Efek Sitoprotektif Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.) terhadap Sel Vero yang diinduksi Hidrogen Peroksida (H2O2)
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit
degeneratif
termasuk
penyakit
kronik
yang
banyak
mempengaruhi kualitas hidup serta produktivitas seseorang. Terdapat bermacammacam penyakit degeneratif dan hampir semua organ bisa terkena penyakit
degeneratif. Penyakit degeneratif tersebut antara lain penyakit kardiovaskuler,
hipertensi, diabetes mellitus dan kanker (Brunner dan Suddarth, 2002). Penyakit
degeneratif merupakan penyebab kematian terbesar di dunia. Menurut World
Health Organization (WHO), badan lembaga kesehatan dari PBB, terdapat
hampir sekitar 17 juta orang meninggal dunia akibat penyakit degeneratif setiap
tahun (Depkes RI, 2013).
Kanker merupakan suatu penyakit yang selnya mengalami pertumbuhan
tidak normal dan cepat yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak
terkendali dan memiliki kemampuan untuk menyerang jaringan biologis lainnya.
Kanker bukanlah penyakit menular, namun menjadi masalah kesehatan yang
serius di belahan dunia manapun termasuk di Indonesia (Diandana, 2009; Hawari,
2004). Secara fisiologis, sistem pertumbuhan sel dalam individu diatur oleh suatu
sistem keseimbangan, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apabila terjadi apoptosis
yang berlebih, maka akan mengalami kemunduran fungsi dari suatu sistem organ
yang dapat menimbulkan penyakit. Sebaliknya, apabila terjadi proliferasi yang
berlebih, maka akan membentuk suatu massa tumor (malignancy) yang akan
mengarah pada kanker (Sudiana, 2011; Sharma, 2000).
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron yang
tidak berpasangan pada orbital terluarnya dan dapat berdiri sendiri (Clarkson dan
1
Universitas Sumatera Utara
Thompson, 2000). Radikal bebas secara umum terdiri dari dua bentuk yaitu
Reactive Oxygen Species (ROS) dan Reactive Nitrogen Species (RNS). ROS
adalah senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif seperti
hidrogen peroksida (H2O2), sedangkan RNS sering dianggap sebagai subkelas dari
ROS (Kothari, et al., 2010). Kedua spesies ini mengakibatkan disfungsi
mitokondrial, gangguan produksi protein dan agregasi protein yang menyebabkan
modulasi aktivasi apoptosis, nekrosis dan autophagis sel (Navarro, et al., 2014).
Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu maupun diproduksi secara
kontinyu sebagai konsekuensi dari metabolisme normal (Septiana, et al., 2006).
Kondisi ini pada akhirnya akan berdampak sangat luas pada tubuh seperti
terjadinya kanker dan penyakit-penyakit kronis lainnya (Waris dan Ahsan, 2006).
Oleh sebab itu, tubuh kita memerlukan suatu substansi penting yaitu antioksidan
dan juga senyawa yang memiliki aktivitas sitoprotektif yang dapat membantu
melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif
senyawa ini. Antioksidan berfungsi mengatasi atau menetralisir radikal bebas
serta dapat mencegah terjadinya kerusakan tubuh dari timbulnya penyakit
degeneratif (Kosasih, et al., 2006).
Aktivitas sitoprotektif suatu senyawa dalam memproteksi sel diperkirakan
diperoleh dengan cara homeostatis redoks dari reactive oxygen species (ROS) dan
reactive nitrogen species (RNS) oleh senyawa antioksidan (Alezandro, et al.,
2013). Pengujian sitoprotektif dilakukan dengan menggunakan pereaksi MTT
pada sel hidup. Metode ini dapat digunakan untuk mengukur jumlah sel,
sitotoksisitas, proliferasi dan aktivitas sel. Hasil dari pengujian dapat dibaca pada
multi-well scanning spektrofotometer (ELISA reader) dan menunjukkan tingkat
presisi yang tinggi (Montagnon, et al., 1981).
2
Universitas Sumatera Utara
Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun
antioksidan alami. Banyak bahan pangan yang dapat dijadikan sumber antioksidan
alami,
seperti
rempah-rempah
dan
sayur-sayuran.
Kebanyakan
sumber
antioksidan alami adalah tumbuhan dan umumnya merupakan senyawa fenolik
yang tersebar di seluruh bagian tumbuhan baik di kayu, biji, daun, buah, akar,
bunga maupun serbuk sari (Sarastani, et al., 2002). Senyawa fenolik atau
polifenolik antara lain dapat berupa golongan flavonoid. Kemampuan flavonoid
sebagai antioksidan telah banyak diteliti, flavonoid memiliki kemampuan untuk
mereduksi radikal bebas (Giorgio, 2000).
Keanekaragaman hayati Indonesia sangat berpotensi dalam penemuan
senyawa baru yang berkhasiat sebagai antikanker, salah satunya adalah daun
Afrika (Vernonia amygdalina Del.). Tumbuhan yang berasal dari Afrika ini
adalah salah satu tumbuhan dari suku Asteraceae, yang banyak digunakan sebagai
obat tradisional dari genus Vernonia. Khasiatnya antara lain sebagai antibakteri,
antijamur, antimalaria, antioksidan, antidiabetes, dan sangat berguna sebagai
bahan baku obat. Tumbuhan ini tergolong baru di Indonesia tetapi sudah mulai
dikenal oleh masyarakat di Indonesia dan sudah digunakan sebagai tanaman obat
untuk mengobati berbagai jenis penyakit dan juga telah dibuktikan dalam bidang
fitokimia (Atangwho, et al., 2010).
Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak air daun Afrika
mengandung karbohidrat, tanin, saponin, flavonoid dan glikosida (Nwanjo dan
Nwokoro, 2004). Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak etanol
daun
Afrika
mengandung
flavonoid,
glikosida,
saponin,
tanin
dan
triterpenoid/steroid (Setiawan, 2012). Daun Afrika memiliki rasa yang pahit dari
seskuiterpen lakton, vernolepin, vernodalin, vernomygdin dan steroid glikosida.
3
Universitas Sumatera Utara
Daun Afrika memiliki aktivitas antioksidan yang sangat tinggi (Iwakolun, et al.,
2006). Beberapa peneliti sebelumnya telah menggunakan ekstrak air dan ekstrak
etanol-air. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari daun ini
memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dari ekstrak air (Ijeh dan Ejike,
2010). Ekstrak air daun Afrika memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 =
0,1367±0,001 mg/mL dan ektrak metanol dengan nilai IC50 = 0,2172±0,004
mg/mL dengan metode DPPH. Potensial scavenging DPPH dari ekstrak lebih
rendah secara signifikan dibandingkan dengan kuersetin sebagai standard
flavonoid yang digunakan dengan nilai IC50 = 0,006187±0,00018 mg/mL
(Atanghwo, et al., 2013). Hasil pengujian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun
Afrika terhadap sel Vero menunjukkan nilai IC50 sebesar 79,561 µg/mL.
Penurunan nilai IC50 berkorelasi dengan peningkatan sitotoksisitas (Hartati, 2015).
Berdasarkan hal tersebut di atas maka penelitian ini dilakukan untuk
menguji efek sitoprotektif dari ekstrak daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap sel Vero. Sel Vero atau disebut juga sel normal yang berasal dari organ
ginjal monyet hijau asal Afrika. Bahan yang digunakan sebagai penginduksi
radikal bebas pada uji sitoprotektif adalah hidrogen peroksida (H2O2), sebagai
salah satu radikal bebas dari bahan kimia eksogen.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang, maka perumusan masalah dalam
penelitian ini adalah:
a. apakah ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan viabilitas sel Vero yang
diinduksi hidrogen peroksida?
b. apakah ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang
diinduksi hidrogen peroksida?
4
Universitas Sumatera Utara
c. apakah ekstrak daun Afrika dapat mengurangi ROS (Reactive Oxygen
Species) pada sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida?
1.3 Kerangka Pikir Penelitian
Sel Vero yang diinduksi dengan H2O2 mengakibatkan stres oksidatif pada
sel Vero sehingga merusak sel Vero. Dengan pemberian ENDA, EEADA dan
EEDA yang mengandung flavonoid menunjukkan adanya aktivitas sitoprotektif.
Hubungan variabel-variabel tersebut dapat dilihat pada kerangka pikir penelitian
yang ditunjukkan pada Gambar 1.1.
5
Universitas Sumatera Utara
Variabel Bebas
Sel Vero
ENDA/EEADA/EEDA
H2O2 0,8 mM
Uji MTT
Viabilitas sel
% jumlah sel
hidup
Ekstrak yang berpotensi
Apoptosis
Ekspresi gen
Sel apoptosis
Pengikatan Antibodi
dengan antigen
% sel yang
apoptosis
Jumlah warna
coklat sedikit
Viabilitas sel meningkat
Gambar 1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian
Keterangan:
= Variabel terikat
= Parameter
6
Universitas Sumatera Utara
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian ini adalah
sebagai berikut:
a. ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan viabilitas sel Vero yang diinduksi
hidrogen peroksida.
b. ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang diinduksi
hidrogen peroksida.
c. ekstrak daun Afrika dapat mengurangi ROS (Reactive Oxygen Species)
pada sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
1.5 Tujuan Penelitian
Berdasarkan hipotesis di atas, maka tujuan penelitian ini adalah:
a. untuk mengetahui apakah ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan
viabilitas sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
b. untuk mengetahui ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel
Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
c. untuk mengetahui apakah ekstrak daun Afrika dapat mengurangii ROS
(Reactive Oxygen Species) pada sel Vero yang diinduksi hidrogen
peroksida.
1.6 Manfaat Penelitian
Berdasarkan tujuan penelitian di atas, penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah kepada tenaga kesehatan, khususnya farmasis,
bahwa daun Afrika dapat berfungsi sebagai salah satu obat tradisional yang
bersifat sitoprotektif terhadap sel Vero.
7
Universitas Sumatera Utara
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit
degeneratif
termasuk
penyakit
kronik
yang
banyak
mempengaruhi kualitas hidup serta produktivitas seseorang. Terdapat bermacammacam penyakit degeneratif dan hampir semua organ bisa terkena penyakit
degeneratif. Penyakit degeneratif tersebut antara lain penyakit kardiovaskuler,
hipertensi, diabetes mellitus dan kanker (Brunner dan Suddarth, 2002). Penyakit
degeneratif merupakan penyebab kematian terbesar di dunia. Menurut World
Health Organization (WHO), badan lembaga kesehatan dari PBB, terdapat
hampir sekitar 17 juta orang meninggal dunia akibat penyakit degeneratif setiap
tahun (Depkes RI, 2013).
Kanker merupakan suatu penyakit yang selnya mengalami pertumbuhan
tidak normal dan cepat yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak
terkendali dan memiliki kemampuan untuk menyerang jaringan biologis lainnya.
Kanker bukanlah penyakit menular, namun menjadi masalah kesehatan yang
serius di belahan dunia manapun termasuk di Indonesia (Diandana, 2009; Hawari,
2004). Secara fisiologis, sistem pertumbuhan sel dalam individu diatur oleh suatu
sistem keseimbangan, yaitu apoptosis dan proliferasi. Apabila terjadi apoptosis
yang berlebih, maka akan mengalami kemunduran fungsi dari suatu sistem organ
yang dapat menimbulkan penyakit. Sebaliknya, apabila terjadi proliferasi yang
berlebih, maka akan membentuk suatu massa tumor (malignancy) yang akan
mengarah pada kanker (Sudiana, 2011; Sharma, 2000).
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron yang
tidak berpasangan pada orbital terluarnya dan dapat berdiri sendiri (Clarkson dan
1
Universitas Sumatera Utara
Thompson, 2000). Radikal bebas secara umum terdiri dari dua bentuk yaitu
Reactive Oxygen Species (ROS) dan Reactive Nitrogen Species (RNS). ROS
adalah senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif seperti
hidrogen peroksida (H2O2), sedangkan RNS sering dianggap sebagai subkelas dari
ROS (Kothari, et al., 2010). Kedua spesies ini mengakibatkan disfungsi
mitokondrial, gangguan produksi protein dan agregasi protein yang menyebabkan
modulasi aktivasi apoptosis, nekrosis dan autophagis sel (Navarro, et al., 2014).
Radikal bebas dapat berasal dari polusi, debu maupun diproduksi secara
kontinyu sebagai konsekuensi dari metabolisme normal (Septiana, et al., 2006).
Kondisi ini pada akhirnya akan berdampak sangat luas pada tubuh seperti
terjadinya kanker dan penyakit-penyakit kronis lainnya (Waris dan Ahsan, 2006).
Oleh sebab itu, tubuh kita memerlukan suatu substansi penting yaitu antioksidan
dan juga senyawa yang memiliki aktivitas sitoprotektif yang dapat membantu
melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif
senyawa ini. Antioksidan berfungsi mengatasi atau menetralisir radikal bebas
serta dapat mencegah terjadinya kerusakan tubuh dari timbulnya penyakit
degeneratif (Kosasih, et al., 2006).
Aktivitas sitoprotektif suatu senyawa dalam memproteksi sel diperkirakan
diperoleh dengan cara homeostatis redoks dari reactive oxygen species (ROS) dan
reactive nitrogen species (RNS) oleh senyawa antioksidan (Alezandro, et al.,
2013). Pengujian sitoprotektif dilakukan dengan menggunakan pereaksi MTT
pada sel hidup. Metode ini dapat digunakan untuk mengukur jumlah sel,
sitotoksisitas, proliferasi dan aktivitas sel. Hasil dari pengujian dapat dibaca pada
multi-well scanning spektrofotometer (ELISA reader) dan menunjukkan tingkat
presisi yang tinggi (Montagnon, et al., 1981).
2
Universitas Sumatera Utara
Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun
antioksidan alami. Banyak bahan pangan yang dapat dijadikan sumber antioksidan
alami,
seperti
rempah-rempah
dan
sayur-sayuran.
Kebanyakan
sumber
antioksidan alami adalah tumbuhan dan umumnya merupakan senyawa fenolik
yang tersebar di seluruh bagian tumbuhan baik di kayu, biji, daun, buah, akar,
bunga maupun serbuk sari (Sarastani, et al., 2002). Senyawa fenolik atau
polifenolik antara lain dapat berupa golongan flavonoid. Kemampuan flavonoid
sebagai antioksidan telah banyak diteliti, flavonoid memiliki kemampuan untuk
mereduksi radikal bebas (Giorgio, 2000).
Keanekaragaman hayati Indonesia sangat berpotensi dalam penemuan
senyawa baru yang berkhasiat sebagai antikanker, salah satunya adalah daun
Afrika (Vernonia amygdalina Del.). Tumbuhan yang berasal dari Afrika ini
adalah salah satu tumbuhan dari suku Asteraceae, yang banyak digunakan sebagai
obat tradisional dari genus Vernonia. Khasiatnya antara lain sebagai antibakteri,
antijamur, antimalaria, antioksidan, antidiabetes, dan sangat berguna sebagai
bahan baku obat. Tumbuhan ini tergolong baru di Indonesia tetapi sudah mulai
dikenal oleh masyarakat di Indonesia dan sudah digunakan sebagai tanaman obat
untuk mengobati berbagai jenis penyakit dan juga telah dibuktikan dalam bidang
fitokimia (Atangwho, et al., 2010).
Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak air daun Afrika
mengandung karbohidrat, tanin, saponin, flavonoid dan glikosida (Nwanjo dan
Nwokoro, 2004). Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak etanol
daun
Afrika
mengandung
flavonoid,
glikosida,
saponin,
tanin
dan
triterpenoid/steroid (Setiawan, 2012). Daun Afrika memiliki rasa yang pahit dari
seskuiterpen lakton, vernolepin, vernodalin, vernomygdin dan steroid glikosida.
3
Universitas Sumatera Utara
Daun Afrika memiliki aktivitas antioksidan yang sangat tinggi (Iwakolun, et al.,
2006). Beberapa peneliti sebelumnya telah menggunakan ekstrak air dan ekstrak
etanol-air. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari daun ini
memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dari ekstrak air (Ijeh dan Ejike,
2010). Ekstrak air daun Afrika memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 =
0,1367±0,001 mg/mL dan ektrak metanol dengan nilai IC50 = 0,2172±0,004
mg/mL dengan metode DPPH. Potensial scavenging DPPH dari ekstrak lebih
rendah secara signifikan dibandingkan dengan kuersetin sebagai standard
flavonoid yang digunakan dengan nilai IC50 = 0,006187±0,00018 mg/mL
(Atanghwo, et al., 2013). Hasil pengujian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun
Afrika terhadap sel Vero menunjukkan nilai IC50 sebesar 79,561 µg/mL.
Penurunan nilai IC50 berkorelasi dengan peningkatan sitotoksisitas (Hartati, 2015).
Berdasarkan hal tersebut di atas maka penelitian ini dilakukan untuk
menguji efek sitoprotektif dari ekstrak daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)
terhadap sel Vero. Sel Vero atau disebut juga sel normal yang berasal dari organ
ginjal monyet hijau asal Afrika. Bahan yang digunakan sebagai penginduksi
radikal bebas pada uji sitoprotektif adalah hidrogen peroksida (H2O2), sebagai
salah satu radikal bebas dari bahan kimia eksogen.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang, maka perumusan masalah dalam
penelitian ini adalah:
a. apakah ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan viabilitas sel Vero yang
diinduksi hidrogen peroksida?
b. apakah ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang
diinduksi hidrogen peroksida?
4
Universitas Sumatera Utara
c. apakah ekstrak daun Afrika dapat mengurangi ROS (Reactive Oxygen
Species) pada sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida?
1.3 Kerangka Pikir Penelitian
Sel Vero yang diinduksi dengan H2O2 mengakibatkan stres oksidatif pada
sel Vero sehingga merusak sel Vero. Dengan pemberian ENDA, EEADA dan
EEDA yang mengandung flavonoid menunjukkan adanya aktivitas sitoprotektif.
Hubungan variabel-variabel tersebut dapat dilihat pada kerangka pikir penelitian
yang ditunjukkan pada Gambar 1.1.
5
Universitas Sumatera Utara
Variabel Bebas
Sel Vero
ENDA/EEADA/EEDA
H2O2 0,8 mM
Uji MTT
Viabilitas sel
% jumlah sel
hidup
Ekstrak yang berpotensi
Apoptosis
Ekspresi gen
Sel apoptosis
Pengikatan Antibodi
dengan antigen
% sel yang
apoptosis
Jumlah warna
coklat sedikit
Viabilitas sel meningkat
Gambar 1.1 Skema Kerangka Pikir Penelitian
Keterangan:
= Variabel terikat
= Parameter
6
Universitas Sumatera Utara
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian ini adalah
sebagai berikut:
a. ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan viabilitas sel Vero yang diinduksi
hidrogen peroksida.
b. ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang diinduksi
hidrogen peroksida.
c. ekstrak daun Afrika dapat mengurangi ROS (Reactive Oxygen Species)
pada sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
1.5 Tujuan Penelitian
Berdasarkan hipotesis di atas, maka tujuan penelitian ini adalah:
a. untuk mengetahui apakah ekstrak daun Afrika dapat meningkatkan
viabilitas sel Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
b. untuk mengetahui ekstrak daun Afrika dapat menurunkan apoptosis sel
Vero yang diinduksi hidrogen peroksida.
c. untuk mengetahui apakah ekstrak daun Afrika dapat mengurangii ROS
(Reactive Oxygen Species) pada sel Vero yang diinduksi hidrogen
peroksida.
1.6 Manfaat Penelitian
Berdasarkan tujuan penelitian di atas, penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah kepada tenaga kesehatan, khususnya farmasis,
bahwa daun Afrika dapat berfungsi sebagai salah satu obat tradisional yang
bersifat sitoprotektif terhadap sel Vero.
7
Universitas Sumatera Utara