Purifikasi Parsial Dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE
DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Purifikasi Parsial dan
Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini
didanai oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI (Proyek PKPP 2012). Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Lusiana Kresnawati Hartono
NIM G84090017

ABSTRAK
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Purifikasi Parsial dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134. Dibimbing
oleh I MADE ARTIKA dan TATIK KHUSNIATI.
Intoleransi laktosa merupakan salah satu kasus yang sering terjadi pada
bayi, orang dewasa, maupun manula. Hal tersebut terjadi karena keterbatasan βgalaktosidase pada saluran pencernaan. Salah satu solusinya adalah konsumsi βgalaktosidase dari sumber lain. Isolat BAL strain B134 merupakan salah satu
sumber yang menghasilkan β-galaktosidase. Produksi β-galaktosidase tertinggi
tercapai saat inokulum 2% ditumbuhkan dalam media MRS yang mengandung
2% laktosa, pH media 5, dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. Purifikasi
parsial β-galaktosidase menghasilkan kemurnian 3.131 kali, rendemen 3.206%,
dan aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg. Aktivitas tertinggi β-galaktosidase
tercapai pada pH 6 dan suhu 45ºC. Aktivitas β-galaktosidase stabil pada pH 4.5
dan suhu 30ºC. Kation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M bersifat
aktivator terhadap aktivitas β-galatosidase sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada

konsentrasi 0.1 M menghambat aktivitas β-galaktosidase. Nilai Km dan Vmaks
dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit.
Kata kunci: Purifikasi parsial, β-galaktosidase, Bakteri Asam Laktat (BAL).

ABSTRACT
LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Partial Purification and Characterization
β-Galaktosidase from Lactic Acid Bacteria (LAB) Strain B134 Isolate. Supervised
by I MADE ARTIKA and TATIK KHUSNIATI.
Lactose intolerance is often occurs in baby, adult, and eldery. It could
happen because of the absence of β-galactosidase in gastrointestinal tract. One of
solution is β-galactosidase intake from other sources. LAB strain B134 Isolate is a
source of β-galactosidase. The aim of the present study was to partial purification
and characterization of β-galactosidase from LAB strain B134 isolate. Maximum
production of β-galactosidase was obtained when 2% inoculums in MRS that
contain 2% lactose, pH: 5, and incubation for 24 hours in 37ºC. Partial
purification of β-galactosidase used dialysis. The purification factor, yield, and
specific activity of β-galactosidase were found to be 3.313 times, 3.026%, and
45.828 U/mg respective. β-galaktosidase showed higest activity was at pH 6 and
temperature 45ºC. Activity of β-galactosidase was stable at pH 4.5 and 30ºC.
Cation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ in 0.1 M increased β-galactosidase activity.

Meanwhile, Ca2+, Cu2+, and Hg2+ in 0,1 M inhibited β-galactosidase activity. Km
and Vmaks of β-galactosidase were 3.934 mM and 3.278 µmol/min.
Keywords: Partial purification, β-galaktosidase, Lactic Acid Bacteria (LAB)

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE
DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

2013

Judul Skripsi : Purifikasi Parsial Dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat
Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134
Nama
: Lusiana Kresnawati Hartono
NIM
: G84090017

Disetujui oleh

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Pembimbing I

Dr Ir Tatik Khusniati, M.App.Sc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc

Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
dengan judul Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Isolat
Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 dilakukan sejak Oktober 2012 hingga
Januari 2013 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat
Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc dan
Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. selaku pembimbing yang telah memberikan
bimbingan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada
Neneng Karimayati, A.Md AL, Abdul Choliq, S.Pd, Febri, dan staf Laboratorium
Biokimia Mikroba LIPI Biologi yang telah membantu selama penelitian.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada papa, mama, Bima, sahabat, dan
teman-teman Biokimia 46 atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2013
Lusiana Kresnawati Hartono

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Waktu dan Tempat Penelitian

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur Percobaan

2

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN

6
6
11
13

Simpulan

13

Saran

14

DAFTAR PUSTAKA

14

LAMPIRAN

16

RIWAYAT HIDUP

20

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11

Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari
isolat BAL strain B134
6
Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat
BAL strain B134
7
Pengaruh konsentrasi laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari
isolat BAL strain B134
7
Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134
7
Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase
8
Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase
9
Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase
9

Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase
10
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase
10
Kurva Michaelis-Menten
11
Kurva Line-Weaverburk
11

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8

Kurva standar ONP
Kurva standar protein
Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum
Penentuan waktu produksi optimum
Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase
Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase
Pengaruh logam terhadap aktivitas β-galaktosidase
Kinetika kimia β-galaktosidase purifikasi parsial

16
16
17
17
17
18
19
19

PENDAHULUAN
Kejadian intoleransi laktosa dijumpai pada bayi, orang dewasa, maupun
manula. Intoleransi laktosa sering terjadi pada orang Asia, Afrika, Timur Tengah,
beberapa negara Mediterania dan juga pada ras Aborigin Australia. Ras Kaukasia
lebih sedikit mengalami kasus intoleransi laktosa, hanya sekitar 5% yang
mengalaminya. Konsumsi laktosa penduduk dunia secara georafis yaitu Eropa
Utara >90%, Eropa Selatan dan Asia Tengah 50%, Afrika 5-20%, dan Asia
Tenggara 1% (Ranchiaro dan Tishkoff 2010). Penelitian pada anak usia 3-5 tahun
di Jakarta menunjukkan 23% responden defisiensi β-galaktosidase (Hegar et al
1995). Penelitian lain pada anak usia 6-12 tahun 1998 di Jakarta menunjukkan
sekitar 50% responden mengalami intoleransi laktosa. Kecenderungan intoleransi
laktosa akan meningkat seiring pertambahan usia. Hal ini terjadi karena produksi
β-galaktosidase menurun seiring pertambahan usia (Tehuteru 1999). Menurut
Hegar et al. (1995), insiden terkait intoleransi laktosa di Indonesia mencapai 70%.
Intoleransi laktosa merupakan kondisi saat laktosa tidak dihidrolisis oleh
enzim tetapi diproses oleh bakteri melalui tahap fermentasi. Fermentasi tersebut
belangsung dalam usus yang menghasilkan gas yang menyebabkan rasa sakit.
Laktosa yang tidak dapat dicerna melalui fermentasi akan menghambat
penyerapan air dari feses yang menyebabkan diare (BPOM 2008). Enzim yang
berperan penting dalam pencernaan laktosa dalam usus halus adalah βgalaktosidase.
β-galaktosidase merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi
glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-galaktosida pada ujung
nonreduksi β-D-galaktosa (Gary dan Kindell 2005). Hidrolisis laktosa secara
enzimatik dengan β-galaktosidase memiliki nilai energi tinggi. Solusi bagi
penderita intoleransi laktosa adalah mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase.
Menurut Fox dan McSweeney (1981), konsumsi suplemen β-galaktosidase efektif
untuk mengurangi gangguan penyerapan laktosa. Namun, harga suplemen ini
mahal.
Solusi lainnya adalah mencari sumber β-galaktosidase yang murah. Enzim
ini terdapat pada hewan, tumbuhan, fungi, dan mikroorganisme. Pada bakteri dan
khamir, β-galaktosidase bersifat intraseluler sedangkan pada fungi bersifat
ekstraseluler (Mahoney 2004). Bakteri asam laktat (BAL) menghasilkan βgalaktosidase yang mampu menurunkan kadar laktosa dalam susu. Lactobacillus
bulgaricus merupakan salah satu contoh BAL. Lactobacillus bulgaricus mampu
mengurai 50-60% laktosa secara intraseluler (Wierzbicki dan Kosikowski 1973,
Sumathy et al. 2012).
Kemampuan β-galaktosidase dalam mencerna laktosa akan meningkat
apabila dilakukan pemurnian. Pemurnian enzim merupakan tahapan pemisahan
enzim target dengan protein lain. Pemurnian enzim meliputi pengendapan oleh
garam atau pelarut organik, dialisis, dan kromatografi. Aktivitas spesifik βgalaktosidase yang tinggi menggambarkan kemampuan enzim yang tinggi dalam
menghidrolisis laktosa. β-galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus meningkat
aktivitas spesifiknya menjadi 62.80 U/mg setelah dilakukan pemurnian.
Kemurniannya meningkat 1.47 kali (Mozumder et al 2012). Sayangnya,
pemurnian enzim membutuhkan biaya yang tidak sedikit dan menghasilkan

2
volume enzim yang sangat sedikit. Pemurnian parsial dapat dilakukan untuk
mengatasi masalah tersebut. Tahapan pemurnian parsial akan menghilangkan satu
atau beberapa langkah pemurnian enzim. Hal ini dapat dilakukan apabila aktivitas
awal enzim tinggi.
Beberapa spesies lokal BAL yang diisolasi dari makanan tradisional asal
Bogor, koleksi Puslit Biologi LIPI, memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi
berdasarkan uji aktivitas awal. Salah satu strain yang memiliki aktivitas βgalaktosidase yang tinggi adalah B134. Penelitian tersebut mendasari karakterisasi
β-galaktosidsase pada isolat bakteri asam laktat strain B134. Penelitian ini
bertujuan untuk melakukan permurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase
dari isolat BAL strain B134.

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2012 hingga Februari 2013
yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Mikroba Bidang Mikrobiologi,
Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di
Cibinong, Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah biakan isolat BAL strain B134 yang
merupakan koleksi biakan bakteri bidang Mikrobiologi LIPI, bahan media MRS
modifikasi, akuades, buffer fosfat 0.05 M pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 6.5 dan
pH 7, buffer fosfat 0.01 M pH 7, amonium sulfat, β-galaktosidase, o-nitrofenil-βD-galaktopiranosida (oNPGal), Na2CO3 1M, o-nitrofenol (oNP), reagen Bradford,
NaCl 0.15 N, bovine serum albumin (BSA), reagen Bradford.
Alat
Alat yang digunakan adalah mikropipet, laminar air flow cabinet, autoklaf
Hirayama, neraca analitik, spektrofotometer UV-VIS 1700 Shimadzu, kuvet,
microwave, vorteks, cool room, penangas air Eyela, inkubator Isuzu, magnetic
strirer, sentrifus, sonikator Eyela, tabung dialisis Cabinet, pH meter HM-25G
TOADKK, dan stopwatch.
Prosedur Percobaan
Penyiapan media tumbuh isolat BAL strain B134
Bahan-bahan untuk membuat media MRS modifikasi dan 2 g CaCO3
dilarutkan dalam 200 mL akuades. Nilai pHnya diatur hingga 7.0. Selanjutnya,
media dipanaskan dalam microwave sampai mendidih lalu ditambahkan 0.2 mL
tween 80. Media agar MRS modifikasi di autoklaf pada 121ºC selama 15 menit.
Setelah itu, media dituang ke cawan petri.

3
Peremajaan isolat BAL strain B134
Sebanyak 1 ose isolat BAL strain B134 dipindahkan ke cawan petri berisi
MRS modifikasi dengan metode cawan gores. Kemudian, cawan petri diinkubasi
dalam inkubator bersuhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian, 1 ose bakteri diambil
dan diremajakan kembali dalam agar miring selama 24 jam untuk dijadikan stok.
Stok pada media agar miring ini menjadi biakan yang akan digunakan untuk total
bakteri dan produksi awal β-galaktosidase.
Total Bakteri per mL Sel
Sebanyak 0.1 mL bakteri dimasukkan dalam tabung berisi 0.9 mL media
MRS modifikasi cair (merupakan pengenceran 10-4). Pengenceran dilakukan
secara berseri hingga 10-7. Masing-masing pengenceran diambil 100 µL dan
disebar menggunakan batang kaca penyebar pada media agar MRS modifikasi
dalam cawan petri. Setelah itu, cawan petri diinkubasi pada 37ºC selama 24 jam.
Koloni yang tumbuh pada masing-masing pengenceran dihitung.
Produksi Awal
Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari stok agar miring dipindahkan ke dalam
200 mL MRS modifikasi cair. Kemudian, media diinkubasi pada 37ºC selama 48
jam. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4ºC selama 15 menit. Pelet yang diperoleh dicuci sebanyak 2 kali dengan buffer
PO4 0.05 M pH 6.5 (1 g/5 mL). Pelet hasil pencucian buffer yang kedua
ditambahkan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 dan glass bead. Suspensi sel divorteks
selama 5 menit. Suspensi sel disentrifus kembali pada kecepatan 9.500 rpm pada
suhu 4ºC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase
kasar. Volume enzim yang diperoleh diukur kemudian uji aktivitas dan uji kadar
protein dilakukan untuk mengetahui aktivitas spesifik awal.
Optimasi Pertumbuhan
Penentuan Konsentrasi Inokulum. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL
media MRS modifikasi cair dengan pH 7. Variasi inokulum bakteri yang
digunakan adalah 1%, 2%, dan 5%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam.
Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar
protein menunjukkan inokulum optimum Isolat BAL strain B134.
Penentuan pH Media. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS
modifikasi cair dengan inokulum hasil optimasi. Variasi pH media yang
digunakan adalah 5, 6, 7, dan 8. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam.
Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar
protein menunjukkan pH media optimum isolat BAL strain B134.
Penentuan pengaruh kadar laktosa. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL
media MRS modifikasi cair dengan inokulum dan media hasil optimasi. Variasi
kadar laktosa yang digunakan adalah 1%, 2%, dan 3%. Media diinkubasi pada
37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas βgalaktosidase dan kadar protein menunjukkan kadar laktosa optimum isolat BAL
strain B134.
Penentuan waktu pertumbuhan. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL
media MRS modifikasi cair dengan inokulum bakteri, pH media, dan kadar
laktosa hasil optimasi. Variasi waktu inkubasi yang digunakan adalah 0, 6, 12, 18,

4
24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, dan 72 jam. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48
jam. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein
menunjukkan waktu inkubasi optimum isolat BAL strain B134.
Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)
Inokulum isolat BAL strain B134 diambil sebanyak inokulum hasil
optimasi dengan kerapatan optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2.400 mL media
MRS modifikasi cair steril dan diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi
selama waktu pertumbuhan optimum, sel dipanen. Media berisi bakteri yang telah
dipanen kemudian disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 9500 rpm pada
suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan buffer fosfat 0.05 M pH
6.5 sebanyak dua kali. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan buffer
fosfat 0.05 M pH 6.5. Kemudian, pemecahan sel dilakukan dengan sonikator pada
50 kHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang dihasilkan merupakan
ekstrak kasar β-galaktosidase.
Pengendapan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987)
Sebanyak 10 mL β-galaktosidase kasar diendapkan dalam amonium sulfat.
Penambahan amonium sulfat dilakukan secara bertahap. Konsentrasi amonium
sulfat yang digunakan yaitu 0-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%,
dan 60-70%. Larutan kemudian diaduk dengan magnetic stirrer secara perlahan
selama 20 menit kemudian diinkubasi dalam cool room selama 1 jam. Setelah 1
jam, larutan disentrifus dengan kecepatan 9.500 rpm selama 15 menit pada suhu
4ºC. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer PO4 0.05 M pH
6.5. Kejenuhan amonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas
spesifik yang tinggi.
Jumlah amonium sulfat (gram/liter) =
Keterangan:
S1
: Konsentrasi awal amonium sulfat
S2
: Konsentrasi akhir amonium sulfat
NB: Nilai 533 menunjukkan bahwa dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter
untuk membuat larutan jenuh 100%.
Pemurnian dengan Dialisis
Tabung dialisis diisi 2 mL β-galaktosidase hasil pengendapan amonium
sulfat. Tabung kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang
diletakkan diatas stirer dan disimpan dalam cool room bersuhu 4ºC selama 15 jam.
Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009)
Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara
sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam
tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian
ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida (oNPGal) 2 mg/ml dan
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5 ditambahkan 1 mL
Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan mengukur
absorban pada λ=420 nm.
Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP dari 0-2.5 mM
yang dilarutkan dalam buffer PO4 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M

5
pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 5
menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M. Larutan di vortex
dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada λ=420 nm.
Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai banyaknya enzim
yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat oNPGal per menit
pada kondisi percobaan.
Karakterisasi β-Galaktosidase
Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase.
Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan buffer asetat, fosfat dan tris-HCl
pada variasi pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0. Pengujian aktivitas
dilakukan pada suhu 37ºC selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji
aktivitas β-galaktosidase menunjukkan pH optimum β-galaktosidase. Stabilitas βgalaktosidase terhadap pH diuji dengan menginkubasikan β-galaktosidase pada
larutan buffer pada berbagai pH (5-8 dengan selang 0.5) selama 1 jam. Setelah
inkubasi selesai, larutan β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam
penangas es. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis
β-galaktosidase pada pH optimum. Nilai aktivitas β-galaktosidase tersisa
dinyatakan dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan
kontrol (β-galaktosidase tanpa perlakuan).
Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Uji
aktivitas β-galaktosidase dengan variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55 ºC
dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas dilakukan
berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji
aktivitas β-galaktosidase menunjukkan suhu optimum β-galaktosidase. Stabilitas
β-galaktosidase terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan β-galaktosidase
pada berbagai suhu (25-55oC dengan selang 5oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi
selesai, β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas
β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada
pH dan suhu optimum. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase
dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa
perlakuan).
Pengaruh kation terhadap aktivitas β-galaktosidase. Logam yang
digunakan untuk pengujian pengaruh kation adalah Hg+, Cu2+, Ca2+, Co2+, Mg2+,
Mn2+, dan Zn2+ dengan konsentrasi 0.1 M. Sebanyak 100 µL kation dengan
konsentrasi 0.1 M ditambahkan dalam campuran substrat-buffer-enzim, dan
diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis β-galaktosidase.
Penghambatan atau peningkatan aktivitas β-galaktosidase oleh kation dinyatakan
dalam persentase aktivitas β-galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya
(tanpa penambahan kation logam).
Penentuan Kinetika Enzim. Analisis KM dan Vmaks dilakukan pada enzim
kasar dan enzim hasil dialisis. Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 pada pH
optimum, 100 µl enzim, dan 200 µl substrat oNPGal yang diujikan pada
konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, dan 5 mg/ml diinkubasi selama 5-30 menit.
Setiap 5 menit, sebanyak 1000 µl Na2CO3 1 M ditambahkan agar reaksi berhenti
kemudian larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada λ=420
nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan

6
kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal
dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut.
Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks.
Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X
dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan
pembentukan produk persatuan waktu.
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Pengukuran Kurva Standar. Standar protein yang digunakan adalah
bovine serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi dari 0.005-1.00 mg/mL
menggunakan pelarut NaCl 0.15 M. Sebanyak 20 µl BSA ditambahkan dalam 1
mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Pengukuran Sampel. Sebanyak 20 µl β-galaktosidase ditambahkan dalam
1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit.
Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.
Pembuatan Blanko. Sebanyak 40 µl NaCl 0.15 M ditambahkan dalam 1
mL lautan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban
larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil

Aktivitas spesifik βgalaktosidase (U/mg)

Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL strain B134
Inokulum isolat BAL strain B134 yang ditumbuhkan dalam MRS
modifikasi paling optimum adalah 2% dengan aktivitas spesifik β-galaktosidase
sebesar 8.265 U/mg (Gambar 1). Keadaan pH MRS modifikasi juga
mempengaruhi aktivitas spesifik dari β-galaktosidase. Nilai pH 5 memiliki
aktivitas spesifik sebesar 75.074 U/mg (Gambar 2). Konsentrasi laktosa 2% dalam
MRS modifikasi menghasilkan aktivitas spesifik β-galaktosidase tertinggi sebesar
20.468 U/mg (Gambar 3).
1.976 ±
0.044

2.5
2.0

1.556 ±
0.041

1.5
1.0

0.540 ±
0.014

0.5
0.0
1%

2%

5%

[Inokulum B134] (%)

Gambar 1 Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik
β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134

7

Aktivitas spesifik βgalaktosidase (U/mg)

80
70
60
50
40
30
20
10
0

70.644 ±
3.036

58.466 ±
11.914

43.040 ±
9.555

5

29.636 ±
8.278

6

7

8

pH media

Gambar 2 Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase
dari isolat BAL strain B134
20.631 ±
2.785

Aktivitas spesifik
β-galaktosidase (U/mg)

25
20
15
10
5

2.533 ±
0.993

2.687 ±
0.212

0
1%

2%
[Laktosa]

3%

Gambar 3 Pengaruh laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari
isolat BAL strain B134

18

2.5
2.25
2
1.75
1.5
1.25
1
0.75
0.5
0.25
0

16
14
12
10
8
6
4
2
0
0

6

12

18

24

30

36

42

Jam ke-

Gambar 4 Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134
Keterangan

: Jumlah sel

: Aktivitas β-galaktosidase (U)

Aktivitas
β-galaktosidase (U)

Jumlah Sel (104)

Waktu Inkubasi Optimum Produksi β-Galaktosidase
Aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan hingga jam ke 24.
Aktivitas tertinggi sebesar 17.333 U/mL diperoleh pada jam ke 24 dengan OD
sebesar 1.989 yang setara dengan 7.615 10-8 sel.

8
Purifikasi Parsial β-Galaktosidase dari Isolat BAL Strain B134
Enzim kasar memiliki aktivitas spesifik sebesar 14.638 U/mg dengan
rendemen sebesar 100%. Pengendapan amonium sulfat dioptimasi secara
bertingkat sehingga diperoleh fraksi dengan aktivitas tertinggi adalah fraksi 4050% dengan aktivitas spesifik sebesar 18.656 U/mg. β-galaktosidase hasil
pengendapan amonium sulfat 50% jenuh memiliki aktivitas spesifik sebesar
28.170 U/mg dengan rendemen sebesar 19.576%. Kemurnian β-galaktosidase
setelah pengendapan dengan amonium sulfat 50% jenuh sebesar 1.924 kali. βgalaktosidase setelah perlakuan dialisis memiliki aktivitas spesifik sebesar 45.828
U/mg dengan rendemen sebesar 3.206%. Kemurnian setelah dialisis adalah 3.131
kali.
Tabel 1 Aktivitas β-galaktosidase pada tahapan purifikasi parsial
Tahapan
Enzim Kasar1
Pengendapan
amonium
sulfat
50%
jenuh
Dialisis
1

Volume
enzim
(mL)
40

Total
aktivitas
(U)
1530.543

Total
protein
(mg)
104.562

Aktivitas
spesifik
(U/mg)
14.638

Rendemen
(%)

Kemurnian
(kali)

100

1.000

3.26

299.617

10.636

28.170

19.576

1.924

1.32

49.075

1.071

45.828

3.206

3.131

Berasal dari 8 gram bobot basah pelet Isolat BAL strain B134

Karakterisasi β-Galaktosidase
Pengaruh Suhu
Gambar 5 menunjukkan bahwa aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh
suhu. Pada suhu 25ºC hingga 45ºC, aktivitas β-galaktosidase mengalami
peningkatan tetapi aktivitas menurun pada suhu 50-55ºC.
Aktivitas β-galaktosidase (U/mL)

30

21.403 ±
0.27

25

15.899 ± 16.907 ±
0.27
0.38

20
15

25.667 ± 23.729 ±
0.27
1.04
20.977 ±
0.11

9.465 ±
0.27

10
5
0
25

30

35

40

45

50

55

Suhu (ºC)

Gambar 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase
Pengaruh pH
Aktivitas β-galaktosidase meningkat pada pH 4.5 hingga 6 lalu mengalami
penurunan pada pH 6.5 hingga 8.5 (Gambar 6). Aktivitas tertingginya berada pada
pH 6 dengan nilai aktivitas sebesar 19.814 U/mL.

9

Aktivitas β-galaktosidase (U/mL)

25
18.961 ±
0.55

20

19.814 ±
0.66 18.496 ±
0.55 17.853 ±
0.27
12.140 ±
0.10

15

10

5.550 ±
1.32

6.093 ±
0.11

1.829 ±
0.12

5
0.400 ±
0.004
0
4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

pH

Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase
Stabilitas β-Galaktosidase
Kestabilan β-galaktosidase terhadap suhu ditunjukkan pada Gambar 7.
Setelah inkubasi 1 jam, aktivitas β-galaktosidase tersisa pada suhu 30ºC sebesar
49.70%. Kestabilan β-galaktosidase terhadap pH ditunjukkan pada gambar 8.
Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa setelah 1 jam inkubasi berkisar antara
50.98%. Kestabilan aktivitasnya berada pada pH 4.5.

Aktivitas β-galaktosidase tersisa (%)

60

47.90 ±
0.43

50

44.88 ±
4.70
37.03 ±
2.14

40
26.46 ±
0.00

30
20

12.87 ±
3.84

8.94 ±
0.00

10

-0.72 ±
0.00

0
25
-10

30

35

40

45

50

55

Suhu ˚C

Gambar 7 Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase

Aktivitas β-galaktosidase tersisa
(%)

10
60 50.98 ±
42.49 ±
0.28
37.79 ±
39.75 ± 0.55 42.88 ±
50
36.23 ± 2.77 35.05 ± 1.11
1.11 33.49 ±
32.71 ± 2.77
3.32
5.53
40
2.21
30
20
10
0
4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

pH

Gambar 8 Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase
Pengaruh Logam
Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase ditunjukkan pada
Gambar 9. Penambahan kation Co2+, Zn2+, Mn2+, dan Mg2+ meningkatkan
aktivitas β-galaktosidase sedangkan kation Ca2+,Cu2+, dan Hg2+ menghambat
aktivitas β-galaktosidase.
156.30 ±
1.27

Aktivitas β-galaktosidase relatif (%)

180
160
140
120

100.00 ±
0.00

100

118.40 ± 120.19 ±
1.79
0.35

114.14 ±
2.89

85.44 ±
0.42

80
60
40

1.65 ±
0.06

3.09 ±
0.12

20
0
Kontrol

Ca2+

Co2+

Zn2+

Cu2+

Mn2+

Hg2+

Mg2+

Kation

Gambar 9 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase

Parameter Kinetik
Kurva Michaelis-Menten menunjukkan hubungan antara konsentrasi
oNPGal dengan kecepatan β-galaktosidase hasil purifikasi parsial (Gambar 8).
Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari kurva Line-Weaverburk (Gambar 9).
Persamaan Line-Weaverburk yang diperoleh adalah y=1.200x+0.305 dengan nilai
r2 sebesar 0.963. Dari persamaan tersebut, nilai Km diketahui sebesar 3.934 mM
dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit.

11
4

V (µmol/menit)

3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

5

10

[Substrat] (mM)

Gambar 8 Kurva Michaelis Menten
4.5
y = 1.2007x + 0.3058
R² = 0.9637

4
3.5

1/V

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

1/S

Gambar 9 Kurva Lineweaver-burk
Pembahasan
Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL Strain B134
Konsentrasi inokulum mempengaruhi aktivitas spesifik β-galaktosidase.
Semakin tinggi konsentrasi inokulum yang digunakan akan melipatgandakan
jumlah bakteri sehingga meningkatkan hidrolisis laktosa. Namun, konsentrasi
inokulum yang terlalu tinggi akan menyebabkan bakteri berkompetisi untuk
memperoleh nutrisi yang terkandung dalam media. Akibatnya aktivitas βgalaktosidase mengalami penurunan.
Nilai pH media dan konsentrasi laktosa juga berpengaruh terhadap
aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al 2007). Bakteri Asam Laktat (BAL) strain
B134 ditumbuhkan dalam media MRS modifikasi (de Man Rogrosa Sharpe) (de
Man et al 1960). Glukosa pada MRS digantikan oleh laktosa. Laktosa merupakan
sumber karbon terbaik untuk menginduksi produksi β-galaktosidase. Rendahnya
laktosa dalam media kultur menurunkan aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al
2005).

12
Waktu inkubasi B134 terbaik ditentukan berdasarkan aktivitas tertinggi βgalaktosidase. Saat fase eksponensial, sel akan melakukan penggandaan minimal
dua kali lipat dari jumlah sel sebelumnya. Kebutuhan nutrisi meningkat selama
fase ini. Laju hidrolisis laktosa pun mengalami peningkatan. Pada akhir fase
eksponensial, pertumbuhan bakteri mulai melambat akibat ketersediaan nutrisi
yang menurun (Yuwono 2006). Gambar 4 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase
tertinggi tercapai saat fase eksponensial.
Produksi dan Purifikasi Parsial β-Galaktosidase
Isolat BAL strain B134 ditumbuhkan dalam MRS modifikasi yang telah
dioptimasi. B134 diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Pemanenan sel
dilakukan menggunakan sentrifus pada kecepatan 9500 rpm selama 15 menit pada
suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase. β-galaktosidase
selanjutnya dimurnikan dengan amonium sulfat. Pemisahan protein saat
pengendapan dengan amonium sulfat berdasarkan sifat ioniknya selain itu enzim
juga akan mengalami pemekatan (Yuanita et al. 2010).
Tahap akhir dari purifikasi parsial adalah dialisis. Tabung dialisis memiliki
membran semipermeabel yang memungkinkan senyawa berukuran lebih kecil dari
10 kDA (kilo Dalton) dapat keluar dari membran, sedangkan β-galaktosidase yang
berukuran 432 kDA akan tertahan dalam tabung. Senyawa yang keluar dari tabung
dialisis seperti ion logam, inhibitor, peptida kecil.
Enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari berbagai tahapan purifikasi
parsial diuji aktivitasnya dan diukur pada λ= 420 nm. Prinsip pengujiannya adalah
reaksi antara β-galaktosidase dengan substrat oNPG (o-nitofenil-β-D-galaktosida)
akan memutus ikatan 1,4-β-D galaktosa yang akan menghasilkan produk oNP (onitrofenil) yang berwarna kuning dan galaktosa. Reaksi dihentikan menggunakan
Na2CO3 setelah inkubasi 5 menit pada suhu 37ºC. Produk oNP yang terbentuk
diukur dengan spektrofotometer λ=420 nm. Aktivitas spesifik merupakan unit
enzim yang terkandung dalam miligram protein. Aktivitas spesifik β-galaktosidase
B134 sebesar 45.828 U/mg setelah pemurnian dialisis. Sebagai perbandingan,
aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Lactobacillus lactis pada pemurnian yang
sama sebesar 55.62 U/mg (Mozumder et al. 2012).
Karakterisasi β-Galaktosidase
Kerja β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 3
menunjukkan aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Aktivitas βgalaktosidase mengalami peningkatan seiring naiknya suhu karena energi kinetik
yang dihasilkan enzim semakin meningkat. Gerak vibrasi, translasi, serta rotasi
enzim semakin cepat. Peningkatan gerak enzim meningkatkan terjadinya
tumbukan antara enzim dengan substrat. Sebaliknya, suhu tinggi menyebabkan
enzim mengalami perubahan konformasi sisi aktif sehingga aktivitasnya
mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).
Perubahan konformasi tersebut menyebabkan rusaknya interaksi non
kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi
elektrostatik) yang menjaga strutur 3D enzim. Akibatnya enzim mengalami
denaturasi yang merubah struktur lipatan enzim. Stuktur enzim akan terbuka
dibagian permukaan sehingga sisi aktifnya berubah dan aktivitas enzim
mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).

13
Aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh pH. Peningkatan aktivitas βgalaktosidase sebelum mencapai aktivitas optimum disebabkan adanya interaksi
antara H+ dari lingkungan dengan residu asam amino yang terletak pada sisi aktif
enzim. Interaksi tersebut menyebabkan peningkatan keadaan ionisasi sisi aktif
enzim. Hal ini menyebabkan sifat katalitik enzim untuk mengikat substrat
meningkat. Ketika mencapai pH optimum, keadaan ionisasi berada pada keadaan
yang tepat sehingga aktivitas enzim mencapai nilai tertinggi. Aktivitas enzim pada
pH yang basa mengalami penurunan karena interaksi antara OH- dari lingkungan
dengan residu asam amino akan menurunkan sifat katalitik enzim dan
menyebabkan enzim terdenaturasi (Nelson dan Cox 2008).
Kestabilan enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 7 dan 8
menunjukkan kestabilan β-galaktosidase pada suhu 30ºC dan pH 4.5. Faktor yang
mempengaruhi kestabilan enzim seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik,
interaksi ion, dan jembatan sulfida. Stabilnya enzim terhadap panas karena
terbentuknya konformasi terntentu yang tahan terhadap denaturasi. Konformasi
tersebut terbentuk karena pelipatan asam amino (Yuningtyas 2011).
Enzim membutuhkan koenzim dan aktivator untuk meningkatkan sifat
katalitiknya. Ion logam merupakan aktivator yang dibutuhkan enzim untuk
mengaktivasi kompleks substrat-enzim (Bintang 2010). Ion logam akan mengikat
substrat pada sisi pemotongan. Ion logam juga dapat menstabilkan konformasi
aktif enzim (Baehaki et al. 2008).
Peningkatan aktivitas enzim terjadi karena ion logam menjadi bagian
integral dari sisi aktif enzim, merubah konstanta keseimbangan reaksi enzimatis,
merubah muatan listrik, menghambat ion inhibitor, dan menukar ion yang kurang
efektif pada sisi aktif enzim atau substrat (Richardson dan Hyslop 1985).
Natarajan et al (2012) menunjukkan bahwa Mg2+ dan Mn2+ meningkatkan
aktivitas β-galaktosidase dari Bacillus sp. Penurunan aktivitas enzim terjadi
karena ion logam bertindak sebagai inhibitor. Kekuatan ion logam akan
mempengaruhi konformasi dari enzim. Ion Cu2+ dan Hg2+ bertindak sebagai
inhibitor irreversibel yang membentuk ikatan kovalen dengan gugus prostetik di
sisi aktif enzim (Bintang 2010).
Faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah konsentrasi substrat.
Peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kerja enzim hingga
mencapai titik steady state yaitu saat kecepatan enzim tetap meskipun konsentrasi
substrat bertambah (Nelson dan Cox 2008). Nilai Km dari β-galaktosidase sebesar
3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit. Sebagai perbandingan, nilai
Km dan Vmaks β-galaktosidase dari Lactobacillus plantarum NCIMB sebesar
3.934 mM dan 3.278 µmol/menit (Kara 2004).

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pertumbuhan terbaik isolat BAL strain B134 tercapai pada inokulum 2%
yang ditumbuhkan pada media MRS yang mengandung 2% laktosa, pH media 5,
dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. β-galaktosidase dari Isolat BAL strain
B134 berhasil dimurnikan secara parsial. Aktivitas spesifik β-galaktosidase
setelah purifikasi parsial sebesar 45.828 U/mg dengan kemurnian sebesar 3.131

14
kali. Aktivitas β-galaktosidase optimum pada suhu 45ºC dan pH 6. Aktivitas βgalaktosidase stabil pada pH 5.5 dan suhu 30ºC. Pengaruh kation Co2+, Zn2+, Mn2+,
Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M terhadap aktivitas β-galatosidase bersifat aktivator
sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada konsentrasi 0.1M menghambat aktivitas βgalaktosidase. Nilai Km dan Vmaks dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan
3.278 µmol/menit.
Saran
Penelitian lebih lanjut mengenai β-galaktosidase dapat dilakukan
pemurnian β-galaktosidase menggunakan kromatografi filtrasi gel, amobilisasi βgalaktosidase, dan potensi β-galaktosidase dapat diaplikasikan untuk
menghasilkan produk susu rendah laktosa.

DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2008. Kenali Intoleransi Lebih
Lanjut. InfoPOM Vol 9 No.1:1-3.
Baehaki Ace, Maggy T. Suhartono, Nurheni Sri Palupi, dan Tati Nurhayati. 2008.
Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas
aeruginosa. Jurnal. Teknol Dan Industri Pangan 19(1):80-87.
Bintang, Maria. 2010. Biokimia: Teknik penelitian. Jakarta: EGC.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding .
Anal Biochem 72:248-254.
Chooklin Supasit, Lupong Kaewsichan, Jasade Kaewsrichan. 2011. Potential use
of Lactobacillus casei TISTR 1500 for the bioconversion from palmyra sap and
oil palm sap to lactic acid. Electronical Journal of Biotechnology 14 (5).
De Man, J. C, Rogosa M, Sharpe Elisabeth. 1960. A Medium for the Cultivation
of Lactobacilli. J.Appl.Bact. 23:130-135.
Fox PF, McSweeney PLH. 1981. Dairy Chemistry and Biochemistry. London:
Blackie Academic and Professional.
Gary RK, Kindell SM. 2005. Quantitative assay of senescence-associated betagalactosidase activity in mammalian cell extracts. Anal Biochem. 343 (3):32934.
Hames B.D. dan Hoper N.M. 2000. Biochemistry: The instant notes. 2nd Ed.
Hongkong: SpringerVerlag.
Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2005. Production of β-galactosidase by
Bifidobacteria as influenced by various culture conditions. International
Journal of Food Microbiology 104:197-206.
Hegar B, Buller H.A. 1995. Breath hydrogen test in lactose malabsorption.
Pediatric Indonesia 35: 161-171.
Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2007. Cultural condition affecting the growth
and production of β-galactosidaseby Bifidobacterium longum CCRC 15708 in a
jar fermenter. Intenational Journal of Food Microbiolgy 116:186-189.
Kara Firat. 2004. Release and characterization of beta-galactosidase from
Lactobacillus plantarum [tesis]. Turki (TR): Middle East Technical University.

15
Liu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating βgalaktosidase from Enterobacter cloaceae B5. Process Biochemistry 44:232236.
Mahoney R.R. 2004. Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose
hydrolysis: a review. Food Chem 63:147-154.
Mozumder N H M R, Akhtaruzzaman M, Bakr M A, Zohra Fatema Tuj. 2012.
Study on isolation and partial purification of lactase (β-Galactosidase) enzyme
from Lactobacillus bacteria isolated from yogurt. J. Sci. Res. 4(1):239-249.
Natarajan Jayashree et al. 2012. Isolation and Characterization of β-Galactosidase
Producing Bacillus sp. from Diary Effluent. World Appl. Sci. J. 17(11):14661474.
Nelson, David L dan Cox Michael M. 2008. Lehninger: Principles of
Biochemistry. New York: W.H Freeman and Company.
Ranciaro Alessia, Tishkoff Sarah A. 2010. Population Genetic: Evolutionary
history of lactose tolerance in Africa. NIH Consensus Development
Conference: 2010 Feb 22-24; Maryland. Maryland (US).
Richardson T dan DB Hyslop. 1985. Enzim dalam O.R. New York: Bekker Inc.
Rusynyk AR, Still CD. 2001. Lactose intolerance. JAOA 101:10-12.
Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York: RR Doneley and Sons.
Sumathy R, Vijayalakshmi M, Deecaraman M. 2012. A study on β-galaktosidase
of Lactobacillus sp. from milk product and its applications. International
Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 3:138-148.
Tehuteru Edi Setiawan. 1999. Malabsorpsi laktosa pada anak. J. Kedokter Trisakti
18(3):139-144.
Tossaveinen O. 2003. Losing the lactose. Dairy Industries International 68:23-26.
Wang D, Sakakibara M. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in
sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem 4:255261.
Wierzbicki LE, Kosikowski FV. 1973. Lactase potential of various microorganism
grown in whey. J Dairy Sci 56:26-29.
Yuanita Leny, Aline Puspita, Suzana Surodjo, Sri Handayati , Farid Al Amin, Arif
Budiman. 2005. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Fitase Bacillus subtilis
dari Holiwood Gresik. Berk Penel Hayati 12:113-119.
Yuningtyas, Sitaresmi. 2011. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Enterobacter cloaceae serta Potensinya terhadap Susu UHT
[tesis]. Indonesia (ID): Institut Pertanian Bogor.
Yuwono, T. 2006. Biokimia Molekuler. Jakarta: Erlangga.

16

LAMPIRAN
Lampiran 1 Kurva Standar oNP

Absorban

µmol oNP
0.000
0.115
0.230
0.460
0.690
0.920
1.150
2.300
2.875
4.600
5.750

A
0.000
0.013
0.018
0.058
0.087
0.101
0.154
0.306
0.436
0.583
0.721

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

y = 0.1290x + 0.0012
R² = 0.9915
0

2

4
6
µmol ONP

8

Lampiran 2 Kurva standar protein

Absorban

[BSA] (mg/mL)
0.000
0.005
0.010
0.050
0.100
0.200
0.400
0.800
1.000
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

Absorban
0.000
0.002
0.012
0.055
0.123
0.189
0.399
0.763
0.891

y = 0.9097x + 0.0112
R² = 0.9969

0

0.5
1
[BSA] (mg/mL)

1.5

17
Lampiran 3 Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum
Penentuan Konsentrasi Inokulum Isolat BAL strain B134
Inokulum
1%
2%
5%

Aktivitas (U)
1
1.609
1.243
1.142

2
1.552
1.273
1.142

Total protein (mg)
1
3.038
0.639
0.720

2
2.824
0.635
0.747

Aktivitas spesifik
(U/mg)
1
2
0.530
0.550
1.945
2.006
1.585
1.528

Aktivitas
spesifik rerata ±
SD
0.540 ± 0.014
1.976 ± 0.044
1.556 ± 0.041

Penentuan pH Media MRS
pH

Aktivitas (U)
1
2.241
1.009
1.373
1.280

5
6
7
8

2
2.227
1.009
1.336
1.261

Total protein (mg)
1
0.031
0.028
0.027
0.054

2
0.033
0.020
0.020
0.036

Aktivitas spesifik
Aktivitas
(U/mg)
spesifik rerata ±
SD
1
2
72.791 68.497 70.644 ± 3.036
36.283 49.797 43.040 ± 9.555
50.042 66.891 58.466 ± 11.914
23.783 35.489 29.636 ± 8.278

Penentuan Konsentrasi Laktosa dalam Media MRS
[Laktosa]
1%
2%
3%

Aktivitas (U)
1
1.609
1.243
1.142

2
1.552
1.273
1.142

Total protein (mg)
1
3.038
0.639
0.720

2
2.824
0.635
0.747

Aktivitas spesifik
(U/mg)
1
2
0.530
0.550
1.945
2.006
1.585
1.528

Aktivitas
spesifik rerata ±
SD
0.540 ± 0.014
1.976 ± 0.044
1.556 ± 0.041

Lampiran 4 Penentuan waktu produksi optimum
Jam ke-

OD

Jumlah Sel (sel/mL)

0
6
12
18
24
30
36
42

0.016
0.327
1.900
1.974
1.989
2.016
1.984
1.950

6.1257 10-10
1.2519 10-8
7.2743 10-8
7.5576 10-8
7.615 10-8
7.7184 10-8
7.5959 10-8
7.4657 10-8

[ONP]
µmol
0.000
0.452
2.960
4.902
8.667
7.271
5.262
4.510

Aktivitas
(U/mL)
0.000
0.904
5.919
9.803
17.333
14.543
10.524
9.020

Aktivitas
(U)
0.000
0.832
6.630
9.999
16.467
12.652
9.472
8.930

Lampiran 5 Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase
Optimasi suhu β-galaktosidase
Suhu
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0

[oNP] (µmol)
1
4.636
7.814
8.357
10.605
12.930
12.233
10.527

2
4.829
8.085
8.550
10.798
Suhu
10.450

Aktivitas (U/mL)
1
2
9.271
9.659
15.628
16.171
16.713
17.101
21.209
21.597
25.860
25.473
24.465
22.992
21.054
20.899

Aktivitas rerata ±
SD
9.465 ± 0.27
15.899 ± 0.38
16.907 ± 0.27
21.403 ± 0.27
25.667 ± 0.27
23.729 ± 1.04
20.977 ± 0.11

18
Optimasi pH β-galaktosidase
pH
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5

[oNP] (µmol)
1
2
4.636
4.829
7.814
8.085
8.357
8.550
10.605
10.798
12.930
12.736
12.233
11.496
10.527
10.450
4.636
4.829
7.814
8.085

Aktivitas (U/mL)
1
2
9.271
9.659
15.628
16.171
16.713
17.101
21.209
21.597
25.860
25.473
24.465
22.992
21.054
20.899
9.271
9.659
15.628
16.171

Aktivitas rerata ±
SD
9.465 ± 0.27
15.899 ± 0.38
16.907 ± 0.27
21.403 ± 0.27
25.667 ± 0.27
23.729 ± 1.04
20.977 ± 0.11
9.465 ± 0.27
15.899 ± 0.38

Lampiran 6 Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase
Stabilitas suhu β-galaktosidase
Aktivitas (U/mL)
1
2
25.0
2.605
4.000
30.0
12.372
12.217
35.0
12.372
10.667
40.0
9.116
9.891
45.0
6.791
6.791
50.0
2.295
2.295
55.0
-0.186
-0.186
Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL
Suhu

Aktivitas tersisa (U/mL)
1
2
10.15
15.58
48.20
47.60
48.20
41.56
35.52
38.54
26.46
26.46
8.94
8.94
-0.72
-0.72

Aktivitas tersisa ±
SD
12.87 ± 3.84
47.90 ± 0.43
44.88 ± 4.70
37.03 ± 2.14
26.46 ± 0.00
8.94 ± 0.00
-0.72 ± 0.00

Aktivitas tersisa (%)
1
2
51.17
50.78
31.14
34.27
34.27
38.18
35.84
39.75
32.71
37.40
38.97
40.53
42.88
42.10
43.66
42.10
29.58
37.40

Aktivitas tersisa
rerata ± SD
50.98 ± 0.28
32.71 ± 2.21
36.23 ± 2.77
37.79 ± 2.77
35.05 ± 3.32
39.75 ± 1.11
42.49 ± 0.55
42.88 ±1.11
33.49 ± 5.53

Stabilitas pH β-galaktosidase
Aktivitas (U/mL)
1
2
4.5
10.140
10.062
5.0
6.171
6.791
5.5
6.791
7.566
6.0
7.101
7.876
6.5
6.481
7.411
7.0
7.721
8.031
7.5
8.496
8.341
8.0
8.651
8.341
8.5
5.860
7.411
Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL
pH

Lampiran 7 Pengaruh Logam terhadap aktivitas enzim kasar
Kation
Kontrol
Ca2+
Co2+
Zn2+
Cu2+
Mn2+
Hg2+
Mg2+

Aktivitas β-galaktosidase
(U/mL)
1
2
28.341
28.186
24.465
24.000
33.767
33.302
32.992
34.233
0.803
0.896
43.535
44.310
0.431
0.478
34.078
31.597

Aktivitas β-galaktosidase
tersisa (%)
1
2
100.000
100.000
85.738
85.149
118.651
118.152
118.925
121.452
3.006
3.179
155.403
157.206
1.607
1.694
116.182
112.101

Aktivitas βgalaktosidase
tersisa rerata ± SD
100.00 ± 0.00
85.44 ± 0.42
118.40 ± 0.35
120.19 ± 1.79
3.09 ± 0.12
156.30 ± 1.27
1.65 ± 0.06
114.14 ± 2.89

19
Lampiran 8 Kinetika Kimia Enzim Purifikasi parsial
Dari persamaan y=1.200x+0.305 diperoleh nilai 1/Vmaks = 0.305 dan
nilai Km/Vmaks = 1.200. Maka nilai Vmaks = 3.278 µmol/menit dan Km sebesar
3.934 mM.
[S] (mg/mL)
0.100
0.500
1.000
2.000
4.000

[S] (mM)
0.332
1.660
3.320
6.639
13.278

1/S
3.012
0.602
0.301
0.151
0.075

120

1/V
3.846
1.541
0.531
0.310
0.275

y = 3.633x - 0.8127
y = 3.2307x + 10.055 R² = 0.9943
oNPGal 0.1 mg/mL
R² = 0.9441

100

y = 1.8443x + 14.47
R² = 0.8305

80
[oNP] (µmol)

V (µmol/menit)
0.26
0.649
1.884
3.23
3.633

oNPGal 0.5 mg/mL
oNPGal 1 mg/mL

60

oNPGal 2 mg/mL
40

y = 0.6494x + 1.6956
R² = 0.9689

20

oNPGal 4 mg/mL

y = 0.2601x + 1.2664
R² = 0.9203

0
0

5

10

-20

15

20

25

30

Waktu (menit)

Kurva linier oNP vs waktu
Lampiran 9 Hasil pemurnian β-galaktosidase dengan pengendapan amonium
sulfat
Fraksi

0-10%
10-20%
20-30%
30-40%
40-50%
50-60%
60-70%

[ONP]
µmol
1.060
2.138
2.247
2.479
18.744
39.597
6.946

Aktivitas
(U/mL)

Aktivitas
(U)

[Protein]
mg/mL

2.121
4.276
4.493
4.958
37.488
79.194
13.891

2.121
4.148
5.841
5.652
37.488
79.194
13.891

0.179
0.283
0.294
0.298
2.009
5.978
3.074

Total
Protein
(mg)
0.179
0.275
0.383
0.339
2.009
5.978
3.074

Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
11.851
15.089
15.263
16.656
18.656
13.248
4.520

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten, 7 Januari 1992 dari ayah Lusi Hartono dan Ibu
Eny Suwartiningsih. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Tambun Selatan
tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di
Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Selama masa perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus sebagai
bendahara umum 1 UKM Gentra Kaheman tahun 2011-2012 dan 2012-2013, dan
staff biologi molekuler CREBS (Community of Reasearch and Education in
Biochemistry) tahun 2011-2012. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum
biokimia umum tahun ajaran 2012-2013 dan asisten praktikum pengantar
penelitian biokimia tahun ajaran 2013.