Validasi metode penetapan kadar heptaminol HCL dengan agen penderivat o-ftalaldehid secara spektrofotometri ultraviolet - USD Repository

  

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR HEPTAMINOL HCl

DENGAN AGEN PENDERIVAT O-FTALALDEHID SECARA

SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Agnes Anania Triavika Sahamastuti

  

NIM : 078114142

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  

2011

HALAMAN PERSEMBAHAN

  Walau ku harus berjalan Dalam lembah kekelaman Perlindungan-Mu, oh, Tuhan Nyatalah bagi hidupku

  Tiada pernah sedetikpun Tiada pernah Kau tinggalkan Sungguh mulia dan sempurna Hanya Kau layak disembah

  Yesus, Engkau Juruselamatku Dalam janji-Mu, kemenanganku Selamanya kan kunyatakan Besar setia-Mu, Tuhan, dihidupku..

  (True Worshippers) Best regards for my lovely family,

  Papah, Mami, Adit and Angga For your support, love, and patient for me.. and especially for my Jesus, Who always pour His bless and grace for me..

  I belong to You, LORD!! All for Jesus! Amen!

  

PRAKATA

  Segala puji syukur atas segala kebaikan, hikmat dan rahmat Tuhan Yesus selama pengerjaan skripsi ini dari awal sampai akhir, sehingga penulis dapat menyelesaikan seluruh rangkaian penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul Validasi Metode Penetapan Kadar Heptaminol HCl Dengan Agen Penderivat O- Ftalaldehid Secara Spektrofotometri UV.

  Selama proses pelaksanaan dan penyusunan skripsi, penulis mendapatkan banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih yang setulus-tulusnya kepada:

  1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pmbimbing dan dosen penguji yang telah banyak memberikan waktu dan bantuan berupa saran dan kritik sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat berjalan dengan lancar.

  3. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.

  4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.

  5. PT. Corsa Indonesia, yang telah membantu dalam pengadaan baku heptaminol

  6. Pak Parlan dan Mas Bimo selaku laboran Laboratorium Kimia Organik dan Laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerjasamanya selama proses penelitian.

  7. Pak Bambang dan Mas Devi selaku laboran Laboratorium Analisis Makanan, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta atas bantuan dan kerjasamanya selama proses penelitian.

  8. Semua dosen dan laboran yang telah membantu baik dalam kuliah maupun dalam praktikum, terimakasih atas banyak ilmu dan bantuan yang telah saya dapat.

  9. Papah, Mami, Adit, dan Angga atas segala dukungan, doa dan semangat yang selalu diberikan, sehingga walaupun dengan banyak pengorbanan, skripsi ini akhirnya selesai.

  10. Teman-teman satu tim skripsi heptaminol HCl, Aji dan Dudud. Akhirnya, setelah cukup lama kita berkutat di laboratorium, kita bisa bernafas lega juga.

  Terimakasih buat kerjasamanya yang kompak.

  11. Sahabat yang sudah kudapat selama 3,5 tahun di Sanata Dharma, Riris, Septi, Xiang-Xiang, Putri, dan Fetri. Terimakasih buat banyak informasi, pengertian, waktu dan semangat yang selalu kalian berikan.

  12. Teman-teman sepelayananku dan komselku, Ka Iva, Veny, Lilis, Yemi, Tere, Ka Sabrina, Irma, Vina, Jessi, Sani, Ka Maria, Ko Hendro dan semua ”anak

  DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ............................................................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................. ii HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... iv HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v PRAKATA ............................................................................................ vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................. ix DAFTAR ISI ......................................................................................... x DAFTAR TABEL ................................................................................. xiv DAFTAR GAMBAR ............................................................................ xv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xvii

  INTISARI ............................................................................................. xviii

  

ABSTRACT ............................................................................................ xix

BAB I. PENGANTAR .........................................................................

  1 A. Latar Belakang .................................................................................

  1 1. Permasalahan .............................................................................

  3 2. Keaslian Penelitian ....................................................................

  3 3. Manfaat Penelitian .....................................................................

  4 B. Tujuan Penelitian .............................................................................

  5 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .................................................

  6

  B. O-Ftalaldehid (OPA) .......................................................................

  7 C. Derivatisasi .......................................................................................

  8 D. Spektrofotometri UV .......................................................................

  9 E. Validasi Metode Analisis .................................................................

  12 1. Spesifisitas (Specificity) .............................................................

  13 2. Linearitas ....................................................................................

  13

  3. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ) ……………………….

  13 4. Ketepatan (Accuracy) .................................................................

  14 5. Ketelitian (Precision) .................................................................

  14 F. Landasan Teori .................................................................................

  16 G. Hipotesis ...........................................................................................

  17 BAB III. METODE PENELITIAN ......................................................

  18 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................

  18 B. Variabel Penelitian ...........................................................................

  18 1. Variabel Bebas ............................................................................

  18 2. Variabel Tergantung ...................................................................

  18 3. Variabel Pengacau Terkendali ....................................................

  18 C. Definisi Operasional .........................................................................

  19 D. Bahan .................................................................................................

  19 E. Alat ....................................................................................................

  19 F. Tata Cara Penelitian ..........................................................................

  20

  2. Pembuatan Larutan OPA .............................................................

  20 3. Pembuatan Larutan Stok Heptaminol HCl (4 mg/mL) ................

  20 4. Pembuatan Larutan Baku Heptaminol HCl .................................

  20 5. Pembuatan Kurva Baku Heptaminol HCl ...................................

  21 6. Recovery Kurva Baku...................................................................

  21 G. Analisis Hasil .....................................................................................

  22 1. Spesifisitas ...................................................................................

  22 2. Linearitas Kurva Baku .................................................................

  22 3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) ....................

  22 4. Ketelitian (Precision) ..................................................................

  22 5. Ketepatan (Accuracy) .................................................................

  23 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................

  24 A. Pembuatan Larutan ............................................................................

  24 1. Larutan Heptaminol HCl .............................................................

  24 2. Larutan OPA ...............................................................................

  24 3. Larutan Baku Heptaminol HCl ...................................................

  27 B. Pembuatan Kurva Baku Heptaminol HCl .........................................

  29 C. Validasi Metode ................................................................................

  31 1. Spesifisitas ..................................................................................

  32 2. Linearitas .....................................................................................

  35 3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) ....................

  36 4. Ketepatan (Accuracy) ..................................................................

  38

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................

  40 A. Kesimpulan ........................................................................................

  40 B. Saran ..................................................................................................

  40 DAFTAR PUSTAKA .............................................................................

  41 LAMPIRAN ............................................................................................

  44 BIOGRAFI PENULIS ............................................................................

  58

  DAFTAR TABEL

  Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda .............................................................................

  14 Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang berbeda .............................................................................

  15 Tabel III. Elemen data yang dibutuhkan untuk validasi metode analisis ..............................................................................

  16 Tabel IV. Data replikasi kurva baku heptaminol HCl ......................

  30 Tabel V. Data absorbansi blangko larutan OPA dalam bufer borat pH 9 ……………………………………………....

  37

  DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur molekul heptaminol HCl ……………………….

  6 Gambar 2. Struktur molekul o-ftalaldehid ..........................................

  7 Gambar 3. Reaksi antara o-ftalaldehid dengan amina primer bersama merkaptoetanol ...................................................

  8 Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik ....................................

  9 Gambar 5. Reaksi Cannizzaro pada OPA ..........................................

  26 Gambar 6. Usulan reaksi fotodegradasi OPA ....................................

  27 Gambar 7. Reaksi antara OPA dengan heptaminol bersama merkaptoetanol akan menghasilkan senyawa hasil derivatisasi yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom ……………………………………………….

  28 Gambar 8. Gugus kromofor dan auksokrom dari senyawa hasil derivatisasi (Gugus kromofor ditunjukkan oleh garis lurus, sedangkan gugus auksokrom ditunjukkan oleh garis titik-titik) ……………………………………… 29

  Gambar 9. Hubungan antara kadar heptaminol HCl dengan absorbansi derivatnya pada replikasi I ..............................

  31 Gambar 10. Spektrum absorbansi OPA ………....................................

  33 Gambar 11. Reaksi degradasi hasil derivatisasi antara OPA dengan heptaminol (Lindroth, 1985) …………………………….

  33 Gambar 12. (A) Spektrum absorbansi hasil derivatisasi setelah

  absorbansi hasil derivatisasi setelah 1 jam reaksi ….……. 34 Gambar 13. Perkiraan spektra absorbansi hasil derivatisasi setelah 15 menit reaksi ……………………………….….

  35

  DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Sertifikat Analisis Heptaminol HCl dari PT. Corsa ……..

  45 Lampiran 2. Hasil scanning panjang gelombang larutan OPA ……….. 46 Lampiran 3. Hasil scanning panjang gelombang hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA setelah 1,5 menit reaksi …………………………………………

  47 Lampiran 4. Hasil scanning panjang gelombang hasil degradasi dari hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA …………………………………………………….

  48 Lampiran 5. Contoh Perhitungan Kadar Larutan Baku heptaminol HCl …………………………………………

  49 Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Kurva Baku Heptaminol HCl ….

  50 Lampiran 7. Perhitungan LOD dan LOQ …………………………….

  53 Lampiran 8. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku heptaminol HCl ………………………………………….

  55

  

INTISARI

  Heptaminol merupakan senyawa amina primer alifatis yang tidak memiliki gugus kromofor ataupun auksokrom, sehingga tidak dapat ditetapkan kadarnya secara langsung menggunakan spektrofotometer ultraviolet (UV) ataupun visible (Vis). Untuk dapat menetapkan kadarnya, perlu dilakukan derivatisasi menggunakan agen penderivat tertentu dan menghasilkan senyawa turunan heptaminol yang memiliki kromofor dan auksokrom. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan pengembangan metode spektrofotometri UV dengan derivatisasi menggunakan agen penderivat o-ftalaldehid (OPA) untuk menetapkan kadar heptaminol HCl.

  Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif. Pada penelitian ini dilakukan pembuatan kurva baku dari hasil derivatisasi heptaminol HCl menggunakan regresi linear antara kadar kurva baku dan absorbansinya. Untuk menentukan kevalidan metode, digunakan parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan, dan ketelitian.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai koefisien korelasi (r) dari kurva baku heptaminol HCl sebesar 0,9995, rentang nilai recovery-nya sebesar 99,32-101,78%, rentang nilai CV sebesar 0,38-0,98%, batas deteksinya 0,67 µg/mL dan batas kuantitasinya 2,23 µg/mL pada pengukuran di panjang gelombang 332 nm. Maka dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki validitas yang baik untuk spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan, dan ketelitiannya.

  Kata kunci : heptaminol, o-ftalaldehid (OPA), spektrofotometri UV, validasi

  

ABSTRACT

  Heptaminol is a primary amine aliphatic which have neither chromophore nor auxochrome, and can not directly determined by spectrophotometer ultraviolet (UV) nor visible (Vis). To determine its level, it needs derivatization with a specific derivatizing agent to produce the derivate of heptaminol which have chromophore and auxochrome. This research is to develop a method of spectrophotometry UV with derivatization by o-phthalaldehyde (OPA) to determine the level of heptaminol HCl.

  This research is a descriptive non experimental research. In this study, done by making a standard curve of derivate of heptaminol HCl by using a Linear regression between level of standard curve against their absorbance. To determine the validity of the method, parameters such as selectivity, linearity, limit of detection, limit of quantitation, accuracy, and precision were determined.

  The result of correlation coefficient (r) of standard curve of heptaminol HCl was 0,9995, range of recovery values were 99,32-101,78%, range of CV values were 0,38-0,98%, limit of detection was 0,67 µg/mL and limit of quantitation was 2,23 µg/mL, which measured in 332 nm. Therefore, it can be concluded that the method has good validity for specificity, linearity, limit of detection, limit of quantitation, accuracy, and precision.

  Keywords: heptaminol, o-phthalaldehyde (OPA), validation

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Heptaminol merupakan obat turunan amina yang digunakan sebagai

  kardiotonik dan vasodilator. Dilihat dari struktur molekulnya, heptaminol adalah senyawa amina primer alifatis yang tidak memiliki gugus kromofor ataupun auksokrom, sehingga tidak dapat ditetapkan kadarnya secara langsung menggunakan spektrofotometer ultraviolet (UV) ataupun visible (Vis). Karena itu, perlu dilakukan derivatisasi terlebih dahulu untuk menghasilkan senyawa turunan heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom, sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan lebih spesifik dan sensitif.

  Analisis heptaminol yang telah dilakukan antara lain dengan menggunakan: Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-fotodensitometri, dengan derivatisasi menggunakan 4-chloro-7-nitrobenzo-2,1,3-oxadiazole (Morros, Borja, dan Segura, 1985); spektrofotometri dan spektrofluorometri dengan ditambahkannya reagen asetilaseton-formaldehida (Fattah, El-Yazbi, Belal dan Abdel-Razak, 1997); serta Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan derivatisasi pra-kolom menggunakan o-phthalaldehyde dan detektor fluoresensi (Brodie, Chasseaud, Rooney, Daragh dan Lambe, 1982).

  Dari data tersebut, heptaminol telah dianalisis menggunakan beberapa agen penderivat, salah satunya adalah o-ftalaldehid (OPA). OPA merupakan reaksi yang berlangsung hanya memerlukan waktu yang singkat dan hasilnya sensitif. Menurut Benson dan Hare (1975), dibandingkan dengan agen penderivat amina primer yang umumnya dipakai, seperti fluorescamine dan ninhidrin, OPA lebih larut dan stabil dalam larutan bufer, dan sensitivitasnya dalam mendeteksi protein 5-10 kali lebih besar dibandingkan fluorescamine.

  OPA memiliki gugus aldehid yang dapat bereaksi dengan gugus amina pada heptaminol, sehingga menghasilkan senyawa derivat yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Namun, sejauh penelusuran yang ditemukan, masih jarang dilakukan penetapan kadar heptaminol menggunakan metode spektrofotometri UV, meskipun alat tersebut umumnya digunakan oleh laboratorium-laboratorium analisis di Indonesia. Metode spektrofotometri merupakan metode yang cukup mudah dan cepat untuk dilakukan, serta memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang cukup baik, sehingga umumnya dipilih sebagai metode awal dalam menetapkan kadar suatu senyawa.

  Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian heptaminol HCl dengan Susanti (2011) dan Mukti (2011). Berdasarkan hasil optimasi dari Susanti (2011), diperoleh nilai absorbtivitas molar (

  ε) rata-rata dari hasil derivat antara heptaminol

• 1 -1

  dengan OPA sebesar 667,3544 M cm . Nilai ini berada pada tingkat ”sedang” dari mudah-tidaknya senyawa tersebut dianalisis menggunakan spektrofotometri UV (Mulja dan Suharman, 1995). Umumnya, analisis menggunakan

• 1 -1

  spektrofotometri UV memerlukan nilai cm , karena absorbansi ε diatas 1000 M yang diperoleh akan lebih besar pada konsentrasi analit yang kecil. Namun, analit

• 1 -1

meskipun intensitas absorbansinya akan jauh lebih kecil dibandingkan dengan senyawa lain yang memiliki nilai ε lebih besar (Pavia, Lampman, dan Kriz, 2001).

  Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan analit dengan konsentrasi yang cukup besar, sehingga dapat meningkatkan intensitas absorbansinya.

  Oleh karena itu, perlu dilakukan validasi terhadap metode penetapan kadar yang digunakan, sehingga metode tersebut sesuai untuk penetapan kadar heptaminol HCl. Melalui penelitian ini, penulis hendak melakukan validasi untuk mengetahui sensitivitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan presisi dari metode penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV sesuai dengan hasil optimasi dari Susanti (2011).

  1. Permasalahan

  Apakah penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV memenuhi kriteria spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi?

  2. Keaslian penelitian

  Berdasarkan data-data penelitian yang telah dilakukan sebelumnya mengenai penetapan kadar heptaminol yang diperoleh penulis, masih jarang ditemukan penetapan kadar heptaminol secara spektrofotometri UV di Indonesia. Selain itu, sepanjang pengetahuan penulis, analisis heptaminol yang dilakukan umumnya menggunakan detektor fluoresensi.

  Analisis heptaminol dengan metode spektrofotometri yang pernah dilakukan yaitu penetapan kadar heptaminol dan mexiletine dalam sediaan obat secara spektrofotometri dan spektrofluorometri dengan penambahan reagen asetilaseton-formaldehida pernah dilakukan oleh Fattah et al. (1997).

  Selain dengan metode spektrofotometri, penetapan kadar heptaminol dalam plasma dan urin pernah dilakukan menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan detektor fluoresensi setelah diderivatisasi dengan OPA. Metode ini dilaporkan memiliki sensitivitas yang cukup baik untuk studi farmakokinetika (Brodie et al., 1983). Penetapan kadar heptaminol pada plasma dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dan in situ Fluorometri dengan derivatisasi menggunakan 4-chloro-7-nitrobenzo-2,1,3-oxadiazole juga pernah dilakukan oleh Morros et al.(1985).

3. Manfaat penelitian

  Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut:

  a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah mengenai metode alternatif untuk penetapan kadar heptaminol HCl, yaitu menggunakan agen penderivatisasi OPA dengan metode spektrofotometri UV.

  b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat menyediakan metode penetapan kadar heptaminol HCl yang dapat dimanfaatkan oleh pihak industri dalam penjaminan kualitas.

B. Tujuan Penelitian

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi metode penetapan kadar heptaminol dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Heptaminol HCl CH

  3 CH CH

  3

3 HCl OH NH

  2 Gambar 1. Struktur molekul heptaminol HCl

  Heptaminol HCl (Gambar 1.) memiliki rumus molekul C H ClNO,

  8

  20 a

  dengan bobot molekul 180,7 g/mol (Anonim, 2010 ). Heptaminol HCl berbentuk kristal, dengan titik lebur 178-180 C, larut dalam air dan alkohol, tidak larut dalam aseton, benzen dan eter (Anonim, 1989). Heptaminol HCl adalah senyawa turunan amina yang memiliki efek kardiotonik dan vasodilator. Dosis terapinya

  b

  berkisar antara 1-3 mg/kg BB (Anonim, 2010 ). Heptaminol HCl bekerja pada sistem kardiosirkulasi serta sistem neuromuskuler, sehingga berkhasiat meningkatkan tekanan darah dan memperkuat kerja jantung (Hardjasaputra, Budipranoto, Sembiring dan Kamil, 2002).

  Heptaminol HCl mempunyai 2 khasiat utama, yaitu:

  1. Heptaminol akan meningkatkan kekuatan sistolik dan kapasitas kerja jantung,

  output jantung serta aliran darah koroner. Selain itu, heptaminol juga memperkuat pembuluh darah perifer.

  2. Heptaminol akan memperkuat dan menormalkan sistem neuromuskuler (Hardjasaputra et al., 2002).

  Dilihat dari strukturnya, heptaminol hanya memiliki gugus –NH

  2 dan –

  OH yang penting untuk keperluan analisis. Menurut Snyder, Kirkland dan Glajch (1997), gugus –NH

  2 tidak memiliki koefisien ekstingsi molar (

  ε), sehingga senyawa ini sukar untuk dideteksi menggunakan spektrofotometer UV.

B. O-Ftalaldehid (OPA)

  

Gambar 2. Struktur molekul o-ftalaldehid

  OPA (Gambar 2.) dengan rumus molekul C

  8 H

  6 O 2 berbentuk kristal atau

  serbuk berwarna kuning. Bobot molekul OPA adalah 134,12 g/mol (Anonim,

  a 2005 ).

  Penetapan kadar protein menggunakan OPA cepat dan sensitif. OPA akan bereaksi dengan gugus amina primer pada protein. OPA bereaksi dengan amina primer dan merkaptoetanol menghasilkan senyawa berfluoresensi biru yang memiliki panjang gelombang eksitasi maksimum pada 340 nm dan panjang gelombang emisi maksimum pada 455 nm seperti terlihat pada Gambar 3. Reaksi ini berlangsung secara spontan, sehingga reaksinya berlangsung dalam beberapa menit (Ahmed, 2005).

  O S OH H OH NH ₂ HS R H

  N R O o-ftalaldehid dengan amina primer bersama merkaptoetanol

  Gambar 3. Reaksi antara

  OPA memberikan sensitivitas yang lebih besar dalam deteksinya. Hal ini disebabkan karena dua kriteria penting: pertama, OPA tidak berfluoresensi sehingga tidak mengganggu deteksi. Kedua, reaksinya terjadi dengan cepat pada suhu kamar, meminimalkan penggunaan waktu yang lama (Blackburn, 1989).

C. Derivatisasi

  Dalam pelaksanaan suatu analisis, kemungkinan banyak terdapat zat-zat yang memberikan absorbansi maksimal pada panjang gelombang 200-210 nm, umumnya merupakan bahan-bahan yang dipakai sebagai pelarut, khususnya yang memiliki ikatan hidrogen. Proses derivatisasi dilakukan untuk mengatasi keadaan tersebut dengan cara mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga terjadi pergeseran panjang gelombang maksimal ke arah pergeseran merah atau mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga menghasilkan senyawa yang berfluoresensi.

  Dalam proses derivatisasi, harus diperhatikan bahwa zat penderivat harus memberikan reaksi yang cepat dan stabil serta meningkatkan sensitivitas pengukuran (Mulja dan Suharman, 1995).

D. Spektrofotometri UV

  Spektrofotometri UV adalah salah satu teknik analisis spektroskopik yang menggunakan radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan memakai alat spektrofotometer. Pada analisis menggunakan spektrofotometri UV, dilakukan pembacaan absorbansi (penyerapan) atau transmitansi (penerusan) radiasi elektromagnetik oleh suatu molekul. Hasil pembacaan absorbansi disebut sebagai absorban (A) dan tidak memiliki satuan, sedangkan hasil pembacaan transmitansi disebut transmitan dan memiliki satuan %T (Mulja dan Suharman, 1995).

  Adanya radiasi ultraviolet dan cahaya tampak akan meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, dimana energi yang disumbangkan oleh foton-foton menyebabkan elektron-elektron dapat mengatasi kekangan inti dan berpindah ke orbital baru yang lebih tinggi energinya (Day dan Underwood, 2002). Transisi elektron yang mungkin terjadi dapat dilihat pada gambar 4, yaitu:

  antibonding σ* π* antibonding

  E

  n non bonding

  π bonding

  σ bonding

  Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik

  

  1. Transisi elektron σ σ*. Elektron di orbital σ bonding akan tereksitasi ke orbital

  σ* antibonding. Transisi ini terjadi pada daerah ultraviolet jauh, membutuhkan energi yang besar dan terjadi pada molekul yang memiliki ikatan tunggal (Mulja dan Suharman, 1995).

  2. Transisi elektron n  σ*. Eksitasi elektron terjadi dari orbital n nonbonding ke orbital

  σ* antibonding. Transisi ini terjadi pada senyawa jenuh dengan elektron

  nonbonding , dan membutuhkan energi yang lebih rendah daripada transisi 

  elektron σ σ* serta terjadi karena radiasi pada daerah 150-250 nm (Khopkar, 1990).

  3. Transisi elektron n   π* dan π π*. Sebagian besar penerapan spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik didasarkan pada transisi ini.

  Energi yang diperlukan untuk transisi ini menghasilkan absorban maksimum

  

  pada daerah 200-700 nm (Khopkar, 1990). Transisi n π* terjadi pada senyawa yang memiliki elektron n nonbonding yang tereksitasi ke orbital

  π*

  antibonding . Transisi 

  π π* terjadi pada senyawa yang memiliki ikatan rangkap dua atau tiga (alkena dan alkuna) yang menyerap energi yang sesuai dan terjadi pada daerah ultraviolet dekat (Mulja dan Suharman, 1995).

  Iradiasi dari suatu komponen organik dapat menyebabkan terjadinya eksitasi elektron dari sutau orbital (umumnya berupa pasangan elektron bebas atau orbital ikatan) ke orbital yang lain (umumnya berupa orvital non-bonding atau orbital anti-ikatan). Hal ini dapat ditunjukkan berupa:

  20

  x P x a ε = 0,87 x 10 P merupakan kemungkinan terjadinya transisi (bernilai dari 0 sampai dengan 1), dan a adalah daerah sasaran dari sistem yang mengabsorbsi, dimana sistem yang mengabsorbsi ini umumnya disebut sebagai kromofor. Umumnya, semakin panjang gugus kromofornya, semakin besar intensitas absorbansinya (Williams dan Fleming, 1980).

  Bouguer, Lambert dan Beer membuat suatu persamaan matematik yang menghubungkan antara absorban atau transmitan terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi:

  A = ε. b. c

• 1 -1

  dimana: T = % transmitan; A = absorban; cm ); c ε = absorbansi molar (Lt.mol

• 1

  = konsentrasi (mol.Lt ); b = tebal larutan (cm). F Pada pengukuran yang menghasilkan absorban yang rendah, intensitas sinar yang masuk dengan sinar yang diteruskan hampir sama, sehingga kesalahan akan menjadi besar, sebab yang terdeteksi adalah perbedaan antara kedua intensitas tersebut. Sedangkan, pada absorban yang tinggi, energi yang diterima sangat kecil, sehingga sukar diukur secara akurat (Redja, 1980). Pembacaan absorbansi sebesar 0,2 – 0,8 atau persen transmitan sebesar 15 - 65% akan memberikan persen kesalahan analisis yang masih dapat diterima (0,5 – 1%) (Mulja dan Suharman, 1995).

  Nilai ε (daya serap molar atau koefisien ekstingsi molar) adalah karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam suatu pelarut tertentu, pada panjang gelombang tertentu, dan tidak bergantung pada konsentrasi dan panjang dikatakan bahwa nilai ε sangat mempengaruhi puncak spektrum yang dihasilkan oleh suatu zat. Rincian nilai

  ε terhadap puncak spektrum adalah: 1-10= sangat

  2

  2

  3

  3

  4

  4

  5

  lemah; 10-10 = lemah; 10 -10 = sedang; 10 -10 = kuat; 10 -10 = sangat kuat (Mulja dan Suharman, 1995). Semakin besar nilai

  ε, maka semakin mudah senyawa tersebut untuk dianalisis menggunakan spektrofotometri UV, karena semakin besar absorbansi yang diperoleh untuk kadar analit yang sama.

  Kriteria pelarut yang baik dalam spektrofotometri adalah tidak mengabsorbsi radiasi UV pada daerah yang sama dengan analitnya. Biasanya, pelarut yang dipilih adalah yang tidak memiliki sistem terkonjugasi. Air, etanol 95% dan n-heksana merupakan pelarut yang banyak digunakan. Zat-zat tersebut tidak terlihat dalam daerah spektrum ultraviolet dimana puncak absorbsi analit biasanya muncul (Pavia, et al., 2001).

  Pengukuran absorbansi senyawa untuk analisis kuantitatif pada spektrofotometri dilakukan pada panjang gelombang maksimum, yaitu panjang gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorbansi yang maksimum. Pada panjang gelombang maksimal kepekaan analisis yang diperoleh maksimal. Selain itu, pita absorban disekitar panjang gelombang maksimal berbentuk datar, dan memberikan kesalahan yang kecil pada pengukuran ulang (Mulja dan Suharman, 1995).

E. Validasi Metode Analisis

  Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis meliputi antara lain linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan dan ketelitian.

  specificity)

  1. Spesifisitas (

  Spesifisitas suatu metode adalah kemampuan metode tersebut untuk mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel (Anonim, 2006). Spesifisitas ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil degradasi, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tersebut (Harmita, 2004).

  2. Linearitas

  Linearitas adalah kemampuan metode untuk memberikan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit di dalam sampel. Syarat suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik adalah bila nilai koefisien korelasi (r)-nya > 0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa utama (Snyder et al., 1997).

  

3. Batas Deteksi ( limit of detection/LOD) dan Batas Kuantitasi (limit of

quantitation/LOQ)

  Batas deteksi adalah konsentrasi terkecil suatu analit dalam sampel yang dapat terdeteksi. Batas deteksi digambarkan sebagai perbandingan signal-to-noise (S/N) antara hasil uji sampel dengan analit yang diketahui konsentrasinya dan blangko. Rasio signal-to-noise untuk batas deteksi adalah sekurangnya 3:1 perhitungan tiga kali nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilai slope kurva

  b baku (Anonim, 2005 ).

  Batas kuantitasi adalah konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang masih dapat menunjukkan pengukuran secara teliti dan tepat. Penentuan batas kuantitasi didasarkan pada perhitungan sepuluh kali nilai standar deviasi blangko

  b dibagi dengan nilai slope kurva baku (Anonim, 2005 ).

  4. Ketepatan ( accuracy)

  Ketepatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali analit yang ditambahkan (Harmita, 2004). Kriteria penerimaan akurasi ditentukan berdasarkan kadar analit, dinyatakan dalam persen (%) perolehan kembali, seperti yang tertera pada Tabel I.:

  

Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) Perolehan kembali (%)

100 98-102

10 98-102

  1 97-103

0,1 95-105

0,01 90-107

0,001 80-110

  

0,0001 80-110

0,00001 80-110

0,000001 60-115

0,0000001 40-120

  (Huber, 2003)

  5. Ketelitian ( precision)

  Ketelitian adalah derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel yang berulang suatu sampel yang homogen dengan menggunakan suatu metode analisis. Presisi umumnya dinyatakan dengan koefisien variasi (CV) atau standar deviasi relatif (RSD), seperti yang tertera pada tabel II (United States Pharmacopeial Convention, 2005):

  

Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) CV (%)

100 1,3

10 2,7

  

1 2,8

0,1 3,7

0,01 5,3

0,001 7,3

  0,0001

  11 0,00001 15 0,000001 21 0,0000001

  30

  (Huber, 2003) Metode uji yang berbeda membutuhkan validasi yang berbeda. Kategori metode pengujian dengan validasi metode yang diperlukan adalah sebagai berikut, seperti yang juga dicantumkan dalam Tabel III (United States Pharmacopeial

  Convention , 2005):

  a. Kategori I: metode analitik yang digunakan untuk penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk akhir sediaan farmasi;

  b. Kategori II: metode analitik yang digunakan untuk penetapan ketidakmurnian dalam bahan baku atau bahan aktif atau hasil degradasi senyawa dalam produk akhir sediaan farmasi;

  c. Kategori III: metode analitik yang digunakan untuk penetapan karakteristik penampilan obat (misalnya disolusi, pelepasan obat); d. Kategori IV: metode analitik yang digunakan untuk uji identifikasi.

  Tabel III. Elemen data yang dibutuhkan untuk validasi metode analisis

Karakteristik analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV

• Ketepatan Ya Ya Tidak Ketelitian Ya Ya Tidak Ya Tidak * Spesifisitas Ya Ya Ya Ya Batas deteksi Tidak * Tidak Ya Tidak * Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak Tidak * Linearitas Ya Ya Tidak Tidak * * Rentang Ya Ya Tidak Keterangan : * tergantung dari masing-masing uji

F. Landasan Teori

  Heptaminol merupakan obat turunan amina yang digunakan sebagai kardiotonik dan vasodilator. Berdasarkan strukturnya, heptaminol adalah senyawa amina primer alifatis yang tidak memiliki gugus kromofor ataupun auksokrom. Karena itu, perlu dilakukan derivatisasi terlebih dahulu agar menghasilkan senyawa turunan heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom, sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan lebih spesifik dan sensitif.

  Reagen penderivat OPA memiliki gugus aldehida yang dapat bereaksi dengan gugus amina primer pada heptaminol. Reaksi ini akan menghasilkan senyawa turunan heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV, yang akan semakin meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas pengukurannya.

  Metode spektrofotometri UV merupakan metode yang cukup mudah dan cepat untuk dilakukan, serta memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang cukup baik, sehingga umumnya dipilih sebagai metode awal dalam menetapkan kadar suatu senyawa. Adanya peningkatan sensitivitas karena proses penderivatisasian derivat dengan absorbansinya, memperkecil batas deteksi dan batas kuantitasi, serta memberikan akurasi dan presisi yang baik dalam pengukuran absorbansinya.

  Penelitian ini dilakukan untuk melihat apakah metode penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV memenuhi parameter validasi yang baik untuk spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan presisi. Dalam hal ini, spesifisitas dianalisis berdasarkan perbandingan spektra absorbansi masing-masing senyawa (hasil derivatisasi dan OPA), linearitas dianalisis berdasarkan koefisien korelasi

  ≥ 0,999, batas deteksi dan batas kuantitasi berdasarkan perhitungan antara standar deviasi blangko dan slope kurva baku, akurasi dianalisis berdasarkan % recovery antara 98-102%, dan presisi dianalisis berdasarkan CV (Coefficient of Variance)

  ≤ 1,3%.

G. Hipotesis

  Berdasarkan landasan teori di atas, dapat disusun hipotesis bahwa metode spektrofotometri UV yang dikembangkan untuk heptaminol HCl memiliki validitas yang baik untuk parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

  rancangan penelitian deskriptif. Jenis penelitian non eksperimental karena tidak dilakukan variasi uji dan manipulasi terhadap subjek uji, yaitu heptaminol HCl.

  Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Variabel Penelitian

  1. Variabel bebas

  Variabel bebas dalam penelitian ini adalah seri kadar larutan heptaminol HCl.

  2. Variabel tergantung

  Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

  3. Variabel pengacau terkendali

  Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya, suhu reaksi, dan kemurnian pelarut yang digunakan. OPA bersifat fotosensitif, dimana OPA akan rusak oleh adanya cahaya. Untuk mengatasinya, maka larutan OPA dimasukkan dalam gelas Bekker yang telah dibungkus dengan kertas aluminium, suhu kamar terkendali (15-30

  C). Pelarut yang digunakan adalah pelarut dengan derajat pro analysis yang memiliki tingkat kemurnian yang tinggi.

C. Definisi Operasional 1. Heptaminol HCl yang divalidasi adalah heptaminol HCl yang berasal dari PT.

  Corsa, Indonesia (Certificate of Analysis terlampir di Lampiran 1).

  2. Sistem spektrofotometri yang digunakan adalah seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis merek Genesys 10 UV.

  3. Absorbansi yang diamati adalah absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA.

  4. Parameter validasi metode yang digunakan adalah spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

D. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi heptaminol HCl baku pembanding (PT. Corsa); o-ftalaldehid (p.a., Nacalai); merkaptoetanol; metanol; asam borat; NaOH; KCl (p.a., E. Merck); aquabidestilata (LPPT UGM).

E. Alat

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Spektrofotometer UV-Vis merk Genesys 10 UV, kuvet UV, vortex merk Thermolyne , pH meter merk pHep Family, neraca merk PJ Precisa Junior, neraca analitik merk Precisa

  125 A SCS, mikropipet 100-1000 µL, seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.

F. Tatacara Penelitian

  1. Pembuatan bufer borat pH 9

  Larutkan 0,75 g H

  3 BO 3 dan 0,95 g KCl dalam aqua bidestilata sampai

  125 mL. Kemudian ditambahkan dengan 52 mL larutan NaOH 0,1 M dan aqua bidestilata sampai volume 250 mL. Ukur pH larutan, kemudian tepatkan pH-nya menjadi 9 dengan menambahkan larutan H

  3 BO 3 atau larutan NaOH (Perrin dan Dempsey, 1974).

  2. Pembuatan larutan OPA

  Timbang lebih kurang seksama 100,0 mg OPA, kemudian dilarutkan dalam 2 mL metanol. Tambahkan 100 µL merkaptoetanol dan 200 mL bufer borat pH 9. Campur sampai homogen. Simpan dalam lemari es dan ditempat gelap. Larutan OPA inilah yang kemudian ditambahkan pada larutan baku heptaminol HCl.

  3. Pembuatan larutan stok heptaminol HCl (4 mg/mL)

  Timbang lebih kurang seksama 100,0 mg baku heptaminol HCl, masukkan ke dalam labu takar 25,0 mL, larutkan dengan aqua bidestilata hingga tanda.

  4. Pembuatan larutan baku heptaminol HCl

  Pipet 375; 500; 625; 750; dan 875 µL dari larutan stok heptaminol HCl, hingga volume tepat 10,0 mL, sehingga diperoleh kadar kurva baku sebesar 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; dan 0,35 mg/mL.

  5. Pembuatan kurva baku heptaminol HCl

  Masukkan masing-masing 3 mL larutan OPA ke dalam 5 vial yang telah dibungkus dengan kertas aluminium. Tambahkan masing-masing 300 µL seri larutan baku 0,15; 0,2; 0,25; 0,3 dan 0,35 mg/mL. Vortex campuran selama 10 detik. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 332 nm menggunakan spektrofotometer UV setelah didiamkan ditempat gelap dan pada suhu kamar selama 15 menit (terhitung setelah 1,5 menit sesudah penambahan larutan heptaminol HCl ke dalam larutan OPA). Buat kurva regresi linear antara kadar heptaminol dengan absorbansi senyawa hasil derivatisasi, kemudian ditentukan persamaan garis regresi linear dan tentukan nilai koefisien korelasinya.