Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara

(1)

TESIS

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK

ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi

cortex) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF

EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG

(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

LEMBAR PERSETUJUAN TESIS

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF

EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG

(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

Medan, April 2014 Menyetujui:

Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,

Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195301011983031004 NIP 195311281983031002

Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed. NIP 195103261978022001 NIP 196602091992031003

Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195301011983031004

Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 195103261978022001

Mengetahui: Disahkan Oleh:

Ketua Program Studi, Dekan,

Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195409091982011001 NIP 195311281983031002

(4)

PENGESAHAN TESIS

Nama Mahasiswa : Vonna Aulianshah Nomor Induk Mahasiswa : 127014001

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Kamis tanggal tujuh belas bulan April tahun dua ribu empat belas.

Mengesahkan: Tim Penguji Tesis

Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed.

(5)

SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama Mahasiswa : Vonna Aulianshah Nomor Induk Mahasiswa : 127014001

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara

Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.

Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.

Medan, April 2014

Yang membuat pernyataan,

Vonna Aulianshah NIM 127014001

(6)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala nikmat yang tak terhingga sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul “Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara”,sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:

1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K).

2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.

3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.

4. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Pembimbing yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.

(7)

5. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., dan bapak Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed., sebagai penguji.

6. Ibu Dra. Suwarti, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta staf.

7. Bapak Prof. Dr. Supargiyono Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.

Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada hentinya kepada ayahanda Drs. M. Thaib M. Syah, M.Pd., dan ibunda Dra. Elli Dahnum tercinta, yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi kesuksesan penulis, juga kepada saudaraku Verdy Razqianshah dan Vahmi Khairianshah, juga yang teristimewa Cut Putri Agustina, teman-teman Denny Satria, Fitriyanti, Mainal Furqan, Sri Wastuti, Ninda T.M, serta buat semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

Medan, April 2014 Penulis,

Vonna Aulianshah NIM 127014001

(8)

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL

KANKER PAYUDARA

ABSTRAK

Kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita. Kanker merupakan pertumbuhan sel-sel tubuh yang tidak terkendali atau abnormal. Minat terhadap penggunaan obat tradisional khususnya untuk penyakit kanker akhir-akhir ini cenderung meningkat. Ekstrak etanol kulit batang pohon Tanjung (EEKBPT) diketahui memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui karakteristik simplisia dan EEKBPT, dan untuk mengetahui aktivitas fraksi aktif EEKBPT melalui nilai IC50,

Fraksi diperoleh melalui ekstraksi cair-cair dari EEKBPT menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat. Dari ekstraksi tersebut diperoleh fraksi

n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air (sisa). Nilai IC

selektivity index (SI), mekanisme penghambatan siklus sel dan efek penekanan ekspresi enzim COX-2 sel kanker payudara T47D.

Hasil karakterisasi simplisia dan EEKBPT diperoleh kadar air berturut-turut5,32% dan 22,58%;kadar sari larut air 16,57%dan 64,81%; kadar sari larut dalam etanol 20,84% dan 64,15%; kadar abu total 3,23% dan 1,01%;serta kadar abu tidak larut asam 1,54% dan 0,06%. Hasil skrining fitokimia ditemukan golongan steroid/triterpenoid dalam fraksi n-heksana; flavonoid, tanin, glikosida, dalam fraksi etil asetat dan flavonoid, saponin, glikosida dalam fraksi air.

fraksi diperoleh melalui uji sitotoksik terhadapsel T47D dan sel normal (Vero) menggunakan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromida] untuk selanjutnya ditentukan nilai SI masing-masing fraksi. Fraksi yang paling aktif dilanjutkan untuk uji mekanisme penghambatan siklus sel dengan metode flowsitometri dan efek penekanan ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D dengan metode imunositokimia.

Aktivitas antikanker fraksi aktif EEKBPT ditunjukkan melalui nilai IC50

fraksi n-heksana, etilasetat, dan air terhadap sel T47D berturut-turut sebesar 5796,218 µg/ml; 398,236 µg/ml; dan 145,068 µg/ml; dan fraksi air merupakan fraksi yang paling aktif. Nilai SI 4,130 yang menunjukkan fraksi ait selektif terhadapsel T47D, menghambat siklus sel padafase G2-M, dan mampu menekan

ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D. Berdasarkan beberapa parameter di atas dapat disimpulkan bahwa fraksi aktif EEKBPT memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D.

Kata Kunci: fraksi n-heksana, fraksi etilasetat, fraksi air, fraksi aktif, T47D, Vero, sitotoksik, MTT, flowsitometri, imunositokimia, COX-2.

(9)

BARKETHANOLICEXTRACT (MIMUSOPSI CORTEX) AGAINSTBREASTCANCER CELL

Abstract

Breast cancer is primary cause of death on women. Cancer is growth

uncontrolled or abnormal of cells. Interest touse traditional medicine, especially

forcanceron recent years tended to increase. Mimusopsi cortex’s ethanolic extract are known have cytotoxic activity against T47D cell. The aims ofthis study was investigated the characteristics of simplex and Mimusopsi cortex’s ethanolic extract, and investigated the anticancer activity of active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract through calculated the IC50 values, selectivity index (SI)

values, the mechanism of cell cycle inhibition and suppression effect of COX-2 enzyme expressionon T47D breast cancer cell.

Fractions were obtained by liquid-liquid extraction of values using n -hexane and ethylacetate solvent. From the extraction were obtained n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and aqueous fraction (residu). IC50 values of

fractions were obtained through the cytotoxic test against T47D cell and normal cells (Vero) using MTT [3 -(4,5-dimetiltiazol-2-yl) -2,5difeniltetrazoliumbromide] method, then was determined SI values of each fraction. The most active fraction was continued to mechanism of cell cycle inhibiti on test using flowcyitometry method and suppresion effects of COX-2 enzyme expression on T47D cells using immunocytochemistry method.

Based ons implex and ethanolic extract of Mimusopsi cortex

characterization showed water content respectively 5.32% and 22.58%, water-soluble extract content 16.57% and 64.81%; ethanol-water-soluble extract content 20.84% and 64.15%, total ash content 3.23% and 1.01%, and acidic unsoluble ash 1.54% and 0.06%. Phytochemical screening showed steroids/triterpenoids in n -hexane fraction; flavonoids, tannins, glycosides,in ethylacetate and flavonoids, saponins, glycosides in aqueous fraction.

Anticancer activity of active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract was showed through IC50 values of n-hexane fraction, ethylacetate, and

aqueous to T47D cells, respectively 5796.218 µg/ml, 398.236 µg/ml, and 145.068 µg/ml, Aqueous fraction is the most active fraction of Mimusopsi cortex’s

ethanolic extract. SI value of 4.130 indicates the aqueous fraction selective against T47D cells, inhibited the G2-M phase cell cycle, and able to suppressed the COX-2 enzyme expression of T47D cells. Based on some parameters above had conclusive that active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract has anticancer activity on T47D breast cancer cells.

Keywords: Ethanolic extract of Mimusopsi corte xfractions, T47D, Vero, cytotoxic, MTT, flowcytometry, immunocytochemistry, COX-2.

(10)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

PENGESAHAN TESIS ... iv

SURAT PERNYATAAN ... v

KATA PENGANTAR ... vi

ABSTRAK ... viii

ABSTRACT ... ix

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xv

DAFTAR GAMBAR ... xvi

DAFTAR LAMPIRAN xvii BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 6

1.3Hipotesis ... 7

1.4 Tujuan Penelitian ... 7

1.5 Manfaat Penelitian ... 8

1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 8

1.7 Alur Penelitian ... 9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 11

2.1 TumbuhanTanjung ... 11

2.1.1 Morfologi tumbuhan ... 11

(11)

2.1.3 Manfaat kulit batang pohon tanjung ... 12

2.2 Ekstraksi ... 12

2.2.1 Ekstraksi cair-cair ... 13

2.3 Kanker ... 14

2.3.1 Tinjauan umum kanker ... 14

2.3.2 Sifat kanker ... 14

2.3.3 Siklus sel ... 18

2.3.4 Mekanisme apoptosis ... 21

2.3.5 Karsinogenesis ... 21

2.4Kanker payudara ... 21

2.5 Sel T47D ... 21

2.6Uji sitotoksik ... 26

2.7MTT assay ... 26

2.8Flowcytometry ... 27

2.9Selectivity index ... 28

2.10Enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) ... 28

BAB III METODE PENELITIAN ... 31

3.1 Alat dan Bahan ... 32

3.1.1 Alat ... 32

3.1.2 Bahan ... 33

3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ... 33

3.2.1 Pengambilan sampel ... 33

3.2.2 Identifikasi tumbuhan ... 34

(12)

3.3 Pembuatan Pereaksi ... 34

3.3.1 Pereaksi Bouchardat ... 34

3.3.2 Pereaksi Dragendorff ... 35

3.3.3 Pereaksi Mayer ... 35

3.3.4 Besi (III) Klorida 1% ... 35

3.3.5 Pereaksi Molish ... 35

3.3.6 Timbal (II) asetat 0,4 M ... 35

3.3.7 Larutan asam klorida 1 N ... 35

3.3.8 Larutan asam klorida 2 N ... 36

3.3.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N ... 36

3.3.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N ... 36

3.3.11Pereaksi Lieberman-Bouchardat ... 36

3.3.12 Pereaksi kloralhidrat ... 36

3.4 Karakterisasi Simplisia ... 36

3.4.1 Pemeriksaan makroskopik ... 36

3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 36

3.4.3 Penetapan kadar air ... 37

3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ... 37

3.4.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ... 38

3.4.6 Penetapan kadar abu total ... 38

3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam ... 38

3.5 Karakterisasi Ekstrak ... 39

3.6 Skrining Fitokimia ... 39

(13)

3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ... 39

3.6.3 Pemeriksaan glikosida ... 40

3.6.4 Pemeriksaan antrakinon ... 40

3.6.5 Pemeriksaan saponin ... 40

3.6.6 Pemeriksaan tanin ... 41

3.6.7 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ... 41

3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung ... 41

3.8 Pembuatan Fraksi-Fraksi EEKBPT ... 42

3.9 Uji antikanker Ekstrak dan Fraksi EEKBPT ... 42

3.9.1 Pembuatan media RPMI ... 43

3.9.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI) ... 43

3.9.3 Pembuatan media M199 ... 44

3.9.4 Pembuatan media kultur lengkap (MK-M199) ... 44

3.9.5 Penumbuhan sel T47D ... 44

3.9.6 Penumbuhan sel Vero ... 45

3.9.7 Subkultur sel ... 46

3.9.8 Panen sel ... 46

3.9.9 Perhitungan sel ... 46

3.9.10 Pembuatan larutan uji ... 47

3.10Uji Sitotoksik Ekstrak dan Fraksi EEKBPT ... 48

3.11 Analisis Hasil ... 49

3.12 Indek Selektivitas ... 49

3.13 Pengamatan Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri menggunakan Propidium Iodida ... 50

(14)

3.14 Uji Penekanan Ekpresi Enzim COX-2 dengan

metode imunositokimia ... 50

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 52

4.1Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 52

4.2Karakterisasi Simplisia dan EkstrakEtanol Kulit Batang Pohon Tanjung (EEKBPT) ... 52

4.3Ekstraksi ... 54

4.4Hasil Skrining Fitokimia Fraksi EEKBPT ... 56

4.5Uji Sitotoksik dan Penentuan Indeks Selektivitas Ektrak Etanol dan Fraksi EEKBPT Terhadap sel T47D dan Sel Vero (Sel Normal) ... 58

4.6Uji Penghambatan Siklus Sel Dengan Metode Flowsitometri ... 61

4.7Uji Penekanan Ekspresi Enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) Dengan Media Sel T47D ... 64

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 69

5.1Kesimpulan ... 69

5.2Saran ... 70

DAFTAR PUSTAKA ... 71

(15)

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Ikatan kompleks CDK-Cyclin pada fase siklus sel ... 21

Tabel 3.1 Matrik uji sitotoksik fraksi EEKBPT terhadap sel T47D dan Vero ... 31

Tabel 3.2Matrik uji penghambatan siklus sel T47D ... 32

Tabel 3.3 Matrik uji penekanan ekspresi enzim COX-2 sel T47D ... 32

Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia KBPT ... 53

Tabel 4.2Hasil karakterisasi EEKBPT ... 53

Tabel 4.3Hasil skrining fitokimia fraksi EEKBPT ... ... 56

Tabel 4.4Nilai IC50 Tabel 4.5Akumulasi sel T47D setelah pemberian sampel pada masing-masing sampel uji ... 59

(16)

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 8

Gambar 1.2 Diagram alur penelitian ... 9

Gambar 2.1 Pohon Tanjung dan batang pohon Tanjung... 12

Gambar 2.2 Siklus sel ... 20

Gambar 2.3 Proses terjadinya karsinogenesis sel ... 23

Gambar 2.4 Reduksi MTT menjadi formazan ... 27

Gambar 2.5Mekanisme COX-2 dalam regulasi sel kanker ... . 29

Gambar 3.1Hemositometer (kamar hitung) ... 47

Gambar 4.1Profil siklus sel T47D kontrol ... 62

Gambar 4.2 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air dengan konsentrasi IC50 Gambar 4.3 Profil siklus sel T47D dengan perlakuan fraksi air ... 62

dengan konsentrasi ½ IC50 Gambar 4.4Profil siklus sel T47D dengan perlakuan doksorubisin ... 62

dengan konsentrasi IC50 Gambar 4.5Profil siklus sel T47D dengan perlakuan doksorubisin ... 63

dengan konsentrasi ½ IC50 Gambar 4.6Hasil Pengamatan ekpresi enzim COX-2 pada sel T47D ... 63

(17)

DAFTAR LAMPIRAN

Ha Lampiran 1 Hasil identifikasi kulit Batang pohon Tanjung

(Mimusopsi cortex.)... 79 Lampiran 2 Gambar simplisia kulit batang pohon Tanjung

(Mimusopsi cortex.)... 80 Lampiran 3 Cara pengambilan sampel kulit batang pohon Tanjung ... 81 Lampiran 4 Hasil Pemeriksaan Mikroskopik Serbuk kulit

batang pohon Tanjung ... 82 Lampiran 5 Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara perkolasi ... 83 Lampiran 6 Bagan pembuatan fraksi dari ekstrak etanol kulit batang

Tanjung ... 84 Lampiran 7 Perhitungan kadar air simplisia kulit batang pohon

Tanjung ... 85 Lampiran 8 Perhitungan kadar sari larut air simplisia kulit

batang pohon Tanjung ... 86 Lampiran 9 Perhitungan kadar sari larut etanol simplisia kulit

batang pohon Tanjung ... 87 Lampiran 10 Perhitungan kadar abu total simplisia kulit

batang pohon Tanjung ... 88 Lampiran 11 Perhitungan kadar abu tidak larut asam simplisia kulit

batang pohon Tanjung ... 89 Lampiran 12 Perhitungan kadar air ekstrak etanol kulit batang pohon

Tanjung ... 90 Lampiran 13 Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etanol

kulit batang pohon Tanjung ... 91 Lampiran 14 Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etanol

kulit batang pohon Tanjung ... 92 Lampiran 15 Perhitungan kadar abu total ekstrak etanol

(18)

Lampiran 16 Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etanol

kulit batang pohon Tanjung ... 94

Lampiran 17 Perhitungan absorbansi persen sel hidup T47D ... 95

Lampiran 18 Perhitungan absorbansi persen sel hidup Vero ... 97

Lampiran 19Perhitungan IC50 sampel uji terhadap sel T47D ... 99

Lampiran 20Perhitungan IC50 sampel uji terhadap sel Vero ... 103

Lampiran 21Bagan pembuatan media RPMI ... 107

Lampiran 22Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)-RPMI ... 108

Lampiran 23Bagan pembuatan media M199 ... 109

Lampiran 24Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)-M199 ... 110

Lampiran 25Bagan penumbuhan sel T47D dan Vero ... 111

Lampiran 26Bagan panen sel T47D dan Vero ... 112

Lampiran 27Bagan penghitungan sel T47D dan Vero ... 113

Lampiran 28Bagan pembuatan larutan uji ... 114

Lampiran 29Bagan pengujian sitotoksik ... 115

Lampiran 30Bagan pengujian flowsitometri ... 116

Lampiran 31Bagan pengujian imunositokimia ... 117

Lampiran 32Sel T47D di bawah mikroskop ... 119

Lampiran 33Sel Vero di bawah mikroskop ... 120

Lampiran 34Microplate -96 sumuran ... 121

Lampiran 35Mikroskop inverted, Elisa reader, inkubator CO2, Lampiran 36 Flowsitometer, Laminar Air Flow ... 122

Sertifikat kultur jaringan dari laboratorium pusat Kedokteran tropis fakultas kedokteran UGM ……… 124

(19)

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL

KANKER PAYUDARA

ABSTRAK

Fraksi diperoleh melalui ekstraksi cair-cair dari EEKBPT menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat. Dari ekstraksi tersebut diperoleh fraksi

n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi air (sisa). Nilai IC

selektivity index (SI), mekanisme penghambatan siklus sel dan efek penekanan ekspresi enzim COX-2 sel kanker payudara T47D.

Aktivitas antikanker fraksi aktif EEKBPT ditunjukkan melalui nilai IC50

ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D. Berdasarkan beberapa parameter di atas dapat disimpulkan bahwa fraksi aktif EEKBPT memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D.

Kata Kunci: fraksi n-heksana, fraksi etilasetat, fraksi air, fraksi aktif, T47D, Vero, sitotoksik, MTT, flowsitometri, imunositokimia, COX-2.

(20)

BARKETHANOLICEXTRACT (MIMUSOPSI CORTEX) AGAINSTBREASTCANCER CELL

Abstract

Breast cancer is primary cause of death on women. Cancer is growth

uncontrolled or abnormal of cells. Interest touse traditional medicine, especially

values, the mechanism of cell cycle inhibition and suppression effect of COX-2 enzyme expressionon T47D breast cancer cell.

Based ons implex and ethanolic extract of Mimusopsi cortex

Anticancer activity of active fraction of Mimusopsi cortex’s ethanolic extract was showed through IC50 values of n-hexane fraction, ethylacetate, and

aqueous to T47D cells, respectively 5796.218 µg/ml, 398.236 µg/ml, and 145.068 µg/ml, Aqueous fraction is the most active fraction of Mimusopsi cortex’s

Keywords: Ethanolic extract of Mimusopsi corte xfractions, T47D, Vero, cytotoxic, MTT, flowcytometry, immunocytochemistry, COX-2.

(21)

BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Penyakit kanker merupakan penyakit kedua terbesar di dunia setelah penyakit jantung. Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena sulit disembuhkan, bahkan tidak jarang menyebabkan kematian (Saputra, dkk., 2000).Menurut World Health Organization (WHO), penyakit kanker pada suatu saat akan menjadi masalah kesehatan utama baik di negara maju maupun di negara berkembang, termasuk Indonesia. Diperkirakan penyakit ini diderita oleh 15 orang pada setiap 100.000 penduduk dunia (Andriyani, 2010).

Jumlah penderita kanker payudara di Amerika Serikat dan beberapa negara maju lainnya menduduki peringkat pertama (Luwia, 2009). Kasus kanker payudara di Amerika tercatat hampir 200.000 wanita yang terdiagnosis dan setiap tahunnya terdapat lebih dari 40.000 meninggal akibat penyakit ini (Chen, et al., 2010). Data terbaru dari American Cancer Society telah menghitung bahwa di tahun 2013, terdapat 64.640 kasus kanker payudara. Sekitar 39.620 wanita meninggal dunia setiap tahunnya karena kanker payudara.

Data Pathology Based Cancer Registry bekerja sama dengan Yayasan Kanker Indonesia, menunjukkan kanker payudara di Indonesia menduduki peringkat kedua dari semua jenis kanker yang sering diderita (Luwia, 2009). Berdasarkan data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2009, kanker payudara menempati urutan pertama pada pasien rawat inap di seluruh rumah sakit di Indonesia yaitu 21,69%, disusul kanker leher rahim 17% (Rasjidi, 2009).

(22)

Berdasarkan data Global Burden of Cancer, angka kejadian kanker payudara di Indonesia sebanyak 26 per 100.000 perempuan (Bambang, 2010).

Sel kanker pada awalnya adalah sel normal, karena adanya kerusakan komponen berubah menjadi sel ganas yang tumbuh tidak terkendali(Ruddon, 2007). Kerusakan sel bisa disebabkan oleh berbagai hal, antara lain infeksi virus, paparan senyawa karsinogenik (senyawa kimia yang dapat menimbulkan proses pembentukan sel kanker), paparan radiasi sinar radioaktif (sinar X dan ultra violet), faktor genetik dan gaya hidup (Mangan, 2003).

Pengobatan kanker dapat dilakukan melalui operasi, radiasi atau kemoterapi. Obat antikanker ideal adalah yang memiliki toksisitas selektif, artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Antikanker yang ada sekarang umumnya menekan pertumbuhan atau proliferasi sel tetapi menimbulkan toksisitas karena menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat antara lain sumsum tulang, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit. Minat terhadap penggunaan obat tradisional khususnya untuk penyakit kanker akhir-akhir ini cenderung meningkat. Hal ini disebabkan adanya kekhawatiran efek samping yang ditimbulkan oleh obat-obat konvensional dan juga dengan alasan obat tradisional mudah didapat dan murah harganya (Kurnijasanti, 2008).

Tanjung (Mimusops elengi L.) adalah sej

2012). Bagian tanamanini terutama kulit batangnya sudah dipakai secara tradisional oleh masyarakat sebagai obat kumur, antibakteri, antivirus, penurun demam, dan lain-lain (Gami, et al., 2012; Heyne, 1987). Sampai saat ini belum

(23)

ada penelitian atau laporan yang menyebutkan kulit batang pohon Tanjung (KBPT) menimbulkan efek toksik terhadap manusia.

Penelitian menunjukkan KBPT mengandung karbohidrat, protein, flavonoid, tanin, saponin, glikosida, serta steroid/terpenoid (Kadam, et al, 2012; Aulianshah, 2012). KBPT juga mengandung senyawa-senyawa sepertiTaraxerone,

taraxerol, betulinic acid, α-spinasterol, quercitrol dan sodium ursolat (Gami, et al., 2012).

Selain penggunaan secara tradisional beberapa penelitian juga mengemukakan bahwa KBPT berkhasiat sebagai antibakteri, antiinflamasi, antioksidan, dan antikanker (Gami, et al., 2012; Kadam, et al., 2012).Penelitian Rangama, et al., (2009), menyimpulkan bahwa ekstrak etanol kulit batang Tanjung (EEKBPT) secara signifikan mampu menghambat bakteriStaphylococcus aureus menggunakan metode Agar Diffusion Bioassay.

Ekstrak kloroform, etanol, metanol dan air juga diketahui memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram negatif dan Gram positif (Murudkar, et al., 2007). Sifat antibakteri erat hubungannya dengan menghambat pertumbuhan tumor malignan. Hal ini disebabkan bakteri merupakan salah satu agen biologi yang bersifat karsinogen yang dapat menyebabkan timbulnya keganasan pada sel (Sudiana, 2008). Penelitian Chang, et al.,(2005) menyebutkan bahwa bakteri seperti

Helicobacter pylorijuga dapat menyebabkan kanker terutama kanker gastric.

EEKBPT juga memiliki aktivitas antiinflamasi dengan cara menghambat enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) (Amir, et al., 2013). Selain penginduksi pada proses inflamasi, ekspresi COX-2 yang berlebihan juga ditemukan pada banyak tipe pre-malignan dan malignan neoplasma pada manusia dan organisme lain,

(24)

seperti pada kanker prostat, payudara, liver (Hu, et al., 2003), dan kolorektal (Moore dan Simmons, 2000).

Aktivitas antioksidan KBPTtelah diteliti Ganu, et al.,(2010),dengan menguji ekstrak metanol KBPT menggunakan metode DPPH dan Hydroxyl Radical Scavenging Activity Assay secara in vitro. Pada penelitian tersebut disimpulkan bahwa dengan konsentrasi 100 µg/ml sampel mampu mengurangi kadar radikal bebas berturut-turut hingga 71,55% dan 82,11%.

UjiEEKBPTterhadap larva Artemia salinadengan metodeBrine-Shrimp Lethality Bioassay (BST), ditemukanbahwa EEKBPTmemiliki aktivitas sitotoksik (Chaitali, et al., 2010). Penelitian Yadav, et al., (2013), menemukan bahwa EEKBPTmenghambat pertumbuhan sel-sel meristem bagian akar umbi bawang Bombay (Allium cepa), dimana pertumbuhan akar Allium cepaberkurang dalam waktu 48 dan 96 jam bergantung dosis.

Pengujian antikanker secara in vitroyang lain adalah menggunakan biakan sel (Cell line).

Salah satu jenis cell line kanker payudara adalah sel T47D.

Pengujian dengan cara ini lebih baik dibandingkan pengujian secara in vivokarena lebih ekonomis, lebih aman, dan waktu pengujian relatif lebih singkat (Masters, 2000).

Sel ini merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering digunakan dalam penelitian kanker secara in vitro karena penanganannyamudah, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi (Abcam, 2007).Sel T47D adalah model sel kanker payudara yang belum resisten terhadap agen kemoterapi

(25)

doxorubicin, tetapi diketahui memiliki gen p53 yang telah termutasi (Junedi, et al., 2010). Gen p53 padaselini mengalamimissensemutation,sehingga kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat responseelement pada DNA, maka akan mengurangi atau menghilangkan kemampuannya dalam meregulasi siklus sel dan memacuapoptosis (Schafer,et al.,2000).

Penelitian antikanker dari EEKBPT secara in vitro telah dilakukan terhadap cell line kanker payudara T47D menggunakan metode MTT. Pada penelitian ini ditemukan bahwa dengan konsentrasi 112,800 µg/mlEEKBPT mampu menghambat pertumbuhan 50% sel kanker payudara T47D (Aulianshah, dkk., 2012). Suatu ekstrak dikatakan aktif sebagai antikanker jika memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/ml (Kamuhabwa, 2000). Namun, bukan berarti ekstrak tumbuhan

yang memiliki IC50 >100 µg/ml tidak berpotensi dikembangkan sebagai

antikanker karena menurut Machana, (2011), ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker jika nilai IC50 > 500µg/ml.IC50

Penelitian untuk menemukan obat antikanker saat ini tidak hanya berdasarkan efek sitotoksik semata, namun bagaimana obat tersebut dapat mencegah perkembangan sel kanker (proliferasi) dan penyebaran sel kanker ke jaringan lain (metastasis). Menurut Sobolewski, et al., (2010), salah satu enzim yang saat ini diduga terlibat dalam kedua hal tersebut adalah enzim

cyclooxygenase- 2 (COX-2). COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi oleh sitokin, endotoksin, dan faktor pertumbuhan (growth factors). COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel kanker. Prostaglandin

yang kurang aktif diduga karena ekstrak yang menggunakan pelarut yang mampu menarik zat bersifat polar dan juga nonpolar kemungkinan menghasilkan efek antagonis atau sinergis.

(26)

yang dibiosintesis oleh COX-2 ternyata terlibat dalam karsinogenesis melalui dengan cara mendorong proliferasi sel, angiogenesis, dan penghambatan apoptosis (Koki dan Masferrer, 2002). Menurut Fosslien (2001), enzim COX-2 yang diproduksi oleh sel tumor malignan berkontribusi dalam pembentukan sel darah baru (angiogenesis).

Berdasarkan pemaparan di atas, maka peneliti tertarik untuk melakukan fraksinasi dari EEKBPT yang bertujuan memisahkan senyawaaktif pada EEKBPT yang berkhasiat sebagai antikanker berdasarkan sifat kepolarannya, yaitu nonpolar, semipolar, polar dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Selanjutnya fraksi tersebut diuji terhadap cell line kanker payudara T47D untuk mendapatkan fraksi yang memiliki aktivitas antikanker paling aktif, kemudian dilakukan pengujian efek antiproliferasinya melalui mekanisme penghambatan siklus sel kanker dan juga terhadap ekspresi enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2) pada sel T47D. Selain itu juga dilakukan pengujian toksisitasnya terhadap sel normal (sel Vero) untuk mendapatkan bukti ilmiah tentang aktivitas antikanker fraksi aktif KBPT yang aman, selektif, dan berkhasiat sehingga semakin berpotensi untuk dikembangkan menjadi obat tradisional.

1.2 Perumusan Masalah

Adapun perumusan masalah dari penelitian ini adalah:

a. apakah simplisia dan EEKBPT memenuhi persyaratan karakterisasi serta golongan senyawa kimia apakah yang terkandung di dalam masing-masing fraksi EEKBPT?

b. apakah fraksi aktif EEKBPT menunjukkan aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D melalui efek sitotoksik fraksi n-heksana,

(27)

etilasetat dan air EEKBPT terhadap sel T47D, nilai indeks selektifitas, mekanisme penghambatan siklus sel, serta efek menekan ekspresi enzim COX-2 fraksi aktif terhadap sel T47D?

1.3Hipotesis

Adapun hipotesis dari penelitian ini adalah:

a. simplisia dan EEKBPT memenuhi persyaratan karakterisasisertafraksi EEKBPT mengandung golongan senyawa kimia seperti flavonoid, tanin, saponin, glikosida, dan steroid/triterpenoid.

b. fraksi aktif EEKBPT memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker payudara T47D yang ditunjukkan melalui efek sitotoksik fraksi n-heksana, etilasetat dan air EEKBPT terhadap sel T47D, nilai indeks selektifitas, mekanisme penghambatan siklus sel, serta efek menekan ekspresi enzim COX-2 fraksi aktif terhadap sel T47D.

1.4Tujuan Penelitian

Adapun tujuan penelitian ini adalah untuk:

a. mengetahui karakteristik simplisiadan EEKBPTsertamengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam masing-masing fraksi EEKBPT. b. mengetahui aktivitas antikanker fraksi aktif EEKBPT terhadap sel kanker

payudara T47D melalui efek sitotoksik fraksi n-heksana, etilasetat dan air EEKBPT terhadap sel T47D, nilai indeks selektifitas, mekanisme penghambatan siklus sel, serta efek menekan ekspresi enzim COX-2 fraksi aktif terhadap sel T47D.

(28)

1.5Manfaat Penelitian

Adapun manfaat dari penelitian ini adalah menambah bukti ilmiah tentang kulit batang pohon Tanjung sebagai antikanker sehingga dapat dikembangkan sebagai obat tradisional.

1.6 Kerangka Pikir Penelitian

Adapun kerangka pikir pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.1 Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter

Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian

Simplisia Kulit batang pohon Tanjung Ekstrak etanol kulit batang pohon Tanjung ECC

fraksi n-heksana, fraksi etilasetat, dan fraksi air

Karakteristik

golongan senyawa

1. makroskopik 2. mikroskopik 3. kadar air 4. kadar abu total 5. kadar abu tidak

larut dalam asam 6. kadar sari larut

dalam air 7. kadar sari larut

dalam etanol 1. Alkaloid 2. Flavonoida 3. Tanin 4. Saponin 5. Steroid/triterpenoid 6. Glikosida 7. Antrakinon Sel T47D

Sitotoksisitas Nilai IC_{dan SI}50

Fraksi paling aktif dan aman penekanan ekspresi COX-2 Efek penghambatan Ekspresi COX-2 % Siklus sel Sel T47D

(29)

1.7 Alur Penelitian

Penelitian ini didasarkan pada beberapa penelitian sebelumnya tentang aktivitas kulit batang pohon Tanjung sebagai antioksidan, antiinflamasi dan memiliki aktivitas sitotoksik. Pada penelitian untuk melihat efek sitotoksik KBPT terhadap sel T47D diperoleh nilai IC50yang kurang aktif, oleh karena itu peneliti

mencoba melakukan fraksinasi dari ekstrak etanol KBPT dengan harapan diperoleh aktivitas sitotoksik yang lebih poten daripada sebelumnya. Selanjutnya dari fraksi-fraksi tersebut diuji efek sitotoksiknya terhadap sel kanker payudara T47D dan sel normal (Vero) sehingga diperoleh nilai IC50dan selectivity index

(SI) masing-masing fraksi. Fraksi yang paling aktif dan selektif dilanjutkan untuk pengujian mekanisme penghambatan siklus sel dan efek penekanan ekspresi enzim COX-2 pada antikanker sel T47D. Sehingga dari rangkaian pengujian di atas diharapkan diperoleh aktivitas fraksi aktif dari ekstrak etanol kulit batang Tanjung terhadap sel kanker payudara T47D. Alur penelitian ini dapat dilihat seperti Gambar 1.2:

(30)

Kulit Batang Pohon Tanjung (KBPT)

Gambar 1.2 Diagram alur penelitian Aktivitas antioksidan

tinggi dari ekstrak methanol KBPT (Ganu,

et al., 2010).

Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol KBPT terhadap larva Artemia salina (Chaitali, et al., 2010) dan sel meristem Bawang Bombay (Yadav,

et al., 2013).

Aktivitasekstrak etanol KBPT mencegah inflamasi dengan menghambat enzim

COX-2(Amir, et al., 2013).

Aktivitas sitotoksik dari ekstrak etanol KBPT terhadap sel T47D dengan

IC50 112,800 µg/ml (Aulianshah, dkk., 2012)

Ekstrak etanol KPT Etilasetat n-heksana Fraksi Sisa (Air)

Uji Sitotoksik Uji Sitotoksik Uji Sitotoksik

IC50 IC50 IC50

Fraksi paling aktif dan aman

Imunositokimia Penekanan Cell Cycle

ekspresi COX-2 Fase G1/S/G2/M Aktivitas antikanker ECC Sel kanker Sel kanker

Ket: Uji sitotoksik dilakukan terhadap sel kanker T47D dan sel normal (Vero)

karakterisasi

Skrining fitokimia

SI SI

(31)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Tanjung 2.1.1 Morfologi tumbuhan

Pohon Tanjung (Mimusops elengi L.) merupakantumbuhanserba guna.Kayunya dikenal awet, keras dan kuat untuk konstruksi jembatan,kapal laut, lantai, dandaun pintu.Bagian tanaman lain juga dapat dimanfaatkan seperti akar, kulit, daun dan bunganya sebagai bahan obat-obatan (Steenis, 2003).

Pohon Tanjung termasuk tumbuhan berumahsatu. Pohonberukuran sedang,tumbuhhingga ketinggian 15m (Gambar 2.1).Daun-dauntunggal,tersebar,bertangkai panjang. Helaian daun berbentuk bulattelur hinggamelonjongdengan panjang9-16 cm,bertepirata, namun bergelombang. Kulit bagian dalam berserat, merah muda atau kemerahan(Steenis, 2003).

2.1.2 Sistematika Tumbuhan

Sistematika tumbuhan Tanjung menurut Heyne (1987), adalah sebagai berikut.

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae

Ordo : Ebenales

Famili : Sapotaceae Genus : Mimusops

(32)

xxxiv

Gambar 2.1 Pohon Tanjung (kiri) dan batang pohon Tanjung (kanan) 2.1.3 Manfaat Kulit Batang Pohon Tanjung

Kulit batang pohon Tanjung digunakan untuk obat penurun panas.Kulitbatangpohon direbus deng anai rdan dibuatobat kumurselamaempathari untuk mengobati sakit gigi dan juga untuk menyegarkan nafas(Heyne,1987). Selain itu kulit batang tanjung juga memiliki aktivitas sitotoksik, antineoplastik, antioksidan, antihiperlipidemia, antifungal, antivirus, gastroprotektif, serta diuretik (Gami, et al., 2012).

2.2 Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung (Depkes, 1979). Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa factor seperti sifat dari bahan mentah obat dandaya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi dan kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna dari obat.

(33)

Sifatbahanmentahobat merupakan factor utama yang dipertimbangkan dalam memilih metode ekstraksi (Ansel,1989) .Kelarutandan stabilitas bahan kandungan tumbuhan merupakan sifat yang penting untuk memperoleh sediaan obat yang tepat, oleh karena banyak bahan tumbuhan larut dalam air atau alkohol sehingga air atau etanol menjadi acuan cairan pengekstraksi (Voight,1994).

Caraekstraksidapatdilakukandenganteknik perkolasi.Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan gaya kapiler yang cenderung untuk menahan. Untuk menentukan akhir perkolasi, dilakukan pemeriksaan zat aktif secara kualiitatif pada perkolat terakhir. Proses perkolasi terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (Depkes, 2000).

2.2.1 Ekstraksi cair-cair

Ekstraksi cair-cair merupakan suatu teknik yang mana suatu larutan (biasanya dalam air) dibuat bersentuhan dengan suatu pelarut kedua (biasanya pelarut organik), yang pada hakikatnya tidak tercampurkan, pada proses ini terjadi pemindahan satu atau lebih zat terlarut (solute) kedalam pelarut yang kedua. Pemisahan yang dapat dilakukan bersifat sederhana, bersih, cepat, dan mudah,

(34)

yang dapat dilakukan dengan cara menggojok dalam sebuah corong pisah selama beberapa menit (Bassett, et al., 1994).

Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat nonpolar atau semi polar. Sementara itu senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi dan senyawa polar lainnya akan tertahan dalam fase air. Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi ialah pelarut yang mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi sampel (Rohman, 2007).

2.3 Kanker

2.3.1 Tinjauanumumkanker

Kanker adalah penyakit yangditandai denganpertumbuhansel yangtidak terkendalidankemampuansel-seltersebutuntukmenyerangjaringan

biologislainnya,baik denganpertumbuhanlangsungdijaringanyangbersebelahan (invasi)ataudenganmigrasiselke tempatyangjauh(metastasis).Pertumbuhanyang tidakterkendalitersebutdisebabkan kerusakanDNA,menyebabkanmutasigen vitalyangmengontrolpembelahansel.Beberapamutasi mungkindibutuhkanuntuk mengubahselnormalmenjadisel kanker.Mutasi-mutasitersebutseringdiakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secaraspontan(diperoleh)ataupundiwariskan(mutasigermline)(Ruddon, 2007).

Kanker merupakan suatu tumor atau neoplasma atau neoblastoma, yang terdiri dari tumor jinak (benign) dantumor ganas (malignant). Perbedaan antara

(35)

tumorganasdan tumorjinakdisampingfaktormasapertumbuhannyaadalahtumor ganas bersifat infiltratif, sedangkan tumor jinak bersifat ekspansif. Tumor ganas bersifat residifyang berarti dapatkambuh,sedangkantumorjinak tidak residif.Tumorganas bermetastasis,tetapitumorjinaktidak demikian.Adanyapolimorfiyaitubentukdan ukuranintiselyang berbeda-bedapadatumor ganas, terdapat pulaseletia yaitu selyangmempunyai intilebihdarisatu. Pada tumorganassudahtidak adaanaplasi(dediferensiasi)yangberartikehilanganuntuk diferensiasisel. Disampingitu, tumor ganas telah kehilangan polaritasyaitu perbedaanantarabagianatasdenganbawahataubagiandepan denganbelakang (Mulyadi,1997).

Ada lima kelompok besar yang digunakan untuk mengklasifikasikankanker yaitu karsinoma, sarkoma, limfoma, adenoma dan leukemia (Ruddon, 2007).

a. Karsinoma ialah kanker yang berasal dari kulit atau jaringan yang menutupiorgan internal.

b. Sarkoma ialah kanker yang berasal dari tulang, tulang rawan, lemak, otot,pembuluh darah, atau jaringan ikat.

c. Limfoma ialah kanker yang berasal dari kelenjar getah bening dan jaringansistem kekebalan tubuh.

d. Adenoma ialah kanker yang berasal dari tiroid, kelenjar pituitari, kelenjaradrenal, dan jaringan kelenjar lainnya.

e. Leukemia ialah kanker yang berasal dari jaringan pembentuk darah seperti sumsum tulang dan sering menumpuk dalam aliran darah.

(36)

2.3.2 Sifatkanker

Kanker mempunyai berbagai sifat umum, diantaranyaadalah: a.Heterogenitas

Populasisel dalamsuatutumortidakhomogen,tetapiheterogen,walaupun semuaberasaldarisatuselyangsama.Heterogenitasini terjadikarenasel-selkanker tumbuh dengan cepat, sehingga belum dewasa, belum matang telah mengalami mitosis kemudian terus membelah sehinggas emakinlama semakin banyak keturunan sely ang makin jauh menyimpan gdari selasalnya, yang menimbulkan bentuk yang bervariasi(Sukardja, 2000).

b.Tumbuhautonom

Selkankertumbuh terustanpabatas(immortal),liar,terlepasdarikendali pertumbuhannormalsehinggaterbentuksuatutumoryang terpisahdaribagiantubuh yangnormal.Tumordapatmenimbulkankelainanbentukdan gangguanfungsiorgan yangditumbuhinya.Sel-selnormalsetelahbeberapagenerasiakan berhentitumbuh (Sukardja, 2000).

c.Mendesakdanmerusaksel-selnormaldisekitarnya

Sel-sel tumor mendesak (ekspansif) sel-sel normal di sekitarnya,

yang berubah menjadi kapsul yang membatasi pertumbuhan tumor. Pada tumorjinak,kapsulituberupakapsulsejatiyangmemisahkangerombolanseltumorden gansel-

selnormal,sedangkanpadatumorganasberupakapsulpalsu,karenakapsulitudapat ditembusataudiinfiltrasiolehsel-selkanker (Sukardja, 2000).

d.Dapatbergeraksendiri(amoeboid)

(37)

gerombolansel-seltumorinduknya,masukdiantarasel-selnormaldisekitarnya.Hal inimenimbulkan:

i. Infiltrasiatauinvasikejaringanatauorgandisekitarnya.

Selkanker dapat tumbuh di jaringan sekitarnya, menimbulkanperlekatan- perlekatan,obstruksisaluran-salurantubuh.

ii. Metastaseatauanaksebardikelenjarlimfeataudiorganlainnya.

Selkankermasukkedalamkelenjarlimfemelalui pembuluh limfe dantumbuhsebagaianaksebardi kelenjarlimfe(penyebaran limfogen).Sel-selkankerdapatpulamasukkedalampembuluhdarahdanbersama

alirandarahberedarkeseluruhtubuh(penyebaranhematogen)(Sukardja, 2000). e.Tidakmengenalkoordinasidanbatas-bataskewajaran

Ketidakwajaranituantaralaindisebabkanoleh: i. Kurangdayaadhesidankohesi

Karena kurangnya daya adhesi dan kohesi sel-sel kanker itu mudah lepas dari gerombolanselinduknyadandapatbergerakmenyusupdiantarasel-selnormal.

ii. Tidakmengenalkontakinhibisi

Sel-selnormalakanberhentitumbuhjikaadakontakdenganselnormaldisekitarnya, sedangselkankertidak.

iii. Tidakmengenaltandaposisi

Selnormalberhentitumbuhjikaberadapadaposisiyang

tidaksemestinya,sedangkanselkankertidak,sehinggadapattimbulmetastase. iv. Tidakmengenalbataskepadatan

(38)

Selnormalakanberhentitumbuhjikakepadatansel telahmencapaikonsistensi tertentu,sedangselkankertidak(Sukardja, 2000).

f.Tidakmenjalankanfungsinyayangnormal

Sel-sel kanker merusak fungsi organ yang ditumbuhinya. Hal iniantara lain karena(Sukardja, 2000):

i. Membranselkankertidakmengandungfibronektinyaitusuatuglukoproteinyang dapat menghambat pertumbuhan sel

ii. Selkanker dapat membentuk hormon, enzimdan proteinyangpadapertumbuhansel normalhanya diproduksioleh sel-sel tertentu saja.

2.3.3 Siklus sel

Pertumbuhanselmenunjukkan adanyaperubahanukuransel dan merupakan hasil akhir dari proses-prosesyangberpengaruh padakehidupansel tersebutsepertiproliferasi,diferensiasidan kematiansel.Selkankerseringkali dikatakansebagaiselyangberproliferasilebih cepatdibandingkandengankeadaan normalnya(Ruddon,2007).

Sel kankerdapatberadadalamtigakeadaanyaitusedang membelah(siklusproliferatif),dalamkeadaanistirahat(tidakmembelah),dan secara permanentidakmembelah(Nafrialdidan Gan,1995).Selkankeryangsedang membelahterdapatdalam4(empat)fase:

a.FasePascaMitosis(G1)

(39)

dimulaisintesisasamdeoksiribonukleat

(DNA)(Mulyadi,1997).PadafaseG1,ditemukan suatu faktor yang menginduksi fase G1 untuk masuk ke fase S, faktor ini disebut S-phase Promoting Factor

(SPF). Untuk masuk ke setiap fase akan diinduksi oleh suatu Cyclin

Dependent-protein Kinase (CDK). Fase G1 akan diinduksi oleh CDK-4 dan

CDK-6 yang membentuk komplek dengan cyclin-D dan cyclin-E (Gambar 2.2 dan Tabel 2.1). CDK-cyclin G-1 komplek ini akan memfosforilasi retinoblastoma (p-RB) yang semula memblokir aktivitas faktor transkripsi (seperti E2F, ABL). Proses fosforilasi ini mengakibatkan p-RB menjadi inaktif. Ketidakaktifan dari p-RB ini mengakibatkan faktor transkripsi menjadi aktif (Sudiana, 2008).

b.FaseSintesisDNA(S)

Faseini merupakansaatterjadinyareplikasiDNA.DalamfaseSberlangsung perbaikanDNAyangdapatuntukmencegahberkembangnya generasikanker.Fase iniberlangsungkira-kira6-8jam(Mulyadi,1997). Fase S akan diinduksi olek CDK-2 yang membentuk kompleks dengan cyclin-A dan cyclin-E(Gambar 2.2 dan Tabel 2.1), yang disebut CDK-cyclin G-2 complex. Adanya kompleks ini akan mengakibatkan terjadinya ikatan antara Dbf-4p dengan CDC-7p. Ikatan ini mengakibatkan Dbf-4p menjadi aktif, sehingga ia menelusuri untaian DNA sampai menemukan suatu area yang dikenal dengan ORC (Origin Recocnition

Complex). Setelah CDC-7p dilepas dan Dbf-4p membentuk ikatan dengan

ORC sehingga terbentuklah OR (Origin of Replication). Dengan adanya berbagai enzim, maka untaian DNA akan terbentuk pasangan rantai baru. Selanjutnya dengan adanya enzim helikase maupun gyrase akan terbentuk dua

(40)

untaian DNA yang baru (Sudiana, 2008). c.FasePraMitosis(G2)

Sel yang telah masuk dalam fase pra mitosis ini memiliki ciri-ciri : sel berbentuktetraploid,mengandungDNAduakalilebihbanyakdaripadafaselain dan masihberlangsungsintesisRNAdanprotein(NafrialdidanGan,1995).

d.FaseMitosis (M)

Fase M akan diinduksi oleh CDK-1 yang membentuk komplek dengan cyclin-A dan cyclin-B(Gambar 2.2 dan Tabel 2.1) yang disebut sebagai

CDK-cyclin-M complex. Sewaktumitosis berlangsung(faseM)sintesisprotein

danRNAberkurang secaratiba-tiba,berlangsungpemisahansel menjadiduasel anakandengansifatdan karakteristiknyayangsamainduknya(Nafrialdidan Gan,1995).Berdasarkan morfologinya proses inidapat dibagimenjadi 4 subfase yaitu profase, metafase, anafase dan telofase. Fase iniberlangsung sekitar 30-60 menit (Mulyadi, 1997).Kemudian sel akan mulai memasuki siklus pembelahan sel berikutnya, yang disebut fase G-0 (Sudiana, 2008).

Gambar 2.2Siklus sel. Dimodifikasi dari Vermeulen,et al., (2003).

Tahap-tahap pada siklus sel G0 : sel tidak aktif G1 : fase istirahat S : Sintesis DNA G2 : fase pra-mitosis M : pembelahan sel

(41)

Tabel 2.1 Ikatan kompleks CDK-Cyclinpada fase siklus sel

CDK Cyclin Aktivitas siklus sel

CDK4 Cyclin D1, D2, D3 Fase G1

CDK6 Cyclin D1, D2, D3 Fase G1

CDK2 Cyclin E Transisi G1-S

CDK2 Cyclin A Fase S

CDK1 Cyclin B Transisi S-M

CDK1 Cyclin A Mitosis

2.3.4Mekanisme apoptosis

Apoptosis adalah kematian sel melalui mekanisme genetik (kerusakan/fragmentasi kromosom atau DNA).

a. Apoptosis fisiologis

Yaitu kematian sel yang diprogram. Kematian sel ini erat kaitannya dengan suatu enzim yang dikenal dengan nama telomerase. Telomer terletak pada ujung kromosom merupakan salah satu faktor yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer ini akan mengalami pemendekan pada waktu sel melakukan pembelahan diri. Bila ukuran telomer mencapai ukuran tertentu (ukuran kritis) sebagai akibat dari pembelahan berulang, maka sel tersebut tidak dapat melakukan pembelahan diri lagi. Selanjutnya, akan terjadi fragmentasi dan sel akan mengalami apoptosis. Namun, pada sel ganas pemendekan telomer sampai level kritis tidak aka terjadi karena adanya aktivitas dari enzim ribonukleoprotein (telomerase) secara terus-menerus. Oleh karena itu, maka sel ganas dapat bersifat immortal (Sudiana, 2008).

b. Apoptosis Patologis

Apoptosis patologis yaitu kematian sel karena adanya rangsangan. Rangsangan ini dapat terjadi karena adanya aktifitas dari p53. Hal ini disebabkan karena adanya gen yang cacat. Gen yang cacat dapat memicu

(42)

aktifitas beberapa enzim seperti PKC (Protein Kinase C) dan CPK-K2, dimana kedua enzim ini dapat memicu aktifitas p53 yang merupakan faktor transkripsi terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 akan menekan semua CDK. Sebelumya telah diketahui bahwa terjadinya siklus pembelahan sel sangat tergantung pada ikatan komplek antara CDK dengan cyclin.

Dengan terjadinya penekanan semua CDK, maka siklus sel akan berhenti. Pada saat siklus terhenti, maka p53 akan memicu aktifitas BAX ( BCL2-associated X protein), di mana protein BAX ini akan menekan aktifitas

BCL-2 (B-Cell Lymphoma-2) pada membran mitokondria, sehingga terjadi

perubahan permeabilitas membran. Perubahan ini mengakibatkan terjadinya pelepasan cytokrom-C ke sitosol. Di sitosol, cytokrom-C akan mengaktivasi Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor 1

2.3.5 Karsinogenesis

) yang selanjutnya mengaktivasi kaskade kaspase. Kaspase inilah yang mengaktifkan DNA-se, kemudian DNA-se yang aktif akan menembus membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA sel yang bersangkutan rusak (fragmentasi) dan akhirnya mengalamin apoptosis (kematian)(Sudiana, 2008).

Karsinogenesis adalahsuatuprosesperubahanstrukturDNAyangbersifat

irreversible,sehinggaterjadikanker(Mulyadi,1997).Salah satufaktorterbentuknya kankerkerenaadanyasel epitelyangterus berkembang(berproliferasi).Saat berproliferasi,genetiksel bisa berubahakibatadanyapengaruhagenkarsinogenyang menyebabkan hilangnya penekanan terhadap proses proliferasi sel.Perubahan

sel

(43)

xxvii

terkendali.Kankerterjadimelaluibeberapa faseyaituinisiasi, promosi, dan progresi (Gambar 2.3):

a. Fase inisiasi: DNAdirusakakibat radiasiatau zatkarsinogen (radikal

bebas).Zat-zatinsiatorinimenggangguprosesreparasinormal,sehinggaterjadimutasiDNAde ngankelainanpadakromosomnya

b. Fase promosi:zatkarsinogentambahan(co-carcinogens)diperlukansebagai promotor untuk mencetuskan proliferasi sel, dengan demikian sel-sel rusak menjadiganas.

c. Faseprogresi:gen-genpertumbuhanyangdiaktivasiolehkerusakanDNA mengakibatkanmitosisdipercepatdanpertumbuhanliardarisel-selganas (Oliveira, et al., 2007).

Gambar 2.3 Proses terjadinya karsinogenesis sel. Dimodifikasi dari (Oliveira, et al., 2007).

2.4KankerPayudara

Pada90%wanita,kankerpayudarapadafaseawal bersifatasimptomatikdan tidak menimbulkannyeri.Kankerpayudarabiasanyadidiagnosisdenganadanya

Bahan kimia

Sel normal

INISIASI PROMOSI

PROGRESI Perbaikan

DNA

Pembelahan sel

KANKER akumulasi

sel

Sel terinisiasi

(44)

benjolan kecilberukuran kurangdari2cm.Padatumor yangganas, benjolan ini bersifat soliter, unilateral, solid, keras dan tidak beraturan. Tanda yang kurang umumadalahadanyaabnormalitaspadaputingdanretraksi.Padakasusyanglebih beratdapatterjadiedemakulit,kemerahandan rasapanaspadajaringanpayudara (Ruddon, 2007).

Jaringan payudara merupakan jaringan yang sensitif terhadap tumbuhnyakanker. Kanker umumnya terjadi pada jaringan yang sel-selnya aktif membelah, salahsatunyaadalahpayudara.Pembelahansel payudaradipacuolehadanyahormon estrogen.Pembelahanini dapatmeningkatkanresikoterjadinyakerusakanpermanen

padaDNA.Gadisatauwanitamudayangbelumpernahhamil,sel-sel

payudaranyabelummengalamipematangansecarasempurna.Seltersebutlebihkuat mengikatkarsinogendan tidakdapat mengatasi kerusakan DNA secara efisien seperti pada sel yangtelah matangsepenuhnya(Clark,1975).

Kanker payudara (Carcinoma mammae) adalah suatu penyakit

neoplasma yangganasyangberasaldari

parenchyma.Penyebabspesifikkankerpayudaramasih belum diketahui, tetapi terdapat banyak faktor yang diperkirakan mempunyai pengaruhterhadapterjadinyakankerpayudaradiantaranya(Anonim,2007):

a. Faktorreproduksi,karakteristikreproduktifyang berhubungandenganresiko terjadinya kankerpayudaraadalahnuliparitas,menarchepada umurmuda, menopausepadaumurlebihtua,dankehamilanpertamapadaumurtua.

b. Penggunaanhormon,hormon eksogenberhubungandenganterjadinyakanker payudara.

(45)

c. Radiasi,denganradiasiionisasiselamaatau sesudahpubertasmeningkatkan terjadinyarisikokankerpayudara.

d. Riwayatkeluargadanfaktorgenetik,terdapatpeningkatanrisikokeganasanini padawanitayangkeluarganyamenderitakankerpayudara.

2.5SelT47D

Celllineadalahselyangdisubkultur dariprimarycultures, yaituselyang langsungberasaldariorganataujaringanyangdiperolehdenganmetodeenzimatik maupunsecaramekanikdandikulturdalamkondisihormonal yangsesuai. SelT47Dmerupakan continous celllinesyangdikulturdari jaringanepitelduktuspayudaraseorangwanitaberusia54tahun.Selini dapat ditumbuhkan

padasuhu37ºCdandapattumbuhsecarakontinu,menempelpadadasarflask (Abcam, 2007).

SelT47D merupakan selkanker yang mengekspresikan reseptor estrogen atauyang biasadisebut ER (Estrogen Reseptor) positifsertamengekspresikanp53yangtelahtermutasi. Padaselini p53mengalamimissensemutationpadaresidu194(dalamzinc-binding domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat

responseelementpadaDNA,makaakanmengurangiatau menghilangkan

kemampuannyadalammeregulasi siklus sel dan memacuapoptosis (Schafer,et al.,2000).

2.6Uji Sitotoksik

Ujisitotoksisitasadalahuji toksisitassecarainvitromenggunakankultursel yangdigunakandalamevaluasikeamananobat, kosmetik,zat tambahanmakanan,

(46)

xxxii

xxxiii

pestisidadan digunakanjugauntukmendeteksiadanyaaktivitasantineoplastikdari suatusenyawa.Senyawasitotoksikadalahsenyawa yangbersifat toksikpadaseltumor secarainvitrodan jikatoksisitasini ditransfermenembussel tumorinvivosenyawatersebutmempunyaiaktivitasantitumor(Freshney,2000).

Metodeinvitromemberikanberbagaikeuntungan,seperti: dapat digunakan padalangkahawalpengembanganobat,hanyamembutuhkansejumlahkecilbahan yangdigunakanuntukkulturselprimermanusiadariberbagaiorgantarget(ginjal, liver,kulit)sertadapatmemberikaninformasisecaralangsungefekpotensialpada seltargetmanusia.Keuntungan lainnya adalah uji yang digunakan sangat sensitif dan dampak yang ditimbulkan dapat dilihat langsung(Doyle, et al.,2000; Miksusanti, 2010).

Akhirdariuji sitotoksisitas pada organ target memberikan informasi tentang perubahan yang terjadipadafungsiselsecaraspesifik(Doyle, et al.,2000). 2.7MTTassay

UjisitotoksisitasdenganmetodeMTTdidasarkanpada aktivitasenzimyang dapatdiukursecarakolorimetri.Metodeini cepat,sensitif,akuratdansejumlahbesar sampeldapat diujisecaraotomatismenggunakanspektrofotometer.Metodeini mengukurselyanghidup(baikyang

masihmembelahataupuntidakmembelah)(Freshney, 2000).

Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan

(47)

direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium (Gambar 2.4), yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup (Cree, 2011).

Gambar 2.4 Reduksi MTT menjadi formazan (Kupcsik, 2011)

2.8 Flowcytometry

Flowcytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan

menganalisa partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida (Sayed, et al., 2009). Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan flourosensi. Suspensi sel atau partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label antibodi melekat pada permukaan atau struktur internal sel. Penyerapan cahaya tergantung pada struktur internal sel dan ukuran dan bentuknya. Cahaya fluoresensi terdeteksi oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk memblokir cahaya yang tidak diinginkan. Hasil data disimpan melalui komputer (Ulfah, 2010).

(48)

Flowcytometry dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-diamino-2-phenylindole (DAPI) Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propium iodide maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Alat yang digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel pada penelitian ini adalah FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) atau flowcytometer (Givan, 2001).

2.9Selectivity Index

Untuk memperoleh nilai selectivity index digunakan sel yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika (vero) menggunakan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Selektivitas indeks (SI) diperoleh dari rasio IC50

2.10 Enzim Cyclooxygenase-2 (COX-2)

sel Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai SI lebih tinggi dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang tinggi (Machana, 2011).

Cyclooxygenase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan

prostaglandin, suatu mediator inflamasi, dan produk metabolisme asam arakidonat. Enzim COX terdiri dari 2 isoenzim yaitu COX-1 dan COX-2. Enzim COX-1 bersifat konstitutif untuk memelihara fisiologi normal dan homeostasis, sedangkan COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi oleh sitokin, endotoksin, dan faktor pertumbuhan (growth factors).

(49)

COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel kanker. Ekspresi berlebihan COX-2 ditemukan pada kebanyakan tumor (Wang dan Dubois, 2004). Mekanisme COX-2 menyebabkan keganasan sel dapat dilihat pada Gambar 2.5.

Gambar 2.5 Mekanisme COX-2 dalam regulasi sel kanker. Dimodifikasi dari (Wang dan Dubois, 2004).

COX-2 memproduksiprostaglandin E2 (PGE2)yang merupakan jenis

paling dominan ditemukan pada keganasan sel. PGE2berikatan dengan reseptor

pada permukaan sel yang merupakan jenis dari G protein-coupled reseptor yaitu EP1, EP2, EP3, dan EP4. Ikatan PGE2 dengan reseptor EP akan meningkatkan

kadar Bcl-2, suatu gen anti-apoptosis yang mengakibatkan down regulation pada proses apoptosis sehingga meningkatkan proliferasi sel kanker. Selain meningkatkan gen Bcl-2, ikatan PGE2 dan EP juga menginduksi ekpresi VEGF

(Vascular Endothelial Growth Factor) yang merupakan faktor penting dalam angiogenesis (pembentukan sel darah baru) yang membuat sel kanker mendapatkan nutrisi dan oksigen dan dapat menyebar ke seluruh tubuh melalui darah (Wang and Dubois, 2004). Mekanisme COX-2 lain yang menyebabkan

Sel epitel Perubahan bentuk sel Sel pembunuh alami Sel-B dan T Sel endotelial

TUMOR EPITEL

Faktor pertumbuhan pro-angiogenesis seperti

VEGF

Proliferasi, migrasi Penyebaran

Pertahanan sistem imun

Sel kanker

(50)

proliferasi sel kanker meningkat diperantarai olehikatan antaraPGE2 dengan

EGFR (Epidermal Growth Factor Reseptor),ikatan tersebut mengaktifkan PI3K(Phosphoinositide 3-Kinase). Selanjutnya PI3K memproduksi PIP3 (Phosphatidylinositol 3,4,5 Triphosphate) yang mengaktifkan PDK1(Pyruvate Deshydrogenase Kinase). Protein ini akan berfosforilasi untuk mengaktifkanAkt/PKB (Protein Kinase B) yang bertanggung jawab dalam progresi dan meningkatnya penyebaran sel kanker (Sobolewski, et al., 2010).

(51)

BAB III

METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yaitu penelitian yang memanipulasi variabel bebas untuk mengetahui akibat manipulasi tersebut terhadap variabel terikat (Latipun, 2006). Desain eksperimen pada penelitian ini meliputi pengujian sitotoksik dan selectivity index (SI)fraksi EEKBPT terhadap sel T47D dan sel Vero ditunjukkan pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Matrik uji sitotoksik fraksi EEKBPT terhadap sel T47D dan Vero Sel T47D dan Sel Vero

P D

Fraksi n-heksana Fraksi etilasetat Fraksi air

P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3

D1 A1.1 A2.1 A3.1 A1.1 A2.1 A3.1 A1.1 A2.1 A3.1

D2 A1.2 A2.2 A3.2 A1.2 A2.2 A3.2 A1.2 A2.2 A3.2

D3 A1.3 A2.3 A3.3 A1.3 A2.3 A3.3 A1.3 A2.3 A3.3

D4 A1.4 A2.4 A3.4 A1.4 A2.4 A3.4 A1.4 A2.4 A3.4

D5 A1.5 A2.5 A3.5 A1.5 A2.5 A3.5 A1.5 A2.5 A3.5

∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ ∑

IC50 IC50 IC50

Keterangan : D1 = konsentrasi sampel 250 µg/ml; D2 = konsentrasi sampel 125 µg/ml;

D3 = konsentrasi sampel 62,5 µg/ml; D4 = konsentrasi sampel 31,25

µg/ml; D5

∑ = total persen sel hidup

= konsentrasi sampel 15,625 µg/ml; P = pengulangan, A = absorbansi

Selanjutnya nilaiIC50 masing-masing sampel terhadap sel T47D dan sel

Vero dibandingkan sehingga didapatkan nilai SI. Fraksi yang memiliki IC50paling

kecil dan selektif dilanjutkan ke uji penghambatan siklus sel dan penekanan ekspresi enzim COX-2 pada sel T47D (Tabel 3.2 dan Tabel 3.3).

(52)

Tabel 3.2 Matrik uji penghambatan siklus sel T47D

Fraksi aktif EEKBPT Doksorubisin IC

fase G

0-G1, S, G2-M fase G0-G1, S, G2-M

½ IC

fase G

0-G1, S, G2-M fase G0-G1, S, G2-M

Tabel 3.3 Matrik uji penekanan ekspresi enzim COX-2 sel T47D

Fraksi aktif EEKBPT Doksorubisin IC

Ekspresi COX-2

Ekspresi COX-2 ½ IC

Ekspresi COX-2

Keterangan : = terjadi penurunan

Berdasarkan hasil dari Tabel 3.1, 3.2 dan 3.3 akan diperoleh kesimpulan tentang aktivitas antikanker fraksi aktif EEKBPT.

3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas,autoclave (Hirayama)blender (Philips), conical tube, eksikator, ELISA

reader (BenMark Biorad), inkubator CO25% (Heraceus), FACScan

flowcytometer(Becton-Dickinson), inverted microscope (Olympus),optilab, krus porselin,laminar air flow (LAF)(Labconco), mikropipet, flask (wadah kultur), hemositometer, alat penghitung, neraca kasar (Home Line), neraca listrik (Vibra AJ),pH meter oven (Memmert), penangas air (Yenaco), rotary evaporator (Haake D1), sentrifugator, seperangkat alat penetapan kadar air, tanur, vortex, 96-well plate, 6-well plate dan 24-well plate.

(53)

3.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit batang pohon Tanjung. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu α-naftol, amonium hidroksida, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat,asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi (III) klorida, kloralhidrat, bismut (III) nitrat, etanol,eter, etilasetat, n-heksan, hepes (Sigma), iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, petroleum eter, raksa (II) klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum,sodium hidrogen sulfat (Macalai tesque), timbal (II) asetat, toluena., air suling, dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma). Sel kanker payudara T47D yang merupakan koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, media Roswell Park Memorial Institute (RPMI), media M199,

Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin-streptomisin 2% (v/v) (Gibco), dan Fungizone (Amphoterisin B) 0,5%. Selain bahan-bahan di atas juga digunakan0,25% Tripsin-EDTA (Gibco), Phospate Buffer Saline(PBS),MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium bromida] (Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/mL, natrium deodesil sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N, propidium iodide (Sigma Aldrich) dan antibodi COX-2.

3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.2.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan kulit batang pohon Tanjung yang sama dari daerah lain. Sampel diambil dari daerah Johor, Kota Medan, Provinsi Sumatera Utara, Medan, Sumatera Utara. Sampel diambil dari bagian batang dan cabang batang pohon yang masih muda.

(54)

Kulit dikupas dari batang memanjang ke bawah (tidak horizontal sepanjang bagian batang) dengan ukuran tertentu (dimodifikasi dari Depkes, 1985). Cara pengambilan sampel dapat dilihat pada Lampiran 3.

Pengolahan sampel kulit batang pohon Tanjung dilakukan di Laboratorium Farmakognosi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan yang meliputi pembuatan simplisia, pembuatan pereaksi, pembuatan ekstrak etanol dan fraksi EEKBPT, karakterisasi simplisia dan ekstrak, dan skrining fitokimia dari fraksi EEKBPT.

3.2.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan pohon Tanjung dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.

3.2.3 Pembuatan simplisia

Bagian kulit yang mati dipisahkan dari bagian kulit batang yang masih segar, kemudian kulit batang dibersihkan dari kotoran dan lumut dengan cara dicuci di bawah air mengalir hingga bersih, ditiriskan lalu ditimbang, selanjutnya dikeringkan di lemari pengering. Setelah kering (mudah dipatahkan) , kulit batang ditimbang kembali, dipatahkan hingga berukuran kecil lalu diserbuk hingga halus. 3.3 Pembuatan Pereaksi

3.3.1 Pereaksi bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 ml(Depkes,1989).

(55)

3.3.2 Pereaksi dragendorff

Sebanyak 8 g bismut (III) nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml(Depkes,1989).

3.3.3 Pereaksi mayer

Sebanyak 1,3596 g raksa (II) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml (Depkes,1989).

3.3.4 Pereaksi besi (III) klorida 1%

Sebanyak 1 g besi (III) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml (Depkes,1989).

3.3.5 Pereaksi molish

Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml (Depkes,1989).

3.3.6 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml(Depkes,1989).

3.3.7 Pereaksi asam klorida 1 N

Sebanyak 8,5 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml (Depkes, 1979).

(56)

3.3.8 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml (Depkes, 1979).

3.3.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N

Sebanyak 4,001 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml (Depkes, 1979).

3.3.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml (Depkes, 1979).

3.3.11 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat, lalu ditambahkan 50 ml etanol ke dalam campuran tersebut(Merck, 1978). 3.3.12 Pereaksi kloralhidrat

Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling(Depkes,1989).

3.4 Karakterisasi Simplisia 3.4.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia kulit batang pohon Tanjung.

3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat dan ditutupi dengan coverglass (kaca penutup), kemudian diamati di bawah mikroskop

(57)

3.4.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi (destilasi toluena) (WHO, 1998).

Cara kerja:

Dua ratus (200) ml toluena dan dua (2) ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan dingin selama 30 menit, lalu volume air dibaca pada tabung penerima yang memiliki ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluenamendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan dingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa kemudian dihitung dalam persen.

3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter) dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar dalam

(58)

persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan(Depkes, 1989).

3.4.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105o

3.4.6 Penetapan kadar abu total

C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96% dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1989).

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600o

3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam

C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1989).

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbangsampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes, 1989).

(59)

3.5 Karakterisasi Ekstrak

Karakterisasi ekstrak seluruhnya mengikuti cara karakterisasi terhadap simplisia.

3.6 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon (Depkes, 1989), saponin, tanin (Farnsworth, 1966), dan steroid/triterpenoid (Harborne, 1987)

3.6.1 Pemeriksaan alkaloid

Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi:

a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff.

Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas (Depkes, 1989).

3.6.2 Pemeriksaan flavonoid

Sampelditimbang 10 g, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol. Dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol(Depkes, 1989).

(60)

3.6.3 Pemeriksaan glikosida

Sampel ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96%-air (7:3) dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol (3:2) sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring, dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50o

Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya ikatan gula (Depkes, 1989).

C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol.

3.6.4 Pemeriksaan antrakinon

Sampel ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan, dikocok dengan 2 ml NaOH 2 N, lalu didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon (Depkes, 1989).

3.6.5 Pemeriksaan saponin

Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Farnsworth, 1966).

(61)

3.6.6 Pemeriksaan tanin

Sampel ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1% b/v. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin(Farnsworth, 1966).

3.6.7 Pemeriksaan steroid/triterpenoid

Sampel ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan pereaksi asam sulfat pekat melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu ataubiru hijau menunjukkan adanya triterpenoid/steroid (Harborne, 1987).

3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (EEKBPT) Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol 96%. Empat ratus(400) g serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 96% selama 3 jam. Selanjutnya dipindahkan massa tersebut sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, tambahkan etanol 96% secukupnya hingga simplisia terendam dan terdapat cairan penyari di atasnya, perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian kran perkolator dibuka dan dibiarkan cairan ekstrak menetes dengan kecepatan 20 tetes per menit dan ditambahkan etanol 96% berulang-ulang secukupnya dan diatur kecepatan penetesan cairan penyari sama dengan kecepatan tetesan perkolat,sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika 400 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa.Perkolat kemudian diuapkan

(62)

dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari 50o

3.8 Pembuatan Fraksi-Fraksi EEKBPT

C menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental (Depkes, 1995).

Sebanyak 20 g ektrak etanol dilarutkan dalam etanol 96% sampai larut kemudian ditambahkan 40 ml air suling, dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu ditambahkan 100 ml n-heksana, lalu dikocok, dan didiamkan sampai terdapat 2 lapisan yang terpisah (± 30 menit). Lapisan n-heksana (lapisan atas) diambil dengan cara dialirkan, dan fraksinasi dilakukan sampai lapisan n-heksana memberikan hasil negatif dengan pereaksi LB. Lapisan n-heksana yang dikumpulkan dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh fraksi

n-heksana. Kemudian pada residu (sisa)ditambahkan 100 ml etilasetat, lalu dikocok, didiamkan sampai terdapat 2 lapisan yang terpisah (± 30 menit), lapisan etilasetat (lapisan atas) diambil dengan cara dialirkan, dan fraksinasi dilakukan sampai lapisan etilasetat memberikan hasil negatif dengan pereaksi FeCl3

3.9 Uji Antikanker Ekstrak dan Fraksi EEKBPT

. Lapisan etilasetat yang dikumpulkan dipekatkan dengan rotary evaporator

sehingga diperoleh fraksi etilasetat. Lapisan air (sisa) diambil dan dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga didapat fraksi air (Bassett, et al., 1994).

Pengujian antikanker fraksi EEKBT terhadap sel kanker payudara T47D dilakukan di Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pengujian tersebut meliputi pembuatan media RPMI, pembuatan media kultur lengkap, penumbuhan sel T47D dan Vero, pembuatan larutan uji, uji sitotoksik dan selectivity index ekstrak etanol, fraksi n-heksana, etilasetat dan air, pengujian penentuan fase penghambatan sel pada siklus sel

(1)

Lampiran 32. Sel T47D di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel T47D sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel T47D setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

c. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10) b a

(2)

Lampiran 33. Sel Vero di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel Vero sebelumdiberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel Vero setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

c. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10)

(3)

Lampiran 34. Microplate -96 sumuran

Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

ekstrak etanol Kontrol media Kontrol sel 15,625 µg/ml 250 µg/ml 125 µg/ml 62,5 µg/ml 31,25 µg/ml Fraksi air

Fraksi n-heksana

Fraksi etilasetat

(4)

Lampiran 35. Mikroskop inverted, Elisa reader, inkubator CO2, Flowsitometer, Laminar Air Flow

Keterangan : Elisa reader

Keterangan : Mikroskop inverted

Keterangan : Inkubator CO2

(5)

Lampiran 35. (Lanjutan)

Keterangan: Flowsitometer

(6)

Lampiran 36. Sertifikat kultur jaringan dari laboratorium Pusat Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran UGM

Uji Aktivitas Antikanker Fraksi Aktif Ekstrak Etanol Kulit Batang Pohon Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel Kanker Payudara

TESIS

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF EKSTRAK

ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG (Mimusopsi

cortex) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF

EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG

(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

LEMBAR PERSETUJUAN TESIS

UJI AKTIVITAS ANTIKANKER FRAKSI AKTIF

EKSTRAK ETANOL KULIT BATANG POHON TANJUNG

(Mimusopsi cortex) TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA

Oleh:

VONNA AULIANSHAH

NIM 127014001

Parts

Dokumen yang terkait

Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D

Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)dan Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Payudara

Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Terhadap Sel Kanker Serviks

Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Terhadap Sel Kanker Serviks

Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Terhadap Sel Kanker Serviks

Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D sitotoksik

Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D

Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tumbuhan Tanjung 2.1.1 Morfologi Tumbuhan Tanjung - Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D

Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Tanjung (Mimusopsi cortex) Terhadap Sel T47D

Dokumen yang Anda mencari sudah siap untuk unduhkan