Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)
TESIS
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF EXTRACT AFRICAN
LEAVES (Vernonia amygdalina Del.) AGAINTS THE VERO
CELLS INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE (H2O2)
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
Medan, Februari 2017
Menyetujui:
Komisi Pembimbing,
Komisi Penguji,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt. Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 197506102005012003
NIP 195707231986012001
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
NIP 197506102005012003
Mengetahui:
Sekretaris Program Studi,
Disahkan Oleh:
Dekan,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
iii
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa
: Safriana
Nomor Induk Mahasiswa : 147014033
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek
Sitoprotektif
Ekstrak
Daun
Afrika
(Vernonia amygdalina Del.) terhadap Sel Vero
yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Selasa
tanggal Tujuh bulan Februari tahun dua ribu tujuh belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis
: Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
iv
Universitas Sumatera Utara
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa
: Safriana
Nomor Induk Mahasiswa
: 147014033
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi
Hidrogen Peroksida (H2O2)
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,
bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan
dalam keadaan sehat
Medan,
Februari 2017
Yang membuat pernyataan,
Safriana
NIM 147014033
v
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan tesis dengan judul “Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)”
yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak
mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun
materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang
tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi
penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah
menyediakan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
4. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si.,
M.Si., Apt., sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan
vi
Universitas Sumatera Utara
bimbingan, arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran
tulus dan ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan
penyelesaian tesis ini.
5. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.,
sebagai Komisi Penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan
bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin baik.
6. Ayahanda H. Abdullah W, S.Sos., dan Ibunda Hj. Warniati, S. E., tercinta,
abang-abang saya, Samsul Ridha, BBA., serta istri Therisita Sheere, B.Bus.
dan Zulfikar Abdullah, BoM(hons), M.M, serta adik-adik tersayang, Fajri
Keumalasari, Amd.Ak., dan Zuhra Safitri sebagai keluarga penulis yang
banyak memberikan bantuan baik dalam bentuk moril dan materil bagi penulis
selama menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian tesis ini.
7. Teman-teman seperjuangan di angkatan 2009 Yulis Kartika, M.Si., Apt., Mirna
Risna Lovinanda Lubis, S.Farm., Apt., Dwi Darmawaty Lubis, S.Farm., Apt.,
Nura Ramadhani, S.Farm., Apt., dan Rina Febriani, S.Sos., serta teman-teman
seperjuangan mahasiswa Magister Farmasi Diah Ramadhani, M.Si., Apt., Reny
Haryani, M.S., Apt., Rialita Lifiani, M.Si., Apt., Yanna Rotua Sihombing,
M.Si., Apt., Saru Noliqo Rangkuti, M.Si., Apt., Koko Prananda Tarigan, M.Si.,
Apt., Eva Diansari Marbun, M.Si., Apt., Dara Fahria Nopa, M.Si., Apt.,
Asyrun Alkhairi Lubis, M.Si., Apt., Denny Satria, M.Si., Apt., Nevi Hayati
Utami, S.Farm., dan Hendra Gunawan, S.Farm., serta semua pihak yang tidak
dapat penulis sebutkan satu per satu yang selalu mendukung penulis.
Serta buat semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu
yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang
vii
Universitas Sumatera Utara
Maha Esa memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan
yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dan semua
pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi
ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.
Medan, Februari 2017
Penulis,
(Safriana)
NIM 147014033
viii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
ABSTRAK
Tubuh kita memerlukan antioksidan sebagai suatu senyawa yang memiliki
aktivitas sitoprotektif yang dapat menetralisir radikal bebas. Mekanisme
perlindungan dibutuhkan untuk melindungi tubuh dari penyakit degeneratif yang
salah satunya adalah kanker. Keanekaragaman hayati Indonesia sangat berpotensi
dalam penemuan senyawa baru yang memiliki aktivitas sitoprotektif, salah
satunya adalah daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.). Tujuan dari penelitian
ini adalah untuk menguji aktivitas sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel
Vero yang diinduksi hidrogen peroksida (H2O2) melalui uji viabilitas sel,
apoptosis dan pengujian ekspresi ROS.
Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental, meliputi
identifikasi tumbuhan, pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, penetapan
kadar air simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak dan pengujian efek
sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2 melalui
analisis viabilitas sel secara MTT, analisis apoptosis secara flow sitometri dan
analisis ekspresi ROS secara imunositokimia.
Hasil penetapan kadar air serbuk simplisia daun Afrika sebesar 7,97%.
Golongan senyawa kimia yang terdapat dalam simplisia dan ekstrak daun Afrika
hasil skrining fitokimia adalah flavonoid, glikosida, saponin, tanin dan
steroid/triterpenoid. Pengujian efek sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel
Vero yang diinduksi H2O2 untuk analisis viabilitas sel secara MTT menunjukkan
Persentase sel Vero hidup terbesar terdapat pada pemberian EEDA 50 μg/ml
sebesar 78,75±2,51%; EEADA 12,5 μg/ml sebesar 68,99±0,91% dan ENDA 12,5
μg/ml sebesar 42,70±2,63%. Pada analisis apoptosis secara flow sitometri
menunjukkan persentase jumlah sel hidup kontrol sel sebesar 80,56%, kontrol
sel+ H2O2 sebesar 10,32%, EEDA 50 μg/ml sebesar 59,56% dan EEADA 12,5
μg/ml sebesar 40,88%.
Hal ini menunjukkan bahwa EEDA dan EEADA dapat meningkatkan
jumlah sel hidup atau memiliki aktivitas sitoprotektif dibandingkan dengan
jumlah sel hidup pada pemberian H2O2. Analisis ekspresi ROS secara
imunositokimia menunjukkan EEDA dan EEADA dapat menurunkan ekspresi
ROS yang ditunjukkan dengan berkurangnya warna coklat pada sel dibandingkan
dengan kontrol sel yang diberi H2O2 yang dominan berwarna coklat.
Kata kunci: Daun Afrika, Vernonia amygdalina Del., Sel Vero,Sitoprotektif, MTT,
Flow Sitometri, Imunositokimia
ix
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF EXTRACT AFRICAN
LEAVES (Vernonia amygdalina Del.) AGAINTS THE VERO
CELLS INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE (H2O2)
ABSTRACT
Our bodies need antioxidants as a compound having cytoprotective
activities that can neutralize free radicals. The mechanism of protection is needed
to protect the body from degenerative diseases, one of which is cancer. Indonesia
has biodiversity which is potential in the new compounds discoveries, one of
which is the African leaves (Vernonia amygdalina Del.). The purposes of the
study were to evaluate the cytoprotective activity of extract African leaves against
the Vero cells induced by hydrogen peroxide (H2O2) through the test cell viability,
apoptotic and to observe the expression of ROS.
The research methods were experimental research, including identification
of plants, collection and processing of plant material, determination of water
content of simplicia, phytochemical screening, the manufacture of extraction and
testing of cytoprotective effects of extract African leaves against Vero cells
induced by H2O2 through the analysis of cell viability by MTT, analysis of
apoptotic by flow cytometry and ROS expression analysis by
immunocytochemistry.
The results of the determination of the water content of 7.97%. Group of
chemical compounds contained in simplicia and extracts of African leaves
phytochemical screening results are flavonoids, glycosides, saponins, tannins and
steroids/triterpenoids. Testing of extract African leaves cytoprotective effects
against the Vero cells induced by H2O2 for analysis of cell viability by MTT
showed the largest percentage of living Vero cells contained in the granting
EEDA 50 µg/mL of 78.75 ± 2.51%; EEADA 12.5 µg/mL at 68.99 ± 0.91% and
ENDA 12.5 µg/mL of 42.70 ± 2.63%. In the analysis of apoptotic by flow
cytometry shows the percentage of viable cell count of 80.56% of control cells,
control cells + H2O2 at 10.32%, EEDA 50 µg/mL of 59.56% and EEADA 12.5
µg/mL at 40.88 %.
This shows that the EEDA and EEADA can increase the number of living
cells or have cytoprotective activity compared to the amount of living cells in
granting H2O2. ROS expression analysis by immunocytochemistry showed EEDA
and EEADA can decrease the expression of ROS as indicated by a reduction in
brown on cells compared with control cells by H2O2 dominant brown.
Keywords: African Leaves, Vernonia amygdalina Del., Vero cells, Cytoprotective,
MTT, Flow Cytometry, Immunocytochemistry
x
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
`
Halaman
JUDUL ........................................................................................................
i
HALAMAN JUDUL ...................................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ............................................................
iv
LEMBAR PENGESAHAN TESIS .............................................................. v
SURAT PERNYATAAN ............................................................................ vi
KATA PENGANTAR ................................................................................ vii
ABSTRAK .................................................................................................. x
ABSTRACT ................................................................................................ xi
DAFTAR ISI ............................................................................................... xii
DAFTAR TABEL ................................................................ ....................... xvi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xviii
BAB I
PENDAHULUAN .......................................................................
1
1.1 Latar Belakang .......................................................................
1
1.2 Perumusan Masalah ...............................................................
4
1.3 Kerangka Pikir Penelitian ......................................................
5
1.4 Hipotesis ................................................................................
7
1.5 Tujuan Penelitian ...................................................................
7
1.6 Manfaat Penelitian .................................................................
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................
8
2.1 Penyakit Degeneratif ..............................................................
8
2.1.1 Jenis-jenis penyakit degeneratif .....................................
9
2.2 Kanker ....................................................................................
13
xi
Universitas Sumatera Utara
2.2.1 Definisi kanker ..............................................................
13
2.2.2 Penyebab kanker ...........................................................
15
2.2.3 Gambaran klinik kanker ................................................
17
2.2.4 Karsinogenesis ..............................................................
18
2.2.5 Apoptosis ......................................................................
20
2.2.6 Sel Vero ........................................................................
23
2.3 Reactive Oxygen Species (ROS) ............................................
23
2.4 Radikal Bebas .........................................................................
27
2.4.1 Definisi radikal bebas ...................................................
27
2.4.2 Pembentukan radikal bebas ..........................................
28
2.4.3 Sumber radikal bebas ....................................................
29
2.4.4 Reaksi perusakan oleh radikal bebas ............................
30
2.5 Antioksidan ............................................................................
31
2.6 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .....................................
32
2.6.1 Daun Afrika ..................................................................
35
2.6.2 Metode ekstraksi ...........................................................
37
2.6.3 Metode pengujian aktivitas sitoprotektif ......................
39
BAB III METODE PENELITIAN .............................................................
43
3.1 Alat dan Bahan .......................................................................
43
3.1.1 Alat ................................................................................
43
3.1.2 Bahan ............................................................................
43
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel ...................................
44
3.2.1 Pengambilan sampel ......................................................
44
3.2.2 Identifikasi daun Afrika .................................................
44
3.2.3 Pembuatan simplisia ......................................................
44
xii
Universitas Sumatera Utara
3.3 Pemeriksaan Makroskopik .....................................................
45
3.4 Pemeriksaan Mikroskopik .....................................................
45
3.5 Penetapan Kadar Air ..............................................................
45
3.6 Pembuatan Ekstrak .................................................................
46
3.7 Skrining Fitokimia .................................................................
46
3.7.1 Pemeriksaan flavonoid ..................................................
47
3.7.2 Pemeriksaan alkaloid ....................................................
47
3.7.3 Pemeriksaan saponin .....................................................
47
3.7.4 Pemeriksaan tanin .........................................................
48
3.7.5 Pemeriksaan glikosida ...................................................
48
3.7.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ...................................
48
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan ......................................................
49
3.9 Pembuatan Media ..................................................................
49
3.9.1 Pembuatan media M199 ................................................
49
3.9.2 Pembuatan media MK-M199 ........................................
50
3.10 Penumbuhan Sel Vero ..........................................................
50
3.10.1 Subkultur sel Vero .....................................................
50
3.10.2 Panen sel Vero ...........................................................
51
3.10.3 Perhitungan sel Vero .................................................
51
3.11 Pembuatan Larutan Uji ........................................................
52
3.12 Analisis Viabilitas Sel ..........................................................
53
3.13 Pengujian Apoptosis ............................................................
54
3.14 Analisis Ekspresi ROS .........................................................
54
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
56
4.1 Identifikasi Tumbuhan ..........................................................
56
xiii
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pemeriksaan Makroskopik ...................................................
56
4.3 Pemeriksaan Mikroskopik ....................................................
56
4.4 Penetapan Kadar Air .............................................................
56
4.5 Skrining Fitokimia ................................................................
57
4.6 Aktivitas Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika ........................
58
4.6.1 Analisis viabilitas sel dengan metode MTT ..................
58
4.6.2 Pengamatan apoptosis dengan flow sitometri ...............
63
4.6.3 Analisis ekspresi ROS secara imunositokimia ..............
67
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................
71
5.1 Kesimpulan ...........................................................................
71
5.2 Saran .....................................................................................
72
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
73
LAMPIRAN ………. ...................................................................................
83
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
2.1 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .................................................
32
4.1 Skrining Fitokimia Daun Afrika .........................................................
57
4.2 Persentase Pengujian Apoptosis .........................................................
66
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian ..................................................
6
2.1 Oksidasi Fosforilasi .......................................................................
25
2.2
Reduksi MTT menjadi Formazan ..................................................
39
3.1. Hemositometer ...............................................................................
52
4.1 Grafik Konsentrasi Larutan Uji terhadap Persen Viabilitas Sel ....
60
4.2
Pengamatan Apoptosis terhadap Sel Vero .....................................
65
4.3
Imunositokimia pada Sel Vero ......................................................
69
xvi
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1
Hasil Identifikasi Tumbuhan .........................................................
83
2
Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan .........................................
84
3
Gambar Tumbuhan Daun Afrika dan Daun Afrika Segar ...........
85
4
Gambar Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Afrika ................
86
5
Hasil Mikroskopik Daun Afrika ...................................................
87
6
Gambar Alat .................................................................................
88
7
Bagan Pembuatan Ekstrak Daun Afrika ......................................
89
8
Bagan Alur Penelitian ..................................................................
90
9
Perhitungan Hasil Penetapan Kadar Air Serbuk Simplisia
Daun Afrika ..................................................................................
91
10
Perhitungan Konsentrasi Larutan Uji ...........................................
92
11
Perhitungan Pengenceran H2O2.....................................................
93
12
Hasil Analisis Statistik Viabilitas Sel ..........................................
94
xvii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF EXTRACT AFRICAN
LEAVES (Vernonia amygdalina Del.) AGAINTS THE VERO
CELLS INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE (H2O2)
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
SAFRIANA
NIM 147014033
Medan, Februari 2017
Menyetujui:
Komisi Pembimbing,
Komisi Penguji,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt. Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 197506102005012003
NIP 195707231986012001
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
NIP 197506102005012003
Mengetahui:
Sekretaris Program Studi,
Disahkan Oleh:
Dekan,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
iii
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa
: Safriana
Nomor Induk Mahasiswa : 147014033
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek
Sitoprotektif
Ekstrak
Daun
Afrika
(Vernonia amygdalina Del.) terhadap Sel Vero
yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Selasa
tanggal Tujuh bulan Februari tahun dua ribu tujuh belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis
: Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
iv
Universitas Sumatera Utara
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa
: Safriana
Nomor Induk Mahasiswa
: 147014033
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi
Hidrogen Peroksida (H2O2)
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,
bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan
dalam keadaan sehat
Medan,
Februari 2017
Yang membuat pernyataan,
Safriana
NIM 147014033
v
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan tesis dengan judul “Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia
amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)”
yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak
mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun
materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang
tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi
penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan, yang telah
menyediakan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
4. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si.,
M.Si., Apt., sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan
vi
Universitas Sumatera Utara
bimbingan, arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran
tulus dan ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan
penyelesaian tesis ini.
5. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.,
sebagai Komisi Penguji yang telah banyak memberikan saran dan masukan
bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin baik.
6. Ayahanda H. Abdullah W, S.Sos., dan Ibunda Hj. Warniati, S. E., tercinta,
abang-abang saya, Samsul Ridha, BBA., serta istri Therisita Sheere, B.Bus.
dan Zulfikar Abdullah, BoM(hons), M.M, serta adik-adik tersayang, Fajri
Keumalasari, Amd.Ak., dan Zuhra Safitri sebagai keluarga penulis yang
banyak memberikan bantuan baik dalam bentuk moril dan materil bagi penulis
selama menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian tesis ini.
7. Teman-teman seperjuangan di angkatan 2009 Yulis Kartika, M.Si., Apt., Mirna
Risna Lovinanda Lubis, S.Farm., Apt., Dwi Darmawaty Lubis, S.Farm., Apt.,
Nura Ramadhani, S.Farm., Apt., dan Rina Febriani, S.Sos., serta teman-teman
seperjuangan mahasiswa Magister Farmasi Diah Ramadhani, M.Si., Apt., Reny
Haryani, M.S., Apt., Rialita Lifiani, M.Si., Apt., Yanna Rotua Sihombing,
M.Si., Apt., Saru Noliqo Rangkuti, M.Si., Apt., Koko Prananda Tarigan, M.Si.,
Apt., Eva Diansari Marbun, M.Si., Apt., Dara Fahria Nopa, M.Si., Apt.,
Asyrun Alkhairi Lubis, M.Si., Apt., Denny Satria, M.Si., Apt., Nevi Hayati
Utami, S.Farm., dan Hendra Gunawan, S.Farm., serta semua pihak yang tidak
dapat penulis sebutkan satu per satu yang selalu mendukung penulis.
Serta buat semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu
yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang
vii
Universitas Sumatera Utara
Maha Esa memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan
yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dan semua
pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi
ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.
Medan, Februari 2017
Penulis,
(Safriana)
NIM 147014033
viii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF EKSTRAK DAUN AFRIKA
(Vernonia amygdalina Del.) TERHADAP SEL VERO YANG
DIINDUKSI HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
ABSTRAK
Tubuh kita memerlukan antioksidan sebagai suatu senyawa yang memiliki
aktivitas sitoprotektif yang dapat menetralisir radikal bebas. Mekanisme
perlindungan dibutuhkan untuk melindungi tubuh dari penyakit degeneratif yang
salah satunya adalah kanker. Keanekaragaman hayati Indonesia sangat berpotensi
dalam penemuan senyawa baru yang memiliki aktivitas sitoprotektif, salah
satunya adalah daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.). Tujuan dari penelitian
ini adalah untuk menguji aktivitas sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel
Vero yang diinduksi hidrogen peroksida (H2O2) melalui uji viabilitas sel,
apoptosis dan pengujian ekspresi ROS.
Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental, meliputi
identifikasi tumbuhan, pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, penetapan
kadar air simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak dan pengujian efek
sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2 melalui
analisis viabilitas sel secara MTT, analisis apoptosis secara flow sitometri dan
analisis ekspresi ROS secara imunositokimia.
Hasil penetapan kadar air serbuk simplisia daun Afrika sebesar 7,97%.
Golongan senyawa kimia yang terdapat dalam simplisia dan ekstrak daun Afrika
hasil skrining fitokimia adalah flavonoid, glikosida, saponin, tanin dan
steroid/triterpenoid. Pengujian efek sitoprotektif ekstrak daun Afrika terhadap sel
Vero yang diinduksi H2O2 untuk analisis viabilitas sel secara MTT menunjukkan
Persentase sel Vero hidup terbesar terdapat pada pemberian EEDA 50 μg/ml
sebesar 78,75±2,51%; EEADA 12,5 μg/ml sebesar 68,99±0,91% dan ENDA 12,5
μg/ml sebesar 42,70±2,63%. Pada analisis apoptosis secara flow sitometri
menunjukkan persentase jumlah sel hidup kontrol sel sebesar 80,56%, kontrol
sel+ H2O2 sebesar 10,32%, EEDA 50 μg/ml sebesar 59,56% dan EEADA 12,5
μg/ml sebesar 40,88%.
Hal ini menunjukkan bahwa EEDA dan EEADA dapat meningkatkan
jumlah sel hidup atau memiliki aktivitas sitoprotektif dibandingkan dengan
jumlah sel hidup pada pemberian H2O2. Analisis ekspresi ROS secara
imunositokimia menunjukkan EEDA dan EEADA dapat menurunkan ekspresi
ROS yang ditunjukkan dengan berkurangnya warna coklat pada sel dibandingkan
dengan kontrol sel yang diberi H2O2 yang dominan berwarna coklat.
Kata kunci: Daun Afrika, Vernonia amygdalina Del., Sel Vero,Sitoprotektif, MTT,
Flow Sitometri, Imunositokimia
ix
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF EXTRACT AFRICAN
LEAVES (Vernonia amygdalina Del.) AGAINTS THE VERO
CELLS INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE (H2O2)
ABSTRACT
Our bodies need antioxidants as a compound having cytoprotective
activities that can neutralize free radicals. The mechanism of protection is needed
to protect the body from degenerative diseases, one of which is cancer. Indonesia
has biodiversity which is potential in the new compounds discoveries, one of
which is the African leaves (Vernonia amygdalina Del.). The purposes of the
study were to evaluate the cytoprotective activity of extract African leaves against
the Vero cells induced by hydrogen peroxide (H2O2) through the test cell viability,
apoptotic and to observe the expression of ROS.
The research methods were experimental research, including identification
of plants, collection and processing of plant material, determination of water
content of simplicia, phytochemical screening, the manufacture of extraction and
testing of cytoprotective effects of extract African leaves against Vero cells
induced by H2O2 through the analysis of cell viability by MTT, analysis of
apoptotic by flow cytometry and ROS expression analysis by
immunocytochemistry.
The results of the determination of the water content of 7.97%. Group of
chemical compounds contained in simplicia and extracts of African leaves
phytochemical screening results are flavonoids, glycosides, saponins, tannins and
steroids/triterpenoids. Testing of extract African leaves cytoprotective effects
against the Vero cells induced by H2O2 for analysis of cell viability by MTT
showed the largest percentage of living Vero cells contained in the granting
EEDA 50 µg/mL of 78.75 ± 2.51%; EEADA 12.5 µg/mL at 68.99 ± 0.91% and
ENDA 12.5 µg/mL of 42.70 ± 2.63%. In the analysis of apoptotic by flow
cytometry shows the percentage of viable cell count of 80.56% of control cells,
control cells + H2O2 at 10.32%, EEDA 50 µg/mL of 59.56% and EEADA 12.5
µg/mL at 40.88 %.
This shows that the EEDA and EEADA can increase the number of living
cells or have cytoprotective activity compared to the amount of living cells in
granting H2O2. ROS expression analysis by immunocytochemistry showed EEDA
and EEADA can decrease the expression of ROS as indicated by a reduction in
brown on cells compared with control cells by H2O2 dominant brown.
Keywords: African Leaves, Vernonia amygdalina Del., Vero cells, Cytoprotective,
MTT, Flow Cytometry, Immunocytochemistry
x
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
`
Halaman
JUDUL ........................................................................................................
i
HALAMAN JUDUL ...................................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ............................................................
iv
LEMBAR PENGESAHAN TESIS .............................................................. v
SURAT PERNYATAAN ............................................................................ vi
KATA PENGANTAR ................................................................................ vii
ABSTRAK .................................................................................................. x
ABSTRACT ................................................................................................ xi
DAFTAR ISI ............................................................................................... xii
DAFTAR TABEL ................................................................ ....................... xvi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xviii
BAB I
PENDAHULUAN .......................................................................
1
1.1 Latar Belakang .......................................................................
1
1.2 Perumusan Masalah ...............................................................
4
1.3 Kerangka Pikir Penelitian ......................................................
5
1.4 Hipotesis ................................................................................
7
1.5 Tujuan Penelitian ...................................................................
7
1.6 Manfaat Penelitian .................................................................
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................
8
2.1 Penyakit Degeneratif ..............................................................
8
2.1.1 Jenis-jenis penyakit degeneratif .....................................
9
2.2 Kanker ....................................................................................
13
xi
Universitas Sumatera Utara
2.2.1 Definisi kanker ..............................................................
13
2.2.2 Penyebab kanker ...........................................................
15
2.2.3 Gambaran klinik kanker ................................................
17
2.2.4 Karsinogenesis ..............................................................
18
2.2.5 Apoptosis ......................................................................
20
2.2.6 Sel Vero ........................................................................
23
2.3 Reactive Oxygen Species (ROS) ............................................
23
2.4 Radikal Bebas .........................................................................
27
2.4.1 Definisi radikal bebas ...................................................
27
2.4.2 Pembentukan radikal bebas ..........................................
28
2.4.3 Sumber radikal bebas ....................................................
29
2.4.4 Reaksi perusakan oleh radikal bebas ............................
30
2.5 Antioksidan ............................................................................
31
2.6 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .....................................
32
2.6.1 Daun Afrika ..................................................................
35
2.6.2 Metode ekstraksi ...........................................................
37
2.6.3 Metode pengujian aktivitas sitoprotektif ......................
39
BAB III METODE PENELITIAN .............................................................
43
3.1 Alat dan Bahan .......................................................................
43
3.1.1 Alat ................................................................................
43
3.1.2 Bahan ............................................................................
43
3.2 Pengambilan dan Pengolahan Sampel ...................................
44
3.2.1 Pengambilan sampel ......................................................
44
3.2.2 Identifikasi daun Afrika .................................................
44
3.2.3 Pembuatan simplisia ......................................................
44
xii
Universitas Sumatera Utara
3.3 Pemeriksaan Makroskopik .....................................................
45
3.4 Pemeriksaan Mikroskopik .....................................................
45
3.5 Penetapan Kadar Air ..............................................................
45
3.6 Pembuatan Ekstrak .................................................................
46
3.7 Skrining Fitokimia .................................................................
46
3.7.1 Pemeriksaan flavonoid ..................................................
47
3.7.2 Pemeriksaan alkaloid ....................................................
47
3.7.3 Pemeriksaan saponin .....................................................
47
3.7.4 Pemeriksaan tanin .........................................................
48
3.7.5 Pemeriksaan glikosida ...................................................
48
3.7.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ...................................
48
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan ......................................................
49
3.9 Pembuatan Media ..................................................................
49
3.9.1 Pembuatan media M199 ................................................
49
3.9.2 Pembuatan media MK-M199 ........................................
50
3.10 Penumbuhan Sel Vero ..........................................................
50
3.10.1 Subkultur sel Vero .....................................................
50
3.10.2 Panen sel Vero ...........................................................
51
3.10.3 Perhitungan sel Vero .................................................
51
3.11 Pembuatan Larutan Uji ........................................................
52
3.12 Analisis Viabilitas Sel ..........................................................
53
3.13 Pengujian Apoptosis ............................................................
54
3.14 Analisis Ekspresi ROS .........................................................
54
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
56
4.1 Identifikasi Tumbuhan ..........................................................
56
xiii
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pemeriksaan Makroskopik ...................................................
56
4.3 Pemeriksaan Mikroskopik ....................................................
56
4.4 Penetapan Kadar Air .............................................................
56
4.5 Skrining Fitokimia ................................................................
57
4.6 Aktivitas Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika ........................
58
4.6.1 Analisis viabilitas sel dengan metode MTT ..................
58
4.6.2 Pengamatan apoptosis dengan flow sitometri ...............
63
4.6.3 Analisis ekspresi ROS secara imunositokimia ..............
67
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................
71
5.1 Kesimpulan ...........................................................................
71
5.2 Saran .....................................................................................
72
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
73
LAMPIRAN ………. ...................................................................................
83
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
2.1 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .................................................
32
4.1 Skrining Fitokimia Daun Afrika .........................................................
57
4.2 Persentase Pengujian Apoptosis .........................................................
66
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian ..................................................
6
2.1 Oksidasi Fosforilasi .......................................................................
25
2.2
Reduksi MTT menjadi Formazan ..................................................
39
3.1. Hemositometer ...............................................................................
52
4.1 Grafik Konsentrasi Larutan Uji terhadap Persen Viabilitas Sel ....
60
4.2
Pengamatan Apoptosis terhadap Sel Vero .....................................
65
4.3
Imunositokimia pada Sel Vero ......................................................
69
xvi
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1
Hasil Identifikasi Tumbuhan .........................................................
83
2
Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan .........................................
84
3
Gambar Tumbuhan Daun Afrika dan Daun Afrika Segar ...........
85
4
Gambar Simplisia dan Serbuk Simplisia Daun Afrika ................
86
5
Hasil Mikroskopik Daun Afrika ...................................................
87
6
Gambar Alat .................................................................................
88
7
Bagan Pembuatan Ekstrak Daun Afrika ......................................
89
8
Bagan Alur Penelitian ..................................................................
90
9
Perhitungan Hasil Penetapan Kadar Air Serbuk Simplisia
Daun Afrika ..................................................................................
91
10
Perhitungan Konsentrasi Larutan Uji ...........................................
92
11
Perhitungan Pengenceran H2O2.....................................................
93
12
Hasil Analisis Statistik Viabilitas Sel ..........................................
94
xvii
Universitas Sumatera Utara