Purifikasi, amobilisasi, dan karakterisasi β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta potensinya terhadap susu UHT

PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI
β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae
SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT

SITARESMI YUNINGTYAS

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi, Amobilisasi, dan
Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae dan Potensinya terhadap
Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, April 2011
Sitaresmi Yuningtyas
NIM G851090041

ABSTRACT
SITARESMI YUNINGTYAS. Purification, Immobilization, and Characterization
of β-Galactosidase from Enterobacter cloacae with Potentiality to UHT Milk.
Under direction of MARIA BINTANG and TATIK KHUSNIATI.
Enzymatic hydrolysis of lactose is an important biotechnological process
because the hydrolyzed products can be consumed by people with lactose
intolerance. The aim of this study was purification, immobilization, and
characterization of β-galactosidase from E. cloacae. This research also studied the
hydrolysis of lactose in UHT milk. The stages of this research were production
and purification β-galactosidase from E. cloacae; characterization of enzyme;
optimization of immobilization formula; and hydrolisis of UHT milk. The βgalactosidase from E. cloacae was purified and showed a purification of 30.26fold, a yield of about 6.18%, and a specific activity of 101.781 U/mg. Free and
immobilized enzyme exhibited maximum activity at an optimal pH of 7.0 and an
optimum temperature of 40°C. This enzyme was activated by Co2+, Mn2+, and
Mg2+; however, was inhibited by Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+. KM for free and
immobilized β-galactosidase were 0.434 and 2.068 mM, respectively. Optimal
formulation of cell and enzyme immobilization were consist of 10% (w/v) cell

with 5% (w/v) sodium alginate and 10% (v/v) purified enzyme with 5% (w/v)
sodium alginate, respectively. This researh found that entrapped β-galactosidase
was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (28.09%) after 6 hours in
batch process as compared to entrapped E. cloacae (22.01%) after 18 hours. Free
β-galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (78.20%)
after 6 hours as compared to free E. cloacae (55.14%) after 18 hours.
Keyword: β-galactosidase, Enterobacter cloacae, purification, immobilization

RINGKASAN
SITARESMI YUNINGTYAS. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi βGalaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT.
Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TATIK KHUSNIATI.
Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti
lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah
disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan
ikatan β-(1,4)-glikosidik dengan proporsi 4,7% dari total susu. Laktosa merupakan
zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus
dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim β-galaktosidase agar dapat
diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh
tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Orang-orang yang memiliki
ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim

β-galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus disebut penderita
laktosa intoleran.
Salah satu solusi untuk penderita laktosa intoleran adalah memodifikasi susu
dengan cara menghidrolisis laktosa secara enzimatik menggunakan βgalaktosidase. Penggunaan enzim dalam keadaan bebas yakni terlarut dalam air,
kurang menguntungkan dalam skala industri karena enzim hanya dapat digunakan
untuk satu kali reaksi. Salah satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai
berulang adalah menggunakan teknik amobilisasi. Sel atau enzim yang teramobil
sering digunakan pada industri karena dapat digunakan secara terus menerus
sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi.
Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan oleh Enterobacter colacae. Bertolak
dari hal tersebut maka penelitian ini menggali potensi β-galaktosidase dari E.
cloacae. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan
karakterisasi β-galaktosidase dari E. cloacae. Selain itu, untuk mengetahui
aktivitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E.
cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase teramobil.
Tahap awal dari penelitian ini adalah penentuan waktu produksi βgalaktosidase optimum dari E. cloacae. Selanjutnya dilakukan produksi βgalaktosidase. Setelah memperoleh enzim β-galaktosidase kasar maka dilanjutkan
dengan tahap purifikasi enzim yang terdiri dari pengendapaan dengan amonium
sulfat, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel. Tahap selanjutnya adalah enzim βgalaktosidase terpurifikasi dan sel E. cloacae diamobilisasi dengan teknik
penjebakan dengan kalsium alginat. Optimasi variasi konsentrasi alginat dan
bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi sel dilakukan terlebih dahulu sebelum

dilakukan amobilisasi sedangkan untuk amobilisasi enzim dilakukan optimasi
konsentrasi alginat saja. Setelah diperoleh konsentrasi optimum alginat maka
dilakukan amobilisasi sel E. cloacae dan amobilisasi β-galaktosidase. Penentuan
karakterisasi β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil yang dilakukan
meliputi suhu optimum, stabilitas suhu, pH optimum, stabilitas pH, aktivator dan
inhibitor, serta parameter kinetik (KM dan Vmaks). Tahap terakhir adalah penentuan
potensi β-galaktosidase terhadap susu UHT yang meliputi hidrolisis laktosa pada
susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase

bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Analisis penurunan kadar laktosa
menggunakan kit enzimatik GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase).
Hasil penelitian ini menunjukan E. cloacae menghasilkan β-galaktosidase
optimum pada waktu inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37°C. Tahap purifikasi βgalaktosidase E. cloacae dengan menggunakan perlakuan pengendapan amonium
sulfat 30-40%, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel menghasilkan aktivitas
spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen 6,18% dan tingkat kemurnian
meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang diperoleh. Suhu optimum
bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah 40°C. Stabilitas suhu
pada β-galaktosidase bebas berkisar pada suhu 25-40°C sedangkan untuk enzim
teramobil berkisar 25-45°C. pH optimum bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas
dan teramobil adalah pH 7. Stabilitas β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase

teramobil pada kisaran pH 5,5-8,0. Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor βgalaktosidase dari E. cloacae sedangkan Ca2+ dan Zn2+ merupakan inhibitor
parsial. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan aktivator bagi enzim tersebut.
Enzim β-galaktosidase bebas dari E. cloacae mempunyai kecepatan maksimum
sebesar 0,655 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada β-galaktosidase
teramobil, kecepatan maksimumnya sebesar 0,012 µmol/menit dengan nilai KM
sebesar 2,068 mM.
Konsentrasi optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan
alginat 5% sedangkan konsentrasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah
larutan enzim terpurifikasi 10% (v/v) dan alginat 5%. E. cloacae bebas dapat
menghidrolisis laktosa pada susu UHT sebesar 55,14% sedangkan E. cloacae
teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam. Aktivitas hidrolisis laktosa oleh βgalaktosidase bebas sebesar 77,99% sedangkan β-galaktosidase teramobil sebesar
28,09% setelah 6 jam. Pemakaian berulang enzim amobil dan sel amobil masih
dapat dilakukan hingga 6 kali pengulangan.
Kata kunci: β-galaktosidase, Enterobacter cloacae, purifikasi, amobilisasi

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI
β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae
SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT

SITARESMI YUNINGTYAS

Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul Tesis
Nama
NIM

: Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari
Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT
: Sitaresmi Yuningtyas
: G851090041

Disetujui
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua

Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi
Biokimia

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.

Tanggal Ujian: 7 April 2011

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya
ilmiah ini berjudul Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari

Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Kegiatan Penelitian
ini dilakukan mulai bulan Juli hingga November 2010 di Laboratorium Biokimia
Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong. Penelitian
ini dibiayai Proyek Puslitbang Biologi LIPI dari dana Program Insentif Penelitian
dan Perekayasa, Ristek 2010.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria
Bintang, MS dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. yang telah memberikan
bimbingan dan pengarahan selama berlangsungnya penelitian serta dalam
penyusunan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I
Made Artika, M.App.Sc. selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran
dalam penulisan tesis. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik,
dan Abi yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada penulis
dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis
tujukan kepada staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi, Neneng
Karimaryati, A.Md. AL, Bapak Abdul Kholiq, S.Pd, dan Resti Siti Mutmainah
atas kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, April 2011

Sitaresmi Yuningtyas

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 13 Juni 1987 dari ayah Ir. Suyono
dan ibu Lina Herlina. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan menamatkannya pada
tahun 2008. Penulis pernah bekerja sebagai Asisten Peneliti di Laboratorium
Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2009. Kesempatan untuk melanjutkan
program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun
2009.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..............................................................................................xiii
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA

Enzim β-Galaktosidase ................................................................................. 4
Enterobacter cloacae .................................................................................... 7
Susu UHT ..................................................................................................... 8
Purifikasi Enzim ......................................................................................... 10
Teknik Amobilisasi ..................................................................................... 12
Karakterisasi Enzim .................................................................................... 14
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ........................................................................................... 17
Metode Penelitian ....................................................................................... 18
HASIL DAN PEMBAHASAN
Waktu Optimum Produksi β-Galaktosidase ................................................. 26
Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase ..................................................... 27
Karakterisasi β-Galaktosidase ..................................................................... 32
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel
Enterobacter cloacae .................................................................................. 40
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi β-Galaktosidase .............. 42
Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT ................................................. 43
Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil ................................ 46
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan .................................................................................................... 48
Saran .......................................................................................................... 48
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 49
LAMPIRAN ........................................................................................................ 53

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase ........................................................ 6
2 Komponen utama susu ....................................................................................... 9
3 Purifikasi β-galaktosidase dari E.cloacae ......................................................... 30

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase ................................................... 5
2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase .......................................................... 5
3 Enterobacter cloacae ........................................................................................ 7
4 Teknik amobilisasi enzim ................................................................................ 14
5 Kurva pertumbuhan E.cloacae dan kurva produksi β-galaktosidase ................ 27
6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase ................................................ 28
7 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan amonium sulfat .......... 29
8 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan kromatografi
filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200 ............................................... 31
9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas
dan teramobil .................................................................................................. 32
10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas
dan teramobil .................................................................................................. 34
11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas
dan teramobil .................................................................................................. 35
12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas
dan teramobil .................................................................................................. 36
13 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae ................................... 38
14 Kurva Lineweaver Burk dari enzim β-galaktosidase bebas dan
enzim β-galaktosidase teramobil ...................................................................... 39
15 Variasi optimum penentuan sel amobil ............................................................ 41
16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobisisasi enzim............... 43
17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil dan sel teramobil ................. 46
18 Penggunaan berulang enzim teramobil dan sel teramobil................................. 47

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan umum penelitian............................................................................... 54
2 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase .............................................................. 55
3 Morfologi Enterobacter cloacae ...................................................................... 55
4 Kurva standar oNP .......................................................................................... 56
5 Kurva standar protein ...................................................................................... 57
6 Penentuan waktu produksi optimum ................................................................ 58
7 Hasil purifikasi β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat ............. 58
8 Hasil kromatografi filtrasi gel .......................................................................... 59
9 Optimasi dan Stabilitas Suhu ........................................................................... 59
10 Optimasi dan stabilitas pH ............................................................................... 61
11 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase ........................................................... 62
12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil ....................... 63
13 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat
untuk amobilisasi sel ....................................................................................... 65
14 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi alginat
untuk amobilisasi enzim .................................................................................. 65
15 Potensi hidrolisis laktosa ................................................................................. 66
16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil ......................................... 67

PENDAHULUAN
Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti
lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah
karbohidrat utama susu dengan proporsi 4,7% dari total susu (Chaplin 2004).
Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang
dihubungkan dengan ikatan β-(1,4)-glikosidik (Fox & McSweeney 1981).
Keberadaan laktosa dalam susu merupakan salah satu keunikan dari susu itu
sendiri karena laktosa tidak terdapat di alam kecuali sebagai produk dari kelenjar
susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh.
Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim βgalaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan
kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar.
Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi
glukosa dan galaktosa karena enzim β-galaktosidase yang rendah pada brush
border pada usus halus (Marsh & Riley 1998). Jika seseorang tidak mempunyai
cukup β-galaktosidase maka laktosa menjadi tidak tercerna dan tidak dapat
diserap masuk ke dalam darah. Bahan-bahan ini akan menumpuk di dalam usus.
Oleh bakteri usus, tumpukan gula susu ini akan diubah menjadi asam-asam
organik dan gas karbon dioksida, gas metan, dan hidrogen. Deposit asam ini
merangsang timbulnya gerakan usus. Hal ini menyebabkan diare dengan tinja
berair, berbusa, dan berbau asam. Penderita laktosa intoleran di dunia terdapat
pada suku bangsa: Indian Amerika sekitar 95-100%, Mediterania 80-85%, Afrika
85-90%, Asia 90-100%, Eropa Utara 40-55%, dan Meksiko 50-75% (Rusynyk &
Still 2001).
Susu dapat dimodifikasi bagi penderita laktosa intoleran dengan ultrafiltrasi,
fermentasi (Fox & McSweeney 1981), dan hidrolisis (Winarno 1999). Proses
ultrafiltrasi akan menghilangkan makromolekul berbobot molekul besar seperti
laktosa dan protein akibat filtrasi sehingga ini akan mengurangi nutrisi (Fox &
McSweeney 1981). Proses fermentasi akan mengubah susu menjadi produkproduk baru, misalnya susu asam dan yoghurt yang pada umumnya dapat
menurunkan 25% kadar laktosa (Winarno 1999). Hidrolisis laktosa dilakukan

2

secara enzimatik menggunakan β-galaktosidase yang akan menghidrolisis laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa yang masih memiliki nilai energi tinggi namun
aman bagi penderita laktosa intoleran. Selain itu, penderita laktosa intoleran dapat
juga mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase. Enzim β-galaktosidase yang sudah
dijual di pasaran adalah Maxilact yaitu β-galaktosidase dari Kluyveromyces lactis.
Enzim ini berupa kapsul maupun cairan. Jika enzim ini ditambahkan ke dalam
susu dan didiamkan selama semalam dalam suasana dingin akan mampu
menghidrolisis laktosa sebesar 70% (Mahoney 2004). Metode ini memang
terbukti efektif mereduksi gejala yang berhubungan dengan malabsorbsi laktosa
tetapi obat ini harganya mahal (Fox & McSweeney 1981).
Penggunaan enzim dalam keadaan bebas, yakni terlarut dalam air, kurang
menguntungkan karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah
satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan
teknik amobilisasi (Palmer 1991). Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian
pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau
organel. Proses ini biasanya menghasilkan bentuk tidak larut dalam air. Sel atau
enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan
secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi
(Mahoney 2004).
Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan dari hewan dan mikroorganisme.
Salah satunya adalah Enterobacter colacae. E. cloacae B5 menghasilkan βgalaktosidase dengan aktivitas transglikosilasi sebesar 55% (Lu et al. 2009).
Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong telah mengidentifikasi kemampuan E.
cloacae dalam memproduksi enzim ini. Isolat tersebut merupakan isolat dari
buah-buahan yang berasal dari Gunung Salak. Pemilihan E. cloacae karena isolat
ini belum diteliti dan diharapkan isolat ini menghasilkan enzim β-galaktosidase
yang potensial dalam mendegradasi laktosa pada susu UHT.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan
karakterisasi β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Selain itu, untuk
mengetahui aktifitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae
bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase
teramobil. Hipotesis penelitian ini adalah Enterobacter cloacae menghasilkan

3

enzim β-galaktosidase yang dapat menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.
Aktivitas penurunan kadar laktosa oleh sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase
bebas, dan β-galaktosidase teramobil berbeda satu sama lain. Penelitian ini
diharapkan dapat

memberikan

informasi

ilmiah

mengenai aktivitas β-

galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Enzim β-galaktosidase ini dapat juga
digunakan dalam pembuatan susu UHT bebas laktosa untuk penderita laktosa
intoleran.

TINJAUAN PUSTAKA
Enzim β-Galaktosidase
Enzim β-galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat
menghidrolisis ikatan β-D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu β-Dgalaktosa

(Gambar

1).

Nama

sistematiknya

adalah

β-D-galaktosida

galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase (IUBMB Enzyme
Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisis ikatan β-(1,4)glikosida pada laktosa. Penggunaan enzim β-galaktosidase dalam proses hidrolisis
ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak
mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam
reaksi hidrolisis (Boyer 2002).
Enzim β-galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast
sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena
akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004).
Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase dapat dilihat pada Tabel 1. Enzim βgalaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada pH
rendah (dibawah pH 5,5) dengan suhu berkisar 30-60ºC (Itoh et al. 1980; Cesca et
al. 1984). Enzim β-galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan
Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada pH 6-8 dengan suhu berkisar 25-40ºC.
Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan
Aspergillus oryzae

aktif pada pH rendah berkisar 2,5-6,0 serta bersifat

termostabil (Mahoney 2004).
Matthews (2005) menyatakan enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri 4
rantai polipeptida (monomer) serta bobot molekul sekitar 464 kDa. Setiap
monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini mempunyai situs aktif pada
Glu 461, Glu 537, dan Trp 999. Glu 461 terlibat pada stabilisasi elektrostatik pada
keadaan transisi. Glu 537 berperan sebagai nukleofili. Trp 999 berperan mengikat
ligan. Ion natrium akan berinteraksi dengan gugus hidroksil dari ligan (Huber et
al. 1994). Langkah pertama mekanisme katalitiknya adalah laktosa membentuk
intermediet dengan nukleofil Glu 537 dan dibantu dengan asam (A: Glu 461 atau
ion Magnesium). Selanjutnya Glu 461 mendonorkan proton dengan memberikan

5

H+ pada oksigen glikosidik yang disertai pemutusan ikatan glikosidik dan
pelepasan glukosa. Langkah kedua adalah pembentukan intermediet transient
triagonal oxocarbonium

yang dibantu oleh basa (B: Glu 461) lalu terjadi

protonasi dari Glu 461 yang dikatalisis air dan diakhiri dengan transfer galaktosil
ke air atau gula lain. Jika akseptor berupa air maka akan terjadi proses hidrolisis
sehingga terbentuk glukosa dan galaktosa. Jika akseptornya berupa gula lain maka
akan terjadi proses transglikosilasi yang akan membentuk galaktooligosakarida
(Gambar 2) (Matthews 2005).
β-Galaktosidase

+
+ H2O
Laktosa

D-Galaktosa

D-Glukosa

Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase.

Laktosa

Pembentukan intermediet

Glukosa
Pemutusan ikatan

Intermediet transient triagonal

Gambar 2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase (Matthews 2005).

6

Tabel 1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase (Mahoney 2004).
Sumber
Jenis-jenis
Yeast
Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, Kluyveromyces
bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus, Pichia pastoris
Fungi

Alternaria alternata, Alternaria palmi, Aspergillus foetidus, A.
fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, Bauvaria bassiana, Curvalaria
inaequalis, Fusarium moniliforme, Mucor meihei, Mucor pusillus,
Paecilomyces varioti, Penicillium conescens, P. chrysogenum, P.
notatum, P. simplicissum, P. melloti, Rhizomucor spp.,
Saccharopolyspora rectivirgula, Scopulariopsis spp., Sirobasidium
magnum, Streptomyces violaceus, Trichoderma reesei

Bakteri

Arthrobacter spp., Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus
coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacilus
subtilis, Bacteroides polypragmatus, Bifidobacterium adolescentis,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium
acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens, Corynebacterium
murisepticum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae,
Erwinia aroieae, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae,
Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. delbruecki, L. bulgaricus, L.
kefiranofaciens, L. helveticus, L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus,
Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc citrovorum,
Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento, Pseudoalteromonas
haloplanktis, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus thermophillus,
Sulfolobus solfataricus, Thermoanaerobacter spp., Thermus ruber,
Thermus thermophillus, Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris

Perbandingan reaksi transglikosilasi laktosa dan hidrolisis

laktosa

tergantung dari jumlah substrat yang tersedia. Reaksi transglikosilasi akan terjadi
pada konsentrasi laktosa yang tinggi sekitar 15-50% sehingga akan terbentuk
galaktooligosakarida (Greenberg & Mahoney 1983). Jika konsentrasi laktosa
rendah yaitu sekitar 5% maka akan terjadi reaksi hidrolisis yang akan membentuk
glukosa dan galaktosa (Burvall & Dahlqvist 1979). Oleh karena itu, enzim ini
digunakan pada industri pangan untuk mereduksi laktosa pada susu dan whey
serta produksi galaktooligosakarida (Mahoney 1998).
β-galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis
laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai pH optimum 6 (Campbell

7

et al. 2005). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, laktosa
yang mempunyai sifat osmotik yang tinggi ini dapat menarik air dan cairan tubuh
ke dalam saluran pencernaan usus kecil. Masuknya cairan tubuh ke dalam usus
kecil akan merangsang gerakan peristaltik dinding usus menjadi lebih cepat. Hal
ini akan mendorong isi usus kecil berpindah secara cepat pula ke dalam usus
besar. Di dalam usus besar ini bakteri-bakteri akan memfermentasikan laktosa
menghasilkan berbagai asam organik dan gas. Akibatnya, akan timbul gejala sakit
perut, mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). βgalaktosidase dapat diaplikasikan untuk penderita laktosa intoleran dengan cara
hidrolisis laktosa pada susu serta konsumsi suplemen β-galaktosidase (Rusynyk &
Still 2001).

Enterobacter cloacae
Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut kingdom Bacteria, filum
Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili
Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae.
Bakteri ini mempunyai dua subspesies yaitu E. cloacae subsp. cloacae dan E.
cloacae subsp. dissolvens (Holt et al. 1994).

E. cloacae merupakan bakteri

berbentuk batang (Gambar 3), Gram negatif, anaerobik fakultatif, ukurannya
berkisar (0,3-0,6) µm × (0,8-2,0) µm, dan motil. Bakteri ini bergerak dengan
menggunakan flagelum peritrikus yaitu flagela yang secara merata tersebar
diseluruh permukaan sel. E. cloacae dapat hanya menggunakan sitrat dan asetat
sebagai sumber karbon. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari buah-buahan, usus
hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1988).

Gambar 3 Enterobacter cloacae.

8

E. cloacae menghasilkan enzim β-galaktosidase, arginin dihidrolase, dan
ornitin dekarboksilase (Huber 1999). β-Galaktosidase dari E. cloacae B5 yang
diisolasi dari tanah mempunyai aktivitas transglikosilasi dan menghasilkan
galaktooligosakarida sekitar 55% dari 275 g/L laktosa pada suhu 50ºC selama 12
jam. Enzim β-galaktosidase ini merupakan homotetramer dengan bobot molekul
442 kDa. Suhu optimumnya pada 35ºC dan aktif pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et
al. 2009)

Susu UHT
Susu adalah hasil ekskresi normal kelenjar susu induk mamalia betina untuk
memberi makan anaknya. Secara kimiawi susu merupakan emulsi lemak dalam
air yang mengandung gula, garam-garam mineral, dan protein dalam bentuk
suspensi koloidal (Rahman et al. 1992). Menurut Walstra et al. (1999), komponen
utama susu adalah air, lemak, protein, laktosa, asam organik, dan mineral (Tabel
2). Selain komponen-komponen dengan persentase besar, di dalam susu juga
terdapat komponen lainnya seperti vitamin (vitamin B, C, dan D) dan enzim
(fosfatase, peroksidase, lipoprotein lipase, protease). Berdasarkan kandungan
lemaknya susu terbagi menjadi dua macam, yaitu susu berlemak (whole milk) dan
susu skim (skim milk). Susu skim mengandung lemak yang lebih rendah
dibanding susu berlemak.
Susu merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme
karena komposisinya yang sangat kompleks. Hal ini menyebabkan susu mudah
sekali mengalami kerusakan oleh mikroorganisme, terutama oleh beberapa jenis
bakteri patogen. Bakteri tersebut akan merusak susu sehingga menurunkan daya
simpannya (Kusnawati 2004). Salah satu upaya untuk mengurangi jumlah bakteri
patogen adalah dengan pemanasan.
Fennema (1996) menyatakan bahwa ada tiga jenis pemanasan pada proses
pengolahan susu, yaitu sterilisasi, pasteurisasi, dan ultra high temperature (UHT).
Sterilisasi biasa dilakukan pada suhu 107-115ºC selama 20-40 menit atau pada
suhu 120-130ºC selama 8-12 menit. Proses ini berpengaruh besar terhadap
kandungan protein karena protein akan tereduksi hingga lebih dari 20%.
Pasteurisasi terdiri dari Holding Methode dan High Temperature Short Time

9

(HTST). Holding Methode merupakan pemanasan dengan suhu 63ºC selama 30
menit. Sedangkan HTST merupakan pemanasan pada suhu 72ºC selama 15 detik.
Tujuan pasteurisasi adalah untuk menghilangkan bibit penyakit sehingga
mengurangi jumlah total bakteri untuk meningkatkan kualitas simpan. Semua
produk pasteurisasi harus disimpan pada suhu rendah karena masih mengandung
bakteri yang tahan panas seperti bakteri termofilik, bakteri asam laktat, bakteri
penghasil spora, dan beberapa jenis bakteri aerobik dan bakteri aerobik fakultatif
seperti Bacillus spp. (Early 1998). UHT merupakan pemanasan pada suhu yang
sangat tinggi diatas 135ºC dalam waktu yang sangat singkat.
Susu UHT dibuat dari susu cair segar yang diolah dengan menggunakan
pemanasan pada suhu tinggi dan dalam waktu yang singkat untuk membunuh
seluruh mikroba sehingga memiliki mutu yang baik. Proses UHT biasanya
dilakukan pada suhu 136-138ºC selama 5-8 detik atau pada suhu 140-145ºC
selama 2-4 detik (Fennema 1996). Kelebihan susu UHT adalah susu ini sangat
higienis karena bebas dari mikroba dan spora sehingga potensi kerusakan
mikrobiologis sangat kecil. Enzim-enzim pada susu seperti fosfatase, protease,
katalase, lipoprotein lipase, laktoperoksidase, sulfhidril oksidase, dan xantin
oksidase mengalami inaktivasi sehingga tidak akan merusak susu (Walstra et al.
1999). Oleh sebab itu, susu UHT mempunyai daya simpan yang panjang pada
suhu kamar hingga 6 bulan. Kontak panas yang sangat singkat pada proses UHT
menyebabkan mutu sensori seperti warna, aroma, dan rasa relatif tidak berubah
(Fennema 1996). Nutrisi yang terkandung sedikit menurun seperti terjadinya
reduksi protein berkisar 2-4%, menurunnya kadar vitamin B dan C, dan reaksi
Maillard yang lebih rendah. Reaksi Maillard merupakan reaksi pencoklatan non
enzimatik yang terjadi antara laktosa dan protein susu akibat proses pemanasan
(Walstra et al. 1999).
Tabel 2 Komponen utama susu (Walstra et al. 1999)
Komponen
Air
Laktosa
Lemak
Protein
Mineral
Asam organik

Rata-rata (%)
87,1
4,6
4,0
3,25
0,7
0,17

Kisaran Normal (%)
85,3-88,7
3,8-5,3
2,5-5,5
2,3-4,4
0,57-0,83
0,12-0,21

10

Purifikasi Enzim
Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses purifikasi sebelum
tahap purifikasi selanjutnya (seperti kromatografi) dan dapat digunakan untuk
keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode
yaitu analitik dan preparatif. Metode analitik menggunakan pengendapan asam
(contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan
denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap
mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif
misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik,
ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pemekatan
β-galaktosidase biasanya menggunakan pengendapan dengan garam.
Pengendapan protein pada tahap awal purifikasi berfungsi untuk
memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan
memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki.
Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang
berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan
daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam
biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, dan amonium
sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan
KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi
dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan.
Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan
kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan
garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out).
Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim, hal
ini karena sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh
perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan
dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang
mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling
berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1993).

11

Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan β-galaktosidase
karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik,
murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Pada proses pengendapan, terjadi
penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein
pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk
pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat
menyebabkan denaturasi protein.
Tahap selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan
molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran
semipermeabel. Kantong dialisis selofan (MWCO 10 kD) dalam bufer mampu
memisahkan molekul-molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti
ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya. Molekul yang besar dan
mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran
seperti β-galaktosidase. Setelah enzim dimasukkan ke kantong dialisis dan
direndam dalam larutan bufer maka akan terjadi proses difusi dan osmosis.
Konsentrasi garam di dalam kantong dialisis lebih tinggi sehingga larutan bufer
akan masuk ke dalam kantong dialisis menggantikan garam yang keluar sehingga
terjadi proses kesetimbangan (Scopes 1993).

Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran
molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam
bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan
silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori
dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang
maka makin kecil ukuran pori. Polimer yang membentuk gel matrik harus
mempunyai syarat: tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH, suhu,
dan kekuatan ionik yang lebar; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah
efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan
laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai
jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam
(Boyer 2000).

12

Gel yang dapat digunakan untuk kromatografi filtrasi gel berupa dekstran,
poliakrilamida, agarosa, kombinasi poliakrilamida-dekstran, dan kombinasi
dekstran-agarosa. Gel yang pertama dikembangkan adalah dekstran yang berasal
dari polisakarida. Dekstran mempunyai nama dagang sephadex. Jika dekstran
berikatan silang dengan N,N-metilenbisakrilamida dinamakan Sephacryl. Gel
poliakrilamida

diproduksi

dari

kopolimerisasi

akrilamida

dengan

N,N-

metilenbisakrilamida. Agarosa terbuat dari galaktosa dan anhidrogalaktosa. Nama
dagang gel agarosa adalah Bio Gel-A, Sepharose, dan Superose. Kombinasi
poliakrilamida-dekstran mempunyai nama dagang Ultragel. Sedangkan kombinasi
dekstran-agarosa dinamakan Superdex (Boyer 2000).
Superdex tersusun dari pengikatan kovalen antara dekstran dan agarosa.
Superdex 200 dapat memisahkan fraksi protein dengan bobot molekul sekitar
10.000-600.000 Dalton dengan ukuran gelnya berkisar 13 µm. Superdex 200
stabil antara pH 1-14. Superdex 200 mempunyai keunggulan yaitu tingkat resolusi
yang tinggi walaupun dalam keadaan laju alir yang cepat (Hellberg, Ivarsson,
Johansson 1996).
Teknik Amobilisasi
Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan
secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Metode amobilisasi yang
ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami
amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan radikal bebas selama
proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya (Cao 2005). Bahan
penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi.
Menurut Illanes et al. (2008), teknik amobilisasi terdiri atas penempelan
pada permukaan padat (adsorpsi), ikatan kovalen (covalen bonding), ikatan silang
(crosslinking), mikroenkapsulasi, dan penjebakan (entrapment) (Gambar 4).
Teknik amobilisasi adsorpsi berdasarkan interaksi ikatan ionik, interaksi ikatan
hidrogen, ikatan hidrofobik atau gaya Van der Waals antara enzim atau sel mikrob
dan bahan penyangga (Ramakrishna & Prakasham 1999). Bahan penyangga yang
biasa digunakan adalah alumina, kaca, tanah liat dan penukar ion. Amobilisasi
dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim
seperti –OH, -SH, -NH2, dan -COOH atau sel mikrob dengan bahan penyangga

13

anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan
kovalen ini akibat penambahan agen pengikat. Bahan penyangga yang digunakan
adalah silika gel yang terlapisi glutaraldehida. Glutaraldehida digunakan untuk
membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga.
Amobilisasi dengan menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan
menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah
polietilenglikol (PEG) dan glutaraldehida. Polietilenglikol sebagai agen presipitasi
dan glutaraldehida sebagai pembentuk ikatan silang (Illanes et al. 2008). Teknik
mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikrob
dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1100 µm. Walaupun molekul enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran,
substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan
yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao 2005). Teknik amobilisasi dengan
penjebakan adalah membuat enzim atau sel mikrob terjebak di dalam polimer
butiran gel (Illanes et al. 2008).
Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan
rigid yang berfungsi mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium namun
substrat masih tetap dapat masuk ke dalam butiran gel (beads). Butiran gel berupa
polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan
gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan
poliakrilamid paling luas dipakai pada teknik amobilisasi sel maupun enzim.
Alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat
(Najafpour et al. 2004). Alginat berasal dari alga coklat yang secara luas telah
dipakai sebagai pengental, penstabil, gel, dan film.
Penjebakan sel atau enzim menggunakan alginat karena alginat tidak larut
air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan
natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen
misalnya kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation
multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh
adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan
tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi
kalsium alginat dalam bentuk butiran gel (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium

14

alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi
yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran gel tanpa membatasi transfer
masa.
Keuntungan teknik amobilisasi adalah lebih mudah memisahkan produk
yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, penggunaan kembali biokatalis,
produktivitas volumetrik yang tinggi, dan mereduksi biaya produksi. Enzim yang
teramobilisasi mempunyai half-live lebih panjang dan dapat diprediksi rata-rata
kerusakannya (Cao 2005).

Gambar 4 Teknik amobilisasi enzim. (a) pengikatan kovalen; (b)pengikat silang;
(c) adsorpsi; (d) penjebakan; (e) enkapsulasi.

Karakterisasi Enzim
Suhu dan pH
Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Suhu dapat
meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak struktur enzim. Suhu
optimum merupakan batas keduanya (Dixon & Webb 1978). Peningkatan suhu
sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik
enzim karena energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi, yaitu pada saat

15

kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga
memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini
mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Martin
1981).
Efek pH pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang
dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan pH dapat
mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim
sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar pH
yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada
konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim
mempunyai pH optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal.
Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau
penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang
tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan pH lingkungannya (Lehninger
2004).

Aktivator dan Inhibitor
Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila
komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor,
sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor
dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang
berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat
dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat,
senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Ion K+ dan
Mg2+ dibutuhkan agar aktivitas enzim β-galaktosidase optimum (Mahoney 2004).
Parameter Kinetik
Kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai
konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim
dijaga konstan. Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan
reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya
konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini

16

dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan
bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh
substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004).
Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan
sebagai tetapan Michaelis-Menten (KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada
saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum
(vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat
tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk
hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi
substrat ([S]), kecepatan awal (v0), vmaks, dan KM (Lehninger 2004). Persamaan
Michaelis-Menten adalah sebagai berikut.
v0 

vmaks [S]
K M  [S]

Persamaan Michaelis – Menten dapat

ditransformasikan ke suatu

persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan
menghasilkan nilai vmaks dan KM yang lebih tepat karena pemetaan 1/v0 terhadap
1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut KM/vmaks,
perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/vmaks dan perpotongan pada sumbu x
sebesar -1/KM (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai
berikut.
1

v0



KM

.

1



1

vmaks [S] vmaks

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang
merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media
produksi terdiri atas 20 g laktosa, 10 g pepton, 20 g ekstrak khamir, dan 10 g
NaCl yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Bufer yang digunakan adalah bufer
fosfat 0,05 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim β-galaktosidase, pembuatan
kurva

standar,

dan

penentuan

karakterisasi

enzin

adalah

enzim

β-

galaktosidase,bufer fosfat 0,1 M pH 7, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida
(oNPGal), Na2CO3 1 M, o-nitrofenol (oNP), CaCl2.2H2O, CoCl2.6H2O,
ZnSO4.7H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, HgCl2, MgSO4.7H2O Bahan untuk
penentuan kadar protein metode Bradford dan kurva standar adalah enzim βgalaktosidase, pereaksi Bradford (100 mg coomassie briliant blue dalam 50 ml
etanol 95% kemudian ditambahkan 100 ml H3PO4 85% lalu ditera dengan
akuades hingga 1 liter), dan bovine serum albumin (BSA). Bahan untuk
pengendapan enzim yaitu amonium sulfat dan membran selofan. Pengisi kolom
kromatografi berupa Superdex 200 dan glasswol. Bahan untuk amobilisasi enzim
dan sel adalah Na-alginat dan CaCl2. Bahan untuk mengetahui potensi βgalaktosidase pada susu UHT adalah susu UHT, sel E. cloacae amobil, sel E.
cloacae bebas, enzim β-galaktosidase amobil, dan enzim β-galaktosidase hasil
kromatografi filtrasi gel, dan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (Cypress
Diagnostics).
Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji
aktivitas enzim β-galaktosidase dan karakterisasinya, penentuan kadar protein,
dan produksi β-galaktosidase adalah mikropipet, tabung reaksi, erlenmeyer,
termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas es,
stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700
Shimadzu, inkubator Isuzu, botol