Isolasi Dan Seleksi Bakteri Endofit Yang Berpotensi Meningkatkan Vigor Tanaman Nilam (Pogostemon Cablin Benth).

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI ENDOFIT YANG
BERPOTENSI MENINGKATKAN VIGOR
TANAMAN NILAM (Pogostemon cablin B.)

RESTU SATRIO BAWONO

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Seleksi
Bakteri Endofit yang Berpotensi Meningkatkan Vigor Tanaman Nilam
(Pogostemon cablin Benth) adalah benar karya saya dengan arahan dari dosen
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2016

Restu Satrio Bawono
NIM G84110013

ABSTRAK
RESTU SATRIO BAWONO. Isolasi dan Seleksi Bakteri Endofit yang Berpotensi
Meningkatkan Vigor Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth). Dibimbing oleh
MARIA BINTANG dan ALINA AKHDIYA.
Bakteri endofit dapat berperan sebagai PGPB (plant growth-promoting
bacteria) dengan cara menghasilkan zat pengatur tumbuh dan meningkatkan
ketersediaan nutrisi bagi tanaman. Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri
endofit dari tanaman Nilam dan menyeleksi bakteri endofit yang berpotensi
meningkatkan vigor tanaman Nilam serta melakukan karakterisasi reaksi biokimia
terhadap isolat bakteri terpilih. Sebanyak 43 isolat endofit berhasil diisolasi dari
tiga jenis tanaman Nilam, yaitu klon B6, varietas Sidikalang, dan Varietas
Patchoulina. Sebanyak 6 isolat patogen terhadap daun tembakau dieliminasi. Dua

puluh sembilan isolat yang bersifat non-hemolitik dilakukan pengujian lebih lanjut
Terdapat 14 isolat yang masuk ke dalam jaringan planlet Nilam dan dilakukan
karakterisasi biokimia. Isolat B63.8, B63.10, NSD 20, dan P 35 memiliki aktivitas
fiksasi Nitrogen dan pelarutan Fosfat. Isolat P 40 dapat memproduksi auksin dan
komponen yang serupa dengan konsentrasi paling tinggi, yaitu 58,7773 ppm. Isolat
NSD 20 dapat menghambat pertumbuhan R. solanacearum melalui uji antagonis
dan uji pengaruh Volatile Organic Compounds (VOCs).
Kata kunci: bakteri endofit, bakteri penambat nitrogen, bakteri pelarut fosfat,
produksi IAA-like compounds, aktivitas selulolitik.

ABSTRACT
RESTU SATRIO BAWONO. Endophytic Bacteria Isolation and Selection that
Potentially Improve the Vigor of Patchouli Plant (Pogostemon cablin Benth).
Supervised by MARIA BINTANG and ALINA AKHDIYA.
Endophytic bacteria can act as PGPB (plant growth-promoting bacteria) by
generating growth regulators and increase the availability of nutrients for plants.
Objective of this research was to isolate endophytic bacteria from Patchouli plants,
select the effective endophytic bacteria that potentially increase vigor of Patchouli
plant and characterize of biochemical reactions. A total of 43 endophytic bacteria
were isolated from three types of patchouli plants such as B6 clone, Sidikalang

variety, and Patchoulina variety. A total of 6 isolates were eliminated due to its
pathogenicity towards tobacco leaves. There were 29 non-hemolytic isolates and
further screening step were done towards that isolates. A total of 14 isolates could
enter the planlet tissues and have been characterized. B63.8, B63.10, NSD 20, and
P 35 have nitrogen fixation and phosphate solubilization activity. P 40 isolate
produced the highest concentration of IAA like compound about 58.7773 ppm.
NSD 20 isolate could inhibit the growth of R. solanacearum by doing antagonis
assay and VOC influence assay.
Keywords: endophytic bacteria, nitrogen fixation, phosphat solubilization, IAAlike compounds production, selulolytic activity

ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI ENDOFIT YANG
BERPOTENSI MENINGKATKAN VIGOR
TANAMAN NILAM (Pogostemon cablin B.)

RESTU SATRIO BAWONO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa yang
telah melimpahkan berkat, karunia, serta kasih setia sehingga penulis dapat
menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit
yang Berpotensi Meningkatkan Vigor Tanaman Nilam (Pogostemon cablin Benth).
Ucapan terima kasih serta penghargaan penulis persembahkan kepada Ibu
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS selaku dosen pembimbing I serta Ibu Dr. Alina
Akhdiya, MSi selaku pembimbing II yang senantiasa memberikan pengetahuan dan
arahan selama penelitian hingga penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis
ucapkan juga kepada Ibu Dr. Ragapadmi, M.Si, Andri Ferbianto, S.Si, Sherly
Anggraini, SP, dan seluruh staf di Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian
dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Badan

Litbang Pertanian, Jalan Tentara Pelajar 3A, Kota Bogor atas segala dukungan dan
bantuan selama penelitian ini. Ucapan salam juga penulis sampaikan kepada
Mahasiswa Biokimia IPB angkatan 48 yang senantiasa mendukung, terutama Lu’lu,
Dezika, Budi, dan Dwi.
Karya tulis ini penulis persembahkan untuk kedua orang tua, yaitu Teguh
Sutanto dan Yenny Pramusinta serta adik Rahma Larasati yang senantiasa
mendukung dan memberi doa. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Saran dan
kritik senantiasa diharapkan untuk karya yang lebih baik.

Bogor, Januari 2016
Restu Satrio Bawono

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN

1

BAHAN DAN METODE

2

Bahan dan Alat

2

Prosedur Penelitian

2

HASIL

5

Sterilisasi Permukaan Tanaman dan Isolasi Bakteri Endofit

5

Respon Hipersensitivitas dan Aktivitas Hemolitik Isolat Endofit

6

Sifat Patogen Isolat Endofit terhadap Planlet Nilam

7

Karakterisasi Biokimia Isolat Endofit Terpilih

8

Kemampuan Isolat Endofit Terpilih dalam Menghambat R. solanacearum
PEMBAHASAN

10
11

Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Nilam

12

Respon Hipersensitivitas dan Aktivitas Hemolitik Isolat Endofit

12

Sifat Patogen Isolat Endofit terhadap Planlet Nilam

13

Karakterisasi Biokimia Isolat Endofit Terpilih

14

Kemampuan Isolat Endofit Terpilih dalam Menghambat R. solanacearum

18

SIMPULAN DAN SARAN

19

Simpulan

19

Saran

20

DAFTAR PUSTAKA

20

LAMPIRAN

25

RIWAYAT HIDUP

33

DAFTAR TABEL
1
2

Produksi Asam Indolasetat, kemampuan fiksasi Nitrogen, dan
pelarutan Fosfat isolat bakteri endofit
Kemampuan isolat bakteri endofit menghambat pertumbuhan
patogen R. solanacearum

10
11

DAFTAR GAMBAR
1

Media TSA 100% yang telah diinokulasi air bilasan terakhir pada
proses sterilisasi permukaan tanaman Nilam
2 Jumlah bakteri endofit hasil isolasi dari tanaman Nilam B6, Nilam
Sidikalang, dan Nilam Patchoulina
3 Daun tembakau setelah diinfiltrasi oleh isolat endofit.
4 Isolat bakteri endofit yang ditumbuhkan pada agar darah. Anak
panah menunjukkan zona hemolitik disekitar koloni isolat endofit
5 Planlet Nilam yang diinokulasikan isolat endofit, dan patogen R.
solanacearum
6 Konsentrasi IAA-like compounds beberapa isolat bakteri endofit
7 Tumbuhnya isolat bakteri endofit penambat nitrogen pada agar LGI
dan isolat bakteri endofit pelarut fosfat pada media Pikovskaya.
8 Potensi bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan patogen R.
solanacearum. Anak panah menunjukkan zona hambatan
pertumbuhan R. solanacearum
9 Terhambatnya pertumbuhan R. solanacearum oleh VOCs yang
dihasilkan isolat terpilih dan pertumbuhan R. solanacearum yang
tidak dipengaruhi VOCs
10 Struktur kimia Indole Acetic Acid
11 Mekanisme reaksi IAA membentuk kompleks berwarna
12 Lintasan biosintesis IAA yang menggunakan triptofan sebagai
prekursor dan yang tidak bergantung terhadap triptofan

6
6
7
7
8
9
9
11

11
14
15
16

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

Hasil isolasi bakteri endofit dari tanaman Nilam
Hasil uji HR isolat pada tanaman tembakau dan uji aktivitas
hemolitik
3 Hasil pengukuran absorbansi IAA-like compounds yang dihasilkan
bakteri endofit
4 Keadaan planlet Nilam yang telah diinokulasikan isolat bakteri
endofit
5 Kurva standar pengukuran IAA

25
28
29
31
32

PENDAHULUAN
Tanaman Nilam (Pogostemon cablin, B.) merupakan salah satu jenis tanaman
penghasil minyak atsiri. Tanaman ini dibudidayakan oleh para petani untuk diambil
minyak atsirinya. Namun demikian, sebagian besar minyak atsiri dihasilkan oleh
petani dengan menggunakan peralatan penyulingan yang masih sederhana. Minyak
atsiri dari tanaman Nilam tersebut merupakan bahan baku atau penunjang dalam
industri parfum, kosmetika, farmasi, sabun, makanan, dan minuman. Hingga kini
minyak atsiri yang berasal dari tanaman nilam memiliki pangsa pasar ekspor paling
besar dalam perdagangan Indonesia, yaitu mencapai 60 persen (Halimah 2010).
Menurut Rusli (2010), pemakaian minyak Nilam di dunia mencapai 1500 ton/tahun.
Masalah penyakit pada tumbuhan akan selalu muncul selama manusia masih
mengusahakan tanaman atau tumbuhan tersebut sebagai tanaman budidaya, seperti
pada bidang budidaya nilam. Penyakit merupakan suatu proses bagian tertentu dari
organisme tidak dapat menjalankan fungsinya secara normal karena adanya suatu
gangguan. Salah satu penyakit tumbuhan yang dialami Nilam adalah penyakit layu
bakteri. Penyakit ini ditandai dengan berbagai gejala, seperti beberapa daun muda
layu dan daun tua sebelah bawah menguning, bagian tanaman yang terinfeksi
(batang, cabang, dan tangkai daun) yang dibelah akan tampak pembuluh berwarna
coklat, demikian juga empulur sering berwarna kecoklatan, batang mengeluarkan
lendir putih (Adinugroho 2008). Salah satu penyebab penyakit ini adalah bakteri
Ralstonia solanacearum. Patogen ini merupakan bakteri penyebab penyakit yang
cukup penting di daerah tropis, subtropis, dan daerah bersuhu hangat (Jeung et al.
2007).
Berbagai pengendalian yang telah dilakukan antara lain pengendalian
kimiawi seperti penggunaan bakterisida, penggunaan varietas yang resisten dan
prosedur sanitasi lahan), pengapuran pada lahan terinfestasi, rotasi tanaman dengan
tanaman non-Solanaceae (Khoirunnisya 2009), menanam tanaman dari varietas
yang resisten terhadap penyakit layu bakteri dan mencabut tanaman terserang
(Khoirunnisya 2009) serta pengendalian hayati menggunakan Bacillus subtilis
(Nawangsih 2006), Pseudomonas fluorescens (Nawangsih 2006; Ratdiana 2007).
Selain pengendalian di atas, pada dasawarsa terakhir diketahui bahwa bakteri
endofit yang biasa bersimbiosis dengan tanaman juga dapat menjadi sumber strain
yang menjanjikan dibandingkan dengan bakteri rizosfer karena kurangnya
kompetisi dengan bakteri lain dalam apoplas. Hubungan simbiosis antara bakteri
endofit dengan tanaman dapat bersifat netral, mutualisme atau komensalisme
(Bacon dan Hinton 2006). Bakteri endofit mendapatkan nutrisi dari hasil
metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman dalam melawan patogen,
sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan
selama hidupnya (Simarmata et al. 2007).
Bakteri endofit adalah bakteri yang mengkolonisasi jaringan tanaman sehat
tanpa menyebabkan gejala atau luka pada inangnya dan dapat hidup pada bagian
tanaman seperti akar, batang, dan daun. Bakteri endofit dapat berperan sebagai
plant growth-promoting bacteria (PGPB) yang dapat meningkatkan pertumbuhan
tanaman dengan cara memproduksi zat pengatur tumbuh dan meningkatkan
ketersediaan nutrisi (Glickman et al 1995). Zat pengatur tumbuh merupakan
senyawa yang mampu menimbulkan respon fisiologi tanaman pada konsentrasi
rendah. Sementara itu, peningkatan keteresediaan nutrisi pada tanaman oleh bakteri
endofit melalui penambatan nitrogen, pelarutan fosfat, atau peningkatan besi.

2
Beberapa bakteri endofit mampu menambat nitrogen bebas dari udara dengan cara
mengubah nitrogen (N2) menjadi ammonia (NH3) agar dapat dimanfaatkan.
Nitrogen pada tanaman berfungsi dalam pembentukan asam amino, protein, asam
nukleat, enzim, hormon, klorofil, dan biomolekul lainnya (Fatma 2014). Isolasi
bakteri endofit, seleksi, serta karakterisasi isolat bakteri terpilih perlu dikaji dengan
baik untuk mendapatkan agen hayati yang unggul, aman, dan berpotensi
meningkatkan vigor tanaman Nilam.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri endofit dari tanaman Nilam dan
menyeleksi mikrob endofit yang efektif berpotensi meningkatkan pertumbuhan
tanaman Nilam serta melakukan karakterisasi reaksi biokimia terhadap isolat
bakteri terpilih. Penelitian ini diharapkan dapat menggantikan peran pestisida pada
budidaya Nilam dengan penggunaan bakteri endofit dan memberikan informasi
pemenfaatan bakteri endofit yang berpotensi meningkatkan vigor tanaman nilam.

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman Nilam koleksi BB Biogen klon
B6 yang merupakan hasil mutasi somaklonal dari tetua Tapak Tuan, tanaman Nilam
varietas Sidikalang, tanaman Nilam varietas Patchoulina, isolat bakteri Ralstonia
solanacearum, larutan bleaching komersial (konsentrasi bahan aktif NaOCl 5,25%),
aquades, etanol 75%, media TSA (Trypticase Soy Agar), bakteri patogen R.
solanacearum, media Sucrose Peptone Agar, garam fisiologis, media agar darah,
planlet Nilam, kertas saring Whatmann no. 1, asam pikrat, larutan Na2CO3, media
Murashige-Skoog, larutan standar IAA. Alat-alat yang digunakan adalah mortar,
kabinet laminar air flow, inkubator, kompor, neraca analitik, penangas, erlenmeyer,
gelas piala, pipet pisau, cawan petri, autoklaf, oven, nampan, pisau, gelas ukur,
baskom, alat PCR, gunting, batang pengaduk, sentrifugasi, spektrofotometer.
Prosedur Penelitian
Sterilisasi Permukaan Batang Tanaman Nilam (Schulz 2014)
Tanaman dibersihkan dari tanah yang menempel, dicuci di bawah air yang
mengalir, kemudian ditiriskan di atas kertas tissue. Bagian batang dipisahkan dari
bagian akar dan daun menggunakan gunting steril, kemudian dipotong-potong
dengan ukuran ± 4 cm sebelum dilakukan sterilisasi permukaan. Sterilisasi
permukaan batang tanaman dilakukan dengan cara perendaman selama 1 menit
dalam 2.5 % larutan bleaching komersial, dibilas dengan akuades steril, direndam
selama 5 menit dalam etanol 75 %, dan terkahir dibilas dengan 2 kali dengan
akuades steril.
Konfirmasi keberhasilan proses sterilisasi permukaan dilakukan dengan cara
menginokulasikan 100 µL air bilasan terakhir ke media TSA. Jika dalam waktu 24
jam atau 48 jam setelah inkubasi, terdapat koloni mikrob yang tumbuh pada media
TSA tersebut, maka proses sterilisasi dianggap gagal dan proses isolasi yang
dilakukan dengan sampel tersebut harus diulang mulai dari awal.

3
Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Nilam (Costa et al. 2012)
Batang yang telah disterilisasi masing-masing dipotong kecil kemudian
digerus sampai hancur dengan menggunakan mortar steril. Hasil gerusan masingmasing diencerkan secara serial dengan akuades steril, kemudian disebarkan pada
media TSA 20 %. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang dan kondisi gelap selama 2
hari sampai 6 minggu. Koloni yang tumbuh pada media isolasi dan menunjukkan
morfologi koloni yang berbeda dipilih, dan dimurnikan dengan teknik penggoresan
kuadran pada media TSA 100 %.
Penyimpanan Isolat (Feltham et al. 2008)
Isolat murni yang diperoleh dari hasil isolasi diremajakan dan diperbanyak
pada media TSA. Kultur padat bakteri endofit yang telah diremajakan (umur 48-72
jam) diambil menggunkan lup inokulasi kemudian dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf yang telah berisi 750 µL gliserol 40 % steril. Tabung tersebut ditutup
rapat, diberi label, dan selanjutnya diberi perlakuan dengan alat vortex agar
terbentuk suspensi sel yang merata, kemudian disimpan pada lemari pendingin 20oC.
Bioesei Respon Hipersensitivitas (HR) (Wahyudi et al. 2011)
Isolat bakteri endofit ditumbuhkan pada media TSA selama 2-7 hari, dan
Ralstonia solanacearum ditumbuhkan pada media SPA selama 7 hari. Koloni
bakteri yang tumbuh diambil dengan lup inokulasi kemudian disuspensikan dengan
akuades steril sampai diperoleh kepadatan sel ± 107 sel/mL. Sebanyak 0.5-1.0 mL
masing-masing suspensi bakteri diinfiltrasikan ke permukaan bawah daun
tembakau (Nicotiana tabaccum) umur 2 bulan. Pengamatan terhadap reaksi HR
yang timbul di bagian yang diinfeksi dilakukan setiap hari selama 7 hari berturutturut. Sebagai kontrol, digunakan akuades untuk menginfeksi daun tembakau.
Bioesei HR untuk masing-masing isolat dilakukan dalam 2 ulangan.
Uji Kemampuan Hemolitik (Aziz et al. 2014)
Isolat bakteri yang tidak bersifat patogen pada tanaman tembakau selanjutnya
diuji aktivitas hemolitiknya. Uji aktivitas hemolitik dilakukan dengan cara
menginokulasikan isolat bakteri ke permukaan media agar darah yang
komposisinya terdiri dari: Blood Agar Base (BBL) 40 g/L, dan darah domba steril
yang telah di-defibrinasi sebanyak 50 ml/L (Snavely dan Brahier 1960). Setelah
diinkubasi selama 1-5 hari pada suhu ruang (29 oC - 30 oC), dilakukan pengamatan
aktivitas hemolitik di sekitar koloni bakteri. Isolat-isolat yang tidak menunjukkan
aktivitas hemolitik merupakan isolat terpilih yang digunakan sebagai bahan
percobaan berikutnya.
Uji Patogenisitas Isolat terhadap Planlet Tanaman Nilam (Daub 1986)
Inokulum bakteri endofit terpilih ditumbuhkan pada media TSA selama 67 hari. Koloni yang telah tumbuh diambil dengan ose selanjutnya disuspensikan
dalam akuades steril. Sebanyak 100 µl suspensi bakteri (± 1.0 x 107 sel/mL)
diteteskan ke media di sekitar akar planlet Nilam berumur 2 minggu. Sebagai
kontrol, akuades steril digunakan untuk menggantikan suspensi bakteri endofit
yang diinokulasikan. Planlet yang telah diinokulasi diinkubasikan kembali dan

4
gejala penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri yang diinokulasikan diamati selama
10 hari. Penumbuhan planlet dilakukan pada kondisi berikut: media MurashigeSkoog, suhu 23 oC, 8 jam gelap, dan 16 jam terang. Planlet yang sehat diinkubasi
lebih lanjut sampai berumur 4 minggu untuk digunakan sebagai bahan percobaan
berikutnya. Satu botol planlet berisi tiga tanaman nilam sebagai ulangan perlakuan.
Karakter Isolat Bakteri Endofit yang Berpotensi Menghambat Pertumbuhan
Patogen Ralstonia solanacearum (Krausse et al. 2005)
Uji antagonis dilakukan dengan pengujian dual culture, yaitu antara bakteri
endofit hasil isolasi dengan patogen Ralstonia solanacearum di dalam cawan berisi
media TSA. Satu lup massa bakteri endofit hasil isolasi digoreskan pada media TSA,
diinkubasi 3 hari pada ruang gelap. Setelah bakteri endofit tumbuh, patogen
Ralstonia solanacearum digores menyilang dengan bakteri endofit dan diinkubasi
kembali hingga 3 hari. Bakteri endofit yang berpotensi menghambat patogen
membuat pertumbuhan Ralstonia solanacearum terhambat atau bahkan tidak
terjadi.
Bioesei Potensi Produksi Volatile Organic Compounds (VOCs) dan Aktivitas
Penghambatanya terhadap Kultur R. solanacearum (Fernando et al. 2005)
Potensi kemampuan produksi VOCs isolat bakteri endofit hasil isolasi diuji
menggunakan teknik cawan terbagi (divided petri plate) sebagaimana dipublikasi
oleh Fernando et al. (2005). TSA dituang ke dalam ruang pertama yang terdapat
pada two compartment petri plate sedangkan SPA (Sucrose Peptone Agar) dituang
pada ruang kedua. Setelah media agar tersebut memadat, isolat bakteri endofit
digoreskan pada permukaan TSA dan diinkubasi pada suhu ruang dalam keadaan
gelap. Tiga hari setelah inkubasi, ketika bakteri endofit telah tumbuh pada
permukaan media, bakteri patogen R. solanacearum digoreskan pada media SPA
dan cawan ditutup kembali. Inkubasi dilakukan selama 7 hari. Sebagai kontrol,
bakteri patogen R.solanacearum digoreskan pada media SPA dalam two
compartment petri plate, namun bakteri endofit tidak digoreskan pada media TSA
dalam cawan tersebut. Cawan kontrol diinkubasi dengan cara yang sama dengan
cawan perlakuan.
Uji Kemampuan Fiksasi Nitrogen (Franche et al. 2009)
Kultur bakteri endofit hasil isolasi diinokulasikan ke permukaan media LGI
agar dengan cara digores. LGI agar merupakan media bebas nitrogen dengan
komposisi sebagai berikut: 5 g L-1 sukrosa, 0.2 g L-1 K2HPO4, 0.6 g L-1 KH2PO4, 0.2
g L-1 MgSO4.7H2O, 0.02 g L-1 CaCl2, 0.002 g L-1 Na2MoO4.2H2O, 0.01 g L-1 FeCl3,
dan 19 g L-1 agar bacto. Bakteri diinkubasi pada suhu ruang selama 12 hari.
Uji Potensi Isolat Pelarut Fosfat (Ruangsanka 2014)
Aktivitas bakteri endofit pelarut fosfat ditentukan berdasarkan
pembentukan zona bening pada media Pikovskaya (Rao 1994). Media yang
digunakan adalah media Pikovskaya dengan komposisi: 10 g L-1 glukosa, 5 g L-1
Ca3PO4, 0.5 g L-1 (NH4)2SO4, 0.2 g L-1 KCl, 0.1 g L-1 MgSO4.7H2O, 0.01 g L-1
MnSO4.7H2O, 0.5 g L-1 ekstrak yeast, dan 0.01 g L-1 FeCl3.6H2O. Bakteri
diinkubasi selama 2 minggu hingga tumbuh, ditandai dengan adanya zona bening.

5
Penentuan Kadar Asam Indolasetat dan Komponen Sejenisnya (Suriaman
2010).
Pengukuran IAA-like compound dilakukan dengan metode kolorimetri
menggunakan reagen Salkowski yang dimodifikasi oleh Suriaman et al. (2010).
Kurva standar IAA diperoleh dari pengukuran IAA standar (Merck, Darmstadt,
Germany) pada konsentrasi 0-100 ppm (Lampiran 2) dan digunakan untuk
mengetahui konsentrasi IAA setiap kultur bakteri. Satu lup massa bakteri endofit
hasil isolasi diambil dan dikulturkan kembali pada media TSB (Trypticase Soy
Broth) dan diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang 75 rpm) selama 7-10 hari.
Kultur disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm, suhu 4 oC, selama 10 menit.
Sebanyak 1 mL supernatan kultur direaksikan dengan 2 mL reagen Salkowski (12
g L-1 Fe Cl3 dalam 7.9 M H2SO4), kemudian didiamkan dalam kondisi gelap selama
30 menit pada suhu ruang. Keberadaan IAA-like compound di dalam sampel yang
dianalisis ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi merah muda
hingga merah anggur. Campuran reaksi diukur rapat optis atau absorbansinya
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm. Media tanpa
inokulasi bakteri digunakan sebagai kontrol.

HASIL
Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Nilam
(Patchoulina plant)
Sterilisasi permukaan adalah tahapan awal yang perlu dilakukan sebelum
melakukan isolasi bakteri endofit. Sterilisasi permukaan tanaman dilakukan dengan
menggunakan 2.5% larutan bleaching komersial, 75% larutan etanol, dan air
distilasi. Air distilasi tersebut bermanfaat sebagai air bilasan yang selanjutnnya
disebar pada dua buah cawan petri berisi media TSA 100% yang disebut dengan
kontrol. Pengamatan terhadap kontrol tersebut dilakukan pada hari ketiga dan
menunjukkan tidak adanya bakteri yang tumbuh. Hal ini ditunjukkan media agar
tetap jernih (Gambar 1).
Isolasi bakteri endofit dilakukan pada tiga jenis varietas tanaman Nilam
(Patchoulina plant), yaitu tanaman Nilam B63 (koleksi BB BIOGEN), Nilam
Sidikalang, dan Nilam Patchoulina. Bakteri endofit yang diperoleh dari proses
isolasi ini, yaitu 17 bakteri dari tanaman Nilam B6, 11 bakteri dari Nilam Sidikalang,
dan 15 bakteri dari tanaman Nilam Patchoulina. Total bakteri yang diperoleh adalah
43 jenis bakteri (Gambar 2). Bakteri endofit yang diperoleh memiliki berbagai jenis
warna, bentuk, serta elevasi yang beragam.

6

Gambar 1 Media TSA 100% yang telah diinokulasi air bilasan terakhir pada proses
sterilisasi permukaan tanaman Nilam tidak ditumbuhi oleh bakteri
setelah diinkubasi 24 jam.

Nilam
Patchoulina
15 koloni

Nilam B6
17 koloni

Nilam Sidikalang
11 koloni

Gambar 2 Jumlah bakteri endofit hasil isolasi dari tanaman Nilam B6, Nilam
Sidikalang, dan Nilam Patchoulina
Respon Hipersensitivitas Daun Tembakau yang Diinfiltrasikan Isolat Endofit
dan Aktivitas Hemolitik Isolat Endofit
Seleksi mikrob endofit yang dapat meningkatkan vigor tanaman Nilam
dapat dilakukan melalui beberapa uji in vitro. Pengujian awal yang sangat penting
adalah uji respon hipersensitivitas (HR). Uji HR dilakukan untuk menyingkirkan
isolat yang berpotensi patogen terhadap tanaman. Uji HR dilakukan terhadap 43
isolat bakteri endofit. Hasil pengujian menunjukkan 6 jenis bakteri yang
menimbulkan respon positif patogen terhadap daun tembakau. Respon positif pada
uji HR ditandai dengan matinya jaringan daun tembakau yang telah diinfiltrasikan
bakteri endofit sehingga berwarna kuning dan kering (Gambar 3).
Uji hemolitik merupakan tahapan penting selanjutnya. Uji ini dilakukan
untuk mengeliminasi isolat yang berpotensi melisis sel darah merah mamalia dan
manusia. Hasil pengujian menunjukkan 8 jenis bakteri memiliki sifat hemolitik.
Bakteri yang bersifat hemolitik ditandai dengan timbulnya zona bening di sekitar
atau di bawah isolat pada media agar darah (Blood Agar) (Gambar 4). Diperoleh 29
isolat bakteri yang bersifat non-hemolitik dan tidak berpengaruh negatif terhadap
tanaman.

7

Gambar 3 Daun tembakau setelah diinfiltrasi oleh isolat endofit. Matinya jaringan
daun tembakau setelah 24 jam diinfiltrasi bakteri R. solanacearum (a)
dan respon hipersensitif daun tembakau setelah 3 hari diinnfiltrasi
bakteri endofit (b)

(a)

(b)

Gambar 4 Isolat bakteri endofit yang ditumbuhkan pada agar darah. Anak panah
menunjukkan zona hemolitik disekitar koloni isolat endofit

Sifat Patogen Isolat Endofit terhadap Planlet Nilam
Seleksi bakteri endofit selanjutnya dilakukan pada inang sesungguhnya
(planlet Nilam). Penggunaan hasil kultur jaringan tanaman Nilam untuk seleksi
bakteri endofit ini karena planlet bersifat sangat rentan terhadap cekaman sehingga
segera memberikan kondisi sebenarnya terhadap perlakuan yang diberikan
(Akhdiya 2014). Sebanyak 29 isolat bakteri endofit non-patogen dan non-hemolitik
diinokulasikan pada media planlet.
Planlet yang telah diinokulasikan bakteri endofit menghasilkan tampilan
yang berbeda pada bagian media, akar, dan daunnya. Planlet yang diperkaya dengan
isolat endofit memiliki daun yang lebar dan warna hijau yang cerah. Planlet yang
diperkaya isolat endofit juga tumbuh lebih tinggi dibandingkan dengan planlet yang
tidak diinokulasikan bakteri endofit. Sebaliknya, planlet yang diinokulasikan
dengan R. solanacearum menjadi layu (Gambar 5). Uji patogenisitas terhadap
planlet menunjukkan 3 isolat menyebabkan kematian planlet dan 15 isolat tidak
dapat masuk ke dalam jaringan. Diperoleh 14 isolat bakteri yang dapat masuk ke
dalam jaringan dan tidak menimbulkan kematian.

8

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 5 Kondisi planlet Nilam kontrol yang tidak diberi perlakuan (a), planlet
yang telah diperkaya bakteri endofit yang menghasilkan media
berwarna kecoklatan dan pertumbuhan akar normal (b), planlet yang
diperkaya bakteri endofit tetapi pertumbuhan akar terhambat (c), planlet
yang mati dan sakit setelah diinokulasi patogen Ralstonia
solanacearum
Karakterisasi Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Pengujian kandungan Asam Indolasetat dilakukan pada supernatan bakteri
endofit yang telah ditumbuhkan pada media TSB 100% selama 10 hari. Metode
yang digunakan adalah metode kolorimetri, yaitu berdasarkan perubahan warna
sampel setelah penambahan reagen Salkowski. Hasil pengujian menunjukkan
adanya konsentrasi yang berbeda-beda pada setiap isolat bakteri endofit (Tabel 1),
yaitu dari 4 ppm hingga 58 ppm. Isolat P 40 menghasilkan Asam Indolasetat dengan
konsentrasi tertinggi, yaitu 58.7773 ppm (Gambar 6).
Peningkatan ketersediaan nutrisi pada tanaman oleh bakteri endofit, yaitu
melalui penambatan nitrogen dan pelarutan fosfat. Pengujian potensi bakteri endofit
menambatkan Nitrogen bebas dari udara dilakukan dengan cara menumbuhkan
bakteri tersebut pada media agar LGI. Bakteri yang tumbuh pada media LGI
memiliki kemampuan menambat Nitrogen (Gambar 7a). Bakteri yang tumbuh pada
media agar LGI memiliki tampilan berair dan jernih. Terdapat 6 isolat yang dapat
tumbuh pada agar LGI, antara lain B63.8, B63.9, B63.10, NSD 20, NSD 23, dan P
35. Sementara itu, uji potensi pelarut fosfat dilakukan dengan cara menumbuhkan
bakteri endofit pada media agar Pikovskaya (Gambar 7b). Zona jernih disekitar
media Pikovskaya mengindikasi adanya aktivitas pelarutan fosfat oleh isolat endofit

9

[IAA-like compounds] (ppm)

70
60
50
40
30
20
10
0

Kode isolat
Gambar 6 Konsentrasi auksin dan komponen sejenisnya (IAA like-compounds)
yang diproduksi oleh isolat bakteri endofit terpilih

(a)
Gambar 7 Tumbuhnya
isolat bakteri endofit penambat (b)
nitrogen pada agar LGI
(a), isolat bakteri endofit pelarut fosfat pada media Pikovskaya (b).
Anak panah menunjukkan tumbuhnya bakteri penambat nitrogen
dan zona pelarutan fosfat di sekitar koloni.

10

Tabel 1 Produksi Asam Indolasetat, kemampuan menambat nitrogen, dan melarutan
fosfat isolat bakteri endofit
Kode
Bakteri
B63.6
B63.7
B63.8
B63.9
B63.10
B63.11
NSD 20
NSD 23
P 26
P 27
P 30
P 35
P 39
P 40

Penambatan
Nitrogen
+
+
+
+
+
+
-

Pelarutan
Fosfat
+
+
+
+
+
+
-

Kadar IAA-like
compounds (ppm)
4.4359
10.9807
29.6894
10.8484
11.3112
8.0058
15.5422
8.3363
7.8735
4.5020
9.9890
23.0786
15.6083
58.7773

Keterangan: (+) hasil uji positif penambatan nitrogen dan pelarutan fosfat
(-) hasil uji negatif penambatan nitrogen dan pelarutan fosfat
Kemampuan Isolat Terpilih dalam Menghambat Bakteri Patogen Ralstonia
solanacearum
Beberapa bakteri endofit dapat menghambat pertumbuhan patogen R.
solanacearum bahkan mematikan patogen tersebut (Tabel 2). Penghambatan
terhadap patogen ini diuji dengan cara menggoreskan silang bakteri endofit dengan
bakteri patogen. Terdapat 4 isolat endofit yang mampu menghambat pertumbuhan
R. solanacearum pada uji Antagonis, antara lain B63.8, NSD 20, P 35, dan P 39.
Terhambatnya pertumbuhan R. solanacearum ditandai dengan tidak tumbuhnya
bakteri R. solanacearum yang bertumpang tindih dengan isolat endofit (Gambar 8).
Bakteri endofit juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen
melalui produksi Volatile Organic Compounds (VOC). Penghambatan terhadap
patogen karena pengaruh VOCs dilakukan dengan menumbuhkan isolat endofit
dengan R. solanacearum pada cawan terbagi dua. R. solanacarum ditumbuhkan
pada satu sisi yang berisi media SPA sedangkan isolat endofit ditumbuhkan pada
sisi lainnya yang berisi media TSA. Adanya penghambatan pertumbuhan R.
solanacearum karena pengaruh VOCs ditandai dengan perumbuhan bakteri tersebut
yang kurus dan tidak menyebar (Gambar 9). Terdapat 3 isolat yang dapat
menghambat pertumbuhan R. solanacearum karena pengaruh VOCs, yaitu B63.9,
B63.11, dan NSD 20.

11
Tabel 2 Kemampuan bakteri endofit menghambat pertumbuhan patogen R.
solanacearum
Kode Bakteri
B63.6
B63.7
B63.8
B63.9
B63.10
B63.11
NSD 20
NSD 23
P 26
P 27
P 30
P 35
P 39
P 40

Uji Antagonis
+
+
+
+
-

Pengaruh VOCs
+
+
+
-

Keterangan: (+) ada aktivitas penghambatan
(-) tidak ada aktivitas penghambatan

Gambar 8 Potensi bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan patogen R.
solanacearum. Anak panah menunjukkan zona hambatan
pertumbuhan R. solanacearum saat bertumpang tindih dengan isolat
endofit

.
R. solanacearum
(a)
(b)
Gambar 9 Terhambatnya pertumbuhan R. solanacearum oleh VOCs yang
dihasilkan isolat terpilih (a) dan pertumbuhan R. solanacearum yang
tidak dipengaruhi VOCs (b).
R. solanacearum

12

PEMBAHASAN
Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Nilam
(Patchoulina plant)
Proses isolasi bakteri endofit seringkali memberikan hasil membingungkan
antara bakteri endofit yang diperoleh atau mikrob lain yang berada di permukaan
tanaman. Sterilisasi permukaan adalah tahap penting awal yang perlu dilakukan
sebelum melakukan isolasi mikrob endofit. Proses ini penting dilakukan agar
mendapat bakteri endofit yang sebenarnya (Akhdiya 2014). Air bilasan terakhir dari
proses sterilisasi permukaan yang disebar pada media TSA 100% sebagai kontrol
tidak ditumbuhi oleh mikrob. Hal ini menunjukkan permukaan tanaman bersih dari
mikrob permukaan dan bakteri yang diperoleh merupakan true endophyte microbes.
Sterilisasi permukaan batang tanaman dilakukan dengan merendam batang
ke dalam larutan bleaching komersial (NaOCl) 5,25% selama 1 menit dan etanol
70% selama 5 menit. Kedua larutan ini berfungsi sebagai desinfektan untuk
membunuh bakteri permukaan pada batang tanaman (Cao et al. 2004). Batang steril
tersebut kemudian dibilas dengan akuades. Pembilasan ini dilakukan untuk
membersihkan larutan etanol dan NaOCl dari permukaan tanaman. Media TSA
100% yang disebar dengan air bilasan terakhir tidak ditumbuhi oleh bakteri
mengindikasi permukaan batang tanaman tersebut sudah bersih dari bakteri
permukaan.
Isolasi dilakukan dari tiga jenis varietas tanaman Nilam, yaitu Nilam klon
B6, varietas sidikalang, dan varietas Patchoulina. Batang tanaman yang
permukaannya sudah bersih digerus hingga halus dan cairan hasil gerusan
diinokulasi pada media TSA 20%. Penggunaan media TSA 20% bertujuan
mengurangi kemungkinan kontaminasi bakteri selain bakteri endofit yang
diharapkan. Hasil isolasi menunjukkan adanya perbedaan jumlah bakteri endofit
dari ketiga tanaman Nilam. Terdapat 15 koloni pada nilam Patchoulina, 17 koloni
dari klon B6, dan 11 koloni dari varietas sidikalang. Keanekaragaman bakteri
endofit dipengaruhi oleh kandungan senyawa di dalam jaringan tanaman dan ruang
antar sel pada jaringan tanaman. Semakin banyak senyawa yang dihasilkan suatu
tumbuhan, bakteri endofit yang tumbuh di dalam jaringan tanaman tersebut juga
semakin beragam (Yuliar et al. 2013).
Respon Hipersensitivitas Daun Tembakau yang Diinfiltrasikan Isolat Endofit
dan Aktivitas Hemolitik Isolat Endofit
Salah satu syarat bakteri yang digunakan sebagai agen biokontrol adalah
tidak memberikan pengaruh negatif terhadap tanaman. Penapisan awal mikrob
endofit hasil isolasi dilakukan dengan melakukan uji respon hipersensitif dan uji
hemolitik. Bakteri endofit yang bersifat pathogen menyebabkan kematian pada
daun tembakau. Matinya jaringan daun tembakau ini diketahui dari perubahan
warna hijau menjadi kuning pada daun tembakau. Isolat-isolat yang menimbulkan
reaksi hipersensitif tidak dilakukan uji lanjut karena bersifat patogen bagi tanaman.
Uji hipersensitivitas menggunakan daun tanaman tembakau (Nicotiana
tabacum) karena tanaman ini merupakan tanaman model yang telah diketahui
secara lengkap sekuen gennya. Selain itu, daun tembakau memiliki ruang di antara
pembuluh daun yang lebar sehingga relatif lebih mudah menginfiltrasikan bakteri

13
tersebut. Reson hipersensitif terjadi pada tanaman sebagai reaksi atas infeksi
cendawan, bakteri, dan virus patogen tanaman. Respon ini merupakan kompleks
pertahanan tanaman dan juga sebagai tanggapan awal dalam bentuk nekrosis dan
terjadinya kematian sel untuk membatasi pergerakan patogen (Leiwakabessy 2011).
Leiwakabessy juga menjelaskan bahwa gen yang dapat menimbulkan sifat patogen
adalah gen Avr (Avirulen). Menurut Wahyudi et al. (2011), induksi reaksi
hipersensitif dan patogenisitas suatu bakteri dipengaruhi oleh gen hrp yang umum
ditemukan pada bakteri Gram negatif patogen tanaman, seperti kelompok
Xanthomonas sp. Hasil positif uji HR menunjukkan perubahan warna dari hijau
menjadi kuning pada bagian daun yang diinfiltrasikan mikroba.
Bakteri endofit yang tidak mematikan jaringan daun tembakau dilakukan
pengujian aktifitas hemolitik. Zona jernih yang terbentuk di sekitar isolat
menunjukkan adanya aktivitas hemolitik dari isolat tersebut.
Aktivitas hemolitik merupakan peristiwa luruhnya membran eritrosit yang
mengakibatkan keluarnya isi sel diikuti dengan lepasnya molekul hemoglobin yang
terkandung di dalamnya. Peristiwa lisis membran eritrosit ini tetap dalam keadaan
tidak terurai tetapi pada bagian membran tertentu terjadi kebocoran yang
menyebabkan keluarnya isi sel karena mekanisme komplemen pada gabungan
antigen-antibodi. Hemolisin adalah senyawa penyebab peristiwa hemolisis ini,
ditemukan pada beberapa mikroba dan cendawan. Mekanisme hemolisin melisis sel
darah merah dari beberapa bakteri, yaitu dengan membentuk pori-pori pada
membran sel. (Mangindaan dan Losung 2013).
Sifat Patogen Isolat Bakteri Endofit terhadap Planlet Nilam
Dua puluh sembilan isolat bakteri yang tidak memiliki aktivitas hemolitik
diuji patogenisitasnya terhadap tanaman inang. Uji patogenisitas mikrob endofit
tetap harus dilakukan pada tanaman inangnya karena mikroba endofit yang lolos uji
HR belum tentu bersifat non-fitopatogenik terhadap semua jenis tanaman termasuk
tanaman inangnya. Oleh karena itu, seleksi dilanjutkan dengan melakukan uji pada
tanaman inang sesungguhnya, yaitu planlet Nilam.
Seleksi mikrob endofit pada planlet dilakukan dengan memilih mikrob yang
tidak mengakibatkan kematian tanaman planlet dan mikroba yang dapat masuk ke
dalam jaringan. Sebanyak 3 isolat bakteri endofit menyebabkan kematian pada
planlet Nilam. Terdapat 14 isolat bakteri endofit yang dapat meresap ke dalam
media dan masuk ke jaringan planlet. Bakteri tersebut dapat masuk ke dalam
jaringan tanaman melalui akar dan menkolonisasi di berbagai kompartemen yang
berbeda, seperti di apoplast dan ruang intrasel antara dinding sel dan jaringan xilem
(Malfanova 2013).
Planlet Nilam yang diinokulasikan bakteri endofit pada bagian media
menunjukkan tampilan yang beragam dan berbeda dibandingkan dengan planlet
Nilam yang tidak diinokulasikan bakteri endofit (kontrol). Tampilan tersebut
meliputi tinggi tanaman, perubahan warna media, panjang akar, dan keberadaan
akar udara. Bakteri endofit dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman melalui
mekanisme langsung dan tidak langsung. Peningkatan pertumbuhan tanaman
terlihat dari perbedaan tinggi planlet yang diinokulasikan mikroba endofit dengan
planlet kontrol. Munif et al. (2012) melaporkan beberapa mikroba endofit dapat
merangsang pertumbuhan tanaman secara langsung melalui pembentukan senyawa

14
zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh (ZPT) merupakan senyawa yang mampu
menimbulkan respon fisiologi tanaman dengan cara meningkatkan ketersediaan
nutrisi. Beberapa zat pengatur tumbuh, di antaranya auksin, giberelin, asam absisat
(ABA), sitokinin, etilen asam jasmonat (JA), dan asam salisilat (Munif et al. 2012).
Adanya isolat bakteri endofit yang mampu menghasilkan IAA-like
compounds juga memengaruhi pertumbuhan akar planlet. Menurut Fuchs (1986)
dalam Arimarsetiowati dan Ardiyani (2012), adanya tambahan IAA-like compounds
dengan konsentrasi tertentu tidak selalu meningkatkan pertumbuhan akar tetapi
dapat menurunkan pertumbuhan akar. Hal ini berhubungan dengan kadar nitrogen
yang terkandung pada media kultur jaringan sudah disesuaikan dengan IAA sintetis
yang diberikan. Nitrogen yang melimpah pada media dibandingkan dengan IAA
kurang baik bagi pertumbuhan akar karena asam amino yang terbentuk dapat
menghambat pertumbuhan akar. Hal inilah yang menyebabkan perbedaan panjang
akar pada planlet.
Karakterisasi Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Auksin merupakan salah satu hormon penting bagi tanaman. Auksin dapat
memengaruhi pertumbuhan batang, diferensiasi dan percabangan akar,
perkembangan buah, dominansi apikal, fototropisme, dan geotropisme (Dewi 2008).
IAA termasuk dalam golongan auksin alami (Gambar 10). IAA ditemukan pada
ujung batang dan akar berfungsi sebagai pengatur pembesaran sel dan memicu
pemanjangan sel di daerah belakang meristem ujung. Senyawa ini juga diperlukan
pada proses pembentukan bunga (Santoso dan Nursaidi 2001).

Gambar 10 Struktur kimia Indole Acetic Acid (Andanawarih 2008)

Gambar 11 Mekanisme reaksi IAA membentuk kompleks berwarna (Shahab et
al.2009).
Pengukuran kadar IAA-like compounds yang dihasilkan oleh isolat bakteri
endofit terpilih dilakukan dengan metode kolorimetri. Prinsip metode ini adalah

15
terjadinya perubahan warna pada campuran supernatan bakteri dengan reagen
Salkowski. Reagen Salkowski yang digunakan sesuai metode yang dipublikasi oleh
Gordon dan Weber (1951) dalam Suriaman et al. (2010). Hasil positif uji ini
ditandai dengan perubahan warna supernatan bakteri menjadi merah muda hingga
merah anggur. Warna merah ini terjadi karena produk kondensasi berupa gugus
aldehid dengan derivatif pyrrole dan kombinasi Fe pada kondisi asam membentuk
komponen koinoidal berwarna merah keunguan (Gambar 11). Seluruh isolat
terpilih dapat menghasilkan IAA-like compounds dengan konsentrasi yang berbedabeda. Isolat P 40 memproduksi IAA-like compounds dengan konsentrasi paling
tinggi, yaitu 58,7773 ppm.
Media kultur yang digunakan pada pengujian IAA-like compounds tidak
ditambahkan dengan triptofan. Media pertumbuhan ini menggunakan TSB yang
mengandung pepton kasein dan pepton kedelai. Kandungan pepton kasein dan
pepton kedelai adalah asam amino dan substansi nitrogen lainnya. Becton,
Dickinson, dan Company (2006) mengatakan bahwa pepton kasein dan pepton
kedelai mengandung triptofan secara berturut-turut sebesar 0,8% dan 0,2%. Hasil
uji kolorimetri terhadap kultur supernatan tiap isolat bakteri menunjukkan nilai
absorbansi yang berbeda. Hal ini mengindikasi adanya perbedaan kandungan IAAlike compounds tiap isolat bakteri.
Auksin mendorong pembelahan sel dengan cara memengaruhi dinding sel
tanaman (Suriaman 2010). Lebih jelas diuraikan oleh (Aslamsyah (2002), bahwa
adanya induksi auksin dapat mengaktivasi pompa proton (ion H+) yang terletak
pada membran plasma. Hal ini menyebabkan nilai pH di bagian dinding sel lebih
rendah dari biasanya, yaitu mendekati nilai pH membran plasma (nilai pH sekitar
4,5 dari nilai pH normal 7). Aktifnya pompa proton tersebut dapat memutus ikatan
hidrogen di antara serat selulosa dinding sel. Dinding sel akan merenggang dan
mengalami penurunan tekanan karena ikatan hidrogen telah putus. Hal ini yang
menyebabkan terjadinya pelenturan sel. Enzim-enzim tertentu pada dinding sel juga
akan teraktivasi ketika nilai pH dinding sel rendah sehingga berbagai macam
protein dan polisakarida pada dinding terdegradasi. Kondisi tersebut merupakan
proses terjadinya pemanjangan dan pembesaran sel yang dipengaruhi oleh auksin.
Taghavi et al. (2009) menyatakan terdapat dua jenis lintasan biosintesis IAA
pada bakteri, yaitu lintasan yang dipengaruhi oleh triptofan dan lintasan yang tidak
bergantung pada triptofan. Triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim
terdapat pada protein sehingga asam amino ini dapat dengan mudah digunakan oleh
mikroorganisme. Menurut Spaepen (2007) dalam Fatma (2014), lintasan
biosintesis IAA yang bergantung pada triptofan dikelompokkan berdasarkan
identifikasi senyawa intermedietnya, yaitu lintasan indole-3-acetamide (IAM),

16

Gambar 12

Lintasan biosintesis IAA yang menggunakan triptofan sebagai
prekursor dan yang tidak bergantung terhadap triptofan (Spaepen et
al. 2007).

indole-3-piruvate (IpyA), tryptamine (TAM), tryptophan side-chain oxidase (TSO),
dan indole-3-acetonitrile (IAN)
Spaepen et al. (2007) menjelaskan lebih lanjut mengenai lima jalur
biosintesis IAA dengan prekursor triptofan. Lintasan indole-3-acetamide (IAM)
merupakan lintasan dengan karakter terbaik bagi bakteri. Lintasan ini terdiri dari
dua langkah, yaitu triptofan dioksidasi oleh enzim tryptophan-2-monooxigenase
(IaaM) menjadi IAM, selanjutnya IAM akan dihidrolisis oleh enzim IAM hidrolase
untuk menghasilkan IAA. Beberapa bakteri yang menggunakan lintasan IAM di
antaranya Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pantoea
agglomerans, Rhizobium, dan Bradyrhizobium (Theunis et al. 2004). Alternatif
lintasan kedua adalah melalui lintasan triptamin (TAM). Proses ini terjadi
pengubahan triptofan menjadi triptamin oleh enzim triptofan dekarboksilase,
selanjutnya triptamin akan diubah menjadi IAA oleh enzim indole-acetaldehide
dehidrogenase. Perley dan Stowe (1966) memaparkan aktivitas triptofan
dekarboksilase terjadi pada bakteri Bacillus cereus. Alternatif lintasan ketiga adalah
indole-3-pyruvate (IpyA). Proses ini terjadi pengubahan triptofan menjadi asam
indol piruvat oleh enzim triptofan transaminase dan kemudian diubah menjadi IAA
oleh enzim indole-acetaldehide dehidrogenase. Blaha et al. (2005) menjelaskan
bakteri Pa. Agglomerans, Bradyrhizobium,Azospirillum, Rhizobium, Cyanobacter,
dan Entherobacter cloacea menggunakan lintasan IpyA untu k biosintesis IAA.
Alternatif lintasan keempat adalah Tryptophan side-chain Oxidase (TSO). Lintasan
ini hanya terjadi pada bakteri Pseudomonas fluorescens. Triptofan langsung
dikonversi menjadi indole-3-acetaldehide (IAAId) dengan melewati IpyA dan
langsung dapat dioksidasi menjadi IAA (Oberhansli et al. 1991). Alternatif
pembentukan IAA oleh bakteri yang terakhir melalui lintasan indole-3-acetonitrile

17
(IAN). Namun lintasan ini hanya terjadi pada tanaman. Beberapa ilmuwan masih
mendebatkan proses lintasan ini (Bartling et al 1992).
Lintasan biosintesis IAA yang tidak menggunakan triptofan sebagai
prekursor terjadi pada bakteri Alcaligenes faecalis, (Nagasawa et al. 1990 dan
Kobayashi et al. 1993). Prinsen et al. (1993) mendemonstrasikan penelitiannya
untuk membuktikan lintasan biosintesis IAA tanpa prekursor triptofan.
Penelitiannya dilakukan terhadap bakteri Az.brasilense menggunakan media yang
tidak mengandung triptofan. Lintasan ini tidak menggunakan enzim spesifik dan
masih dikaji lebih mendalam.
Kemampuan isolat B63.8, B63.9, B63.10, NSD 20, dan NSD 23 untuk
tumbuh pada media yang tidak mengandung nitrogen (agar LGI) mengindikasi
isolat tersebut mampu menambat nitrogen bebas di udara. Hanya terdapat sedikit
bakteri yang menambat N2 bebas untuk diubah menjadi amonia dan nitrat sebagai
sumber nitrogennya karena pemecahan ikatan rangkap tiga pada N2 membutuhkan
energi yang cukup besar (Sumarsih 2003). Proses reduksi N2 menjadi NH4+
dinamakan proses penambatan atau fiksasi gas nitrogen. Salisbury dan Ross (1995)
memaparkan bahwa penambatan ini hanya dapat dilakukan oleh mikroorganisme
prokariot. Hasil reaksi kimia penambatan nitrogen menghasilkan dua molekul
amonia dari satu molekul gas nitrogen. Reaksi kimia proses penambatan nitrogen
sebagai berikut:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP = 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi
Kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit terpilih di meda agar LGI
sangat lambat. Proses ini memerlukan 16 molekul ATP dan pasokan elektron serta
proton. Terpakainya energi pada proses penambatan nitrogen membuat
pertumbuhan sel bakteri menjadi lambat (White 2007). Bakteri endofit yang
tumbuh pada media agar LGI memiliki tampilan basah dan cembung.
Proses fiksasi nitrogen bebas melibatkan penggunaan ATP dan proses
reduksi ekuivalen berasal dari metabolisme primer. Reaksi penambatan yang terjadi
dikatalisis oleh nitrogenase dan hidrogenase. Davet (2004) menyatakan bahwa
kemampuan fiksasi nitrogen suatu bakteri dipengaruhi oleh karakter enzim
nitrogenasenya dan juga ekspresi gen Niff. Terdapat dua protein kompleks pada
enzim ini, yaitu nitrogen reduktase (NR) dan protein besi molibdenum (MoFe).
Kirchoff et al. (2007) menjelaskan proses fiksasi nitrogen terdiri dari beberapa
tahapan. Pertama, elektron dari molekul nitrogen bebas diikat dan H2 dilepaskan
oleh nitrogenase pada waktu yang sama. Kemudian elektron dan proton dari NR
diterima oleh nitrogenase dan selanjutnya ditambahkan ke dalam molekul N2. Kerja
enzim hidrogenase pada proses reduksi nitrogen adalah menyimpan beberapa
energi metabolik yang hilang. Energi tersebut diperoleh dari elektron molekul
hidrogen dan selanjutnya ditransfer kembali ke dalam bentuk feredoksin
(Simanungkalit et al. 2006).
Pengujian potensi isolat endofit terpilih dalam melarutkan fosfat dilakukan
dengan cara menumbuhkan isolat pada media pikovskaya. Media ini mengandung
sumber fosfat yang terikat dengan kalsium dalam senyawa Ca3(PO4)2. Hasil
pengujian menunjukkan terdapat 6 isolat bakteri yang memiliki kemampuan
melarutkan fosfat. Bakteri tersebut antara lain B63.8, B63.10. B63.11, NSD 20, P30,

18
P35. Zona bening yang terbentuk di sekitar atau di bawah isolat bakteri pada agar
pikovskaya mengindikasi adanya kemampuan bakteri melarutkan fosfat.
Unsur fosfat (P) merupakan unsur esensial kedua setelah N yang berperan
penting dalam fotosintesis dan perkembangan akar tanaman. Ketersediaan fosfat
dalam jarang melebihi 0,01% total P. Sebagian besar bentuk fosfat terikat oleh
koloid tanah sehingga tidak tersedia bagi tanaman. Fosfat terikat tersebut
bersenyawa dengan berbagai unsur lain dan membentuk kompleks yang sulit larut,
seperti Al-P, Fe-P, dan Ca-P. Salah satu alternatif mengatasi masalah rendahnya
fosfat tersedia dalam tanah adalah penggunaan bakteri pelarut fosfat (Isgitani et al.
2005).
Bakteri pelarut fosfat dalam aktivitasnya menghasilkan metabolit berupa
asam-asam organik dan enzim Phosphomonoesterase (PME), dan antibiotika.
Asam organik yang dihasilkan oleh mikroba ini, antara lain asam sitrat, glutamat,
suksinat, fumarat, tartrat, laktat, dan α-ketobutirat (Premono 1994; Kim et al. 2002;
Hu Hongqing et al. 2002). Berbagai asam organik tersebut dapat melarutkan fosfat
terikat melalui beberapa mekanisme, antara lain kompetisi anion-orthophosphate,
perubahan nilai pH medium, dan pengikatan logam membentuk logam-organik dan
pengkelatan. Asam sitrat mampu memineralisasi bentuk P-organik menjadi Panorganik. Ponmurugan dan Gopi (2006) dalam penelitiannya menemukan bahwa
spesies Aspergillus niger dan Penicillum simplicissimum berkemampuan
melarutkan P-anorganik karena menghasilkan asam sitrat dengan konsentrasi tinggi.
Asam asetat juga merupakan asam organik yang sering dihasilkan bakteri pelarut
fosfat. Asam ini dibentuk saat bakteri dalam kondisi kurang oksigen. Hal ini
membuat NADH2 yang terbentuk dari glikolisis ataupun lintasan metabolisme
lainnya akan digunakan untuk mereduksi asetil Ko-A menjadi asam asetat. Ligan
organik seperti asam tartrat, oksalat, malat, sitrat yang memiliki gugus karboksilat,
alifatik-OH, dan fenolik-hidroksil dapat melarutkan fosfat akibat pengkelatan
dengan unsur Al, Fe, dan Ca (Setiawati dan Mihardja 2008). Salah satu mekanisme
pelepasan P yang terikat pada besi-P terkait dengan hidrogen sulfida yang
diproduksi oleh bakteri pelarut fosfat. Pengkelatan Fe3+ dari Fe-P oleh siderofor
yang diproduksi oleh beberapa bakteri pelarut P juga diyakini sebagai salah satu
mekanisme kerja bakteri pelarut P.
Asam-asam organik dihasilkan oleh bakteri pelarut P melalui proses
katabolisme glukosa dalam siklus asam trikarboksilat (TCA), yang merupakan
lanjutan proses glikolisis. Bakteri pelarut P memproduksi asam organik dalam
jumlah banyak dan sebagian berdifusi keluar sel kare