UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
x 10 mm ditempatkan diatas agar terinokulasi didalam cawan petri, dan diisi dengan sampel dan standar. Setelah diinkubasi, silinder dipindahkan
dan zona inhibisi yang terbentuk diukur Choma Grzelak, 2010. Pada uji menggunakan hole
– plate, beberapa milimeter lubang digali pada permukaan agar yang diinokulasi dan kemudian diisi sampel.
Larutan senyawa uji akan berdifusi kedalam medium agar dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Cawan petri dibiarkan pada
suhu ruangan untuk proses inkubasi. Kemudian zona hambat yang
terbentuk diukur Shitandi, et al., 2005 dalam Choma Grezlak, 2010. 2.3.2
Metode dilusi
Metode ini memiliki kemampuan untuk mengukur KHM Kadar Hambat Minimum dan KBM Kadar Bunuh Minimum Pratiwi, 2008.
Dua jenis metode dilusi adalah dilusi agar dan pengenceran tabung Choma Grezelak, 2010. Pratiwi 2008 membedakan metode dilusi
menjadi metode dilusi cair serial dilution dan dilusi padat. Pada dilusi cair, dibuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang
ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji
ditetapkan sebagai KHM. Larutan yan ditetapkan sebagai KHM dikultur ulang tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 37
o
C. Media cair yang terlihat tetap jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM Pratiwi, 2008.
Metode dilusi padat serupa dengan metode dilusi cair tetapi menggunakan media padat. Keuntungan metode ini adalah satu
konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji Pratiwi, 2008.
2.3.3 Metode Bioautografi
Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba. Skrining dapat
didefinisikan sebagai prosedur pertama, yang diterapkan pada sampel yang dianalisis, dalam rangka untuk menetapkan ada atau tidaknya analit yang
didapat. Metode skrining ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
daripada metode lainnya. Selain itu, sederhana, murah, hemat waktu dan tidak memerlukan peralatan yang canggih Choma, 2010.
Menurut Choma, skrining metode bioautografi pada dasarnya untuk menguji aktivitas biologis, misalnya antibakteri, antijamur,
antitumor, dan antiprotozoa zat uji. Metode deteksi ini dapat berhasil dengan dikombinasikan dengan teknik kromatografi lapis tipis Choma,
2010. Prosedur dalam metode bioautografi hampir sama dengan yang
digunakan dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa yang diuji berdifusi ke media agar yang diinokulasi dari lapisan kromatografi,
yang merupakan adsorben atau kertas Wagman, 1969; Choma, 2010. Metode bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak,
bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Dalam bioautografi kontak, lempeng KLT atau kromatogram
kertas ditempatkan pada permukaan agar diinokulasi selama beberapa menit atau jam untuk memungkinkan difusi. Selanjutnya, lempeng
dipindah dan lapisan agar diinkubasi. Pertumbuhan zona hambat muncul di mana senyawa antimikroba berada dalam kontak dengan lapisan agar.
Dalam bioautografi immersion agar overlay, lempeng pertama kali dicelupkan di medium agar atau ditutup dengan medium agar, setelah
agar memadat, ditambahkan mikroorganisme yang diuji dan kemudian diinkubasi. Agar dapat berdifusi dengan baik dari senyawa uji ke
permukaan agar, lempeng dapat tetap pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum inkubasi. Metode ini merupakan kombinasi dari bioautografi
kontak dan langsung, karena senyawa antimikroba yang ditransfer dari kromatogram ke media agar, seperti dalam metode kontak, tetapi lapisan
agar tetap pada permukaan kromatogram selama inkubasi dan visualisasi, sebagai bioautografi langsung Choma, 2010.
Di antara semua metode bioautografi, yang paling banyak digunakan adalah bioautografi langsung. Prinsip dari metode ini adalah
lempeng KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu yang tepat dan kemudian diinkubasi dalam suasana lembab.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Permukaan silika dari lempeng KLT ditutupi dengan media kaldu menjadi sumber nutrisi dan memungkinkan pertumbuhan mikroorganisme secara
langsung di atasnya, daerah di mana terdapat spot agen antimikroba menunjukkan zona penghambatan pertumbuhan mikroorganisme yang
terbentuk. Visualisasi dari zona ini biasanya dilakukan dengan menggunakan reagen dehidrogenase untuk deteksi aktivitas, yang paling
umum adalah garam tetrazolium. Dehidrogenase mengkonversi
mikroorganisme hidup garam tetrazolium menjadi berwarna. Sehingga, spot krim - putih muncul dengan latarbelakang ungu pada permukaan
lempeng KLT menunjukkan keberadaan agen antibakteri Choma, 2010.
2.4 Tinjauan Tentang Bakteri
