Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Etanol Herba Ranti (Solanum nigrum Linn) dan Isolasi Senyawa Dari Fraksi Aktif

(1)

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI-FRAKSI EKSTRAK

ETANOL HERBA RANTI (Solanum nigrum Linn) DAN

ISOLASI SENYAWA DARI FRAKSI AKTIF

SKRIPSI

OLEH:

EMILDA KHAIRUNISA NIM 091524025

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI-FRAKSI EKSTRAK

ETANOL HERBA RANTI (Solanum nigrum Linn) DAN

ISOLASI SENYAWA DARI FRAKSI AKTIF

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

EMILDA KHAIRUNISA NIM 091524025

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

LEMBAR PENGESAHAN

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI-FRAKSI EKSTRAK ETANOL HERBA RANTI (Solanum nigrum Linn) DANISOLASI

SENYAWA DARI FRAKSI AKTIF

OLEH:

EMILDA KHAIRUNISA NIM 091524025

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: Agustus 2011

Pembimbing I Panitia Penguji

Dra. Herawaty Ginting, M.Si., Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195112231980032002 NIP 195301011983031004

Pembimbing II, Dra. Herawaty Ginting, M.Si., Apt. NIP 195112231980032002

Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. Dr. Marline Nainggolan, M.Si., Apt. NIP 195103261978022001 NIP 195709091985112001

Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt. NIP 195107231982032001

Disahkan Oleh: Dekan

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002

(4)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT, karena limpahan rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul ”Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Etanol Herba Ranti (Solanum nigrum Linn) dan Isolasi Senyawa Dari Fraksi Aktif ”.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih dan penghargaan yang tulus kepada Ayahanda dan Ibunda tercinta, Mukmil Dumairi dan Huriyah atas doa dan pengorbanannya dengan tulus dan ikhlas, juga kepada kakak, abang dan adik tersayang yang selalu setia memberi doa, dorongan dan semangat.

Penulis juga ingin menyampaikan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan.

2. Ibu Dra. Herawaty Ginting, M.Si., Apt., dan Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan dan nasehat selama penelitian dengan penuh kesabaran hingga selesainya penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., Ibu Dr. Marline Nainggolan, M.Si., Apt., Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini.

(5)

4. Ibu Dra. Aswita Hafni Lubis, M. Si., Apt., yang telah memberikan waktu, membantu dan membimbing selama penelitian dengan penuh kesabaran hingga selesainya penyusunan skripsi ini.

5. Ibu Poppy Anjelissa Z Hasibuan, S.Si M.Si., Apt., selaku dosen wali yang telah memberi bimbingan dan dorongan kepada penulis selama perkuliahan.

6. Ibu dan Bapak Kepala Laboratorium Penelitian dan Laboratorium Farmakognosi yang telah memberikan fasilitas, petunjuk dan membantu selama penelitian.

7. Sahabat-sahabat terbaikku “ten_tuwin” kak ira, kak winda, kak ve, desmi, rika, nita, ipit, vivi, iza, silvi, deni satria dan teman-teman di Farmasi Ekstensi 2008-2009 yang namanya tidak dapat ditulis satu persatu, yang telah begitu banyak membantu dalam proses penelitian hingga selesainya penulisan skripsi ini.

Medan, Agustus 2011 Penulis,

(6)

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-fraksi Ekstrak Etanol Herba Ranti (Solanum nigrum Linn) Dan Isolasi senyawa Dari Fraksi Aktif

Abstrak

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif yang relatif stabil. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan sumber antioksidan alami yang biasanya terdapat dalam tumbuhan. Herba ranti (Solanum nigrum Linn) merupakan salah satu tanaman yang mengandung senyawa fenolik dan flavonoid. Adanya kandungan flavonoid dalam herba ranti tersebut mendorong untuk melakukan pengujian aktivitas antioksidan sehingga dapat digunakan sebagai antioksidan alami.

Uji aktivitas antioksidan penangkapan radikal bebas telah dilakukan terhadap fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat, air dan senyawa aktif dari fraksi etilasetat dari herb ranti. Herba ranti diekstraksi secara maserasi dengan mengpgunakan etanol 96% diperolah ekstrak etanol. Kemudian difraksinasi dengan cara ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut n-heksan, kloroform, etilasetat. Masing-masing fraksi diuji aktivitas antioksidan menggunakan penangkap radikal DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Fraksi etilasetat dikromatografi preparatif dengan menggunakan asam asetat 50% sebagai fase gerak. Kemudian dilihat menggunakan lampu UV dengan penampak bercak 5% b/v aluminium klorida pada panjang gelombang 366 nm. Isolat diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer UV menggunakan pereaksi geser. Isolasi menghasilkan 2 flavonoid, F1 memiliki harga Rf = 0,48 kemungkinan adalah flavanon dan F2 memiliki harga Rf = 0.59 kemungkinan adalah flavonol dengan gugus 4’OH pada cincin B. kemudian dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap isolat.

Hasil uji aktivitas antioksidan keempat fraksi dengan konsentrasi masing-masing 80 µg/ml diperoleh % peredaman fraksi n-heksan 15,22%, fraksi kloroform 68,03%, fraksi etilasetat 68,14% dan fraksi sisa 23,44%. Sedangkan aktivitas antioksidan isolat dengan konsentrasi masing-masing 80 µg/ml diperoleh % peredaman flavonoid1 (flavanon) 49,70%dan isolat flavonoid 2 (flavonol) 41,21%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi etilasetat mempunyai aktivitas antioksidan paling kuat.

(7)

Antioxidant Activities Test of Fraction Ethanol Extract of Ranti Herb (Solanum nigrum. L) And Isolation of fraction active

Abstract

Antioxidant is a compound which can inhibit oxidation in such a way that it reacts with reactive free radicals to form a relatively stable radicals. Flavonoid and phenolic compounds are sources of antioxidant which are commonly found in plants. Ranti herb (Solanum nigrum L) contains flavonoid and phenolic compounds and believed possesses a medical use. A further research on the activity test of antioxidant is encouraged since ranti herb may be used as natural antioxidant for its flavonoid content

In order to increase the usage of natural antioxidant from food, the research has been determine the activity testing of flavonoidas antioxidant, n-hexane fraction, chloroform fraction, ethylacetate fraction of ranti herb and isolating active fraction compounds and the activity testing of flavonoidas antioxidant. Ranti herb was extracted by maceration with ethanol 96%, and fractionated by liquid extraction using n-hexane, chloroform and solvent. The ethylacetate fraction was separated by preparative paper chromatography using 50% acetic acid as mobile phase, visualization using 5% b/v aluminium chloride and 366 nm UV ray. The isolate were identified by UV spectrophotometer using shift reagent.their antioxidant activities weredone by the DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scaevenging method. The isolate result obtained two flavonoids, F1 has Rf = 0.48, indicated that F1 is flavanon and F2 has Rf = 0.59, indicated that F2 flavonol with hydroxyl grops in position 4’.

The result of antioxidant activity test all of fraction with each concentration 80 µg/ml showed that n-hexane fraction has %inhibition value is 15.22%, Chloroform fraction is 68.03%, ethylacetate fraction is 68.1%l, and water fractin is 23,44%. wherever the isolated flavonoid 1 (flavanon) has % inhibition value is 49.70% and isolated flavonoid 2 (flavonol) is 41.21%. The ethylacetate exhibited a strong free radical scavenging.

(8)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

DAFTAR ISI ... viii

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

BAB I. PENDAHULUAN ... 1

1.1Latar Belakang ... 1

1.2Perumusan Masalah ... 2

1.3Hipotesis ... 3

1.4Tujuan Penelitian ... 3

1.5Manfaat Penelitian ... 3

1.6Kerangka Pikir Penelitian ... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 5

2.1 Uraian Tumbuhan ... 5

2.1.1 Daerah Tumbuh ... 5

2.1.2 Nama Daerah ... 5

(9)

2.1.4 Marfologi Tumbuhan ... 6

2.1.5 Kandungan Kimia Tumbuhan dan Kegunaan ... 6

2.2 Ekstraksi ... 7

2.3 Radikal Bebas ... 8

2.4 Antioksidan ... 9

2.4.1 Antioksidan Sintetik ... 10

2.4.2 Butylated Hydroxytoluent (BHT) ... 11

2.5 DPPH ... 11

2.5.1 Pelarut ... 12

2.5.2 Pengukuran Absorbansi-Panjang Gelombang... 12

2.5.3 Waktu Pengukuran ... 13

2.6 Spektrofotometri ... 13

2.7 Senyawa Flavonoid ... 14

2.8 Kromatografi ... 17

BAB III.METODE PENELITIAN ... 20

3.1 Alat-alat ... 20

3.2 Bahan-bahan ... 20

3.3 Pengumpulan dan Pembuatan Simplesia ... 21

3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan ... 21

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan ... 21

3.3.3 Pembuatan Simplisia... 21

3.4 Pembuatan Pereaksi ... 22

3.4.1 Larutan Pereaksi Libermann-Burchard ... 22

(10)

3.4.3 Larutan Pereaksi Asam Sulfat 2N ... 22

3.4.4 Larutan Pereaksi Aluminium Klorida 5%b/v ... 22

3.4.5 Larutan Pereaksi Natrium Hidroksida 2N ... 22

3.4.6 Larutan Radikal Bebas DPPH 0,5mM ... 23

3.5 Pembutan Ekstrak Etanol Dan Ekstraksi Cair-Cair Ekstrak Etanol ... 23

3.5.1 Pembuatan Ektrak Etanol ... 23

3.5.2 Ekstraksi Cair-cair Ekstrak Etanol ... 23

3.6 Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi n-heksan, kloroform,Etilasetat, sisa dan BHT ... 24

3.6.1 Prinsip Metode Penangkapan Radikal Bebas ... 24

3.6.2 Pembuatan Larutan DPPH 0,5mM ... 24

3.6.3 Pembuatan Larutan Induk ... 24

3.6.4 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Sampel Uji dan BHT . 25 3.6.5 Penentuan Persen Peredaman ... 25

3.6.6 Penentuan Nilai IC50 ... 26

3.7 Isolasi Senyawa Dari Fraksi Aktif ... 26

3.7.1 Analisis Senyawa dari Fraksi Aktif Secara KKt ... 26

3.7.2 Pemisahan Senyawa Dari Fraksi Aktif Secara KKt Preparatif ... 27

3.7.3 Uji Kemurnian Terhadap Isolat ... 28

2.7.4 Identifikasi Isolat ... 28

3.8 Uji Aktivitas Antioksidan Isolat Senyawa Dari Fraksi Aktif .... 29

3.8.1 Pembuatan Larutan Induk Isolat ... 29

(11)

3.8.2.1 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Isolat 1 ... 29

3.8.2.2 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Isolat 2 ... 30

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 31

4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan... 31

4.2 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi Cair-cair dari Ekstrak Etanol .... 31

4.3 Hasil Uji Aktivtas Antioksidan Fraksi n-heksan, kloroform, Etilasetat, air dan BHT ... 31

4.4 Hasil Analisis Senyawa Dari Fraksinasi Secara KKt ... 33

4.5 Hasil Uji Kemurnian Terhadap Isolat... 34

4.6 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Isolat ... 38

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 41

5.1 Kesimpulan ... 41

5.2 Saran ... 41

DAFTAR PUSTAKA ... 42

(12)

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

4.1 Aktivitas Antioksidan frksi n-heksan, kloroform, etilasetat, air

dan BHT dari ekstrak etanol herba ranti ... 32 4.2 Aktivitas Antioksidan isolat flavonoid herba ranti ... 38

(13)

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1.1 Kerangka fikir Penelitia... 4

2.1 Rumus Bangun BHT ... 11

2.2 Rumus Bangun DPPH ... 11

2.3 Reaksi antara DPPH dengan atom H netral yang berasal dari Antioksidan ... 12

2.4 Kerangka Flavonoid ... 14

2.5 Struktur Dasar Flavonoid ... 14

2.6 Struktur Flavon ... 15

2. 7 Struktur Flavonol ... 15

2.8 Struktur Flavanon ... 16

2.9 Struktur Flavanonol ... 16

2.10 Struktur Auron ... 16

2.11 Struktur Kalkon ... 16

2.12 Struktur Isoflavon ... 17

2.13 Struktur Antosianin ... 17

3.1. Gambar grafik Konsentrasi Vs persen peredaman fraksi n heksan, kloroform, etilasetat, air dan isolat flavonoid ... 33

3.2. Gambar grafik Konsentrasi Vs persen peredaman isolat senyawa dari fraksi aktif ... 39

(14)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Gambar Tumbuhan Dan Daun Ranti... 44

2. Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 45

3. Bagan Kerja Penelitian ... 46

4. Bagan Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Ranti ... 47

5. Bagan Ekstraksi Cair-cair Ekstrak Etanol ... 48

6. Bagan Analisis Senyawa Dari Fraksi Aktif ... 49

7. Gambar Kromatogram Hasil fraksinasi Secara KKt dengan Fase Diam Kertas Whatman N0. 1... 50

8. Bagan Pemisahan Senyawa Dari Fraksi Aktif ... 55

9. Gambar Kromatogram KKt Preparatif Senyawa Dari Fraksi Aktif 56 10.Gambar Kromatogram KKt Dua Arah Isolat Senyawa Dari Fraksi Aktif ... 57

11.Spektrum UV Isolat Flavonoid ... 59

12. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ... 71

13.Perhitungan Nilai IC50 fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat, sisa/air, isolat flavonoid dan BHT ... 74

14.Gambar Alat rotary evaporator, freeze dryer, dan Spektrofotometer UV-Visibel ... 81

(15)

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-fraksi Ekstrak Etanol Herba Ranti (Solanum nigrum Linn) Dan Isolasi senyawa Dari Fraksi Aktif

Abstrak

(16)

Antioxidant Activities Test of Fraction Ethanol Extract of Ranti Herb (Solanum nigrum. L) And Isolation of fraction active

Abstract

(17)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Pesatnya perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi serta berubahnya pola hidup masyarakat berdampak pada munculnya berbagai penyakit degeneratif seperti penyakit jantung koroner, penyakit kanker, penyakit katarak. Pola makanan yang tidak benar mengakibatkan terbentuknya radikal bebas dalam tubuh sehingga muncul beragam penyakit. Radikal bebas adalah senyawa kimia yang mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Senyawa ini bersifat tidak stabil dan sangat reaktif. Untuk mencapai kestabilan, senyawa ini harus mencari elektron lain sebagai pasangan (Hernani dan Rahardja, 2005).

Tubuh kita membutuhkan substansi penting yakni antioksidan yang dapat membantu melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif senyawa ini (Kosasih, 2004).

Antioksidan adalah zat yang dalam kadar rendah mampu menghambat laju oksidasi molekul target atau senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat memberikan elektronnya dengan cuma-cuma kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu sama sekali dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas (Kumalaningsih, 2006).

Flavonoid memiliki sifat antioksidan sebagai penangkap radikal bebas karena mengandung gugus hidroksil. Karena sifatnya sebagai reduktor, flavonoid dapat bertindak sebagai donor hidrogen terrhadap radikal bebas. Senyawa ini banyak terdapat pada berbagai jenis tumbuhan sehingga dengan banyak mengkonsumsi buah-buahan dan sayur-sayuran yang mengandung flavonoid

(18)

dapat menurunkan resiko terhadap kanker dan penyakit jantung koroner (Silalahi, 2006).

Ranti (Solanum nigrum L) merupakan salah satu sayuran yang sering kita jumpai dipasar, mudah didapatkan dengan harga yang relatif murah dan sering dikonsumsi masyarakat serta menjadi sangat bermanfaat sebagai antioksidan jika dikaitkan dengan kandungan kimianya yaitu senyawa polifenol terutama flavonoid yang bersifat antioksidan (Anonim, 2010).

Penelitian sebelumnya oleh Ginting, dkk., (2010) menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba ranti mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, tannin, saponin, dan glikosida dan mempunyai aktivitas antioksidan kuat dengan nilai IC50 sebesar 89,26 µg/ml. Berdasarkan uraian di atas, maka penulis tertarik

untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi-fraksi ekstrak etanol herba ranti dan mengisolasi senyawa dari fraksi aktif.

1.2Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas maka perumusan masalah penelitian yaitu: a. Fraksi mana dari herba ranti yang mempunyai aktivitas antioksidan paling

besar?

b. Apakah golongan senyawa dari fraksi aktif yang mempunyai aktivitas antioksidan pada simplisia herba ranti?

c. Seberapa besar aktivitas antioksidan senyawa dari fraksi aktif ekstrak etanol herba ranti?

(19)

1.3Hipotesis

Berdasarkan perumusan masalah diatas maka hipotesis penelitian yaitu:

a. Aktivitas antioksidan terbesar herba ranti diduga terdapat pada fraksi etilasetat.

b. Golongan senyawa dari fraksi aktif yang mempunyai aktivitas antioksidan pada simplisia herba ranti adalah flavonoid.

c. Senyawa dari fraksi aktif ekstrak etanol herba ranti memiliki aktivitas antioksidan kuat.

1.4Tujuan

Berdasarkan hipotesis diatas maka tujuan penelitian yaitu:

a. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi-fraksi ekstrak etanol herba ranti.

b. Untuk mengetahui golongan senyawa dari fraksi aktif yang mempunyai aktivitas antioksidan pada simplisia herba ranti.

c. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan isolat senyawa dari fraksi aktif pada simplisia herba ranti.

1.5Manfaat

Berdasarkan tujuan penelitian diatas maka manfaat penelitian yaitu:

a. Memperoleh informasi tentang aktivitas antioksidan fraksi-fraksi ekstrak etanol herba ranti.

b. Memperoleh informasi mengenai golongan senyawa dari fraksi aktif yang terdapat pada simplisia herba ranti.

(20)

c. Memperoleh informasi tentang aktivitas antioksidan isolat senyawa dari fraksi aktif yany terdapat pada simplisia herba ranti.

1.6Kerangka Pikir Penelitian

Variabel Bebas Variabel Terikat

Gambar 1.1 Kerangka fikir penelitian

Ekstrak Etanol Herba Ranti

Fraksi n-heksan 40, 60, 80 µg/ml Fraksi kloroform 40, 60, 80 µg/ml Fraksi etilasetat 40, 60, 80 µg/ml Fraksi air 40, 60, 80 µg/ml

DPPH (radikal bebas)

Persen Peredaman

Isolat Senyawa dari fraksi Aktif

(21)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uraian Tumbuhan

Uraian tumbuhan meliputi daerah tumbuh (habitat), nama daerah, sistematika tumbuhan, morfologi tumbuhan, kandungan kimia dan kegunaan dari tumbuhan.

2.1.1 Daerah Tumbuh

Ranti (Solanum nigrum Linn) termasuk tumbuhan semak dengan tinggi ± 1,5 m. Di Indonesia, tanaman ini lebih dikenal dengan sebutan ranti atau leunca pahit (Anonim, 2010).

2.1.2 Nama Daerah

Karo : Leuh Aceh : Rampai Sunda : Leunca pahit

Melayu : Ranti, terung meranti, terung para cicit, terung perat Maluku : Boose, Bobose (Depkes RI, 1994)

2.1.3 Sistematika Tumbuhan

Divisi : Spermatophyta Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Ordo : Solanales Familia : Solanaceae

(22)

Genus : Solanum

Spesies : Solanum nigrum L (Depkes RI, 1994).

2.1.4 Morfologi Tumbuhan

Habitus : Semak, tinggi ± 1,5 cm Batang : Tegak, bulat, lunak, hijau.

Daun : Tunggal, lonjong, tersebar, panjang 5-7,5 cm, lebar 2,5-3,5 cm, pangkal runcing, tepi rata, ujung runcing, pertulangan menyirip, tangkai panjang, ±1 cm, hijau

Bunga : Majemuk, bentuk corong, berbulu, tangkai ± 1,5 cm, hijau pucat, kelopak panjang 0,3cm, bertaju lima, hijau, benang sari putih kehijauan, mahkota lonjong, bentuk corong, panjang ± 0,4 cm.

Buah : Bulat, masih muda hijau, setelah tua coklat kehitaman. Biji : Bulat pipih, kecil-kecil putih.

Akar : Tunggang , putih kecoklatan (Depkes RI, 1994).

2.1.5 Kandungan Kimia dan Kegunaan

Buah, daun dan kulit batang ranti (Solanum nigrum Linn) mengandung saponin dan tannin, disamping itu buahnya juga mengandung alkaloid dan daunnya mengandung flavonoid (Depkes RI, 1999). Ranti juga mengandung mineral kalsium, fosfor, besi, vitamin A, vitamin C (Hernani dan Rahardjo, 2005)

Buah ranti berkhasiat sebagai obat penurun tekanan darah tinggi, obat sembelit dan untuk peluruh air seni (Depkes RI, 1994). Ranti juga berguna sebagai obat penurun panas, antiradang, antiracun, peluruh dahak, pereda batuk,

(23)

kanker mulut rahim, kanker payudara, lever dan lambung (Hernani dan Rahardjo, 2005).

2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dalam pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain (Depkes RI, 2000).

Beberapa meode ekstraksi dengan menggunakan pelarut yaitu: ( Depkes RI, 2000) A. Cara dingin

1. Maserasi

Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperature kamar. Maserasi yang dilakukan secara terus menerus disebut maserasi kinetic sedangkan maserasi yang dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyarian terhadap maserat pertama, dan seterusnya disebut remaserasi.

2. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperature kamar. Proses perkolasi terdiri dari tahap pelembaban bahan, tahap perendaman antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) terus menerus sampai diperoleh perkolat.

B. Cara panas 1. Refluks

(24)

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

2. Digesti

Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur lebih tinggi temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-500C.

3. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, dilakukan menggunakan alat soklet sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

4. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperature 900C selama 30 menit.

5. Dekok

Dekok adalah infuse pada waktu yang lebih lama (≥ 30 menit) dan temperature sampai titik didih air.

2.3 Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan suatu spesies kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan spesies tersebut menjadi sangat reaktif untuk mencari pasangannya dengan menarik atau menyerang elektron dari senyawa lain sehingga menyebabkan senyawa tersebut akan menjadi radikal juga. Reaksi oksidasi tidak hanya berkaitan dengan kerusakan mutu produk pangan,

(25)

namun reaksi oksidasi yang terjadi pada berbagai organ dan cairan tubuh juga berkaitan dengan munculnya penyakit penyakit degeneratif seperti aterosklerosis, kanker dan liver. Target utama radikal bebas didalam tubuh adalah protein, asam lemak tidak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA. Berbagai kemungkinan dapat terjadi sebagai akibat kerja radikal bebas, misalnya gangguan fungsi sel, kerusakan struktur sel, molekul termodifikasi yang tidak dapat dikenali oleh sistem imun, Semua gangguan tersebut dapat memicu munculnya berbagai penyakit (Kosasih, 2004).

2.4. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan. Antioksidan mencegah terjadinya oksidasi atau menetralkan senyawa yang telah teroksidasi dengan cara menyumbangkan hidrogen atau elektron (Silalahi, 2006). Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal atau dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Atas dasar fungsinya, antioksidan dapat dibedakan menjadi lima yakni: (Kumalaningsih, 2006).

a. Antioksidan primer, merupakan sistem enzim pada tubuh manusia, contohnya: enzim superoksida dismutase.

b. Antioksidan sekunder, merupakan antioksidan alami yang dapat diperoleh dari tanaman atau hewan berupa tokoferol, vitamin C, betakaroten, flavonoid dan senyawa fenolik yang berfungsi menangkap radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih besar.

(26)

c. Antioksidan tersier (sintetik), dibuat dari bahan-bahan kimia yang biasanya ditambahkan ke dalam bahan pangan untuk mencegah terjadinya reaksi autooksidasi. Antioksidan tersier bekerja memperbaiki sel sel dan jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas. Senyawa antioksidan sintetik yang secara luas digunakan adalah Butylated Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluen (BHT), propil galat.

d. Oxygen scavenger, yang mampu mengikat oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi reduksi, misalnya vitamin C.

e. Chelators atau sequestrant, yang dapat mengikat logam yang mengkatalisis reaksi oksidasi misalnya asam.

Zat antioksidan yang alami terdapat pada sayur-sayuran, buah-buahan segar, dan rempah-rempah, yaitu senyawa fenolik atau polifenol yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat beberapa mineral antara lain: seng, selenium dan tembaga, beberapa vitamin antara lain: vitamin A, vitamin C dan vitamin E (Anonim, 2010).

2.4.1 Antioksidan Sintetik

Antioksidan sintetik biasanya ditambahkan ke dalam bahan pangan yang mengandung lemak untuk mencegah terjadinya reaksi autooksidasi. Banyaknya dikembangkan senyawa antioksidan sintetik dikarenakan antioksidan alami seperti vitamin E dan vitamin C sangat peka oleh berbagai proses pada pengolahan senyawa lemak, seperti suhu yang tinggi pada penggorengan atau pemanggangan. Senyawa antioksidan sintetik yang secara luas digunakan adalah Butylated Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluen (BHT), propil galat. (Branen, et.al., 2002).

(27)

2.4.2 Butylated Hydroxytoluen (BHT)

Gambar 2.1 Rumus Bangun BHT

Butylated Hydroxytoluen mempunyai berat molekul 220,35 dengan rumus molekul C15H24O. Butylated Hydroxytoluen mengandung tidak kurang dari 99,0%

C15H24O. Pemerian: Hablur padat, putih, bau khas, lemah. Kelarutan: Tidak larut

dalam air dan propilen glikol, mudah larut dalam etanol, kloroform dan eter. Penyimpanan dalam wadah tertutup baik (Ditjen POM, 1995).

2.5 DPPH

DPPH merupakan singkatan umum untuk senyawa kimia organik yaitu 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil. DPPH adalah bubuk kristal berwarna gelap terdiri dari molekul radikal bebas yang stabil. DPPH mempunyai berat molekul 394.32 dengan rumus molekul C18H12N5O6, larut dalam air. Penyimpanan dalam wadah

tertutup baik pada suhu -20°C (Molyneux, 2004).

(28)

DPPH dapat digunakan untuk menguji kemampuan antioksidan yang terkandung dalam makanan. Prinsipnya dimana elektron ganjil pada molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 516 nm yang berwarna ungu. Warna ini akan berubah dari ungu menjadi kuning lemah apabila elektron ganjil tersebut berpasangan dengan atom hidrogen yang disumbangkan senyawa antioksidan. Reaksi antara DPPH dengan atom H netral yang berasal dari antioksidan dapat dilihat pada gambar 2.3

Gambar 2.3 Reaksi antara DPPH dengan atom H netral yang berasal dari

antioksidan.

2.5.1 Pelarut

Metode ini akan bekerja dengan baik menggunakan pelarut metanol atau etanol karena kedua pelarut ini tidak mempengaruhi dalam reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas (Molyneux, 2004).

2.5.2 Pengukuran Absorbansi-Panjang Gelombang

Panjang gelombang maksimum (λmaks) yang digunakan dalam pengukuran

sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang maksimum untuk DPPH antara lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm, 520 nm. Bagaimanapun dalam praktiknya hasil pengukuran yang memberikan peak maksimum itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang disebutkan diatas (Molyneux, 2004).

(29)

2.5.3 Waktu Pengukuran

Lamanya pengukuran menurut beberapa literatur, yang direkomendasikan adalah selama 30 menit, namun dalam beberapa penelitian khususnya belakangan ini waktu pengukuran yaitu selama 60 menit. Waktu pengukuran digunakan sebagai parameter untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan sampel sebagai rujukan untuk digunakan dalam penelitian-penelitian berikutnya (Molyneux, 2004).

2.6 Spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan suatu metode pengukuran energi radiasi atau intensitas sinar yang terserap oleh larutan. Spektrofotometri UV-Vis (Ultra Violet-Visibel) adalah salah satu bentuk spektrofotometri absorbsi. Pada cara ini, cahaya atau gelombang cahaya elektromagnetik (sinar UV-Vis) berinteraksi dengan zat dan dilakukan pengukuran besarnya cahaya (gelombang elektromagnetik) yang diabsorbsi (Benson, 1987).

Berdasarkan panjang gelombang spektrofotometer dibagi dua yaitu spektrofotometer ultraviolet dengan panjang gelombang 200-400 nm,digunakan untuk senyawa yang tidak berwarna dan spektrofotometri visibel (sinar tampak) dengan panjang gelombang 400-800 nm, digunakan untuk senyawa yang berwarna (Rohman, 2007).

Spektrofotometer pada dasarnya terdiri atas sumber cahaya, monokromator, kuvet untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus (amplifier) dan alat ukur atau alat pencatat (recorder).

(30)

2.7Senyawa flavonoida

Senyawa flavonoida merupakan senyawa polifenol yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C6 – C3 – C6,

yaitu 2 cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan 3 karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga (Markham, 1988).

Gambar 2.4 Kerangka flavonoida

Flavonoida terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran dari flavonoida yang berbeda golongan dan jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal. Flavonoida pada tumbuhan terdapat dalam berbagai bentuk struktur molekul dengan beberapa bentuk kombinasi glikosida. Oleh karena itu, dalam menganalisis flavonoida lebih baik memeriksa aglikon yang telah terhidrolisis daripada dalam bentuk glikosida dengan strukturnya yang rumit dan kompleks (Harborne, 1987).

Sistem penomoran untuk turunan flavonoida adalah:

Gambar 2.5 Struktur dasar flavonoida

(31)

1. Flavon dan flavonol

Flavon dan flavonol merupakan senyawa yang paling tersebar luas dari semua pigmen tumbuhan kuning. Flavon berbeda dengan flavonol karena pada flavon tidak terdapat gugus 3-hidroksi. Hal ini mempengaruhi serapan UV-nya, gerakan kromatografinya, serta reaksi warnanya dan karena itu flavon dapat dibedakan dari flavonol berdasarkan ketiga sifat tersebut. Hanya ada dua flavon yang umum, yaitu apigenin dan luteolin. Jenis yang paling umum adalah 7- glikosida. Flavonol dalam tumbuhan sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida. Aglikon flavonol yang umumnya dijumpai yaitu kemferol, kuersetin, dan mirisetin (Harborne, 1987).

Gambar 2.6 Struktur flavon Gambar 2.7 Struktur flavonol 2. Flavanon dan flavanonol

Senyawa ini terdapat hanya sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Flavanon dan flavanonol tidak berwarna atau hanya kuning sedikit. Flavanon (dihidroflavon) sering terjadi sebagai aglikon, tetapi beberapa glikosidanya dikenal, misalnya hesperidin dan naringin. Flavanonol (dihidroflavonol) merupakan flavonoida yang kurang dikenal, dan senyawa ini tidak diketahui terdapat sebagai glikosida (Robinson, 1995).

(32)

Gambar 2.8 Struktur flavanon Gambar 2.9 Struktur flavanonol

3. Auron dan kalkon

Auron berupa bercak kuning, dengan sinar lampu UV mereka tampak berbeda, warna auron kuning dan berubah menjadi merah jingga bila diuapi amonia. Kalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat dengan sinar lampu UV. Salah satu kalkon yang umum, yaitu: butein, dan salah satu auron yang umum, yaitu: aureusidin. Keduanya terdapat di alam sebagai glikosida dan terdapat khas dalam suku Compositae (Harborne, 1987).

Gambar 2.10 Struktur auron Gambar 2.11 Struktur kalkon

4. Isoflavon

Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna apapun, beberapa isoflavon memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar lampu UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan amonia berubah menjadi coklat pudar. Isoflavon merupakan golongan flavonoida yang penyebarannya terbatas dan jumlahnya sedikit (Harborne, 1987).

(33)

Gambar 2.12 Struktur isoflavon 5. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan, merupakan pembentuk dasar pigmen warna merah, ungu dan biru pada tanaman, terutama sebagai bahan pewarna bunga dan buah-buahan. Sebagian besar antosianin adalah glikosida dan aglikonnya disebut antosianidin, yang terbentuk bila antosianin dihidrolisis dengan asam. Antosianin yang paling umum adalah sianidin yang berwarna merah lembayung (Harborne, 1987; Robinson, 1995; Sastrohamidjojo, 1996).

Gambar 2.13 Struktur antosianidin

2.8 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan perpindahan dari komponen-komponen senyawa diantara 2 fase yaitu fase diam (dapat berupa zat cair atau zat padat) dan fase gerak (dapat berupa gas atau zat cair) (Gritter, 1991).

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagaimacam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat

(34)

dibagi atas: kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan kromatografi gas (KG) (Gandjar, 2007).

Kromatografi kertas

Keuntungan utama KKt ialah kemudahan dan kesederhanaan pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan. Senyawa pada KKt biasanya dideteksi sebagai bercak berwarna atau bercak berfluoresensi pada lampu UV setelah direaksikan dengan penampak bercak (Harborne, 1987).

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada saat melakukan pemisahan secara KKt (Sastrohamidjojo, 1985):

1. Metode pemisahan (penaikan, penurunan atau mendatar). 2. Macam dari kertas.

3. Pemilihan dan pembuatan pelarut (fase gerak). 4. Kesetimbangan dalam bejana yang dipilih. 5. Pembuatan cuplikan.

6. Waktu pengembangan.

7. Metode deteksi dan identifikasi

Fase diam pada KKt digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai. Pemisahan dapat dilakukan menggunakan pelarut tunggal atau menggunakan 2 pelarut yang tidak dapat bercampur, fase gerak merambat perlahan-lahan melalui fase diam yang membungkus serabut kertas.

Fase gerak biasanya merupakan campuran yang terdiri atas 1 komponen organik yang utama air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa dengan

(35)

tujuan untuk memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atau untuk mengurangi kelarutan (Sastrohamidjojo, 1985).

Gerakan noda suatu senyawa dalam pengembang tertentu disebut bilangan Rf senyawa itu dalam pengembang tersebut. Bilangan Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan fase gerak (diukur dari garis awal), karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0. Membanding bilangan Rf flavonoida yang belum dikenal dengan Rf yang telah dikenal dan sejenis merupakan cara yang berguna untuk identifikasi flavonoid yang tidak ada di laboratorium (Markham, 1988).

Menurut Sastrohamidjojo (1985), faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan, suhu, kesetimbangan, sifat dari penyerap, tebal dan kerataan lapisan penyerap, pelarut, kertas, sifat dari campuran, derajat kejenuhan dari bejana pengembangan, tekhnik percobaan dan jumlah cuplikan yang digunakan.

(36)

BAB III

METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan bahan, pembuatan simplisia, pembuatan ekstrak etanol, fraksinasi, uji aktivitas antioksidan fraksi-fraksi, analisis Kromatografi Kertas (KKt), uji kemurnian isolat, identifikasi isolat secara spektrofotometer UV dengan penambahan pereaksi geser (shift reagent) dan uji aktivitas antioksidan senyawa dari fraksi aktif secara spektrofotometri sinar tampak. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, blender (National), desikator, freeze dryer (Modulio), krus porselin, lemari pendingin, lemari pengering, neraca kasar (O’haus), neraca listrik (vibra AJ), oven listrik (fisher scientific), penangas air, rotary evaporator (Buchi 461), seperangkat alat kromatografi kertas, seperangkat alat refluks, lampu UV 366 nm (camag), Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu) .

3.2 Bahan

Bahan tumbuhan yang digunakan adalah herba ranti (Solanum nigrum L.) Bahan-bahan kimia yang digunakan, kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisis 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH) (sigma), Produksi Merk : n-heksan, kloroform, etilasetat, etanol 96%, n-butanol, asam klorida pekat, asam sulfat

(37)

pekat, asam asetat anhidrat, aluminium (III) klorida, asam asetat glasial, air suling, pipa kapiler kertas whatmann No.1 dan No.3.

3.3 Pengumpulan Dan Pembuatan Simplisia

3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan

Metode pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan adalah herba ranti segar yang diambil dari Pasar Sore, Jalan Jamin Ginting, Medan, Sumatera Utara. Gambar tumbuhan dan daun ranti dapat dilihat pada Lampiran 1 Halaman 43.

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh saudara Rina Khor (2008) di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor, Jl. Raya Jakarta-Bogor. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 44.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Bahan tumbuhan yang digunakan adalah herba ranti sebanyak 3,5 kg. Herba ranti dibersihkan dari bagian yang tidak diinginkan, lalu dicuci dibawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan. Kemudian diangin-anginkan, ditimbang beratnya lalu dikeringkan pada lemari pengering. Setelah kering ditimbang sebagai berat kering 0,64 kg. Kemudian diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah plastik, lalu disimpan terlindung dari cahaya matahari. Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 45.

(38)

3.4 Pembuatan Pereaksi

3.4.1 Larutan Pereaksi Liebermann-Burchard

Asam sulfat pekat sebanyak 5 ml dicampurkan dalam 50 ml etanol 96%, lalu ditambahkan 5 ml asam asetat anhidrat ke dalam campuran tersebut (Ditjen POM, 1995).

3.4.2 Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N

Larutan asam klorida pekat sebanyak 17 ml ditambahkan air suling hingga 100 ml (Ditjen POM 1995).

3.4.3 Larutan Pereaksi Asam Klorida 6 N

Asam klorida pekat sebanyak 50 ml diencerkan dalam air suling hingga 100 ml (Markham, 1988).

3.4.4 Larutan Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Larutan asam sulfat pekat sebanyak 5,5 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml (Ditjen POM, 1995).

3.4.5 Larutan Pereaksi Aluminium klorida 5%b/v

Aluminium (III) klorida sebanyak 5 g dilarutkan dalam metanol hingga 100 ml ( Markham, 1988).

3.4.6 Larutan Pereaksi Natrium hidroksida 2N

Natrium hidroksida sebanyak 8,002 g dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga diperoleh larutan 100 ml (Ditjen POM, 1995).

(39)

3.4.7 Larutan Radikal Bebas DPPH 0,5 mM (Konsentrasi 200 µg/ml)

Sebanyak 19,7 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol hingga diperoleh volume larutan 100 ml (Molyneux, 2004).

3.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Dan Ekstraksi Cair-cair Ekstrak Etanol 3.5.1 Pembuatan Ekstrak Etanol

Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan pelarut etanol 96%. Cara kerja:

Sebanyak 600 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi dengan 4500 ml etanol 96% ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari campuran tersebut diserkai. Ampas dicuci dengan etanol 96% secukupnya hingga diperoleh 6000 ml maserat. Pindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienaptuang. Maserat diuapkan dengan alat rotary evaporator pada suhu 40°C sampai diperoleh ekstrak kental kemudian ekstrak dikeringkan dengan freeze dryer pada suhu -400C (Ditjen POM, 1995). Bagan pembuatan ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 46.

3.5.2 Ekstraksi Cair-cair Ekstrak Etanol

Ekstraksi cair-cair senyawa flavonoid dilakukan berturut-turut dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etilasetat.

Cara kerja:

Ekstrak etanol ditambahkan 40 ml etanol, lalu dilarutkan dengan air panas sebanyak 100 ml, dihomogenkan dimasukkan ke dalam corong pisah, mula-mula difraksinasi dengan n-heksan sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali, diperoleh

(40)

fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dipisahkan, fraksi air kemudian difraksinasi lagi dengan kloroform sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali diperoleh fraksi kloroform dan air. Kemudian fraksi kloroform dipisahkan, fraksi air di fraksinasi lagi dengan etilasetat sebanyak 100 ml, dilakukan tiga kali, diperoleh fraksi etilasetat dan fraksi air. Masing-masing fraksi dipekatkan dan dilakukan uji aktivitas antioksidan. Bagan ekstraksi cair-cair dari ekstrak etanol dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 47.

3.6 Uji Aktivitas Antioksidan fraksi-fraksi Ekstrak Etanol Herba Ranti

3.6.1 Prinsip Metode Penangkapan Radikal Bebas (DPPH)

Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) sebagai radikal bebas dalam larutan metanol (sehingga terjadi perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning) dengan nilai IC50

(konsentrasi sampel uji yang mampu meredam radikal bebas 50%) digunakan sebagai parameter untuk menentukan aktivitas antioksidan sampel uji.

3.6.2 Pembuatan Larutan DPPH 0,5 mM

Larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 200 ppm) dipipet sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 40 µg/ml).

3.6.3 Pembuatan Larutan Induk

Sebanyak 25 mg sampel uji ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 1000 µg/ml).

(41)

3.6.4 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Sampel Uji Dan BHT

Larutan induk dipipet sebanyak 1 ml; 1,5 ml; 2 ml ke dalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 40 µg/ml, 60 µg/ml, dan 80 µg/ml. Ditambahkan ke dalam masing-masing labu ukur 5 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 40 µg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm.

Sebanyak 25 mg BHT ditimbang, dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Dipipet sebanyak 0,5 ml ke dalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 20 µg/ml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 40 µg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm.

3.6.5 Penentuan Persen Peredaman

Penentuan aktivitas penangkap radikal bebas dari sampel uji menggunakan 1,1-diphenyl-2-picryl-hidrzil (DPPH) sebagai radikal bebas dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan 60 menit. Nilai serapan larutan DPPH sebelum dan sesudah penambahan larutan uji dihitung sebagai persen peredaman dengan rumus sebagai berikut:

(42)

% peredaman =

  



kontrol sampel kontrol

A A

A _

x 100%

Keterangan: Akontrol = Absorbansi DPPH dalam metanol

Asampel = Absorbansi Sampel

3.6.6. Penentuan Nilai IC50

Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas penangkap radikal adalah nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50 %), nilai tersebut menggambarkan

besarnya konsentrasi senyawa uji yang menangkap radikal bebas 50%. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan konsentrasi ekstrak sebagai absis (sumbu X) dan nilai persentase peredaman (aktivitas antioksidan) sebagai ordinatnya (sumbu Y).

3.7 Isolasi Senyawa Dari Fraksi Aktif

Senyawa dari fraksi aktif diduga senyawa flavonoid sehingga analisis selanjutnya dilakukan sesuai dengan isolasi senyawa flavonoid.

3.7.1 Analisis senyawa dari fraksi aktif secara KKt

Hasil fraksinasi dilakukan KKt menggunakan 5 sistem fase gerak yaitu BAA ( n-butanol-asam asetat-air) 4 :1 : 5, asam asetat 15%, asam asetat 50%, forestal (asam asetat-air-asam klorida) 30 : 10 : 30, asam klorida 1 %, sebagai fase diam adalah kertas Whatmann No.1 yang berukuran 3 x 20 cm.

Cara kerja :

Fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etilasetat dan fraksi air masing-masing ditotolkan pada kertas Whatmann No.1 dari tepi bawah, kemudian kertas tersebut dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak yang

(43)

telah dijenuhkan, lalu dielusi sampai garis tanda. Kertas diangkat dan dikeringkan, lalu disemprot dengan penampak bercak aluminium klorida 5% b/v dan diamati di bawah sinar lampu UV 366 nm. Bagan anlisis senyawa dari fraksi aktif secara KKt dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 48. Gambar kromatogram hasil KKt fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etilasetat dan fraksi air dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 49-53.

3.7.3 Pemisahan senyawa dari fraksi aktif secara KKt preparatif

Fraksi etilasetat dihidrolisa dengan penambahan asam klorida pekat sampai pH 2, dilakukan pemisahan secara KKt preparatif sebagai fase gerak asam asetat 50% dan fase diam kertas Whatmann No.3 yang berukuran 15x15 cm. Cara kerja:

Fraksi etilasetat yang telah diencerkan ditotolkan pada kertas berupa pita, kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi berisi fase gerak yang telah dijenuhkan. Lalu dielusi sampai garis tanda, kertas diangkat, dan dikeringkan, diamati dibawah sinar UV 366 nm. Bagian tengah kertas ditutup dengan kaca yang bersih sedangkan pada sisi kanan dan kiri kertas disemprot dengan penampak bercak aluminium klorida 15% b/v dan dikeringkan, lalu diamati dibawah sinar lampu UV 366 nm, kemudian bercak diberi tanda dan di gunting menjadi potongan-potongan kecil, direndam dalam metanol selama 24 jam dan sekali-sekali dikocok lalu disaring. Proses perendaman dan pelarutan diulangi hingga tiga kali sampai semua senyawa dari fraksi aktif tersari sempurna, selanjutnya filtrat dikumpulkan dan diuapkan hingga diperoleh isolat kental. Bagan pemisahan senyawa dari fraksi aktif dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman

(44)

54. Gambar kromatogram hasil KKt preparatif fraksi etilasetat dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman 55.

3.7.3 Uji kemurnian terhadap isolat

Uji kemurnian terhadap isolat dilakukan secara KKt dua arah menggunakan dua sistem fase gerak yaitu BAA sebagai fase gerak I dan asam asetat 15% sebagai fase gerak II.

Cara kerja:

Isolat ditotolkan pada kertas Whatmann No.1 berukuran 15x15 cm, kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan uap fase gerak I, lalu dielusi sampai garis tanda. Kertas dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya dielusi kembali dengan arah yang berbeda 900 memakai fase gerak II. Kertas dikeluarkan dan dikeringkan. Hasilnya dilihat di bawah sinar UV 366 nm dan dideteksi dengan penampak bercak aluminium klorida 15% b/v dan dilihat kembali dibawah sinar UV 366 nm, kemudian dihitung harga Rf nya (Markham, 1988). Gambar kromatogram hasil KKt 2 arah isolat dapat dilihat pada Lampiran 10 halaman 56.

3.7.4 Identifikasi isolat

Identifikasi isolat dilakukan secara spektrofotometri UV menggunakan pereaksi geser (shift reagent) ( Markham, 1988; Mabry, et al,1970).

Cara kerja:

1. Isolat dilarutkan dalam metanol, dimasukkan ke dalam kuvet lalu diukur spektrumnya, kemudian ditambahkan 3 tetes natrium hidroksida 2N ke dalam kuvet dan diukur spektrumnya. Spektrum diukur kembali setelah 5 menit.

(45)

2. Larutan isolat ditambahkan 6 tetes pereaksi aluminium klorida 5% b/v, dicampur, lalu diukur spektrumnya, selanjutnya ditambahkan 3 tetes asam klorida 6N, dicampur dan diukur spektrumnya.

3. Larutan isolat ditambahkan serbuk natrium asetat hingga 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet, dicampur lalu diukur spektrumnya. Spektrum natrium asetat diukur kembali setelah 5 menit. Serbuk asam borat ditambahkan 1 mm ke dalam kuvet, dicampur, kemudian diukur spektrum natrium asetat/asam borat.

Gambar spektrum isolat secara spektrofotometri UV menggunakan pereaksi geser (shift reagent) dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 58.

3.8 Uji Aktivitas Antioksidan Isolat senyawa dari fraksi aktif

3.8.1 Pembuatan Larutan Induk Isolat

Dilarutkan 5 mg isolat, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda (konsentrasi 500 µg/ml).

3.8.2 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Isolat

3.8.2.1 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Isolat 1 Herba Ranti

Larutan induk dipipet sebanyak 0,8 ml; 1,2 ml; 1,6 ml dan 2 ml ke dalam

labu ukur 10 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 40 µg/ml, 60 µg/ml, dan 80 µg/ml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 2 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 40 µg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan

(46)

metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm.

3.8.2.2 Pengukuran Aktivitas Antioksidan Isolat 2 Herba Ranti

Larutan induk dipipet sebanyak 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml dan 2 ml ke dalam

labu ukur 10 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 40 µg/ml, 60 µg/ml dan 80 µg/ml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 2 ml larutan DPPH 0,5 mM (konsentrasi 40 µg/ml) lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 516 nm.

(47)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Identifikasi Sampel

Hasil identifikasi sampel yang dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor menunjukkan bahwa sampel termasuk suku Solanaceae, spesies Solanum nigrum Linn.

4.2 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi cair-cair senyawa flavonoid dari ekstrak etanol

Hasil maserasi 600 g serbuk simplisia herba ranti diperoleh 102 g ekstrak etanol dan dari 20 g ekstrak etanol difraksinasi menggunakan pelarut n-heksan, kloroform dan etilasetat, setelah pelarutnya diuapkan diperoleh 0,311 g fraksi n-heksan, 0,298 g fraksi kloroform, 0,297 g fraksi etilasetat dan 0,270 g fraksi air.

4.3 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat, air dan BHT

Pemeriksaan aktivitas anti radikal bebas DPPH secara spektrofotometer dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan larutan pereaksi DPPH 0,5 mM. Pengukuran aktivitas antioksidan fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat dan air herba ranti dengan konsentrasi 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80µg/ml yang dibandingkan dengan BHT konsentrasi 20 µg/ml sebagai kontrol larutan DPPH 0,5 mM (tanpa penambahan sampel). Hasil pengukuran aktivitas antioksidan fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat dan air herba ranti dapat dilihat pada tabel berikut.

(48)

Tabel 4.1 Aktivitas antioksidan fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat dan air

dari ekstrak etanol herba ranti

Larutan Uji

Aktivitas antioksidan (% peredaman) 40 µg/ml 60 µg/ml 80 µg/ml

Fraksi n-heksan 8,58 12,68 15,70 Fraksi kloroform 42,89 51,78 63,62 Fraksi etilasetat 46,43 57,22 69,54 Fraksi air 11,11 16,15 23,53

Pembanding 20 µg/ml

BHT 91,30

Data tersebut menunjukkan bahwa fraksi etilasetat mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan pada fraksi n-heksan, kloroform dan sisa. Sedangkan BHT sebagai pembanding dengan konsentrasi 20 µg/ml menunjukkan aktivitas antioksidan paling tinggi dibandingkan keempat fraksi. Dari data tersebut diperoleh persamaan regresi linier untuk fraksi n-heksan Y= 0.1991X + 0,2911 dan nilai IC50 sebesar 249,67 µg/ml, fraksi kloroform Y=

0,7968X+ 3, 7121 dan nilai IC50 sebesar 58,09 µg/ml, fraksi etilasetat Y= 0,874X

+ 3,9570 dan nilai IC50 sebesar 52,68 µg/ml dan fraksi air Y= 0,2886X -0,1287

(49)

Gambar 4.1 Hasil analisis aktivitas antioksidan fraksi n-heksan, kloroform,

etilasetat, dan air ekstrak etanol herba ranti .

Aktivitas antioksidan dari fraksi-fraksi ekstrak etanol herba ranti ditentukan oleh senyawa-senyawa antioksidan diantaranya senyawa flavonoid atau turunan polifenol yang dikandungnya.

4.4 Hasil Analisis senyawa flavonoid dari hasil fraksinasi secara KKt

Hasil analisis KKt menggunakan 5 sistem fase gerak yaitu BAA, asam asetat 15%, asam asetat 50%, Forestall dan asam klorida 1%, pada fraksi n-heksan tidak terdapat noda, ini membuktikan bahwa flavonoida tidak dapat larut dalam n-heksan karena n-heksan bersifat non polar. Menurut Markham (1988), senyawa yang kepolarannya rendah seperti lemak, terpen, klorofil dan lain-lain dapat dibebaskan dengan ekstraksi dalam corong pisah dengan n-heksan. Walaupun

(50)

tidak mungkin mengandung flavonoid, ekstrak tersebut diperiksa secara kromatografi.

Fraksi kloroform dan fraksi air dengan masing-masing fase gerak menunjukkan noda yang tidak terpisah dengan baik, sedangkan pada fraksi etilasetat memberikan pemisahan noda terbaik dan jumlah noda yang lebih banyak, sehingga pada uji selanjutnya hanya dilakukan pada fraksi etilasetat. Fraksi etilasetat dilakukan KKt preparatif menggunakan fase gerak asam asetat 50% dan fase diam kertas Whatmann No.3, hasilnya diperoleh 3 pita, yaitu pita F1 berfluoresensi kuning mempunyai harga faktor retardasi (Rf) = 0,46, F2 berfluoresensi kuning hijau mempunyai harga Rf = 0,59, F3 berfluoresensi biru ungu mempunyai harga Rf = 0,67.

4.5 Uji kemurnian terhadap isolat

Hasil uji kemurnian terhadap isolat F1, F2 dan F3 secara KKt 2 arah dengan fase gerak I adalah BAA dan fase gerak II adalah asam asetat 50% menunjukkan 1 bercak dengan sinar lampu UV 366 nm. Isolat F1 berfluoresensi kuning mempunyai harga Rf = 0,48, F2 berfloresensi kuning hijau mempunyai harga Rf = 0,59 sedangkan F3 belum diperolah bercak noda yang tunggal. Kemudian disemprot dengan penampak bercak aluminium klorida 5% b/v tetap menunjukkan 1 bercak, F1 berfloresensi kuningan mempunyai harga Rf = 0,48, F2 berfluoresensi kuning hijau mempunyai harga Rf = 0,59 sedangkan F3 belum menunjukkan bercak noda tunggal.

Menurut Markham (1988), BAA biasanya merupakan pengembang terbaik dari segi kekuatan pelarut dan pemisahan bercak, sehingga sudah menjadi

(51)

kebiasaan umum untuk menggunakan BAA pada pengembangan pertama pada KKt dua arah.

Penafsiran spektrum UV dilakukan terhadap isolat F1 dan F2 dengan merujuk pada Mabry, et al. (1970) dan Markham (1988).

Penafsiran spektrum UV untuk isolat F1 adalah sebagai berikut:

1. Hasil spektrum isolat F1 dalam metanol memberikan 2 pita absorpsi maksimum yaitu 327,80 nm (pita I) yang menunjukkan adanya absorpsi pada cincin B (sinamoil) dan 298 nm (pita II) yang menunjukkan adanya absorpsi pada cincin A (benzoil) (Lampiran 11 halaman 42). Absorpsi maksimum pada pita I sesuai untuk senyawa flavanon yaitu 300-330 nm dan absorpsi maksimum pada pita II seharusnya absorpsi maksimum senyawa flavanon yaitu 275-295 nm sehingga diduga isolat F1 adalah senyawa flavanon.

2. Hasil spektrum isolat F1 dalam metanol dengan penambahan natrium hidroksida 2 N menunjukkan adanya pergeseran hipsokromik sebesar 31 nm pada pita II yaitu 266,80 nm, bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 43). Ini menunjukkan bahwa pada senyawa flavanon ini tidak dijumpai adanya gugus 5,7-OH pada cincin A, dimana seharusnya terjadi pergeseran batokromik sebesar 35 nm pada pita II.

Spektrum diukur kembali setelah 5 menit, hasil menunjukkan tidak terjadi penguraian pada pita II (Lampiran 11 halaman 44) yang menunjukkan tidak dijumpai adanya gugus orto-dihidroksi pada cincin A.

3. Hasil spektrum isolat F1 dalam metanol dengan penambahan aluminium klorida 5% b/v dan asam klorida 6 N terjadi pergeseran batokromik sebesar 3 nm pada pita II yaitu 301 nm dengan kenaikan intensitas bila dibandingkan

(52)

dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 45). Pergeseran ini menunjukkan tidak dijumpai adanya gugus 5-OH, dimana seharusnya terjadi pergeseran batokromik sebesar 20-26 nm pada pita II.

4. Hasil spektrum isolat F1 dalam metanol dengan penambahan natrium asetat terjadi pergeseran batokromik sebesar 14 nm pada pita II yaitu 312,4 nm dengan kenaikan intensitas bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 46), ini menunjukkan tidak dijumpai adanya gugus 7-OH bebas, dimana seharusnya terjadi pergeseran batokromik sebesar 35-60 nm pada pita II.

5. Hasil spektrum isolat F1 dalam metanol dengan penambahan natrium asetat dan asam borat terjadi pergeseran batokromik sebesar 14 nm pada pita II yaitu 312,40 nm dengan penurunan kenaikkan bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 47), ini menunjukkan dijumpai adanya gugus 6,7-diOH pada cincin A, dimana seharusnya terjadi pergeseran batokromik sebesar 10-15 nm pada pita II.

Hasil spektrum di atas menunjukkan bahwa senyawa tersebut adalah golongan flavanon dengan gugus 6,7 –di OH pada cincin A. Kesimpulan ini didukung dengan tabel warna flavonoid dengan sinar tampak dan UV menurut Harbone yaitu flavanon berwarna kuning pucat sampai hijau kuning.

Penafsiran spektrum UV untuk isolat F2 adalah sebagai berikut:

1. Hasil spektrum isolat F2 dalam metanol memberikan 2 pita absorpsi maksimum yaitu 339,60 nm (pita I) yang menunjukkan adanya absorpsi pada cincin B (sinamoil) dan 281,20 nm (pita II) yang menunjukkan adanya absorpsi pada cincin A (benzoil) (Lampiran 11 halaman 48). Isolat F2 ini dapat diduga

(53)

senyawa flavon atau flavonol dengan gugus 3-OH tersubsitusi yang memiliki absorpsi maksimum pita I 310-360 nm dan pita II 250-280 nm.

2. Hasil spektrum isolat F2 dalam metanol dengan penambahan natrium hidroksida 2N menunjukkan adanya pergeseran batokromik sebesar 43 nm pada pita I yaitu 382,80 nm bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 49). Ini menunjukkan adanya gugus 4’-OH atau gugus hidroksil pada cincin B (sinamoil).

Spektrum diukur kembali setelah 5 menit, hasil menunjukkan tidak terjadi penguraian (Lampiran 11 halaman 50) yang menunjukkan adanya gugus 4’-OH atau gugus hidroksil pada cincin B.

3. Hasil spektrum isolat F2 dalam metanol dengan penambahan aluminium klorida 5% b/v dan asam klorida 6 N menunjukkan tidak ada pergeseran pada pita I yaitu 339,60 nm bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 51 ). Ini menunjukkan mungkin dijumpai adanya gugus 5-OH dengan gugus prenil.

4. Hasil spektrum isolat F2 dalam metanol dengan penambahan natrium asetat terjadi pergeseran hipsokromik sebesar 6 nm pada pita II yaitu 274,20 nm bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 52), maka pada senyawa flavonol ini tidak dijumpai adanya gugus 7-OH bebas. 5. Hasil spektrum isolat F2 dalam metanol dengan penambahan natrium asetat

dan asam borat terjadi pergeseran batokromik sebesar 2 nm pada pita I yaitu 341,20 nm bila dibandingkan dengan spektrum dalam metanol (Lampiran 11 halaman 53), ini menunjukkan tidak dijumpai adanya gugus orto-dihidroksi

(54)

pada cincin B, dimana seharusnya terjadi pergeseran batokromik sebesar 12-36 nm pada pita I.

Hasil spektrum di atas menunjukkan bahwa senyawa tersebut adalah golongan flavonol yang mempunyai gugus 4’OH pada cincin B.

Menurut Harborne (1987), flavonol merupakan senyawa yang paling tersebar luas dari semua pigmen tumbuhan kuning. Flavonol terdapat gugus hidroksi. Flavonol dalam tumbuhan sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida. Aglikon flavonol yang umumnya dijumpai yaitu kemferol, kuersetin, dan mirisetin. Isolat F2 berfluoresensi kuning hijau dan Rf yang diperoleh 0,59 sehingga dapat diduga golongan flavonol glikosida.

4.6 Hasil Analisis Aktivitas Antioksidan Isolat

Pengukuran aktivitas antioksidan isolat herba ranti dengan konsentrasi 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80µg/ml yang dibandingkan dengan BHT konsentrasi 20 µg/ml sebagai kontrol larutan DPPH 0,5 mM (tanpa penambahan sampel). Hasil pengukuran aktivitas antioksidan fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat dan air herba ranti dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 4.2 Aktivitas antioksidan isolat flavonoid dari herba ranti

Larutan Uji

Aktivitas antioksidan (% peredaman) 40 µg/ml 60 µg/ml 80 µg/ml

Isolat F1 43,09 44,41, 49,70 Isolat F2 17,87 35,94 41,21

Pembanding 20 µg/ml

(55)

Data tersebut menunjukkan isolat flavonoid mempunyai aktivitas antioksidan lebih rendah dibandingkan pada fraksi n-heksan, kloroform dan sisa. Sedangkan BHT sebagai pembanding dengan konsentrasi 20µg/ml menunjukkan aktivitas antioksidan paling tinggi dibandingakan keempat fraksi. Dari data tersebut diperoleh persamaan regresi linier untuk isolat F1 Y= 0.6257X + 6,1345 dan nilai IC50 sebesar 70,11 µg/ml, isolat F2 Y= 0,5406X- 0,572 dan nilai IC50

sebesar 93,54 µg/ml.

Gambar 4.2 Hasil analisis aktivitas antioksidan isolate flavonoid 1 dan isolate

flavonoid 2 herba ranti

(56)

sebagai parameter untuk menentukan aktivitas antioksidan sampel uji (Prakash, 2001).

Dari ketiga isolat diperolah isolat flavonoid 1 mempunyai aktivitas antioksidan lebih tinggi dibanding isolat flavonoid 2. Hal ini dapat dihubungkan dengan keberadaan gugus 3-OH dan 3'-OH pada cincin B terhadap aktivitas antioksidan penangkap radikal yang tinggi. Adanya gugus hidroksi pada cincin B dari merupakan sisi aktif utama dalam memutus rantai oksidasi dan gugus hidroksi ganda pada cincin B lebih meningkatkan aktivitasnya.

(57)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

a. Hasil uji aktivitas antioksidan keempat fraksi dengan konsentrasi masing-masing 80 µg/ml diperoleh persentase peredaman fraksi n-heksan 15,70%, fraksi kloroform 63,63%, fraksi etilasetat 69,54% dan fraksi sisa 23,44%. b. Hasil identifikasi isolat F1 dan F2 secara spektrofotometri UV dengan

penambahan pereaksi geser (shift reagent) diperoleh F1 adalah golongan flavanon dan F2 adalah golongan flavonol.

c. Hasil uji aktivitas antioksidan isolat dengan konsentrasi masing-masing 80 µg/ml diperoleh persentase peredaman golongan flavonoid 1 (flavanon) 49,70% dan isolat golongan flavonoid 2 (flavonol) 41,21%. Sedangkan BHT sebagai pembanding dengan konsentrasi 20 µg/ml menunjukkan aktivitas antioksida 91,30%.

5.2 Saran

Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan elusidasi struktur terhadap senyawa flavonoid hasil isolasi dan menguji aktivitas farmakologinya.

(58)

DAFTAR PUSTAKA

Anonima (2010). Anti Oksidan. http //www.wyetindonesia.com/AntiOksidan.html. diakses:16 Mei 2010.

Anonimb (2010). Flavanon: At a Glance. Oktober 2010.

Bassett, J., Denney, R.C., dan Jeffery G.H. (1994). Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Diterjemahkan oleh Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hal 165.

Benson, Harry. (1987). Principles of Chemical Instrumentation. W.B Saunders Company. West Washington. Pages 34

Depkes RI. (1994). Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jilid III. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Hal. 259-260.

Ditjen POM.. (1986). Sediaan Galenik. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal 19, 21.

Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal 133, 659, 733, 748, 1183.

Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal 1, 3, 9 -10.

Ginting, H., dkk (2010). Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Dan Ekstrak Air Herba Ranti (Solanum nigrum L). Lembaga Penelitian Universitas Sumatera Utara. Hal 15-16.

Gritter, R.J., Bobbit, J.M. dan Schwarting A.E. (1991). Pengantar Kromatografi. Terbitan kedua. Diterjemahka oleh Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB. Hal 6 - 8.

Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia. Diterjemahkan: Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: Penerbit ITB. Hal 69-70.

Hernani dan Rahardjo. (2005). Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya. Hal. 3-5.

Kosasih, E.N., Setiabudhi, T dan Heryanto, H. (2004). Peranan Antioksidan Pada Lanjut Usia. Jakarta: Pusat Kajian Nasional Masalah Lanjut Usia. Hal. 48-49, 56-59.

Kumalaningsih, S. (2006). Antioksidan Alami. Cetakan I. Surabaya: Trubus Agrisarana. Hal. 16-25.

(59)

Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B. (1970). The Systematic Identification of Flavonoids. New York: Springer-Verlag. Pages 41, 44-48, 50, 52, 166, 169-171.

Markham, K.R. (1988). Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Diterjemahkan: Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB. Hal 1, 16, 18, 23-26, 38-39, 42-47.

Molyneux, P. (2004). The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhidrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activit. Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2):214-215.

Khor, R. (2008). Karakterisasi Dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Dari Herba Ranti (Solanum nigrum L). Skripsi Fakultas Farmasi USU. Medan. Prakash, A. (2001). Antioxidant Activity. Medallion Laboratories-Analytical

Progress. 19 (2): 701-705.

Rohman, A (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Belajar. Hal 323, 328-329.

Sastrohamidjojo, H. (1985). Kromatografi. Edisi I. Yogyakarta: Liberty. Hal 19, 23-24.

Silalahi, J. (2006). Makanan Fungsional. Penerbit Kanisius. Yogyakarta: Hal. 38-55.

(60)

Lampiran 1. Gambar tumbuhan dan daun ranti

B Keterangan : A. Tumbuhan ranti

(61)

(62)

Lampiran 3. Bagan Kerja Penelitian

Herba ranti

Dikeringkan dilemari pengering pada temperature ± 600C, hingga kering Dcuci, ditiriskan lalu disebarkan diatas kertas kemudian ditimbang

Serbuk simplisia herba ranti

Ditimbang, diekstraksi dengan etanol 96 %

Diekstraksi cair-cair dengan n heksan, kloroform, etilasetat

Diuji aktivitas antioksidan

Fraksi yang paling kuat aktivitas antioksidannya diisolasi secara Kromatografi

Isolat

Diidentifikasi

aktivitas antioksidan Ekstrak Etanol

Fraksi n-heksan

Fraksi kloroform

Fraksi etilasetat

Fraksi air

(63)

Lampiran 4. Bagan Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Ranti

600 g serbuk simplisia

Dimasukkan ke dalam bejana

Direndam dengan etanol sebanyak 4500 ml , ditutup

Dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk Disaring

Maserat _Ampas

Dicuci dengan etanol 96% secukupnya hingga 6000 ml

Pindahkan kedalam bejana tertutup, digabung

Dibiarkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya, selama 2 hari

Enap tuangkan atau disaring Dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu 400C

Ekstrak Etanol sebanyak 102 g

Dikeringkan dengan alat freeze dryer Maserat

(64)

Lampiran 5. Bagan ekstraksi cair-cair ekstrak etanol

Ekstrak etetanol

Ditambahkan 100 ml air panas, dihomogenkan Ditambah 40 ml etanol

Dimasukkan ke dalam corong pisah

Diekstrasi dengan 100 ml n-heksan sebanyak 3 kali

Fraksi air Fraksi

n-heksan

Diekstrasi dengan 100 ml kloroform sebanyak

Fraksi air Fraksi kloroform

dipekatkan

Diekstrasi dengan 100 ml etilasetat sebanyak

Fraksi air dipekatkan Fraksi

etilasetat di k k

(65)

Lampiran 6. Bagan analisis senyawa flavonoid dari ekstrak etanol.

Ekstrak

Dilakukan

Fraksi Fraksi air Fraksi

Fraksi n-heksan

Dikromatografi Kertas menggunakan:

- Fase gerak; BAA,asam asetat 15%, asam asetat 50%, forestal, asam klorida 1%

- Fase diam; Kertas Whatmann No.1 - Penampak Bercak; Aluminium Klorida

(66)

Lampiran 7. Gambar kromatogram fraksi n-heksan, kloroform, etilasetat dan air

secara KKt dengan Fase diam Kertas Whatmann No.1

1 2 3 4

Keterangan: A = Gambar kromatogram hasil fraksinasi secara KKt dengan Fase diam kertas whatmann No.1 dan fase gerak BAA. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik penotolan; bp =

batas pengembang; 1. Fraksi n-heksan; 2. Fraksi kloroform; 3. Fraksi etilasetat; 4 fraksi sisa/air; berflorosensi; kc = kuning coklat; kuning; kh = kuning hijau; c = coklat; mc = merah coklat.

(67)

Lampiran 7.(lanjutan)

1 2 3 4

Keterangan: A = Gambar kromatogram hasil fraksinasi secara KKt dengan Fase diam Kertas Whatmann No.1 dan fase gerak asam asetat 15%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik

penotolan; bp = batas pengembang; 1. Fraksi n-heksan; 2. Fraksi kloroform; 3. Fraksi etilasetat; 4 fraksi sisa/air; berflorosensi; k = kuning; kh kuning hijau; kc = kuning coklat; h = hijau; ht = hijau tua; c = coklat; bu = biru ungu.

(68)

1 2 3 4 A

Keterangan: A Gambar kromatogram hasil fraksinasi secara KKt dengan Fase diam Kertas Whatmann No.1 dan fase gerak asam asetat 50%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik

penotolan; bp = batas pengembang; 1. Fraksi n-heksan; 2. Fraksi kloroform; 3. Fraksi etilasetat; 4 fraksi sisa/air; berflorosensi; k = kuning; kh kuning hijau; kc = kuning coklat; bu = biru ungu.

(69)

Lampiran 7.(lanjutan)

1 2 3 4

Keterangan: A= Gambar kromatogram hasil fraksinasi secara KKt dengan Fase diam Kertas Whatmann No.1 dan fase gerak forestall. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik penotolan;

bp = batas pengembang; 1. Fraksi n-heksan; 2. Fraksi kloroform; 3. Fraksi etilasetat; 4 fraksi sisa/air; berflorosensi; h = hijau; hc = hijau coklat; kc = kuning coklata c = coklat; cm.

(70)

1 2 3 4 A

Keterangan: A = Gambar kromatogram hasil fraksinasi secara KKt dengan Fase diam Kertas Whatmann No.1 dan fase gerak asam klorida 1%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik

penotolan; bp = batas pengembang; 1. Fraksi n-heksan; 2. Fraksi kloroform; 3. Fraksi etilasetat; 4 fraksi sisa/air; berflorosensi; k = kuning; h = hijau; mc = merah coklat; bu = biru ungu.

(71)

Lampiran 8. Bagan pemisahan senyawa dari fraksi aktif

Fraksi

DiKKt preparatif dengan fase gerak asam asetat 50% dan fase diam kertas Whatmann No.3

Isolat F1 Isolat F2 Isolat F3

DiKKt dua arah

Diidentifikasi secara

spektrofotometri UV menggunakan pereaksi geser (shift reagent) Isolat

(72)

Lampiran 9. Gambar Kromatogran KKt Preparatif senyawa dari fraksi aktif

Keterangan: A = Gambar Kromatogram KKt Preparatif fraksi etilasetat dengan fase diam kertas Whatmann No.3 dan fase gerak asam asetat 50%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; tp = titik penotolan; bp = batas

pengembang; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik penotolan; bp = batas penotolan; berflorosensi; k= kuning; kh = kuning hijau; bu = biru ungu.

Lampiran 10. Gambar kromatogram hasil KKt dua arah isolat senyawa dari

(73)

Keterangan: A = Gambar Kromatogram KKt dua arah isolate F1 dengan fase diam kertas Whatmann No.1 dan fase gerak I = BAA dan fase gerak II = asam asetat 50%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; tp = titik

penotolan; bp = batas pengembang; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik penotolan; bp = batas penotolan; berflorosensi; k = kuning.

(74)

Lampiran 10. (lanjutan)

Keterangan: A = Kromatogram KKt dua arah isolate F2 dengan fase diam kertas Whatmann No.1 dan fase gerak BAA dan asam asetat 50%. Penampak bercak AlCl3 5 % b/v; tp = titik penotolan; bp = batas

pengembang; sinar lampu UV 366 nm; tp = titik penotolan; bp = batas penotolan; berflorosensi; k = kuning hijau.

(75)

Lampiran 11. Spektrum UV isolat Flavonoid.

Keterangan: A = Gambar spektrm isolat F1 dalam metanol

Panjang gelombang absorbsi maksimum spektrum isolasi dalam metanol

λ Abs

327,80 1,212 298,00 1,071

(76)

Lampiran 11. (lanjutan)

Keterangan: A = Spektrum UV isolat F1 dalam metanol setelah penambahan NaOH

: MeOH

: MeOH + NaOH Panjang gelombang absorpsi

maksimum spektrum isolasi dalam metanol

λ Abs

Panjang gelombang absorpsi maksimum spektrum isolasi

dalam MeOH + NaOH

λ Abs

327,80 1,212 298,00 1,071

373,80 1,287 266,80 1,028

(77)

Lampiran 11. (lanjutan)

Keterangan: A = Spektrum UV isolat F1 dalam metanol setelah penambahan NaOH diukur selama 5 menit.

: MeOH

: MeOH + NaOH Panjang gelombang absorpsi

maksimum spektrum isolasi dalam metanol

λ Abs

Panjang gelombang absorpsi maksimum spektrum isolasi dalam

MeOH + NaOH setelah 5 menit

λ Abs

327,80 1,212 298,00 1,071

373,80 1,360 266,80 1,028

(78)

Lampiran 11. (lanjutan)

Keterangan: A = Spektrum UV isolat F1 dalam MeOH dan setelah penambahan AlCl3/HCl

: MeOH

: MeOH + AlCl3/HCl Panjang gelombang absorpsi

maksimum spektrum isolasi dalam metanol

λ Abs

Panjang gelombang absorpsi maksimum spektrum isolasi dalam MeOH + AlCl3/HCl

λ Abs

327,80 1,212 298,00 1,071

330.80 1,334 301,00 1,114

(1)

3. Perhitungan nilai IC50fraksi etilasetat herba ranti

X Y XY X2

0 40 60 80

0 46,10 57.39 68,10

0 1844,00 3443,40 5448,00

0 1600 3600 6400

∑X = 180 _

X = 45

∑Y = 171,59 _

Y = 42,90

∑XY = 10735,40 ∑ X2 = 11600

x = konsentrasi y = persen peredaman

( )( )

( ) ( )

x x n

n y x xy

/ / 2 2

∑

− − =

(

) ( )(

)

(

11600

) ( )

180 /4

4 / 59 , 171 180 40

, 10735

− − =

861 , 0 3500

85 , 3013

= =

_ _

x a y b= −

(

0,861

)( )

45 90

, 42 −

16 , 4

Persamaan garis regresi:

b ax y= +

16 , 4 861 ,

0 +

= x

IC50 →50=0,861 x+4,16

2404 , 53

(2)

4. Perhitungan nilai IC50 fraksi air herba ranti

X Y XY X2

0 40 60 80

0 11,11 16.15 23,53

0 444,40 969,00 1882,42

0 1600 3600 6400

∑X = 180 _

X = 45

∑Y = 50,79 _

Y = 12,70

∑XY = 3295,80 ∑ X2 = 11600

x = konsentrasi y = persen peredaman

( )( )

( ) ( )

x x n

n y x xy

/ / 2 2

∑

− − =

(

) ( )(

)

(

11600

) ( )

180 /4

4 / 79 , 50 180 80

, 3295

− − =

2886 , 0 3500

25 , 1010

= =

_ _

x a y b= −

(

0,2886

)( )

45 70

, 12 −

2870 , 0

− =

Persamaan garis regresi:

b ax y= +

287 , 0 2886 ,

0 −

= x

IC50 →50=0,2886 x−0,287

2446 , 174

(3)

5. Perhitungan nilai IC50isolat flavonoid 1 herba ranti

X Y XY X2

0 40 60 80

0 43,09 44.41 49,70

0 1723,60 2664,60 3976,00

0 1600 3600 6400

∑X = 180 _

X = 45

∑Y = 137,2 _

Y = 34,3

∑XY = 8364,20 ∑ X2 = 11600

x = konsentrasi y = persen peredaman

( )( )

( ) ( )

x x n

n y x xy

/ / 2 2

∑

− − =

(

) ( )(

)

(

11600

) ( )

180 /4

4 / 2 , 137 180 20

, 8364

− − =

6257 , 0 3500

20 , 2190

= =

_ _

x a y b= −

(

0,6257

)( )

45 3

, 34 −

1435 , 6

Persamaan garis regresi:

b ax y= +

1435 , 6 6257 ,

0 +

= x

IC50 →50=0,6257 x+6,1435

106 , 70

(4)

6. Perhitungan nilai IC50isolat flavonoid 2 herba ranti

X Y XY X2

0 40 60 80

0 17.87 35,94 41,21

0 714,80 2156,40 3296,80

0 1600 3600 6400

∑X = 180 _

X = 45

∑Y = 95,02 _

Y = 23,755

∑XY = 6168 ∑ X2 = 11600

x = konsentrasi y = persen peredaman

( )( )

( ) ( )

x x n

n y x xy

/ / 2 2

∑

− − =

(

) ( )(

)

(

11600

) ( )

180 /4

4 / 755 , 23 180 6168

− − =

5406 , 0 3500

1 , 1892

= =

_ _

x a y b= −

(

0,5406

)( )

45 755

23 −

572 , 0

Persamaan garis regresi:

b ax y= +

572 , 0 5406 ,

0 +

= x

IC50 →50=0,53406x+0,572 54

, 93

(5)

6. Perhitungan nilai IC50BHT

X Y XY X2

0 20

0 91,26

0 1825,20

0 400

∑X = 20 _

X = 10

∑Y = 91,26 _

Y = 45,63

∑XY = 1825,20 ∑ X2 = 400

x = konsentrasi y = persen peredaman

( )( )

( ) ( )

x x n

n y x xy

/ / 2 2

∑

− − =

(

) ( )(

)

( ) ( )

400 20 /2

2 / 26 , 91 20 20 , 1825

− − =

563 , 4 200

6 , 912

= =

_ _

x a y b= −

(

4,563

)( )

10 63

, 45 −

= b

Persamaan garis regresi:

b ax y= +

0 563 ,

4 +

= x

IC50 →50=4,563 x+0

96 , 10

x µg/m

Lampiran 14. Gambar alat rotary evaporator, freeze dryer dan spektrofotometer UV-Vis

(6)

C Keterangan: A. Alat rotary evaporatorI

B. Alat freeze dryer