasi dari ginjal ikan nila yang
berasal dari Cirata, Jawa Barat, dan NK1 yang diisolasi dari otak ikan nila yang
berasal dari Wadas Lintang, Jawa Tengah. Uji konfirmasi spesies dilakukan dengan
dengan pengujian karakteristik morfologi dan biokima secara konvensional sesuai
SNI 7545.3 : 2009 (SNI 2009) dan dengan polymerase chain reaction (PCR)
(Wongsathein 2012; Delannoy et al. 2013). DNA bakteri diekstrak dengan
pemanasan. Proses amplifikasi DNA bakteri berlangsung dalam campuran sampel
4
25 µl yang terdiri dari 12.5 µl master mix GoTaq®Green (Promega), 8.5 µl nuclease
free water, @ 1 µl primer (reverse dan forward), dan 2 µl template DNA. Primer
spesifik Streptococcus agalactiae yang digunakan yaitu STRA-AgI: 5’-AAGGAA
ACCTGCCATTTG-3’ dan STRA-AgII: 5’-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTA
GAA-3’. Hasil amplifikasi diharapkan memiliki panjang 270bp. Setelah denaturasi
awal pada suhu 95oC selama 15 menit, campuran sampel diamplifikasi 35 siklus,
masing-masing terdiri dari denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, penempelan
primer pada suhu 55oC selama 30 detik, perpanjangan primer pada suhu 72oC
selama 25 detik pemanjangan akhir selama 10 menit pada suhu 72oC, menggunakan
T100 Thermal Cycler Biorad. Hasil amplifikasi dielektroforesis, kemudian
didokumentasikan dengan menggunakan UV documentation (UVITEC).
Stok bakteri S. agalactiae ditumbuhkan pada medium brain heart infusion
agar (BHIA, Merck). Sebelum bakteri digunakan untuk uji virulensi, dilakukan
pasase in vitro sebanyak dua kali dan pasase in vivo sebanyak tiga kali untuk
memperoleh kembali daya patogenisitasnya sesuai kondisi awalnya. Pasase in vitro
dilakukan dengan menggoreskan isolat pada media BHIA. Selanjutnya untuk
pasase in vivo, disiapkan suspensi bakteri dengan mengkultur bakteri S. agalactiae
kedalam media cair Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Merck). Satu ose biakan
bakteri dari media agar dikultur ke dalam 5 ml media BHIB, diinkubasi dalam
shaker waterbath pada suhu 29-30°C dan 140 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam,
diambil 1 ml biakan bakteri dari media kultur cair dan dimasukkan kedalam 9 ml
media BHIB, dinkubasi pada shaker waterbath pada suhu 29-30°C dan 140 rpm
selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap untuk dipergunakan.
Pasase in vivo dilakukan dengan menyuntikkan suspensi bakteri isolat N3M,
N4M, N17O dan NK1 pada ikan uji. Ikan uji disiapkan dalam lima akuarium dengan
kepadatan lima ekor per kuarium, untuk disuntik secara intraperitoneal dengan
empat suspensi isolat yang berbeda dan satu kontrol. Setelah penyuntikan, ikan
diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis atau hampir mati. Ikan sakit
diambil kemudian dilakukan isolasi bakteri dari organ ginjal, mata dan otak. Bakteri
diinokulasi dengan metode penggoresan pada media BHIA dan diinkubasi selama
24 jam. Terhadap koloni yang tumbuh dilakukan pengamatan morfologi koloni,
pewarnaan Gram dan uji karakteristik biokimia untuk memastikan bahwa bakteri
yang tumbuh adalah bakteri yang disuntikkan sebelumnya. Selanjutnya bakteri S.
agalactiae yang diperoleh digores kembali pada media agar, dikultur cair dan
disuntikkan kembali pada ikan uji dengan perlakuan seperti di atas hingga tiga kali.
Uji Virulensi Isolat S. agalactiae pada Ikan Nila
Uji virulensi dilakukan untuk membandingkan tingkat virulensi isolat bakteri
yaitu N3M, N4M, N17O dan NK1 pada ikan. Tingkat virulensi ditentukan
berdasarkan kemunculan gejala klinis, tingkat kematian dan hasil perhitungan dosis
bakteri yang menyebabkan kematian 50% dari jumlah ikan yang diamati (LD50)
(Angka et al. 1995).
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap.
Pengujian dilakukan dengan penyuntikan ikan dengan suspensi bakteri N3M, N4M,
N17O dan NK1 secara intraperitoneal dengan dosis kepadatan berbeda 104 - 108
CFU/ml sebanyak 0.1 ml/ekor dan untuk kontrol disuntik dengan PBS 0.1 ml (Tabel
1). Setiap perlakuan terdiri dari 10 ekor ikan. Perlakuan diulang tiga kali. Ikan
5
dipelihara selama 14 hari dalam akuarium dengan volume air 45 liter, diberi pakan
komersil secara at satiation. Selama pemeliharaan suhu air dipertahankan pada
29oC. Penggantian air sebanyak 50% dilakukan dua hari sekali untuk membuang
sisa pakan dan sisa metabolisme.
Tabel 1 Perlakuan dalam uji virulensi bakteri S. agalactiae
Isolat
N3M
N4M
N17O
NK1
Kepadatan bakteri
(CFU/ml)
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
104
105
106
107
108
PBS
Kode Perlakuan
A41, A42, A43
A51, A52, A53
A61, A62, A63
A71, A72, A73
A81, A82,A83
A01, A02, A03
B41, B42, B43
B51, B52, B53
B61, B62, B63
B71, B72, B73
B81, B82, B83
B01, B02, B03
C41, C42, C43
C51, C52, C53
C61, C62, C63
C71, C72, C73
C81, C82, C83
C01, C02, C03
D41, D42, D43
D51, D52, D53
D61, D62, D63
D71, D72, D73
D81, D82, D83
D01, D02, D03
Parameter yang diamati dalam uji virulensi ini antara lain:
1. Perubahan pola berenang: di permukaan, melayang atau di dasar akuarium,
berenang lemah atau agresif, cara berenang berputar atau tidak beraturan.
Pengamatan dilakukan selama 5 menit.
2. Perubahan yang diamati pada anatomi luar berupa kondisi mata, warna tubuh,
pendarahan atau kelainan lainnya.
3. Mortalitas dicatat dan dihitung dengan rumus berikut:
Tingkat kematian % =
Jumlah ikan mati
x
Jumlah populasi ikan
%
6
4. Penentuan dosis yang menyebabkan kematian 50% jumlah ikan yang diamati
(LD50) dihitung sesuai metode Reed & Muench (1938), yaitu:
A−
A−B
Log negatif LD50 = C + selang proporsi
Selang proporsi =
Keterangan:
A = Kematian diatas 50%
B = Kematian dibawah 50%
C = Log negatif dosis yang menyebabkan kematian di atas 50%
Karakterisasi Virulensi Bakteri S. agalactiae
Blood Survival Assay
Blood survival assay merupakan pengujian kemampuan bakteri hidup dalam
darah inang. Prosedur uji dikerjakan berdasarkan Blood survival assay yang
dilakukan oleh Buchanan et al. (2008), yaitu suspensi S. agalactiae 102 CFU dalam
700 µl PBS, ditambahkan ke dalam 300 µl darah ikan nila dan diinkubasi selama 1
jam pada suhu 28-30oC dengan agitasi. Setelah masa inkubasi, suspensi bakteri
diencerkan dan jumlah bakteri yang hidup dihitung dengan metode cawan tuang
dengan media BHIA. Perlakuan dilakukan terhadap setiap jenis bakteri dengan tiga
ulangan. Sebagai kontrol, metode cawan tuang juga dilakukan pada darah tanpa
penambahan bakteri maupun pada suspensi bakteri tanpa penambahan darah ikan.
Complement-mediated Killing Assay
Complement-mediated killing assay merupakan pengujian untuk mengetahui
kemampuan bakteri menghadapi komplemen yang terdapat dalam serum. Uji ini
dikerjakan berdasarkan Complement-mediated Killing Assay yang dilakukan oleh
Buchanan et al. (2008), yaitu sebanyak 3 ml darah diambil dari ikan nila, dibiarkan
menggumpal, dan disimpan pada suhu 4oC selama 1 jam 30 menit, kemudian
disentrifuse pada 3000 x g pada suhu 4oC selama 10 menit. Serum yang diperoleh
diambil dan disentrifus kembali. Sebagian serum diinaktivasi dengan pemanasan
pada suhu 60oC selama 30 menit. Suspensi bakteri 105 CFU/ml sebanyak 1 ml
ditambahkan ke dalam 150 µl serum aktif maupun inaktif. Sampel divorteks,
diinkubasi pada suhu 28oC selama 2 jam. Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah
bakteri yang hidup dengan metode cawan tuang pada media BHIA.
Sensitivitas S. agalactiae terhadap Oksigen Reaktif
Pengujian sensitivitas S. agalactiae terhadap oksigen reaktif dilakukan sesuai
dengan prosedur uji sensitivitas terhadap oksigen singlet yang dilakukan oleh
Buchanan et al. (2008). Suspensi S. agalactiae dengan kepadatan 107 CFU/ml
diinkubasi dengan 2 µg/ml methylene blue dan diletakkan 20 cm dari sumber
cahaya 100 Watt. Sebagai kontrol, suspensi bakteri tanpa pemberian methylene blue
juga diletakkan 20 cm dari sumber cahaya 100W dan suspensi bakteri dengan/tanpa
methylene blue dibungkus dengan aluminium foil agar tidak terpapar cahaya. Untuk
mengetahui viabilitas bakteri, setelah 1 jam masa inkubasi, dilakukan perhitungan
jumlah bakteri dengan metode cawan tuang pada media BHIA.
7
Deteksi Gen Terkait Virulensi dengan PCR
Gen-gen terkait virulensi antara lain gen surface immunogenic protein, sip;
faktor CAMP, cfb; protein C-β, bac; dan fibrinogen binding protein, fbsA di deteksi
dengan PCR menggunakan primer spesifik.
Isolat bakteri yang digunakan telah dikultur selama 48 jam. Sebanyak 10-20
koloni diambil dan dimasukkan ke dalam mikrotube yang berisi 400 µl RNAse free
water. Ekstraksi DNA dilakukan dengan memanaskan mikrotube yang berisi koloni
bakteri dalam 400 µl RNAse free water pada suhu 98oC selama 10 menit
menggunakan thermostat dan sesekali divortex. Kemudian sampel disentrifugasi
pada 8000 x g selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil sebanyak 300
µl, ditempatkan dalam mikrotube baru dan disimpan pada suhu -20oC sampai
digunakan.
Primer yang digunakan untuk mendeteksi serta gen-gen virulensi bakteri S.
agalactiae seperti pada Tabel 2.
Tabel 2 Primer yang digunakan untuk deteksi gen-gen virulensi S. agalactiae
Primer
Panjang
(bp)
339
Sekuen
Referensi
sip
sip-F
sip-R
GTTAAACCAACTCAGACGTCAG
TTCAGGATGTGCAGCTACTGC
Zhang et
al. 2013
bac
bac-F
bac-R
TGTAAAGGACGATAGTGTGAAGAC
CATTTGTGATTCCCTTTTGC
530
Duarte et
al. 2005
cfb
cfbS
cfbA
CGACAGCATCACACGAAAAATACA
TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA
900
Ye et al.
2011
fbsA
fbsA86
ATCAAGTCCTGTATCTGCTAT
fbsA555rc TTCATTGCGTCTCAAACCG
420
Rosenau et
al. 2007
Tabel 3 Profil siklus amplifikasi DNA gen virulensi S. agalactiae
Primer
denaturasi
awal
denaturasi
annealing
elongasi
elongasi
akhir
sip-F
sip-R
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
52oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
bac-F
bac-R
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
50oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
cfbS
cfbA
94oC, 5m
30 siklus , 94oC,
30 detik
55oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
fbsA86
fbsA555rc
94oC, 5m
30 siklus, 94oC,
30 detik
55oC, 30s
72oC, 1m
72oC, 10m
Proses amplifikasi DNA bakteri berlangsung dalam campuran sampel
sebanyak 25 µl yang terdiri dari: 12.5 µl master mix GoTaq®Green (Promega), 8.5
µl nuclease free water, @ 1 µl primer (reverse dan forward), dan 2 µl template
8
DNA. Proses amplifikasi dilakukan menggunakan T100 Thermal Cycler Biorad,
dengan profil siklus amplifikasi seperti pada Tabel 3. Untuk mendeteksi hasil
amplifikasi, 10 µl amplicon ditambah 4 µl Sybrsafe kemudian dielektroforesis pada
gel agarose 1.5% dalam buffer 1x Tris-acetate-EDTA (220V selama 30 menit).
Selanjutnya hasil elektroforesis diamati dan didokumentasikan dengan
menggunakan UV documentation (UVITEC).
Parameter Kualitas Air
Pengukuran parameter kualitas air dilakukan untuk menjamin bahwa kualitas
air pemeliharaan ikan selama uji virulensi memenuhi syarat kelayakan hidup ikan
nila (SNI 7550, 2009) dan tidak mempengaruhi hasil pengamatan. Parameter yang
diukur yaitu suhu, pH, oksigen terlarut dan amoniak.
Analisis Data
Data tingkat kematian ikan dan viabilitas bakteri diuji dengan analisis ragam
(ANOVA) dan uji lanjut Tukey dengan signifikansi 0.05 menggunakan Minitab 16.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konfirmasi Isolat S. agalactiae
Empat isolat Streptococcus agalactiae yang digunakan dalam penelitian ini,
secara fenotip memiliki memiliki ciri koloni berbentuk bulat kecil (pin point), putih,
dan sedikit berlendir (lengket). Pada agar darah, keempat isolat tidak membentuk
zona hemolisis (non-hemolitik). Uji Gram menunjukkan keempat isolat adalah
bakteri kokus gram positif dan membentuk rantai. Keempatnya bersifat
katalase/oksidasi negatif, non motil, mampu tumbuh pada media TSA+NaCl 6.5%
(Lampiran 1). Hasil uji PCR menunjukkan bahwa isolat bakteri uji adalah S.
agalactiae (Lampiran 2).
Virulensi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila
Uji tantang ikan dengan S. agalactiae isolat N3M, N4M, N17O dan NK1
menunjukkan bahwa keempat isolat bakteri bersifat virulen. Gejala klinis yang
muncul akibat infeksi keempat isolat secara umum sama yaitu diawali dengan
respon terhadap pakan yang menurun, perubahan pola berenang serta perubahan
warna permukaan tubuh menghitam. Gejala yang muncul selanjutnya adalah
berenang gasping (tegak, berusaha mengambil udara dibawah permukaan air),
whirling (berputar-putar), bentuk tubuh melengkung menyerupai huruf C, mata
mengkerut, opacity, purulen, dan eksoptalmia. Gejala ini sesuai hasil penelitian
Hardi et al. (2011) bahwa setelah diinjeksi S. agalactiae, sebelum mati, ikan nila
berenang tidak beraturan, soliter, berenang gasping dan whirling, respon terhadap
9
pakan lambat, permukaan tubuh lebih hitam, mata mengkerut, purulen, opacity, dan
eksoptalmia.
Pengamatan selama uji virulensi menunjukkan bahwa kemunculan gejala
klinis dan kematian ikan yang terjadi tergantung pada jenis isolat dan dosis bakteri
yang disuntikkan (Tabel 4). Hasil pengamatan gejala klinis dan kematian diuraikan
pada Lampiran 3. Gejala klinis pada ikan yang diinjeksi NK1 pertama kali muncul
pada hari ke-1 sampai ke-3 pasca injeksi. Gejala klinis pada ikan yang diinjeksi
dengan N3M dan N4M pertama kali muncul pada hari ke-3 sampai ke-6 pasca
injeksi. Sementara itu pada ikan yang diinjeksi dengan N17O, gejala klinis mulai
tampak pada hari ke-3 sampai ke-5 pasca injeksi.
Tabel 4 Waktu kemunculan gejala klinis dan kematian ikan nila pasca injeksi
dengan S. agalactiae
Isolat
Dosis
K
N3M
-
-
-
10
4
-
-
-
gk gk
10
5
-
-
-
10
6
-
-
gk
1
1
107
-
-
1
gk
8
-
-
gk
10
K
N4M
-
-
-
-
-
-
-
1
-
-
2
1
1
2
1
1
1
-
-
gk gk gk gk
2
3
3
2
2
-
1
2
gk gk gk
3
1
gk
1
1
1
1
1
1
2
gk
1
gk
1
1
2
1
1
3
1
3
3
gk gk
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
-
-
-
-
-
gk gk gk
1
1
1
1
1
-
10
5
-
-
-
-
1
gk
1
1
gk gk
2
-
-
-
106
-
-
-
-
gk gk gk
1
1
1
1
1
1
1
10
7
-
-
gk
1
gk gk
1
1
1
4
gk
1
1
-
10
8
-
-
gk
1
gk
2
2
2
3
gk
2
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
4
-
-
-
-
gk
1
2
1
2
2
2
2
-
-
10
5
-
-
-
-
gk gk gk
1
2
2
1
2
1
2
106
-
-
-
10
7
-
-
10
8
-
K
gk gk
3
1
2
4
1
2
-
-
-
gk
3
1
2
3
1
2
1
1
1
1
-
-
gk
3
3
1
2
gk
2
1
2
1
1
1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
-
1
gk gk
1
1
2
2
1
3
1
1
gk
1
105
-
gk
10
NK1
-
4
K
N17O
Kemunculan gejala klinis dan jumlah kematian ikan (ekor)
pada hari ke1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
2
gk
2
2
2
1
2
1
1
1
gk
2
10
6
gk gk gk
3
1
gk
2
1
2
gk
1
1
2
4
10
7
gk gk
1
1
gk
3
3
3
1
2
3
gk
1
gk
10
8
gk gk
1
3
3
3
2
2
2
2
2
1
1
gk
keterangan: gk = gejala klinis (terinci dalam Lampiran 3), 1-4 = jumlah ikan mati
10
Perubahan pola berenang pada ikan nila pasca injeksi S. agalactiae diawali
dengan tingkah laku berenang tidak beraturan, diam di dasar atau sudut akuarium,
dan diikuti dengan gasping dan whirling (Gambar 1). Perubahan pola berenang
yang khas pada serangan S. agalactiae yaitu berenang whirling, mulai muncul pada
hari ke-5 pasca injeksi, pada ikan yang diinjeksi isolat NK1 dengan dosis 108
CFU/ml. Gejala whirling juga dapat diamati pada ikan yang diinjeksi dengan dosis
yang lebih rendah maupun pada ikan yang diinjeksi dengan isolat lainnya. Ikan
yang diinjeksi isolat N17O dan N3M dengan dosis 106, 107 dan 108 CFU/ml
menampakkan gejala whirling pada hari ke-6 pasca injeksi. Sementara ikan yang
diinjeksi dengan isolat N4M menunjukkan gejala whirling pada hari ke-8 pasca
injeksi. Ikan biasanya mati pada 12-24 jam setelah mengalami whirling. Ikan
kontrol tidak menunjukkan gejala klinis tersebut.
a
c
e
b
d
f
Gambar 1 Perubahan pola berenang ikan pasca injeksi dengan isolat S.
agalactiae. (A) Ikan berenang normal. (B) Ikan berenang lemah di
dasar/sudut akuarium. (C) Berenang tidak menentu dan sirip punggung
mengembang. (D) Ikan berkumpul di sudut akuarium. (E) Ikan
berenang gasping tepat di bawah permukaan air. (F). Ikan berenang
whirling.
Perubahan makroskopis pada organ luar ikan yang tampak selama
pengamatan pasca injeksi S. agalactiae antara lain permukaan tubuh ikan menjadi
menghitam, tubuh ikan berbentuk huruf C, mata mengalami kekeruhan (opacity),
eksoptalmia dan purulens (Gambar 2). Perubahan warna tubuh mulai tampak pada
11
hari ke-2 pasca injeksi dengan semua jenis isolat, terutama ikan yang diinjeksi
dengan dosis 103-106 CFU/ml. Sementara itu perubahan bentuk tubuh seperti huruf
C, mulai tampak pada pengamatan hari ke-10 sampai ke-14 pasca injeksi. Gejala
perubahan bentuk tubuh ini lebih banyak terjadi pada ikan-ikan yang diinjeksi
dengan isolat NK1. Perubahan pada mata mulai terjadi pada hari ke-4 dan hampir
semua ikan yang diinjeksi dengan isolat NK1, mengalami purulens dan eksoptalmia
pada pengamatan hari ke-5 pasca injeksi.
Kematian pertama kali pada ikan yang diinjeksi NK1 terjadi pada hari ke-2
sampai ke-3 pasca injeksi. Kematian ikan yang diijeksi N3M dan N17O, pertama
kali terjadi pada hari ke-3 sampai ke-6 pasca injeksi, sementara ikan yang diinjeksi
N4M, kematian ikan pertama terjadi pada hari ke-4 sampai ke-10 pasca injeksi.
a
b
d
c
e
f
Gambar 2 Perubahan makroskopis pada tubuh ikan pasca injeksi dengan isolat S.
agalactiae. (a) ikan sehat dengan warna tubuh normal dan mata normal.
(b) Permukaan tubuh ikan menghitam. (c) Tubuh ikan berbentuk huruf
C. (d) Mata keruh. (e) Eksoptalmia. (f) Mata putih.
Hasil perhitungan tingkat kematian ikan dan LD50 ditunjukkan pada Tabel 5.
Pada setiap perlakuan dosis injeksi, tingkat kematian ikan akibat injeksi NK1 lebih
tinggi dari tiga isolat bakteri lainnya (p