Preparasi sampel simplisia Ekstraksi simplisia daun Uji skrining fitokimia Uji sitotoksik

3

2. METODE

Kategori penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan penelitian Post Test Only.

2.1 Alat

Tangki nitrogen cair, inkubator CO 2 Binder, mikroskop inverted Olympus Jepang, cell counter , vortex Genie, mikropipet Soccorex, blue tip dan yellow tip Greiner , tabung reaksi, microtube , timbangan elektrik, LAF Nuaire, ELISA reader ELX 800 Bio Tech, 96 well-plate Iwaki, tissue culture flask Nunclon, tabung conical steril Nunclon, hemositometer Marienfield Germany, sonikator, alat gelas Pyrex, vacuum rotary evaporator Heidolp , alumunium foil, spatula, vakum dan corong Buchner dan kamera digital Sony.

2.2 Bahan

Daun sukun, nangka dan kluwih, sel MCF-7, media kultur DMEM Dulbecco’s modified eagle medium , FBS 10 Fetal Bovine Serum , penisilin-streptomisin 1, SDS 10 Sodium Dodecyl Sulfate , tripsin-EDTA tripsin 0,25, DMSO Dimetil Sulfoksida, fungizone 0,5, larutan MTT 3-4,5 dimetiltiazol-2-il, 2,5-difenil tetrazolium bromida, PBS Phosphate Buffered Saline , akuades, metanol, alkohol 70, reagen semprot FeCl 3, sitroborat, dan dragendorff, silica GF-254, n-heksan dan etil asetat.

2.3 Jalannya Penelitian

2.3.1 Preparasi sampel simplisia

Sampel daun sukun, nangka dan kluwih didapatkan dari Kabupaten Sukoharjo, Jawa Tengah. Daun dicuci bersih dan diangin-anginkan sampai air yang menempel pada daun hilang, kemudian dijemur dibawah sinar matahari selama 4-5 hari sampai kering simplisia. Simplisia diserbuk dan ditimbang hasilnya

2.3.2 Ekstraksi simplisia daun

Serbuk simplisia sebanyak 200 gram direndam maserasi menggunakan 750 mL metanol selama 24 jam, kemudian disaring dengan vakum Buchner dan didapatkan larutan. Larutan tersebut dievaporasi sampai dihasilkan ekstrak kental. Ampas diremaserasi sebanyak 4x dengan perlakuan yang sama. Hasil evaporasi dipindah ke dalam cawan porselen dan diletakkan di atas waterbath untuk menguapkan sisa pelarut dan mendapatkan ekstrak kental.

2.3.3 Uji skrining fitokimia

Optimasi fase gerak dilakukan dengan 5 perbandingan fase gerak etil asetat : n-heksan yaitu 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 dan 1:9. Masing-masing ekstrak ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan dalam chamber berisi fase gerak yang optimal dan telah dijenuhkan. Elusi dilakukan dengan fase gerak optimal n-heksan : etil asetat 2:8. Plat kemudian disemprot untuk melihat kandungan 4 senyawa secara kualitatif dengan beberapa reagen yaitu reagen dragendorff untuk deteksi alkaloid, FeCl 3 untuk deteksi tanin dan sitroborat untuk deteksi flavonoid Saifudin, 2014.

2.3.4 Uji sitotoksik

Suspensi sel sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam plate 96 dan diinkubasi selama 24-48 jam dalam inkubator CO 2 5. Pada akhir inkubasi, media pada masing-masing sumuran dibuang, kemudian ditambahkan 100 µL sampel dalam tiap sumuran dengan variasi kadar 500, 250, 125, 62,5 dan 31,25 µgmL. Selanjutnya plate 96 diinkubasi dalam inkubator CO 2 5 selama 48 jam pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, media pada masing-masing sumuran dibuang kemudian ditambahkan 100 µL MTT 5 mg mL dalam PBS. Plate 96 diinkubasi lagi selama 2-4 jam dalam inkubator CO 2 5 dengan suhu 37ºC. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT 3-4,5-dimetiltiazol- 2il-2,5-difenil tetrazolium bromida membentuk formazan yang berwarna ungu. Reaksi pembentukan formazan dihentikan dengan penambahan 100 µL larutan SDS Sodium Dodecyl Sulphate 10 dalam HCl 0,01N ke dalam masing-masing sumuran, lalu dibungkus kertas dan disimpan selama semalam pada suhu kamar di tempat yang gelap. Pada akhir masa inkubasi serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 594 nm. Persentase sel hidup dihitung melalui data absorbansi sel kemudian dibuat kurva hubungan log konsentrasi versus nilai sel hidup dan dihitung harga IC 50 -nya. Absorbansi yang didapat dari pembacaan dengan ELISA reader digunakan untuk menghitung persentase sel hidup dengan rumus : sel hidup = x 100 Selanjutnya dibuat persamaan garis : y = Bx + A, dengan y = sel hidup dan x = log konsentrasi dibuat grafik log konsentrasi versus persentase sel hidup dan dihitung regresi liniernya. Untuk memperoleh nilai IC 50 dimasukkan y = 50 pada persamaan regresi linier dan dicari x nya kemudian dihitung antilog dari konsentrasi tersebut CCRC, 2013. Nilai IC 50 menunjukkan konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian 50 dari populasi.

3. HASIL