AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM α-GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas L.) Aktivitas Penghambatan Enzim α-Glukosidase oleh Ekstrak Etanol Umbi Ubi Jalar Ungu (Ipomoea batatas L.).
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM
α-
GLUKOSIDASE OLEH
EKSTRAK ETANOL UMBI UBI JALAR UNGU (
Ipomoea batatas
L.)
PUBLIKASI ILMIAH
Disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan Program Studi Strata I pada Fakultas Farmasi
Oleh:
RAHMI ELMANIAR
K 100 130 043
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2017
(2)
HALAMAN PERSETUJUAN
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM
α-
GLUKOSIDASE OLEH
EKSTRAK ETANOL UMBI UBI JALAR UNGU (
Ipomoea batatas
L.)
PUBLIKASI ILMIAH
oleh:
RAHMI ELMANIAR K 100 130 043
Telah diperiksa dan disetujui untuk diuji oleh:
Dosen Pembimbing
Dr. Muhtadi, M.Si. NIK.123
(3)
HALAMAN PENGESAHAN
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM
α-
GLUKOSIDASE OLEH
EKSTRAK ETANOL UMBI UBI JALAR UNGU (
Ipomoea batatas
L.)
OLEH RAHMI ELMANIAR
K 100 130 043
Telah dipertahankan di depan Dewan Penguji Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta Pada hari Jum’at, 20 Januari 2017 dan dinyatakan telah memenuhi syarat
Dewan Penguji:
1.Dr. Dosen Pembimbing, M.Sc. (……..……..) (Ketua Dewan Penguji)
2.Dosen Penguji, S. Pd. M.Hum. (………) (Anggota I Dewan Penguji)
3.Dr. Dosen Penguji, M. Ed. (……….) (Anggota II Dewan Penguji)
Dekan,
Azis Saifudin, P.hD., Apt. NIK. 956
(4)
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam naskah publikasi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila kelak terbukti ada ketidakbenaran dalam pernyataan saya di atas, maka akan saya pertanggungjawabkan sepenuhnya.
.
Surakarta, 27 Desember 2016 Penulis
RAHMI ELMANIAR K 100 130 043
(5)
AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM α-GLUKOSIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL
UMBI UBI JALAR UNGU (Ipomoea batatas L.)
Abstrak
Diabetes mellitus adalah suatu gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia. Salah satu kerja obat yang digunakan untuk mengobati penyakit diabetes melitus adalah dengan menghambat kerja enzim α-glukosidase. Umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) merupakan salah satu tanaman yang berpotensi sebagai obat antidiabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α -glukosidase oleh ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) dan mengetahui jenis kinetika penghambatan enzim α-glukosidase. Pengujian aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase menggunakan metode spektrofotometri yang dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Aktivitas enzim diukur berdasarkan pembentukan senyawa nitofenol warna kuning hasil dari reaksi antara substrat p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida dengan enzim α-glukosidase. Uji kinetika penghambatan enzim dilakukan untuk menentukan tipe penghambatan enzim dengan menggunakan inhibitor maupun tanpa inhibitor untuk mendapatkan plot Lineweaver-Burk. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) mempunyai aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase. Nilai penghambatan sebesar 51.18% pada konsentrasi 25 ppm. Uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase menunjukkan jenis penghambatan campuran tipe 1 (mixed inhibitor) yang diketahui melalui titik perpotongan kurva Lineweaver-Burk y ≠ 0 dan x ≠ 0 serta nilai KAP > K dan
VAP < V.
Kata Kunci: α-glukosidase, diabetes mellitus, umbi Ipomoea batatas L.
Abstract
Diabetes mellitus is a metabolism disorder that marked with a hyperglycemia. One of drugs that used for treat diabetes mellitus is by inhibit α-glucosidase enzyme. Purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) is one of plants that have potential for medicine antidiabetics. This research aims to determine the extract of ethanol purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) had an activity inhibition of the enzyme α-glucosidase, and kinetical mechanism inhibition α-glucosidase enzyme. The inhibition activity of the enzyme α -glucosidase measured by spectrophotometry method which read with ELISA reader at a wavelength 405 nm. The activity an enzyme measured based on the formation of compounds p-nitrofenol yellow color. Enzyme inhibition kinetics done to determine the type of enzyme inhibition using the inhibitor and without inhibitor to obtained Lineweaver-Burk curve. Ethanol extract of purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) could inhibited α-glucosidase enzyme. The percentage of inhibition was 51.18% at 25 ppm. Based on Lineweaver-Burk curve that y ≠ 0 and x ≠ 0 and the value of KAP > K and VAP < V, the type
kinetics inhibition of ethanol extract of purple sweet potato (Ipomoea batatas L.) was mixed type.
Keywords: α-glukosidase, diabetes mellitus, sweet potato Ipomoea batatas L.
1.PENDAHULUAN
Diabetes mellitus adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh terganggunya metabolisme sehingga kadar glukosa darah menjadi meningkat (Dipiro et al., 2008). Diabetes mellitus merupakan penyakit
(6)
yang banyak diderita oleh masyarakat, dengan peningkatan jumlah penderita dari tahun 2000 ke tahun 2005 menunjukkan peningkatan menjadi dua kali lipat (Departemen Kesehatan RI, 2005).
Pengobatan untuk menangani diabetes mellitus melalui obat antidiabetik oral maupun insulin (Tjay & Rahardja, 2007). Salah satu kerja obat antidiabetik oral adalah dengan menghambat kerja enzim α-glukosidase (Dipiro et al., 2008). Namun, pengobatan dengan cara tersebut masih banyak permasalahan didalamnya, diantaranya biaya yang mahal, efek samping pengobatan, dan keamanan penggunaan obat. Berdasarkan hal tersebut, mendorong peneliti dalam pengembangan obat herbal alami untuk mengatasi penyakit diabetes mellitus.
Umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) merupakan salah satu tanaman yang mempunyai aktivitas antidiabetes yang bekerja melalui penghambatan enzim α-glukosidase (Matsui et al., 2002). Inhibitor menghambat aksi enzim saat terjadi hidrolisis pati sehingga menimbulkan efek yang menguntungkan pada indeks glikemik. Inhibitor ini dapat menghambat pembebasan glukosa dari karbohidrat serta penyerapan glukosa menjadi terlambat, sehingga kadar glukosa darah prosprandial menjadi berkurang dan menekan hiperglikemik prosprandial (Suthindhiran, Jayasri, & Kannabiran, 2009). Sehingga penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.). Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.), mengetahui seberapa besar aktivitas penghambatan enzim dan mengetahui jenis kinetika penghambatan enzim α-glukosidase.
2.METODE
Penelitian aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase oleh ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) termasuk dalam kategori penelitian eksperimental.
2.1 Alat dan Bahan
Alat : Timbangan analitik, oven, mesin penghalus (blender), penangas air (Memmert), incubator
(Memmert), pH meter (Eutech Instruments), mikroplate 96 sumuran (iwaki), rotatory evaporator (Laborota 4000 Heidolph E-wB eco), vortex (Vortex Maxi Mix II 37600), ELISA reader (Biotex ELX 800), mikropipet (Socorex), cawan porselen, bekker glass, dan alat – alat gelas lain.
Bahan : Simplisia dari umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) berasal dari kabupaten Nganjuk,
etanol 96%, aquadest, enzim α-glukosidase (Sigma Aldrich, USA), buffer fosfat, p-nitrofenil-α -D-glukopiranosida (pNPG) (Sigma Aldrich, USA), natrium karbonat (Na2CO3) (Merck), akarbose
(glucobay), 4-nitrofenol, dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck), bovine serum albumin (BSA), kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), natrium hidroksida (NaOH).
(7)
2.2 Jalan Penelitian : Ekstraksi
Serbuk umbi ubi jalar ungu sebanyak 350 gram diekstraksi secara maserasi menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 7,5 kali berat simplisia selama 3 hari dalam wadah yang tertutup rapat dan terhindar dari cahaya matahari. Setiap hari bejana maserasi diaduk agar semua serbuk tercampur sempurna dengan pelarutnya. Kemudian maserat disaring menggunakan corong Buchner. Maserasi dilakukan sebanyak 2 kali, lalu filtrat yang didapat dievaporasi menggunakan rotatory evaporator dan diuapkan diatas penangas air sehingga mendapatkan ekstrak etanol 96% yang kental (Saifudin, 2002).
Uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase
Sampel ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu dilarutkan dalam DMSO hingga diperoleh konsentrasi 2%, 1,5%, 1%, 0,5%, dan 0,25%. S0 digunakan sebagai koreksi terhadap absorban ekstrak. Reaksi enzim
dihentikan dengan penambahan larutan Na2CO3 200 mM. p-nitrofenil α-D-glukopiranoside diambil
sebanyak 25 μL 20 mM sebagai substrat dicampur dengan dapar fosfat pH 6,8 sebanyak 49 µl 100 mM dan larutan sampel dalam DMSO sebanyak 1 µL, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Kemudian, ditambahkan 25 μL larutan enzim dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C dan ditambahkan 100 μL Na2CO3 100 mM untuk menghentikan reaksi enzim. Sampel diukur serapannya
menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm. Pembacaan hasil dilakukan sebanyak 3 kali. Metode ini dimodikasi dari (Sugiwati, Setiasih, & Afifah, 2009).
Tabel 1. Desain uji reaksi penghambatan enzim α-glukosidase
Blanko C S0` S1
Ekstrak (μL) - - 1 1
DMSO (μL) 1 1 - -
Buffer (μL) 49 49 49 49
Substrat (μL) 25 25 25 25
Inkubasi 37°C selama 5 menit
Buffer (μL) 25 - 25 -
Enzim (μL) - 25 - 25
Inkubasi 37°C selama 15 menit
Na2CO3 (μL) 100 100 100 100
Keterangan :
Blanko = Sistem reaksi tanpa adanya ekstrak dan enzim C = Campuran tanpa ekstrak
S0 = Campuran tanpa enzim namun dengan ekstrak
S1 = Campuran dengan enzim dan ekstrak
Uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
Sampel ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu dilarutkan dalam DMSO hingga diperoleh konsentrasi 0,5%. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan larutan Na2CO3 200 mM. p-nitrofenil α
-D-glukopiranoside diambil sebanyak 25 μL dengan konsentrasi 0,625; 1,25; 2,5; 5; dan 10 mM sebagai substrat dicampur dengan dapar fosfat pH 6,8 sebanyak 49 µl 100 mM dan larutan sampel dalam DMSO sebanyak 1 µL, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Kemudian, ditambahkan 25 μL larutan enzim dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C dan ditambahkan 100 μL Na2CO3 100
(8)
mM untuk menghentikan reaksi enzim. Sampel diukur serapannya menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm. Pembacaan hasil dilakukan sebanyak 3 kali. Metode ini dimodifikasi dari (Alfarabi, 2010)
Tabel 2. Desain uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
S0 S1
Ekstrak (μL) - 1
DMSO (μL) 1 -
Buffer (μL) 49 49
Substrat (μL) 25 25
Inkubasi 37°C selama 5 menit
Enzim (μL) 25 25
Inkubasi 37°C selama 15 menit
Na2CO3 (μL) 100 100
Keterangan :
S0 = Campuran tanpa ekstrak
S1 = Campuran dengan ekstrak
2.3 Analisis Data
Uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase
Analisis data dilakukan dengan menghitung presentase inhibisi α- glukosidase yang dihasilkan dari pengukuran absorbansi, kemudian dihitung menggunakan persamaan :
% penghambatan = − � x 100% Keterangan :
Absorbansi kontrol (DMSO) = tanpa sampel (kontrol-blangko) Absorbansi sampel uji = didapat dari S1 – S0
S1 = absorbansi sampel dengan penambahan enzim S0 = absorbansi sampel tanpa penambahan enzim
IC50 dapat dihitung menggunakan persamaan regresi linier, dengan konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Kemudian, dari persamaan didapatkan persamaan y = a + bx, yang digunakan untuk menghitung nilai IC50 dengan rumus :
IC50 = 50−
Uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
Analisis data dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu dengan menghitung p-NP dengan rumus: p-NP = −
Keterangan :
a dan b = hasil regresi linier dari kurva standar p-NP
Aktivitas enzim dapat dihitung setelah p-NP dihitung dengan rumus: aktivitas enzim = p−NP
(9)
Keterangan :
V = volume enzim dalam sistem reaksi (mL) T = waktu inkubasi
3.HASILDANPEMBAHASAN
Ekstraksi
Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling mudah dan sederhana karena tidak memerlukan pemanasan sehingga senyawa yang terkandung didalam tanaman tidak rusak. Pelarut yang digunakan adalah etanol 96%. Pelarut etanol dipilih karena etanol merupakan pelarut yang aman dan tidak toksik. Berat ekstrak yang didapat sebesar 61,51 gram yeng berasal dari 350 gram simplisia dengan hasil rendemen sebesar 17,57%.
Uji Penghambatan Aktivitas Enzim α-Glukosidase
Uji aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase dilakukan setelah pembuatan kurva standar dari p-nitrofenol. Aktivitas enzim diukur berdasarkan pembentukan senyawa p-nitofenol warna kuning hasil dari reaksi antara substrat dengan enzim. Substrat yang digunakan adalah larutan p-nitrofenil-α -D-glukopiranosida (p-NPG).
Gambar 1. Grafik Konsentrasi p-NPG vs Absorbansi
Persamaan linier kurva baku kemudian digunakan untuk perhitungan daya inhbisi ekstrak terhadap enzim. Ekstrak yang digunakan terdiri dari beberapa konsentrasi. Hal ini dimaksudkan untuk membuat persamaan regresi linier serta untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang digunakan maka semakin tinggi aktivitas penghambatan enzim (daya inhibisi). Pada ekstrak umbi ubi jalar ungu daya inhibisi terendah sebesar 49,12% pada konsentrasi 12,5 ppm, dan daya inhibisi tertinggi sebesar 56,37% pada konsentrasi 100 ppm.
y = 0.0015x + 0.0826 R² = 0.9911 0
0.1 0.2 0.3 0.4
0 50 100 150 200
Abs
o
rba
ns
i
Konsentrasi (μM)
Kurva standar
(10)
Gambar 2. Grafik Konsentrasi Ekstrak vs Daya Inhibisi
Pada akarbose yang digunakan sebagai kontrol positif didapatkan daya inhibisi terendah sebesar 34,78 % pada konsentrasi 12,5 ppm, dan daya inhibisi tertinggi sebesar 62,82 % pada konsentrasi 100 ppm.
Gambar 3. Grafik Konsentrasi Akarbose vs Daya Inhibisi
Daya inhibisi selanjutnya digunakan untuk menghitung IC50 ekstrak. IC50 merupakan
konsentrasi yang diperlukan untuk menghambat 50% aktivitas enzim. Ekstrak yang memiliki nilai IC50
kecil maka menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan terhadap enzim α- glukosidase tinggi.
Tabel 3. Hasil penghambatan enzim terhadap ekstrak dan akarbose
IC50 (µg/mL)
1 2 3 Rerata
Ekstrak 14.76 16.35 16.63 15.82
Akarbose 23.30 24.45 23.28 23.66
Hasil IC50 ekstrak lebih kecil dibandingkan kontrol positif akarbose, hal ini diakibatkan adanya
senyawa lain yang ikut bereaksi selama reaksi campuran-enzim berlangsung. Nilai IC50 yang diperoleh
dalam penelitian ini untuk ekstrak umbi ubi jalar ungu adalah 15,82 µ g/mL. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak antosianin ubi jalar ungu menghasilkan aktivitas penghambatan maltase
48 50 52 54 56 58 60
0 20 40 60 80 100 120
Da y a I nh ibi si (%) Konsentrasi (ppm)
Kurva penghambatan ekstrak
replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 rata-rata 0 10 20 30 40 50 60 70
0 10 20 30 40 50
Da y a I nh ibi si (%) Konsentrasi (ppm)
Kurva Kontrol Positif (Akarbose)
replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 rata-rata
(11)
yang poten dengan IC50 sebesar 0,36 mg/mL (Matsui et al., 2002). Hasil yang didapatkan berbeda
karena metode yang digunakan untuk pengujian, dan bahan ubi jalar ungu berbeda. Faktor yang mempengaruhi perbedaan hasil uji dengan acuan diantaranya enzim yag digunakan, metode yang dilakukan, dan pada acuan yang diuji ekstrak antosianin sedangkan pada pengujian ekstrak etanol. Pada penelitian itu juga menjelaskan bahwa ekstrak yang digunakan adalah ekstrak antosianin ubi jalar ungu. Selain itu penelitian lain menunjukkan bahwa antosianidin, isoflavon dan grup flavonol, dan epigalokatekin galat pada grup flavan-3-ol merupakan inhibitor α-glukosidase yang poten dengan IC50
kurang dari 15 μM (Tadera, Minami, Takamatsu, & Matsuoka, 2006). Hasil nilai IC50 dengan nilai
persen penghambatan berbeda dikarenakan sampel yang digunakan dalam pengujian hanya sebesar 1 μL yang menunjukkan bahwa jumlah sampel sedikit, sehingga kemungkinan sampel yang berada dalam campuran tidak seluruhnya dapat bereaksi dengan campuran yang lain.
Uji Kinetika Penghambatan Enzim α-Glukosidase
Kinetika penghambatan enzim dilakukan melalui dua sistem reaksi, yaitu reaksi substrat–enzim dengan inhibitor, dan reaksi substrat–enzim tanpa inhibitor. Uji kinetika penghambatan enzim digunakan untuk melihat jenis penghambatan ekstrak terhadap enzim.Mekanisme penghambatan dari ekstrak terhadap enzim α-glukosidase pada penelitian ini dapat dilihat pada gambar 4, yang merupakan kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk didapatkan dari plot sumbu x adalah 1/S (satu per konsentrasi substrat), sedangkan sumbu y adalah 1/V (satu per kecepatan reaksi enzim)
Gambar 4. Grafik Kinetika 1/S vs 1/V
Hasil plot Lineweaver-Burk ekstrak umbi ubi jalar ungu menunjukkan bahwa jenis penghambatan campuran karena titik perpotongan tidak berada pada sumbu x maupun y. Jika titik perpotongan berada pada sumbu x merupakan penghambatan kompetitif, sedangkan titik perpotongan berada pada sumbu y merupakan penghambatan non kompetitif. Penghambatan campuran berikatan dengan sisi aktif enzim secara baik dimana secara normal ditempati oleh substrat maupun ditempati oleh bagian lain dari enzim (Storey, 2004).
y = 0.0034x + 0.0013 R² = 0.996
y = 0.0014x + 0.0008 R² = 0.951 0
0.002 0.004 0.006 0.008
-0.5 0 0.5 1 1.5 2
1
/V
1/S
Uji Kinetika Penghambatan
dengan inhibitor tanpa inhibitor
(12)
Suatu senyawa dapat mengalami dua penghambatan sekaligus yaitu gabungan dari inhibisi kompetitif dan inhibisi non kompetitif yang sering disebut sebagai inhibisi campuran (mixed inhibition) (Strelow et al., 2012). Inhibitor kompetitif hanya mengikat enzim bebas. Pengikatan terjadi pada sisi aktif target dimana substrat juga mengikat. Inhibitor kompetitif akan meningkatkan nilai Km yang jelas untuk substrat dengan tidak ada perubahan dalam nilai Vmax secara jelas. Inhibitor nonkompetitif mengikat dengan baik enzim bebas maupun dengan kompleks enzim-substrat. Inhibitor nonkompetitif akan menurunkan nilai Vmax secara jelas, namun tidak ada efek pada nilai Km yang jelas untuk substrat. Sehingga, inhibisi campuran dapat terjadi jika terjadi peningkatan nilai Km dengan diikuti penurunan nilai Vmax.
Tabel 4. Nilai Km dan Vmax ekstrak umbi ubi jalar ungu
Sistem reaksi Km (b/a) Vmax(1/a)
Tanpa inhibitor 1,75 1250
Dengan inhibitor (AP) 2,615 769,231
Selain dari hasil plot Lineweaver-Burk dapat juga dilihat dari nilai Km dan Vmax, yang hasilnya juga menunjukkan kesesuaian terhadap mekanisme kinetika penghambatan campuran (mixed type inhibition). Kriteria penghambatan tipe campuran (mixed type inhibition) ini dapat dilihat nilai KAP > K danVAP < V yang merupakan jenis kinetika campuran tipe 1 (Illanes, 2008).
Kelemahan penelitian ini, tidak dilakukan pengujian KLT untuk melihat senyawa aktif yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase, penetapan kadar flavonoid dan fenolik total, serta penetapan kadar antosianin dalam ekstrak yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase.
4.PENUTUP
Berdasarkan hasil penelitan yang telah dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: Ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dengan ditandai perubahan aktivitas p-NP. Ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dengan nilai inhibisi sebesar 51,18% pada konsentrasi 25 ppm. Kinetika penghambatan enzim α-glukosidase pada ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) menunjukkan jenis inhibisi campuran. Dan disarankan sebaiknya dilakukan uji KLT untuk melihat senyawa aktif yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase, penetapan kadar flavonoid dan fenolik total, serta penetapan kadar antosianin dalam ekstrak yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase.
(13)
PERSANTUNAN
Terimakasih diucapkan kepada Staf Laboratorium Kimia Farmasi dan Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UMS yang telah membantu penulis dalam penyusunan artikel ilmiah ini. Dan Dr. Muhtadi, M.Si selaku pembimbing yang selalu memberikan arahan dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Alfarabi, M. (2010). Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah ( Piper crocatum ) In Vitro. Tesis. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor Departemen Kesehatan RI. (2005). Pharmaceutical care untuk penyakit diabetes mellitus. Jakarta:
Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan Departemen Kesehatan RI.
Dipiro, J. T., Talbert, R. I., Yee, G. C., Matzke, G. R., Wells, B. G., & Posey, L. M. (2008). Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, 7th Edition (7th ed.). United State of America.
Matsui, T., Ebuchi, S., Kobayashi, M., Fukui, K., Sugita, K., Terahara, N., & Matsumoto, K. (2002). Anti-hyperglycemic Effect of Diacylated Anthocyanin Derived from Ipomoea batatas Cultivar Ayamurasaki Can Be Achieved through the α-Glucosidase Inhibitory Action. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(25), 7244–7248.
Saifudin, A. (2002). Senyawa Alam Metabolit Sekunder: Teori, Konsep, dan Teknik Pemurnian (Edisi 1). Yogyakarta: Deepublish.
Strelow, J., Dewe, W., Iversen, P. W., Brooks, H. B., Radding, J. A., McGee, J., & Weidner, J. (2012). Mechanism of Action Assays for Enzymes. In J. McGee & J. Weidner (Eds.), Assay Guidance Manual.
Sugiwati, S., Setiasih, S., & Afifah, E. (2009). Antihyperglycemic Activity of the Mahkota Dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] Leaf Extracts as an Alpha-Glucosidace Inhibitor. Makara Kesehatan, 13(2), 74–78.
Suthindhiran, K. R., Jayasri, M. A., & Kannabiran, K. (2009). Letter International Journal of Integrative Biology α-glucosidase and α-amylase inhibitory activity of. IJIB, 6(3), 115–120. Tadera, K. T., Minami, Y. M., Takamatsu, K. T., & Matsuoka, T. M. (2006). Inhibition of α
-Glucosidase and α-Amylase by Flavonoids. J Nutr Sci Vitaminol, 52, 149–153.
Tjay, T. H., & Rahardja, K. (2007). Obat - Obat Penting Khasiat, Penggunaan, dan Efek - Efek Sampingnya (Edisi 6). Jakarta: PT Gramedia.
(1)
mM untuk menghentikan reaksi enzim. Sampel diukur serapannya menggunakan microplate reader
pada panjang gelombang 405 nm. Pembacaan hasil dilakukan sebanyak 3 kali. Metode ini dimodifikasi dari (Alfarabi, 2010)
Tabel 2. Desain uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
S0 S1
Ekstrak (μL) - 1
DMSO (μL) 1 -
Buffer (μL) 49 49
Substrat (μL) 25 25
Inkubasi 37°C selama 5 menit
Enzim (μL) 25 25
Inkubasi 37°C selama 15 menit
Na2CO3 (μL) 100 100
Keterangan :
S0 = Campuran tanpa ekstrak S1 = Campuran dengan ekstrak 2.3 Analisis Data
Uji penghambatan aktivitas enzim α-glukosidase
Analisis data dilakukan dengan menghitung presentase inhibisi α- glukosidase yang dihasilkan dari pengukuran absorbansi, kemudian dihitung menggunakan persamaan :
% penghambatan = − � x 100%
Keterangan :
Absorbansi kontrol (DMSO) = tanpa sampel (kontrol-blangko) Absorbansi sampel uji = didapat dari S1 – S0
S1 = absorbansi sampel dengan penambahan enzim S0 = absorbansi sampel tanpa penambahan enzim
IC50 dapat dihitung menggunakan persamaan regresi linier, dengan konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan % inhibisi sebagai sumbu y. Kemudian, dari persamaan didapatkan persamaan y = a + bx, yang digunakan untuk menghitung nilai IC50 dengan rumus :
IC50 = 50−
Uji kinetika penghambatan enzim α-glukosidase
Analisis data dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu dengan menghitung p-NP dengan rumus:
p-NP = −
Keterangan :
a dan b = hasil regresi linier dari kurva standar p-NP
Aktivitas enzim dapat dihitung setelah p-NP dihitung dengan rumus: aktivitas enzim = p−NP
(2)
Keterangan :
V = volume enzim dalam sistem reaksi (mL) T = waktu inkubasi
3.HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi
Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling mudah dan sederhana karena tidak memerlukan pemanasan sehingga senyawa yang terkandung didalam tanaman tidak rusak. Pelarut yang digunakan adalah etanol 96%. Pelarut etanol dipilih karena etanol merupakan pelarut yang aman dan tidak toksik. Berat ekstrak yang didapat sebesar 61,51 gram yeng berasal dari 350 gram simplisia dengan hasil rendemen sebesar 17,57%.
Uji Penghambatan Aktivitas Enzim α-Glukosidase
Uji aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase dilakukan setelah pembuatan kurva standar dari p-nitrofenol. Aktivitas enzim diukur berdasarkan pembentukan senyawa p-nitofenol warna kuning hasil dari reaksi antara substrat dengan enzim. Substrat yang digunakan adalah larutan p-nitrofenil-α -D-glukopiranosida (p-NPG).
Gambar 1. Grafik Konsentrasi p-NPG vs Absorbansi
Persamaan linier kurva baku kemudian digunakan untuk perhitungan daya inhbisi ekstrak terhadap enzim. Ekstrak yang digunakan terdiri dari beberapa konsentrasi. Hal ini dimaksudkan untuk membuat persamaan regresi linier serta untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak terhadap aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang digunakan maka semakin tinggi aktivitas penghambatan enzim (daya inhibisi). Pada ekstrak umbi ubi jalar ungu daya inhibisi terendah sebesar 49,12% pada konsentrasi 12,5 ppm, dan daya inhibisi tertinggi sebesar 56,37% pada konsentrasi 100 ppm.
y = 0.0015x + 0.0826 R² = 0.9911 0
0.1 0.2 0.3 0.4
0 50 100 150 200
Abs
o
rba
ns
i
Konsentrasi (μM) Kurva standar
(3)
Gambar 2. Grafik Konsentrasi Ekstrak vs Daya Inhibisi
Pada akarbose yang digunakan sebagai kontrol positif didapatkan daya inhibisi terendah sebesar 34,78 % pada konsentrasi 12,5 ppm, dan daya inhibisi tertinggi sebesar 62,82 % pada konsentrasi 100 ppm.
Gambar 3. Grafik Konsentrasi Akarbose vs Daya Inhibisi
Daya inhibisi selanjutnya digunakan untuk menghitung IC50 ekstrak. IC50 merupakan konsentrasi yang diperlukan untuk menghambat 50% aktivitas enzim. Ekstrak yang memiliki nilai IC50 kecil maka menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan terhadap enzim α- glukosidase tinggi.
Tabel 3. Hasil penghambatan enzim terhadap ekstrak dan akarbose
IC50 (µg/mL)
1 2 3 Rerata
Ekstrak 14.76 16.35 16.63 15.82
Akarbose 23.30 24.45 23.28 23.66
Hasil IC50 ekstrak lebih kecil dibandingkan kontrol positif akarbose, hal ini diakibatkan adanya senyawa lain yang ikut bereaksi selama reaksi campuran-enzim berlangsung. Nilai IC50 yang diperoleh dalam penelitian ini untuk ekstrak umbi ubi jalar ungu adalah 15,82 µ g/mL. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak antosianin ubi jalar ungu menghasilkan aktivitas penghambatan maltase
48 50 52 54 56 58 60
0 20 40 60 80 100 120
Da y a I nh ibi si (%) Konsentrasi (ppm) Kurva penghambatan ekstrak
replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 rata-rata 0 10 20 30 40 50 60 70
0 10 20 30 40 50
Da y a I nh ibi si (%) Konsentrasi (ppm)
Kurva Kontrol Positif (Akarbose)
replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 rata-rata
(4)
yang poten dengan IC50 sebesar 0,36 mg/mL (Matsui et al., 2002). Hasil yang didapatkan berbeda karena metode yang digunakan untuk pengujian, dan bahan ubi jalar ungu berbeda. Faktor yang mempengaruhi perbedaan hasil uji dengan acuan diantaranya enzim yag digunakan, metode yang dilakukan, dan pada acuan yang diuji ekstrak antosianin sedangkan pada pengujian ekstrak etanol. Pada penelitian itu juga menjelaskan bahwa ekstrak yang digunakan adalah ekstrak antosianin ubi jalar ungu. Selain itu penelitian lain menunjukkan bahwa antosianidin, isoflavon dan grup flavonol, dan epigalokatekin galat pada grup flavan-3-ol merupakan inhibitor α-glukosidase yang poten dengan IC50 kurang dari 15 μM (Tadera, Minami, Takamatsu, & Matsuoka, 2006). Hasil nilai IC50 dengan nilai persen penghambatan berbeda dikarenakan sampel yang digunakan dalam pengujian hanya sebesar 1 μL yang menunjukkan bahwa jumlah sampel sedikit, sehingga kemungkinan sampel yang berada dalam campuran tidak seluruhnya dapat bereaksi dengan campuran yang lain.
Uji Kinetika Penghambatan Enzim α-Glukosidase
Kinetika penghambatan enzim dilakukan melalui dua sistem reaksi, yaitu reaksi substrat–enzim dengan inhibitor, dan reaksi substrat–enzim tanpa inhibitor. Uji kinetika penghambatan enzim digunakan untuk melihat jenis penghambatan ekstrak terhadap enzim.Mekanisme penghambatan dari ekstrak terhadap enzim α-glukosidase pada penelitian ini dapat dilihat pada gambar 4, yang merupakan kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk didapatkan dari plot sumbu x adalah 1/S (satu per konsentrasi substrat), sedangkan sumbu y adalah 1/V (satu per kecepatan reaksi enzim)
Gambar 4. Grafik Kinetika 1/S vs 1/V
Hasil plot Lineweaver-Burk ekstrak umbi ubi jalar ungu menunjukkan bahwa jenis penghambatan campuran karena titik perpotongan tidak berada pada sumbu x maupun y. Jika titik perpotongan berada pada sumbu x merupakan penghambatan kompetitif, sedangkan titik perpotongan berada pada sumbu y merupakan penghambatan non kompetitif. Penghambatan campuran berikatan dengan sisi aktif enzim secara baik dimana secara normal ditempati oleh substrat maupun ditempati oleh bagian lain dari enzim (Storey, 2004).
y = 0.0034x + 0.0013 R² = 0.996
y = 0.0014x + 0.0008 R² = 0.951 0
0.002 0.004 0.006 0.008
-0.5 0 0.5 1 1.5 2
1
/V
1/S
Uji Kinetika Penghambatan
dengan inhibitor tanpa inhibitor
(5)
Suatu senyawa dapat mengalami dua penghambatan sekaligus yaitu gabungan dari inhibisi kompetitif dan inhibisi non kompetitif yang sering disebut sebagai inhibisi campuran (mixed
inhibition) (Strelow et al., 2012). Inhibitor kompetitif hanya mengikat enzim bebas. Pengikatan terjadi pada sisi aktif target dimana substrat juga mengikat. Inhibitor kompetitif akan meningkatkan nilai Km yang jelas untuk substrat dengan tidak ada perubahan dalam nilai Vmax secara jelas. Inhibitor nonkompetitif mengikat dengan baik enzim bebas maupun dengan kompleks enzim-substrat. Inhibitor nonkompetitif akan menurunkan nilai Vmax secara jelas, namun tidak ada efek pada nilai Km yang jelas untuk substrat. Sehingga, inhibisi campuran dapat terjadi jika terjadi peningkatan nilai Km dengan diikuti penurunan nilai Vmax.
Tabel 4. Nilai Km dan Vmax ekstrak umbi ubi jalar ungu
Sistem reaksi Km (b/a) Vmax(1/a)
Tanpa inhibitor 1,75 1250
Dengan inhibitor (AP) 2,615 769,231
Selain dari hasil plot Lineweaver-Burk dapat juga dilihat dari nilai Km dan Vmax, yang hasilnya juga menunjukkan kesesuaian terhadap mekanisme kinetika penghambatan campuran (mixed type inhibition). Kriteria penghambatan tipe campuran (mixed type inhibition) ini dapat dilihat nilai KAP > K danVAP < V yang merupakan jenis kinetika campuran tipe 1 (Illanes, 2008).
Kelemahan penelitian ini, tidak dilakukan pengujian KLT untuk melihat senyawa aktif yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase, penetapan kadar flavonoid dan fenolik total, serta penetapan kadar antosianin dalam ekstrak yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase.
4.PENUTUP
Berdasarkan hasil penelitan yang telah dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: Ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dengan ditandai perubahan aktivitas p-NP. Ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase dengan nilai inhibisi sebesar 51,18% pada konsentrasi 25 ppm. Kinetika penghambatan enzim α-glukosidase pada ekstrak etanol umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L) menunjukkan jenis inhibisi campuran. Dan disarankan sebaiknya dilakukan uji KLT untuk melihat senyawa aktif yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase, penetapan kadar flavonoid dan fenolik total, serta penetapan kadar antosianin dalam ekstrak yang dapat mempengaruhi aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase.
(6)
PERSANTUNAN
Terimakasih diucapkan kepada Staf Laboratorium Kimia Farmasi dan Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UMS yang telah membantu penulis dalam penyusunan artikel ilmiah ini. Dan Dr. Muhtadi, M.Si selaku pembimbing yang selalu memberikan arahan dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Alfarabi, M. (2010). Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah ( Piper crocatum ) In Vitro.
Tesis. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor Departemen Kesehatan RI. (2005). Pharmaceutical care untuk penyakit diabetes mellitus. Jakarta:
Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan Departemen Kesehatan RI.
Dipiro, J. T., Talbert, R. I., Yee, G. C., Matzke, G. R., Wells, B. G., & Posey, L. M. (2008).
Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, 7th Edition (7th ed.). United State of America.
Matsui, T., Ebuchi, S., Kobayashi, M., Fukui, K., Sugita, K., Terahara, N., & Matsumoto, K. (2002). Anti-hyperglycemic Effect of Diacylated Anthocyanin Derived from Ipomoea batatas Cultivar Ayamurasaki Can Be Achieved through the α-Glucosidase Inhibitory Action. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(25), 7244–7248.
Saifudin, A. (2002). Senyawa Alam Metabolit Sekunder: Teori, Konsep, dan Teknik Pemurnian (Edisi 1). Yogyakarta: Deepublish.
Strelow, J., Dewe, W., Iversen, P. W., Brooks, H. B., Radding, J. A., McGee, J., & Weidner, J. (2012). Mechanism of Action Assays for Enzymes. In J. McGee & J. Weidner (Eds.), Assay Guidance Manual.
Sugiwati, S., Setiasih, S., & Afifah, E. (2009). Antihyperglycemic Activity of the Mahkota Dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.] Leaf Extracts as an Alpha-Glucosidace Inhibitor. Makara Kesehatan, 13(2), 74–78.
Suthindhiran, K. R., Jayasri, M. A., & Kannabiran, K. (2009). Letter International Journal of Integrative Biology α-glucosidase and α-amylase inhibitory activity of. IJIB, 6(3), 115–120. Tadera, K. T., Minami, Y. M., Takamatsu, K. T., & Matsuoka, T. M. (2006). Inhibition of α
-Glucosidase and α-Amylase by Flavonoids. J Nutr Sci Vitaminol, 52, 149–153.
Tjay, T. H., & Rahardja, K. (2007). Obat - Obat Penting Khasiat, Penggunaan, dan Efek - Efek Sampingnya (Edisi 6). Jakarta: PT Gramedia.