12
c. Pengujian Ketahanan Panas Untuk Pemilahan Isolat
Pemilahan cepat isolat dilakukan dengan cara menginokulasikan kultur E. sakazakii yang telah mencapai fase stasioner ke dalam menstruum pemanas TSB.
Jumlah kultur E.sakazakii yang diinokulasikan ke dalam menstruum pemanas adalah sebesar 10
8
CFUml. Menstruum pemanas yang digunakan terlebih dahulu dipanaskan hingga mencapai suhu 54
C pada waterbath shaker, setelah penunjuk suhu pada waterbath shaker terbaca konstan kultur E. sakazakii diinokulasikan ke dalam
menstruum pemanas. Pemanasan berlangsung selama 32 menit. Beberapa erlenmeyer yang digunakan pada tahapan pemilahan cepat isolat ini dilengkapi dengan termometer
untuk memonitor suhu selama pemanasan berlangsung. Setelah pemanasan selesai dilakukan pendinginan pada air mengalir untuk mencegah terjadinya pemanasan
lanjutan.
d. Pencawanan dan Perhitungan koloni BAM 2001
Pencawanan pour plate dilakukan dengan media TSA Tryptose Soy Agar. Inkubasi dilakukan selama 48 hari pada suhu 35
C. Perhitungan jumlah koloni
dilakukan untuk melihat beberapa isolat yang dapat bertahan dalam jumlah paling besar setelah perlakuan pemanasan. Isolat E. Sakazakii terpilih ini digunakan dalam kajian
ketahanan panas isolat E. sakazakii. Koloni bakteri dapat dihitung dengan rumus Standard Plate Count sebagai berikut:
N = ΣC {[1n
1
+ 0.1n
2
+ ...]d} [Rumus I]
Keterangan : N = jumlah koloni per ml atau per gram produk
∑C = jumlah semua koloni yang dihitung dari 2 cawan
n
1
= jumlah cawan pada pengenceran pertama n
2
= jumlah cawan pada pengenceran kedua d
= pengenceran pertama yang dihitung
Perhitungan penurunan jumlah bakteri dihitung dengan rumus sebagai berikut: [Rumus II]
Keterangan: S = penurunan jumlah koloni N
= Jumlah populasi mikroba sebelum proses termal N
t
= Jumlah mikroba setelah proses termal
Rumus ini digunakan untuk melihat penurunan logaritma jumlah awal isolat yang diuji terhadap jumlah akhirnya. Isolat dengan penurunan jumlah logaritma terkecil
diasumsikan sebagai isolat tahan panas yang akan dikaji ketahanan panasnya.
2. Kajian Ketahanan Panas Isolat
E. Sakazakii Tahan Panas
Kajian ketahanan panas dilakukan dengan menggunakan modifikasi dari metode submerged vessel method Nazarowec- White dan Farber 1997, isolat yang paling toleran
terhadap pemanasan berdasarkan hasil pemilahan cepat digunakan dalam tahapan ini. Kajian ketahanan panas dilakukan pada empat suhu yang berbeda 54, 56,58, dan 60
o
C. N
N
t
___ Log
S =
13 Pemilihan suhu merupakan simulasi dari proses rekonstitusi susu formula pada suhu
hangat, menengah, dan panas. Kajian ketahanan panas terdiri dari persiapan inokulum, persiapan menstruum pemanas dan uji ketahanan panas isolat E. Sakazakii tahan panas.
Prosedur persiapan inokulum yang dilakukan tidak berbeda dengan prosedur persiapan inokulum pada tahapan pemilahan cepat isolat, untuk tahapan lainnya, prosedur yang
dilakukan adalah sebagai berikut,
a Persiapan
menstruum pemanas
Menstruum pemanas yang digunakan dalam kajian ketahanan panas isolat E.sakazakii hasil pemilahan cepat ini adalah susu formula. Pembuatan susu formula
sebagai menstruum pemanas disesuaikan dengan instruksi penyajian susu seperti yang tertera pada kemasan, 13.2 gram susu direkonstitusi dengan menggunakan 90 ml air
bersuhu 70 C, selanjutnya susu formula rekonstitusi ini dituang sebanyak 9 ml pada
erlenmeyer berukuran 50 ml. Erlenmeyer yang digunakan memiliki dimensi yang sama, hal ini bertujuan untuk menyeragamkan penetrasi panas untuk tiap erlenmeyer yang
digunakan.
b Uji ketahanan panas isolat
E. Sakazakii tahan panas
Uji ketahanan panas dilakukan dengan cara memanaskan menstruum pemanas pada waterbath shaker hingga mencapai suhu pemanasan yang diujikan. Suhu
waterbath dipertahankan konstan dengan menjaga level air berada pada level 12 L. Kontrol suhu waterbath dilakukan dengan menempatkan erlenmeyer yang berukuran
sama dengan erlenmeyer yang digunakan untuk pemanasan kultur E. sakazakii dan dilengkapi dengan termometer.
Erlenmeyer berisi menstruum pemanas diinokulasikan dengan kultur bakteri E.sakazakii sebesar 10
8
CFUml
.
selanjutnya erlenmeyer yang telah berisi kultur E. sakazakii tersebut dipanaskan kembali di dalam waterbath dan dipertahankan holding
pada suhu tersebut hingga interval waktu tertentu. Pencawanan dilakukan pada media TSA untuk tiap interval waktu yang ditetapkan. Waktu koreksi saat inokulasi hingga
pengembalian kultur ke dalam waterbath adalah sebesar 30 detik Fardiaz 1992.
c Perhitungan Nilai D, Nilai Z, Nilai D
72
dan D
70
Jumlah bakteri yang tumbuh pada TSA setelah pemanasan dihitung setelah inkubasi selama 48 jam pada inkubator 35
C. Jumlah ini selanjutnya dihitung nilai log nya dan diplotkan pada kurva semilog dimana sumbu y menunjukkan koloni yang masih hidup
setelah pemanasan Log CFU dan sumbu x menunjukkan interval waktu dalam menit untuk tiap suhu yang diujikan. Dari kedua data ini dibuat kurva kecepatan kematian
E.sakazakii pada 4 suhu 54, 56, 58, dan 60 C selanjutnya dilakukan perhitungan nilai
D atau waktu reduksi desimal dari -1 slope kurva. Nilai Z dihitung dengan membuat kurva hubungan nilai D terhadap suhu kurva kematian termal. Kurva ini dibuat dengan
memplotkan temperatur pengujian pada skala aritmatik, dan nilai D pada skala logaritmik. Nilai Z diperoleh dari -1slope kurva ini. Evaluasi pemilahan cepat isolat
dilakukan dengan menghitung nilai D
54
pemilahan cepat untuk isolat tahan panas terpilih dengan rumus sebagai berikut:
14 [Rumus III]
Keterangan : Nt = jumlah bakteri setelah pemanasan t menit
N = jumlah awal bakteri
t = waktu pemanasan D = nilai D pada suhu tertentu
Suhu 72 C merupakan suhu pasteurisasi High Temperature Short Time yang
umum dilakukan selama 15 detik pada Industri susu. Perhitungan Nilai D
72
tiap isolat
yang diuji digunakan untuk menghitung kemampuan bertahan isolat E. Sakazakii lokal terhadap proses pasteurisasi. Nilai ini juga akan dibandingkan dengan nilai D
72
Enterobactericeae lainnya yang mengkontaminasi. Perbandingan dilakukan untuk melihat ketahanan panas isolat lokal E.sakazakii terhadap Enterobacter lainnya yang
mengkontaminasi susu. Perhitungan D
70
juga dilakukan untuk mengevaluasi suhu rekomendasi rekonstitusi susu yang disarankan oleh WHO-FAO. Perhitungan nilai D
72
dan D
70
menggunakan persamaan : [Rumus IV]
Keterangan: D = Nilai D pada suhu lain
D
ref
= Nilai D pada suhu referensi T
= Suhu nilai D yang dicari T
ref
= Suhu nilai D
ref
Z = Nilai z
D = D
ref
10
Tref - T z
- Log N
t
N t
D =
15
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. PEMILAHAN CEPAT ISOLAT
Enterobacter sakazakii TAHAN PANAS
Tahapan pemilahan cepat isolat Enterobacter sakazakii dilakukan dengan parameter penurunan logaritma jumlah koloni terkecil. Penurunan logaritma jumlah koloni yang kecil
mengindikasikan isolat yang diuji dapat bertahan dalam jumlah besar setelah perlakuan panas yang diberikan, sementara penurunan logaritma jumlah koloni yang besar menunjukkan isolat
yang diuji tereduksi dalam jumlah besar selama pemanasan, dan dapat diasumsikan bahwa isolat tersebut tidak tahan panas. Isolat E. sakazakii dengan karakter tersebut tidak disertakan dalam
kajian ketahanan panas, namun hal ini akan diamati lebih lanjut dari kajian ketahanan panas dengan mengukur parameter kinetika inaktivasi mikroba nilai D dan nilai Z untuk memastikan
ketahanan panasnya. Penurunan reduksi logaritma yang tercantum pada Tabel 2 diartikan sebagai penurunan jumlah E. sakazakii yang diinokulasikan pada menstruum pemanas Tryptose
Soy Broth N yang masih dapat bertahan setelah pemanasan N
t
pada suhu 54
o
C selama 32 menit.
Tabel 2. Hasil Pemilahan Cepat Isolat E. sakazakii Tahan Panas No
Kode isolat
Sumber Jumlah awal
No Jumlah akhir
Nt Reduksi
Log S 1.
YR t2a Susu formula
1.3 x 10
7
1.8 x 10
4
2.86 2.
YR t2b Susu formula
5.9 x 10
6
4.0 x 10
3
3.17 3.
YR c3a Susu formula
1.2 x 10
6
2.6 x 10
4
1.66 4.
E8 Makanan bayi
1.2 x 10
6
4.4 x 10
3
2.44 5.
E9 Makanan bayi
3.8 x 10
5
9.1 x 10
3
1.62 6.
E10 Makanan bayi
4.2 x 10
5
1.2 x 10
3
2.54 7.
E12 Makanan bayi
1.3 x 10
7
4.0 x 10
2
4.51 Rata – rata penurunan log S isolat asal susu formula dan makanan bayi adalah sebesar 3
siklus log. Jika dibandingkan dengan isolat asal susu formula isolat asal makanan bayi mengalami rataan penurunan log yang tidak jauh berbeda, kemungkinan yang terjadi adalah E.
sakazakii yang mengkontaminasi produk, baik susu formula dan makanan bayi berasal dari sumber yang sama, beberapa produk makanan bayi maupun susu formula biasanya berasal dari
produsen yang sama. Data perhitungan koloni pemilahan cepat isolat tahan panas dapat dilihat pada Lampiran 1.
Penurunan log yang terjadi mendekati nilai penurunan rataan log isolat type dan capsulated pada percobaan yang dilakukan Iversen et al. 2004, yaitu penurunan sebesar 3
siklus log pada menstruum pemanas Tryptose Soy Broth TSB dari jumlah inokulum awal
Kategori