Isolasi, pengklonan, dan konstruksi RNAi Gen Penyandi H+ ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN KONSTRUKSI RNAi GEN
PENYANDI H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI
Melastoma malabathricum L.
MUZUNI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ii
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Isolasi, Pengklonan, dan
Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma
malabathricum L. adalah karya bersama saya dan pembimbing yang belum pernah
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka.
Bogor, Februari 2011
Muzuni
NIM G361050051
iii
ABSTRACT
MUZUNI. Isolation, Cloning, and RNAi construct of Gene coding Plasma
Membrane H+-ATPase from Melastoma malabathricum L. Under supervised of
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. is an Al-accumulating plant that grows in
acidic soils with high level of soluble aluminum in the tropics. One of the important
proteins in the detoxifying aluminum is a plasma membrane H+-ATPase, a most
abundant protein on the plasma membrane, encoded by pma gene. The objective of
this research is to isolate and characterize the gene encoding plasma membrane H +ATPase from M. malabathricum L. (Mmpma) and to construct RNAi by using 3’UTR
of Mmpma. Total cDNA had been successfully isolated by using reverse
transcription with total RNA as template. Full length cDNA of Mmpma had been
successfully isolated through a gradual isolation of the gene. The 5’ end and
middle gene of Mmpma had been successfully isolated by PCR (polymerase chain
reaction) by using total cDNA as template and pma primers designed from some
plants, while the 3’ end of Mmpma had been isolated by 3’ RACE. The parts of the
gene had been successfully joined by PCR. The joining product was successfully
inserted into pGEM-T Easy and the recombinant plasmid was successfully introduced
into E. coli DH5α. Nucleotide sequence analysis showed that the length of Mmpma
coding sequence was sized 2871 bp encoding 956 amino acids with a predicted
molecular weight of 105.29 kDa and pI value of 6.84. MmPMA has 10 transmembran
domains, 4 cytoplasm loops, 6 functional domains and 3 autoregulatory domains. In
the second cytoplasm loop (C2) contained conserved sequence TGES (phosphatase
activity domain); in the C3 contained conserved sequences DKTGTLT
(phosphorylation and transduction domain), KGAP (ATP-binding and/or kinase
activity domain), DPPR (ATP-binding domain), MITGD (ATP-binding domain) and
GDGVNDAPALK (ATP-binding domain); in the C4 contained 3 autoregulatory
domains: QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, and
YTV. Local alignment analysis based on nucleotide of mRNA showed that Mmpma is
82% identical to pma Vitis vinifera; 81% to pma Juglans regia, pma Populus
tricocarpa, pma Sesbania rostrata, and pma Prunus persica and 80% to pma
Lycopersicon esculentum. Based on deduced amino acid sequence, MmPMA is 94%
identical to PMA Vitis vinifera and PMA Juglans regia; 93% to PMA Populus
trichocarpa; 92% to PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum,
and Arabidopsis thaliana, AHA4.
One of the methods to study the important role of Mmpma gene is by
suppressing the gene expression through RNAi. The Mmpma gene can be
supposed in detoxifying Al and low pH, if the transgenic plants containing RNAi
became sensitive to Al and low pH. RNAi vector had been successfully constructed
using GATEWAYTM cloning technology with the 3’UTRMmpma was used as
double-stranded RNA (dsRNA) trigger sequence, pENTRTM/D-TOPO® as entry
vector, and pANDA plasmid as destination vector. The DNA coding RNAi had been
successfully introduced into M. malabathricum L. mediated by A. tumefaciens
EHA101 to analyze the function of Mmpma gene in the detoxifying aluminum. Based
on the result of transgenic plants tolerance analyzes to Al stress showed that in the
nutrient solution including 3.2 mM Al stress (AlCl3.6H2O), pH 4 for 7 days, the
transgenic plants underwent growth suppression especially roots and leaves, whereas
non-transgenic plants underwent growth normally. We supposed that Mmpma gene
has an important role in the detoxifying aluminum in Melastoma malabathricum L.
iv
RINGKASAN
MUZUNI. Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase
Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang
tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah
tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H+-ATPase
membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma,
yang disandikan oleh gen pma. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan
mengkarakterisasi gen yang menyandikan H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L. (Mmpma) dan mempelajari peranan gen Mmpma
melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR Mmpma. cDNA
total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA
total sebagai cetakan. cDNA Mmpma utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi
gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen Mmpma telah diisolasi
dengan PCR (polymerase chain reaction) menggunakan cDNA total sebagai
cetakan dan primer pma yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian
ujung 3’gen Mmpma telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut
telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam pGEMT Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam E.
coli DH5α. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen
penyandi (CDS) Mmpma adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino
dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai pI sekitar 6.84.
MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4 loop sitoplasma, 6 domain
fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada loop sitoplasma kedua (C2) terdapat
sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen
DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP
dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain
pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4
terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen:
QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa
Mmpma mempunyai kemiripan 82% dengan pma Vitis vinifera; 81% dengan pma
Juglans regia, pma Populus tricocarpa, pma Sesbania rostrata, dan pma Prunus
persica dan 80% dengan pma Lycopersicon esculentum. Berdasarkan deduksi
sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA Vitis
vinifera dan PMA Juglans regia; 93% dengan PMA Populus trichocarpa; 92%
dengan PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, dan
Arabidopsis thaliana.
Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen Mmpma adalah dengan
menekan ekspresi gen tersebut melalaui RNAi. Gen Mmpma dapat diduga
berperan dalam detoksifikasi Al dan pH rendah apabila tanaman transgenik hasil
transformasi RNAi menjadi peka terhadap Al dan pH rendah. Vektor RNAi telah
berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan GATEWAYTM dimana
fragmen 3’UTRMmpma digunakan sebagai sekuen pemicu RNA utas ganda
(dsRNA), pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry vector dan vektor pANDA sebagai
v
destination vector. DNA penyandi RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui A. tumefaciens EHA101 untuk mempelajari peranan
gen Mmpma dalam detoksifikasi Al. Hasil uji toleransi tanaman transgenik
terhadap cekaman Al menujukkan bahwa pada larutan hara yang mengandung 3.2
mM AlCl3.6H2O dan pH 4 selama 7 hari, tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun, sedangkan nontransgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menjelaskan bahwa gen Mmpma
diduga berperanan sangat penting dalam detoksifikasi Al pada Melastoma
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen,
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini, isolasi gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. dan pengujian
peranan gen tersebut terhadap cekaman Al dan pH rendah pada M. malabathricum
L. dengan menggunakan RNA interference (RNAi) merupakan penelitian yang
belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, kedua topik
penelitian di atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.
vi
© Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
vii
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN KONSTRUKSI RNAi GEN
PENYANDI H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI
Melastoma malabathricum L.
MUZUNI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
viii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 18 Januari 2011:
1. Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
2. Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.Si.
Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka, 10 Februari 2011:
3. Dr. Ir. Darda Efendi, M.Sc.
4. Dr. Sustiprijatno, M.Sc.
ix
Judul Disertasi : Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L.
Nama
: Muzuni
NIM
: G361050051
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua
Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr.
Anggota
Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.
Tanggal Ujian Terbuka: 10 Februari 2011
Tanggal lulus:
x
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian maupun penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil
penelitian yang dilakukan selama tiga tahun di Laboratorium Biotechnology
Research Indonesia – The Netherland (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB dan Laboratorium Plant Molecular
Genetics (PMG), Nara Institute of Science and Technology (NAIST), Japan.
Disertasi ini memuat hasil penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan konstruksi
RNAi gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum
L., dan selanjutnya diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan penghargaan dan terima
kasih yang tak terhingga kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua
komisi pembimbing, Bapak Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr. dan Ibu Dr. Ir.
Utut Widyastuti Suharsono, M.Si selaku anggota komisi pembimbing, atas segala
jerih payah dan waktu yang telah disediakan dengan penuh keikhlasan, kesabaran,
dan kelembutan hati dalam memberi bimbingan, nasehat, arahan, dan dorongan
mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga penulisan hasil penelitian.
Demikian pula penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang tinggi
kepada Prof. Dr. Ko Shimamoto dan Dr. Wong Hann Ling dari Nara Institute of
Science and Technology (NAIST), Japan atas bantuan alat dan bahan penelitian
serta
teknis
pelaksanaan
penelitian
biologi
molekuler
selama
penulis
melaksanakan penelitian di Laboratorium Plant Molecular Genetics (PMG),
NAIST, Japan. Kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan
Program Sandwich dari Ditjen Dikti Depdiknas, serta Tim Hibah Kompetensi a/n
Dr Suharsono, terima kasih atas bantuannya dalam menyediakan biaya
pendidikan.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor dan Dekan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo Kendari,
atas izin yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB;
Rektor IPB, Dekan Sekolah Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi
xi
Biologi SPs IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti
pendidikan di SPs IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi SPs
IPB, penulis menyampaikan banyak terima kasih atas ilmu dan kelancaran
administrasi selama penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada staf PPSHB IPB dan PMG NAIST, atas
bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan penelitian di laboratorium.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa
Indonesia di NAIST; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan yang masih aktif di
laboratorium BIORIN, yaitu Ibu Sri Listyowati, Ibu Yohana, Bu Hannum, Pak
Ulung, Pak Radite, Bu Ratna, Muhdar, Anita, Nurul, Lita, Ila, Fajri, dan Indah,
serta yang sudah lulus, yaitu Firdaus, Pa Hadi, Yasinta, Niken, Yassier, Ulfa, dan
Jaya; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan pada program studi Biologi dan
Agronomi; serta rekan-rekan yang tergabung dalam Under Tree Badminton Club,
atas dorongan dan kerjasamanya. Terima kasih disampaikan kepada Pak Abdul
Mulya, Pak Adi, Mbak Pepy Elvavina, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, dan
Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.
Secara khusus, penulis sampaikan terima kasih yang tulus ikhlas kepada
istri tercinta, Nun Santi, SE dan ananda tercinta Nurul Fitriah Muzuni, atas segala
bentuk pengorbanan, kesetiaan, kesabaran, pengertian, dorongan moril, dan doa
sehingga penulis mempunyai semangat kerja yang tinggi untuk menyelesaikan
pendidikan S3. Kepada keempat orang tua penulis: Ibunda Wakanima dan
Ayahanda Laubi Mane (almarhum), serta Ibunda Zamlia dan Ayahanda Amin
Indi, yang tanpa mengenal lelah selalu memanjatkan doa demi keberhasilan
puteranya; penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang tulus.
Semoga Allah SWT menyayanginya seperti menyayangi penulis. Kepada seluruh
keluarga yang berada di Mawasangka, Bau-Bau, dan Kendari, penulis
mengucapkan terima kasih atas segala perhatian, kasih sayang, dan simpati yang
diberikan kepada penulis selama ini.
Akhirnya, penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan biologi molekuler di Indonesia.
Bogor, Februari 2011
Muzuni
xii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Mawasangka, Buton, Sulawesi Tenggara pada
tanggal 7 April 1971 sebagai anak pertama dari pasangan Laubi Mane (almarhum)
dan Wakanima. Pendidikan sarjana ditempuh pada Jurusan Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, lulus tahun
1996. Pada tahun 1998, penulis diterima sebagai mahasiswa program magister
sains pada Program Studi Bioteknologi dan lulus pada tahun 2001. Selanjutnya,
pada tahun 2005 penulis diterima kembali sebagai mahasiswa program doktor di
Program Studi Biologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Sejak tahun 2002, penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Fakultas
MIPA Universitas Haluoleo Kendari. Mata kuliah yang menjadi tanggung jawab
penulis adalah pengantar bioteknologi, genetika molekuler, mikrobiologi terapan,
dan biokimia.
Selama mengikuti program doktor, penulis pernah menjadi Ketua
Himpunan Mahasiswa Pascasarjana Sulawesi Tenggara (tahun 2006-2007), dan
pengurus HIWACANA IPB (tahun 2006). Sebuah artikel ilmiah telah diterbitkan
pada Jurnal Agronomi Indonesia Volume 38, No. 1, Tahun 2010, sedangkan dua
artikel lainnya telah penulis siapkan untuk diterbitkan pada jurnal ilmiah yang
terakreditasi. Ketiga artikel tersebut ialah:
1. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono dan Suharsono. 2010.
Isolasi dan pengklonan fragmen cDNA gen penyandi H+-ATPase membran
plasma dari Melastoma malabathricum L. J. Agron. Indonesia. 38 (1): 67-74.
2. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko
Shimamoto, Suharsono. Isolasi dan pengklonan gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari Melastoma malabathricum L.
3. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko
Shimamoto, Suharsono. Konstruksi RNAi dari fragmen 3’UTR gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L.
Ketiga karya tersebut merupakan bagian dari program doktor penulis.
xiii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xviii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................
Strategi Penelitian ..................................................................................
Manfaat Penelitian ................................................................................
1
4
4
5
TINJAUAN PUSTAKA
Toksisitas Aluminium ........................................................................... 6
Penyerapan dan Distribusi Al pada Akar dan Daun ............................... 7
Lokalisasi Al Subseluler ....................................................................... 8
Sensitivitas Seluler terhadap Al ............................................................... 9
Mekanisme Utama Toksisitas Al ........................................................... 10
Gejala dan Pengaruh Umum Toksisitas Aluminium pada Tanaman ....... 12
Mekanisme Seluler Toleransi Aluminium ............................................. 13
Eksudasi Senyawa-senyawa Pengkelat Aluminum ................................ 14
Ekspresi Gen-gen yang Diinduksi oleh Cekaman Al ............................. 17
Penyerapan Aluminium pada Tanaman M. malabathricum L. ............... 18
Pengaruh yang Ditimbulkan oleh Penyerapan Aluminium pada
Tanaman M. malabathricum .................................................................. 20
H+-ATPase Membran Plasma ................................................................ 23
Peranan Fisiologi H+-ATPase Membran Plasma .................................... 25
Struktur H+-ATPase Membran Plasma .................................................. 27
Siklus Katalitik ..................................................................................... 30
Regulasi Enzim ..................................................................................... 32
Pengaruh Logam terhadap Aktivitas Enzim ........................................... 33
RNA Interference (RNAi) ..................................................................... 35
ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI
H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak .................................................................................................
Abstract ................................................................................................
Pendahuluan .........................................................................................
Bahan dan Metode ................................................................................
Hasil dan Pembahasan ..........................................................................
Kesimpulan ...........................................................................................
38
38
39
40
43
50
xiv
ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI H+-ATPase
MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak ..................................................................................................
Abstract .................................................................................................
Pendahuluan ..........................................................................................
Bahan dan Metode .................................................................................
Hasil dan Pembahasan ...........................................................................
Kesimpulan ............................................................................................
51
51
52
54
59
65
KONSTRUKSI RNAi DARI FRAGMEN 3’UTR GEN PENYANDI
H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak ................................................................................................
Abstract ...............................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Kesimpulan ..........................................................................................
66
66
67
69
74
82
PEMBAHASAN UMUM .......................................................................... 84
KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ..................................................... 89
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 90
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kompartementasi dan bentuk Al di daun dari beberapa tanaman
akumulator Al ........................................................................................ 23
2 Hasil penyejajaran sekuen asam amino beberapa domain dari
berbagai tipe ATPase ............................................................................... 48
xvi
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Halaman
Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, dan konstruksi
RNAi gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L .................................................................... 5
Interaksi A13+ dengan saluran yang permeable terhadap efluks
malat pada membran plasma .................................................................. 16
Peranan asam organik dalam pertumbuhan melastoma ........................... 22
Transport primer dan sekunder melintasi membran plasma .................... 25
Skema H+-ATPase membran plasma AHA2 .......................................... 28
Motif sekuen yang terkonservasi pada loop kecil dan besar sitoplasma
H+-ATPase membran plasma N. plumbaginifolia PMA2 ........................ 29
Situs pengikatan Mg-ATP (substrat H+-ATPase membran plasma)
pada loop besar sitoplasma yang melibatkan motif III, IV, V, dan VI ..... 30
Siklus reaksi H+-ATPase membran plasma ............................................ 31
Hasil PCR menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan pasangan
primer ActF – ActR untuk mendapatkan fragmen aktin yang berukuran
450 pb dan AF2 – AR2 untuk mendapatkan fragmen Mmpma................. 43
10 Urutan nukleotida fragmen cDNA Mmpma ........................................... 44
11 Deduksi asam amino fragmen Mmpma .................................................. 44
12 Situs pemotongan enzim restriksi endonuklease fragmen Mmpma .......... 45
13 Model topografi transmembran dan loop sitoplasma dari H+-ATPase
membran plasma..................................................................................... 46
14 Profil hidrofobisitas PMA Sesbania rostrata, srha5 (A), fragmen
PMA Sesbania rostrata (B) dan fragmen MmPMA (C) .......................... 49
15 RNA Total dari daun Melastoma malabathricum .................................... 59
16 Hasil amplifikasi cDNA menggunakan primer ActF dan actR ................. 60
17 Hasil isolasi bagian-bagian gen penyandi H+-ATPase membran
plasma dari M. malabathricum................................................................ 60
18 Hasil pengurutan nukleotida utuh (full length) gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari M. malabathricum (Mmpma)
yang diperoleh dari penggabungan urutan nukleotida Mmpma5’,
Mmpmam, dan Mmpma3’ berukuran 3155 pb ......................................... 61
19 Peta plasmid pMmpma (6141 pb) yang terdiri dari vektor
pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA Mmpma (3126 pb) ......................... 62
20 Struktur 2 dimensi dari H+-ATPase membran plasma.............................. 63
xvii
21 Deduksi asam amino gen penyandi H+-ATPase membran plasma
dari M. malabathricum .......................................................................... 64
22 Profil hidrofobisitas MmPMA dan PMA Juglans regia (AHA1)
menggunakan skala Kyte & Doolittle..................................................... 64
23 Vektor pANDA digunakan untuk konstruksi RNAi berukuran 20 kb ..... 70
24 Peta fisik plasmid dan situs pengklonan pENTRTM/D- TOPO® ............. 71
25 Hasil amplifikasi pMmpma3’ dengan menggunakan primer 3’UTR-F
dan 3’UTR-R......................................................................................... 74
26 Hasil rekombinasi antara vektor pANDA dan pENTR/D- TOPO® yang
membawa fragmen 3’UTR dari M. malabathricum L. menghasilkan
vektor RNAi, pANDA/3’UTRMmpma .................................................. 75
27 Hasil PCR menggunakan pANDA/3’UTRMmpma sebagai cetakan
dan pasangan Ubq-F dan Gus-R serta Gus-F dan Nos-R sebagai
primer.................................................................................................... 75
28 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke
dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-R....................... 76
29 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke
dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-F ....................... 76
30 Fragmen 3’UTR gen penyandi H+-ATPAse membran plasma dari
M. malabathricum L. membentuk orientasi berulang terbalik yang
diselingi oleh fragmen dari gen gus........................................................ 77
31 Hasil PCR terhadap koloni A. tumefaciens hasil elektroporasi................ 78
32 Hasil PCR menggunakan 4 tanaman transgenik independen
(kolom 2-5), DNA tanaman kontrol (kolom 1), dan DNA vektor
RNAi sebagai cetakan dan pasangan UbiF1 – GusR1 sebagai primer...... 79
33 Tanaman trangenik hasil transformasi RNAi yang membawa
fragmen 3’UTRMmpma dengan konstruksi berulang terbalik
(A1 – A4) dan tanaman non-transgenik (B) yang berumur 3
bulan setelah aklimatisasi........................................................................ 79
34 Akar tanaman transgenik (A) dan non-transgenik (B) setelah
perlakuan 3.2 mM Al dan pH 4 dalam larutan hara selama 6 hari ............ 81
35 Pertumbuhan akar tanaman transgenik dan non-transgenik
pada media hara yang mengandung 3.2 mM AlCl3.6H2O dan
pH 4 selama 7 hari .................................................................................. 82
36 Tanaman transgenik yang diperlakukan dengan 3.2 mM AlCl3.6H2O
dan pH 4 (A) dan tanaman non-transgenik (B) dalam larutan hara
selama 5 hari (A1) dan 7 hari (A2, A3, A4, dan B).................................. 82
37 Strategi yang digunakan untuk mengisolasi gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari Melastoma malabathricum L ............................... 87
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpmam dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 109
2
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpmam menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 112
3
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpma5’ dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 113
4
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpma5’ menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 116
5
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpma3’ dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 117
6
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpma3’ menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 120
7
Kromatogram pengurutan DNA gen Mmpma dengan menggunakan
primer T7 dan SP6 ............................................................................... 121
8
Hasil pengurutan DNA Mmpma menggunakan primer T7 dan SP6 ...... 127
lakang
!
! " # $%" &' () *+,,-./ ! "
! 0 ! 1 " %
-2 3 0 !/ " % %! 4 %
5 " !/ % 5 -
*" 6 $ +,,7. 8! "
" % 9 /
%" %! !
9 " / %!
" %% ! ! % !
/ ! 0 : ;>3. 9%"/ %! %
! %/ 0 0 ! %!
% % 0
%! !
%
? " "
@A9 %
? ! %" %"
! ! 9 / !
@A9 % "
! ! 9 4! " !
!
PENYANDI H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI
Melastoma malabathricum L.
MUZUNI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ii
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Isolasi, Pengklonan, dan
Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma
malabathricum L. adalah karya bersama saya dan pembimbing yang belum pernah
diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka.
Bogor, Februari 2011
Muzuni
NIM G361050051
iii
ABSTRACT
MUZUNI. Isolation, Cloning, and RNAi construct of Gene coding Plasma
Membrane H+-ATPase from Melastoma malabathricum L. Under supervised of
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. is an Al-accumulating plant that grows in
acidic soils with high level of soluble aluminum in the tropics. One of the important
proteins in the detoxifying aluminum is a plasma membrane H+-ATPase, a most
abundant protein on the plasma membrane, encoded by pma gene. The objective of
this research is to isolate and characterize the gene encoding plasma membrane H +ATPase from M. malabathricum L. (Mmpma) and to construct RNAi by using 3’UTR
of Mmpma. Total cDNA had been successfully isolated by using reverse
transcription with total RNA as template. Full length cDNA of Mmpma had been
successfully isolated through a gradual isolation of the gene. The 5’ end and
middle gene of Mmpma had been successfully isolated by PCR (polymerase chain
reaction) by using total cDNA as template and pma primers designed from some
plants, while the 3’ end of Mmpma had been isolated by 3’ RACE. The parts of the
gene had been successfully joined by PCR. The joining product was successfully
inserted into pGEM-T Easy and the recombinant plasmid was successfully introduced
into E. coli DH5α. Nucleotide sequence analysis showed that the length of Mmpma
coding sequence was sized 2871 bp encoding 956 amino acids with a predicted
molecular weight of 105.29 kDa and pI value of 6.84. MmPMA has 10 transmembran
domains, 4 cytoplasm loops, 6 functional domains and 3 autoregulatory domains. In
the second cytoplasm loop (C2) contained conserved sequence TGES (phosphatase
activity domain); in the C3 contained conserved sequences DKTGTLT
(phosphorylation and transduction domain), KGAP (ATP-binding and/or kinase
activity domain), DPPR (ATP-binding domain), MITGD (ATP-binding domain) and
GDGVNDAPALK (ATP-binding domain); in the C4 contained 3 autoregulatory
domains: QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, and
YTV. Local alignment analysis based on nucleotide of mRNA showed that Mmpma is
82% identical to pma Vitis vinifera; 81% to pma Juglans regia, pma Populus
tricocarpa, pma Sesbania rostrata, and pma Prunus persica and 80% to pma
Lycopersicon esculentum. Based on deduced amino acid sequence, MmPMA is 94%
identical to PMA Vitis vinifera and PMA Juglans regia; 93% to PMA Populus
trichocarpa; 92% to PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum,
and Arabidopsis thaliana, AHA4.
One of the methods to study the important role of Mmpma gene is by
suppressing the gene expression through RNAi. The Mmpma gene can be
supposed in detoxifying Al and low pH, if the transgenic plants containing RNAi
became sensitive to Al and low pH. RNAi vector had been successfully constructed
using GATEWAYTM cloning technology with the 3’UTRMmpma was used as
double-stranded RNA (dsRNA) trigger sequence, pENTRTM/D-TOPO® as entry
vector, and pANDA plasmid as destination vector. The DNA coding RNAi had been
successfully introduced into M. malabathricum L. mediated by A. tumefaciens
EHA101 to analyze the function of Mmpma gene in the detoxifying aluminum. Based
on the result of transgenic plants tolerance analyzes to Al stress showed that in the
nutrient solution including 3.2 mM Al stress (AlCl3.6H2O), pH 4 for 7 days, the
transgenic plants underwent growth suppression especially roots and leaves, whereas
non-transgenic plants underwent growth normally. We supposed that Mmpma gene
has an important role in the detoxifying aluminum in Melastoma malabathricum L.
iv
RINGKASAN
MUZUNI. Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+-ATPase
Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Dibimbing oleh
SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO.
Melastoma malabathricum L. adalah suatu tanaman akumulator Al yang
tumbuh pada tanah asam dengan tingkat kelarutan aluminium tinggi di daerah
tropis. Salah satu enzim penting dalam detoksifikasi Al adalah H+-ATPase
membran plasma, suatu protein yang paling melimpah pada membran plasma,
yang disandikan oleh gen pma. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan
mengkarakterisasi gen yang menyandikan H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L. (Mmpma) dan mempelajari peranan gen Mmpma
melalui konstruksi RNAi dengan menggunakan fragmen 3’UTR Mmpma. cDNA
total telah berhasil disintesis dengan menggunakan transkripsi balik dengan RNA
total sebagai cetakan. cDNA Mmpma utuh telah berhasil diisolasi melalui isolasi
gen secara bertahap. Bagian ujung 5’ dan tengah gen Mmpma telah diisolasi
dengan PCR (polymerase chain reaction) menggunakan cDNA total sebagai
cetakan dan primer pma yang didesain dari beberapa tanaman, sedangkan bagian
ujung 3’gen Mmpma telah diisolasi dengan 3’ RACE. Bagian-bagian gen tersebut
telah berhasil digabung menggunakan PCR dan telah disisipkan ke dalam pGEMT Easy. Plasmid rekombinan tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam E.
coli DH5α. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa panjang sekuen
penyandi (CDS) Mmpma adalah 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino
dengan prediksi berat molekul 105.29 kDa dan prediksi nilai pI sekitar 6.84.
MmPMA mempunyai 10 domain transmembran, 4 loop sitoplasma, 6 domain
fungsional dan 3 domain autoregulator. Pada loop sitoplasma kedua (C2) terdapat
sekuen terkonservasi TGES (domain aktivitas fosfatase); pada C3 terdapat sekuen
DKTGTLT (domain fosforilasi dan transduksi), KGAP (domain pengikatan ATP
dan/atau aktivitas kinase), DPPR (domain pengikatan ATP), MITGD (domain
pengikatan ATP) dan GDGVNDAPALK (domain pengikatan ATP); pada C4
terdapat 3 domain autoregulator yang masing-masing mempunyai sekuen:
QKDFGKEQRELQWAHAQRTLHGL, NHIAEEAKRRAEIARL, dan YTV.
Analisis kesejajaran lokal berdasarkan nukleotida mRNA menunjukkan bahwa
Mmpma mempunyai kemiripan 82% dengan pma Vitis vinifera; 81% dengan pma
Juglans regia, pma Populus tricocarpa, pma Sesbania rostrata, dan pma Prunus
persica dan 80% dengan pma Lycopersicon esculentum. Berdasarkan deduksi
sekuen asam amino, MmPMA mempunyai kemiripan 94% dengan PMA Vitis
vinifera dan PMA Juglans regia; 93% dengan PMA Populus trichocarpa; 92%
dengan PMA Vicia faba, Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, dan
Arabidopsis thaliana.
Salah satu cara untuk mempelajari peranan gen Mmpma adalah dengan
menekan ekspresi gen tersebut melalaui RNAi. Gen Mmpma dapat diduga
berperan dalam detoksifikasi Al dan pH rendah apabila tanaman transgenik hasil
transformasi RNAi menjadi peka terhadap Al dan pH rendah. Vektor RNAi telah
berhasil dikonstruksi menggunakan teknologi pengklonan GATEWAYTM dimana
fragmen 3’UTRMmpma digunakan sebagai sekuen pemicu RNA utas ganda
(dsRNA), pENTRTM/D-TOPO® sebagai entry vector dan vektor pANDA sebagai
v
destination vector. DNA penyandi RNAi telah diintroduksikan ke tanaman M.
malabathricum L. melalui A. tumefaciens EHA101 untuk mempelajari peranan
gen Mmpma dalam detoksifikasi Al. Hasil uji toleransi tanaman transgenik
terhadap cekaman Al menujukkan bahwa pada larutan hara yang mengandung 3.2
mM AlCl3.6H2O dan pH 4 selama 7 hari, tanaman transgenik mengalami
hambatan pertumbuhan terutama pertumbuhan akar dan daun, sedangkan nontransgenik tidak mengalami hambatan. Hal ini menjelaskan bahwa gen Mmpma
diduga berperanan sangat penting dalam detoksifikasi Al pada Melastoma
malabathricum L. Penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan uji peranan gen,
merupakan penelitian yang masih jarang dilakukan. Saat ini, isolasi gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L. dan pengujian
peranan gen tersebut terhadap cekaman Al dan pH rendah pada M. malabathricum
L. dengan menggunakan RNA interference (RNAi) merupakan penelitian yang
belum pernah dilakukan oleh peneliti lain di dunia. Oleh karena itu, kedua topik
penelitian di atas adalah kebaruan (novelty) dalam penelitian ini.
vi
© Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumber.
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.
vii
ISOLASI, PENGKLONAN, DAN KONSTRUKSI RNAi GEN
PENYANDI H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI
Melastoma malabathricum L.
MUZUNI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
viii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup, 18 Januari 2011:
1. Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
2. Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.Si.
Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka, 10 Februari 2011:
3. Dr. Ir. Darda Efendi, M.Sc.
4. Dr. Sustiprijatno, M.Sc.
ix
Judul Disertasi : Isolasi, Pengklonan, dan Konstruksi RNAi Gen Penyandi H+ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L.
Nama
: Muzuni
NIM
: G361050051
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Ketua
Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr.
Anggota
Dr. Ir. Utut W. Suharsono, M.Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biologi
Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.
Tanggal Ujian Terbuka: 10 Februari 2011
Tanggal lulus:
x
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji hanya untuk Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan
penelitian maupun penulisan disertasi ini. Disertasi ini disusun berdasarkan hasil
penelitian yang dilakukan selama tiga tahun di Laboratorium Biotechnology
Research Indonesia – The Netherland (BIORIN) Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB dan Laboratorium Plant Molecular
Genetics (PMG), Nara Institute of Science and Technology (NAIST), Japan.
Disertasi ini memuat hasil penelitian tentang isolasi, pengklonan, dan konstruksi
RNAi gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum
L., dan selanjutnya diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan penghargaan dan terima
kasih yang tak terhingga kepada Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku ketua
komisi pembimbing, Bapak Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr. dan Ibu Dr. Ir.
Utut Widyastuti Suharsono, M.Si selaku anggota komisi pembimbing, atas segala
jerih payah dan waktu yang telah disediakan dengan penuh keikhlasan, kesabaran,
dan kelembutan hati dalam memberi bimbingan, nasehat, arahan, dan dorongan
mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan, hingga penulisan hasil penelitian.
Demikian pula penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang tinggi
kepada Prof. Dr. Ko Shimamoto dan Dr. Wong Hann Ling dari Nara Institute of
Science and Technology (NAIST), Japan atas bantuan alat dan bahan penelitian
serta
teknis
pelaksanaan
penelitian
biologi
molekuler
selama
penulis
melaksanakan penelitian di Laboratorium Plant Molecular Genetics (PMG),
NAIST, Japan. Kepada Tim Beasiswa Pendidikan Pascasarjana (BPPS) dan
Program Sandwich dari Ditjen Dikti Depdiknas, serta Tim Hibah Kompetensi a/n
Dr Suharsono, terima kasih atas bantuannya dalam menyediakan biaya
pendidikan.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Rektor dan Dekan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo Kendari,
atas izin yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan pendidikan di SPs IPB;
Rektor IPB, Dekan Sekolah Pascasarjana (SPs) IPB, dan Ketua Program Studi
xi
Biologi SPs IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti
pendidikan di SPs IPB Bogor. Kepada seluruh staf pengajar dan administrasi SPs
IPB, penulis menyampaikan banyak terima kasih atas ilmu dan kelancaran
administrasi selama penulis menjadi mahasiswa di SPs IPB. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada staf PPSHB IPB dan PMG NAIST, atas
bantuannya dalam kelancaran pelaksanaan penelitian di laboratorium.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada rekan-rekan mahasiswa
Indonesia di NAIST; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan yang masih aktif di
laboratorium BIORIN, yaitu Ibu Sri Listyowati, Ibu Yohana, Bu Hannum, Pak
Ulung, Pak Radite, Bu Ratna, Muhdar, Anita, Nurul, Lita, Ila, Fajri, dan Indah,
serta yang sudah lulus, yaitu Firdaus, Pa Hadi, Yasinta, Niken, Yassier, Ulfa, dan
Jaya; rekan-rekan mahasiswa seperjuangan pada program studi Biologi dan
Agronomi; serta rekan-rekan yang tergabung dalam Under Tree Badminton Club,
atas dorongan dan kerjasamanya. Terima kasih disampaikan kepada Pak Abdul
Mulya, Pak Adi, Mbak Pepy Elvavina, Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, dan
Pak Iri atas bantuan dan kerjasamanya.
Secara khusus, penulis sampaikan terima kasih yang tulus ikhlas kepada
istri tercinta, Nun Santi, SE dan ananda tercinta Nurul Fitriah Muzuni, atas segala
bentuk pengorbanan, kesetiaan, kesabaran, pengertian, dorongan moril, dan doa
sehingga penulis mempunyai semangat kerja yang tinggi untuk menyelesaikan
pendidikan S3. Kepada keempat orang tua penulis: Ibunda Wakanima dan
Ayahanda Laubi Mane (almarhum), serta Ibunda Zamlia dan Ayahanda Amin
Indi, yang tanpa mengenal lelah selalu memanjatkan doa demi keberhasilan
puteranya; penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang tulus.
Semoga Allah SWT menyayanginya seperti menyayangi penulis. Kepada seluruh
keluarga yang berada di Mawasangka, Bau-Bau, dan Kendari, penulis
mengucapkan terima kasih atas segala perhatian, kasih sayang, dan simpati yang
diberikan kepada penulis selama ini.
Akhirnya, penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat
memberikan sumbangan bagi perkembangan biologi molekuler di Indonesia.
Bogor, Februari 2011
Muzuni
xii
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Mawasangka, Buton, Sulawesi Tenggara pada
tanggal 7 April 1971 sebagai anak pertama dari pasangan Laubi Mane (almarhum)
dan Wakanima. Pendidikan sarjana ditempuh pada Jurusan Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, lulus tahun
1996. Pada tahun 1998, penulis diterima sebagai mahasiswa program magister
sains pada Program Studi Bioteknologi dan lulus pada tahun 2001. Selanjutnya,
pada tahun 2005 penulis diterima kembali sebagai mahasiswa program doktor di
Program Studi Biologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Sejak tahun 2002, penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Fakultas
MIPA Universitas Haluoleo Kendari. Mata kuliah yang menjadi tanggung jawab
penulis adalah pengantar bioteknologi, genetika molekuler, mikrobiologi terapan,
dan biokimia.
Selama mengikuti program doktor, penulis pernah menjadi Ketua
Himpunan Mahasiswa Pascasarjana Sulawesi Tenggara (tahun 2006-2007), dan
pengurus HIWACANA IPB (tahun 2006). Sebuah artikel ilmiah telah diterbitkan
pada Jurnal Agronomi Indonesia Volume 38, No. 1, Tahun 2010, sedangkan dua
artikel lainnya telah penulis siapkan untuk diterbitkan pada jurnal ilmiah yang
terakreditasi. Ketiga artikel tersebut ialah:
1. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono dan Suharsono. 2010.
Isolasi dan pengklonan fragmen cDNA gen penyandi H+-ATPase membran
plasma dari Melastoma malabathricum L. J. Agron. Indonesia. 38 (1): 67-74.
2. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko
Shimamoto, Suharsono. Isolasi dan pengklonan gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari Melastoma malabathricum L.
3. Muzuni, Didy Sopandie, Utut Widyastuti Suharsono, Wong Hann Ling, Ko
Shimamoto, Suharsono. Konstruksi RNAi dari fragmen 3’UTR gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari Melastoma malabathricum L.
Ketiga karya tersebut merupakan bagian dari program doktor penulis.
xiii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xviii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Tujuan Penelitian ..................................................................................
Strategi Penelitian ..................................................................................
Manfaat Penelitian ................................................................................
1
4
4
5
TINJAUAN PUSTAKA
Toksisitas Aluminium ........................................................................... 6
Penyerapan dan Distribusi Al pada Akar dan Daun ............................... 7
Lokalisasi Al Subseluler ....................................................................... 8
Sensitivitas Seluler terhadap Al ............................................................... 9
Mekanisme Utama Toksisitas Al ........................................................... 10
Gejala dan Pengaruh Umum Toksisitas Aluminium pada Tanaman ....... 12
Mekanisme Seluler Toleransi Aluminium ............................................. 13
Eksudasi Senyawa-senyawa Pengkelat Aluminum ................................ 14
Ekspresi Gen-gen yang Diinduksi oleh Cekaman Al ............................. 17
Penyerapan Aluminium pada Tanaman M. malabathricum L. ............... 18
Pengaruh yang Ditimbulkan oleh Penyerapan Aluminium pada
Tanaman M. malabathricum .................................................................. 20
H+-ATPase Membran Plasma ................................................................ 23
Peranan Fisiologi H+-ATPase Membran Plasma .................................... 25
Struktur H+-ATPase Membran Plasma .................................................. 27
Siklus Katalitik ..................................................................................... 30
Regulasi Enzim ..................................................................................... 32
Pengaruh Logam terhadap Aktivitas Enzim ........................................... 33
RNA Interference (RNAi) ..................................................................... 35
ISOLASI DAN PENGKLONAN FRAGMEN cDNA GEN PENYANDI
H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak .................................................................................................
Abstract ................................................................................................
Pendahuluan .........................................................................................
Bahan dan Metode ................................................................................
Hasil dan Pembahasan ..........................................................................
Kesimpulan ...........................................................................................
38
38
39
40
43
50
xiv
ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI H+-ATPase
MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak ..................................................................................................
Abstract .................................................................................................
Pendahuluan ..........................................................................................
Bahan dan Metode .................................................................................
Hasil dan Pembahasan ...........................................................................
Kesimpulan ............................................................................................
51
51
52
54
59
65
KONSTRUKSI RNAi DARI FRAGMEN 3’UTR GEN PENYANDI
H+-ATPase MEMBRAN PLASMA DARI Melastoma malabathricum L.
Abstrak ................................................................................................
Abstract ...............................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode ...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Kesimpulan ..........................................................................................
66
66
67
69
74
82
PEMBAHASAN UMUM .......................................................................... 84
KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ..................................................... 89
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 90
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kompartementasi dan bentuk Al di daun dari beberapa tanaman
akumulator Al ........................................................................................ 23
2 Hasil penyejajaran sekuen asam amino beberapa domain dari
berbagai tipe ATPase ............................................................................... 48
xvi
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Halaman
Diagram alir percobaan isolasi, pengklonan, dan konstruksi
RNAi gen penyandi H+-ATPase membran plasma dari
Melastoma malabathricum L .................................................................... 5
Interaksi A13+ dengan saluran yang permeable terhadap efluks
malat pada membran plasma .................................................................. 16
Peranan asam organik dalam pertumbuhan melastoma ........................... 22
Transport primer dan sekunder melintasi membran plasma .................... 25
Skema H+-ATPase membran plasma AHA2 .......................................... 28
Motif sekuen yang terkonservasi pada loop kecil dan besar sitoplasma
H+-ATPase membran plasma N. plumbaginifolia PMA2 ........................ 29
Situs pengikatan Mg-ATP (substrat H+-ATPase membran plasma)
pada loop besar sitoplasma yang melibatkan motif III, IV, V, dan VI ..... 30
Siklus reaksi H+-ATPase membran plasma ............................................ 31
Hasil PCR menggunakan cDNA total sebagai cetakan dan pasangan
primer ActF – ActR untuk mendapatkan fragmen aktin yang berukuran
450 pb dan AF2 – AR2 untuk mendapatkan fragmen Mmpma................. 43
10 Urutan nukleotida fragmen cDNA Mmpma ........................................... 44
11 Deduksi asam amino fragmen Mmpma .................................................. 44
12 Situs pemotongan enzim restriksi endonuklease fragmen Mmpma .......... 45
13 Model topografi transmembran dan loop sitoplasma dari H+-ATPase
membran plasma..................................................................................... 46
14 Profil hidrofobisitas PMA Sesbania rostrata, srha5 (A), fragmen
PMA Sesbania rostrata (B) dan fragmen MmPMA (C) .......................... 49
15 RNA Total dari daun Melastoma malabathricum .................................... 59
16 Hasil amplifikasi cDNA menggunakan primer ActF dan actR ................. 60
17 Hasil isolasi bagian-bagian gen penyandi H+-ATPase membran
plasma dari M. malabathricum................................................................ 60
18 Hasil pengurutan nukleotida utuh (full length) gen penyandi
H+-ATPase membran plasma dari M. malabathricum (Mmpma)
yang diperoleh dari penggabungan urutan nukleotida Mmpma5’,
Mmpmam, dan Mmpma3’ berukuran 3155 pb ......................................... 61
19 Peta plasmid pMmpma (6141 pb) yang terdiri dari vektor
pGEM-T Easy (3015 pb) dan cDNA Mmpma (3126 pb) ......................... 62
20 Struktur 2 dimensi dari H+-ATPase membran plasma.............................. 63
xvii
21 Deduksi asam amino gen penyandi H+-ATPase membran plasma
dari M. malabathricum .......................................................................... 64
22 Profil hidrofobisitas MmPMA dan PMA Juglans regia (AHA1)
menggunakan skala Kyte & Doolittle..................................................... 64
23 Vektor pANDA digunakan untuk konstruksi RNAi berukuran 20 kb ..... 70
24 Peta fisik plasmid dan situs pengklonan pENTRTM/D- TOPO® ............. 71
25 Hasil amplifikasi pMmpma3’ dengan menggunakan primer 3’UTR-F
dan 3’UTR-R......................................................................................... 74
26 Hasil rekombinasi antara vektor pANDA dan pENTR/D- TOPO® yang
membawa fragmen 3’UTR dari M. malabathricum L. menghasilkan
vektor RNAi, pANDA/3’UTRMmpma .................................................. 75
27 Hasil PCR menggunakan pANDA/3’UTRMmpma sebagai cetakan
dan pasangan Ubq-F dan Gus-R serta Gus-F dan Nos-R sebagai
primer.................................................................................................... 75
28 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke
dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-R....................... 76
29 Penyejajaran hasil sekuensing dari 6 konstruksi 3’UTR Mmpma ke
dalam vektor pANDA yang menggunakan primer Gus-F ....................... 76
30 Fragmen 3’UTR gen penyandi H+-ATPAse membran plasma dari
M. malabathricum L. membentuk orientasi berulang terbalik yang
diselingi oleh fragmen dari gen gus........................................................ 77
31 Hasil PCR terhadap koloni A. tumefaciens hasil elektroporasi................ 78
32 Hasil PCR menggunakan 4 tanaman transgenik independen
(kolom 2-5), DNA tanaman kontrol (kolom 1), dan DNA vektor
RNAi sebagai cetakan dan pasangan UbiF1 – GusR1 sebagai primer...... 79
33 Tanaman trangenik hasil transformasi RNAi yang membawa
fragmen 3’UTRMmpma dengan konstruksi berulang terbalik
(A1 – A4) dan tanaman non-transgenik (B) yang berumur 3
bulan setelah aklimatisasi........................................................................ 79
34 Akar tanaman transgenik (A) dan non-transgenik (B) setelah
perlakuan 3.2 mM Al dan pH 4 dalam larutan hara selama 6 hari ............ 81
35 Pertumbuhan akar tanaman transgenik dan non-transgenik
pada media hara yang mengandung 3.2 mM AlCl3.6H2O dan
pH 4 selama 7 hari .................................................................................. 82
36 Tanaman transgenik yang diperlakukan dengan 3.2 mM AlCl3.6H2O
dan pH 4 (A) dan tanaman non-transgenik (B) dalam larutan hara
selama 5 hari (A1) dan 7 hari (A2, A3, A4, dan B).................................. 82
37 Strategi yang digunakan untuk mengisolasi gen penyandi H+-ATPase
membran plasma dari Melastoma malabathricum L ............................... 87
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpmam dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 109
2
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpmam menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 112
3
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpma5’ dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 113
4
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpma5’ menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 116
5
Kromatogram pengurutan DNA fragmen Mmpma3’ dengan
menggunakan primer T7 dan SP6 ........................................................ 117
6
Hasil pengurutan DNA fragmen Mmpma3’ menggunakan primer
T7 dan SP6 .......................................................................................... 120
7
Kromatogram pengurutan DNA gen Mmpma dengan menggunakan
primer T7 dan SP6 ............................................................................... 121
8
Hasil pengurutan DNA Mmpma menggunakan primer T7 dan SP6 ...... 127
lakang
!
! " # $%" &' () *+,,-./ ! "
! 0 ! 1 " %
-2 3 0 !/ " % %! 4 %
5 " !/ % 5 -
*" 6 $ +,,7. 8! "
" % 9 /
%" %! !
9 " / %!
" %% ! ! % !
/ ! 0 : ;>3. 9%"/ %! %
! %/ 0 0 ! %!
% % 0
%! !
%
? " "
@A9 %
? ! %" %"
! ! 9 / !
@A9 % "
! ! 9 4! " !
!