Prediksi dan pembuktian kemungkinan fotosensitisasi ciprofloxacin dan furosemide dengan paparan radiasi UVA dan pencegahannya dengan antioksidan alpha lipoic acid [ALA] - USD Repository

  

PREDIKSI DAN PEMBUKTIAN KEMUNGKINAN FOTOSENSITISASI

CIPROFLOXACIN DAN FUROSEMIDE

DENGAN PAPARAN RADIASI UVA DAN PENCEGAHANNYA DENGAN

ANTIOKSIDAN ALPHA LIPOIC ACID (ALA)

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Cendani NIM : 048114106

  

PREDIKSI DAN PEMBUKTIAN KEMUNGKINAN FOTOSENSITISASI

CIPROFLOXACIN DAN FUROSEMIDE

DENGAN PAPARAN RADIASI UVA DAN PENCEGAHANNYA DENGAN

ANTIOKSIDAN ALPHA LIPOIC ACID (ALA)

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Cendani

  Do all the goods you can, All the best you can, In all times you can, In all places you can, For all the creatures you can.

  Anonim M Y LORD JESUS CHRI ST & M OTHER M ARY M Y LOVELY M OM

  

ATAS KERJA KERAS, DOA, & DUKUN GAN N YA

M Y BEST BROTHER, TOM Y SALAHUDDI N SEM OGA KI TA SELALU SUKSES N EN EK, TAN TE LI LY, OM HEN DRA UN TUK DOA DAN DUKUN GAN N YA M ESAKH ARDI PRAYOGA, A.M d.

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Cendani Nomor Mahasiswa : 048114106

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  

“Prediksi dan Pembuktian Kemungkinan Fotosensitisasi Ciprofloxacin dan

Furosemide dengan Paparan Radiasi UV A dan Pencegahannya dengan

Antioksidan Alpha Lipoic Acid (ALA)”

  beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 17 Juli 2008 Yang menyatakan

  

PRAKATA

  Puji dan syukur ke hadirat Tuhan atas berkat dan rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik dan lancar. Adapun skripsi ini disusun dan diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Strata 1 (S1) Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm.).

  Dalam proses penyusunan skripsi ini sangatlah tidak mudah. Dibutuhkan banyak bantuan pikiran, tenaga, semangat, doa, dan tentunya dana yang tidak sedikit sampai akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Tuhan Yesus dan Bunda Maria untuk cinta dan penuntunan terbaik.

  2. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan kepada penulis.

  4. dr. Fenty, M.Kes., Sp.PK., selaku dosen penguji atas kesediaan memberikan

  7. B.S. Ari Sudarmana, S.Si., yang telah banyak membantu dalam penyusunan skripsi sehingga menjadi karya ilmiah.

  8. Mamaku tersayang untuk cinta, kerja keras, doa, semangat, dan dukungannya.

  9. Mesakh Ardi Prayoga, A.Md., yang selalu mencintai dan berada disisiku untuk memberi semangat.

  10. Tomy Salahudin adikku tersayang, untuk dukungannya dan semoga kita selalu sukses.

  11. Nenekku tersayang, untuk doa dan dukungannya.

  12. Tante Lily dan Om Hendra, untuk doa, semangat, dan dukungannya.

  13. Tante Irene, Om Anda, Om Tony, Om Bibi, Om Ranto, Jojo, dan Mba Ram untuk cinta, semangat, dan kasih sayangnya.

  14. Papa dan Mama Ardi, untuk doa dan dukungannya.

  15. Ci Mon dan Ci Nike yang telah menjadi ciciku yang baik selama ini.

  16. Tekla Rosa Oktivia teman seperjuanganku dalam suka dan duka, akhirnya kita selesai juga.

  17. Teman-teman FST 2004, kelas C, dan kelompok praktikum E, atas suka dan duka yang kita alami selama kuliah dan praktikum.

  19. Mba Nur yang telah banyak membantu di laboratorium Kedokteran Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran UGM.

  20. dr. Resati dan dr. Herwinda, atas bantuan dalam menyelesaikan kerja dilaboratorium. Tak lupa dr. Devi, dr. Yuyun, dr. Arum, dr. Layli, dan dr.

  Febri atas kebersamaan kita selama dilaboratorium.

  21. Para Laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah membantu penulis dalam penyelesaian skripsi.

  22. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

  Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan karena keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Oleh karena itu, dengan rendah hati penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun sehingga berguna bagi penelitian selanjutnya. Demikian, semoga skripsi ini berguna bagi pembaca sekalian. Tuhan memberkati. Amin.

  Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimananya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 17 Juli 2008 Penulis

  Cendani

  

INTISARI

  Penggunaan obat sebagai terapi pengobatan tidak jarang menimbulkan efek samping. Fotosensitivitas merupakan salah satu efek samping ciprofloxacin dan furosemide. Ciprofloxacin merupakan antibiotik berspektrum luas dan Furosemide merupakan diuretik yang kuat. Keduanya memiliki kesamaan efek samping yakni kemampuan mentransfer elektron sehingga dapat menjadi fotosensitiser. Namun, energi yang menyebabkan reaksi fotosensitasi masih belum pasti diketahui. Oleh sebab itu, dilakukan prediksi kemungkinan fotosensitasi dengan menggunakan komputasi pemodelan molekul sedangkan pembuktiannya dengan menggunakan metode fotohemolisis.

  Berdasarkan hasil prediksi pemodelan molekul, diperoleh bahwa induksi UV A tidak dapat menyebabkan reaksi fotosensitasi ciprofloxacin dan furosemide. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian fotohemolisis. Lebih lanjut, fenomena ini dibuktikan dengan tidak terdapatnya perbedaan yang signifikan ketika Alpha Lipoic Acid (ALA) ditambahkan sebagai antioksidan (p 0,05).

  Kata kunci: Alpha Lipoic Acid (ALA), fotohemolisis, ciprofloxacin, furosemide, UVA, fotosensitiser

  

ABSTRACT

The usage of drugs as medication therapy not rarely generate side effects.

  Photosensitivity is one of the site effects of Ciprofloxacin and Furosemide. Both, Ciprofloxacin, a broad spectrum, and Furosemide, a potent diuretic has similar side effect. Due to their ability in transfering electron, which is manifested as photosensitizer. However, the energy required to cause photosensitizing still uncertain Therefore, in this study the prediction of photosensitization possibilities were done by computational molecule modeling’s. While their confirmation were carried out by photohaemolysis.

  The molecule modeling predicted that the energy of UV A could not induced photosensitization of Ciprofloxacin and Furosemide which in line with photohaemolysis result. Further, this phenomena was confirmed by no significant differences when Alpha Lipoic Acid (ALA) was added antioxidant.

  

Keyword: Alpha Lipoic Acid (ALA), photohaemolysis, ciprofloxacin, furosemide,

  UVA, photosensitizer

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL............................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................iv HALAMAN PERSEMBAHAN ...............................................................................v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS................................................................vi PRAKATA............................................................................................................ vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...................................................................x

  INTISARI ................................................................................................................xi

  ABSTRACT ............................................................................................................ xii

  DAFTAR ISI........................................................................................................ xiii DAFTAR TABEL............................................................................................... xvii DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xviii DAFTAR LAMPIRAN ..........................................................................................xx

  a. Tujuan Umum............................................................................................. 5

  b. Tujuan Khusus............................................................................................ 5 B.MANFAAT ................................................................................................... 5

  1. Manfaat Teoritis ...................................................................................... 5

  2. Manfaat Praktis ....................................................................................... 6

  BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA..................................................................... 7 A. Alpha Lipoic Acid (ALA) ............................................................................ 7 B. Fotosensitivitas............................................................................................ 8 C. Fotosensitiser............................................................................................. 10 D. Sinar Ultraviolet ........................................................................................ 11 E. Furosemide................................................................................................ 12 F. Ciprofloxacin............................................................................................. 13 G. Landasan Teori.......................................................................................... 14 H. Hipotesis .................................................................................................... 14 I. Rancangan Penelitian................................................................................ 15 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................. 16 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 16

  2. Bahan Penelitian.................................................................................... 17

  D. Tatacara Penelitian..................................................................................... 18

  1. Pretreatment .......................................................................................... 18

  2. Pembuatan Pelet Eritrosit ...................................................................... 20

  3. Treatment .............................................................................................. 20

  4. Pengukuran Hemolisis ........................................................................... 21

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 23 A. Penentuan dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) ............................................... 23 B. Pemodelan Komputasi Ciprofloxacin dan Furosemide .............................. 23

  1. Pemodelan Komputasi HOMO dan LUMO Ciprofloxacin dan Furosemide ..................................................................................... 24

  2. Pemodelan Komputasi Spektrum Ciprofloxacin dan Furosemide ..................................................................................... 25

  2 C. Pengaruh Radiasi UV A 18 J/cm terhadap Fotosensitivitas

  Ciprofloxacin 0,08 mg/ml dan Furosemide 0,008 mg/ml .......................... 29

  1. Hasil Pengukuran Ciprofloxacin UV dan Non UV ............................... 31

  2. Hasil Pengukuran Furosemide UV dan Non UV .................................. 32

  Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Ciprofloxacin dengan diadiasi UV A 18 J/cm

  

2

  ............................................................ 34

  2. Pengukuran Hemolisis Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Furosemide dengan diadiasi UV A 18 J/cm

  

2

  ............................................................ 37

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 42 A. KESIMPULAN ......................................................................................... 42 B. SARAN ..................................................................................................... 42 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 43 LAMPIRAN .......................................................................................................... 47 BIOGRAFI PENULIS........................................................................................... 76

  

DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Energi HOMO, LUMO, ?Energi Ciprofloxacin ..................................... 24 Tabel II. Energi HOMO, LUMO, ?Energi Furosemide ....................................... 24 Tabel III. Panjang Gelombang Ciprofloxacin Hasil Komputasi........................... 25 Tabel IV. Panjang Gelombang Furosemide Hasil Komputasi.............................. 27 Tabel V. Absorbansi Ciprofloxacin dan Furosemide antara UV dan Non UV..... 30 Tabel VI. Mean dan Standar Deviasi (SD) Ciprofloxacin .................................... 31 Tabel VII. Mean dan Standar Deviasi (SD) Furosemide ...................................... 32 Tabel VIII. Absorbansi Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Ciprofloxacin ......................................................................... 34 Tabel IX. Mean dan Standar Deviasi (SD) Variasi Dosis

   Alpha Lipoic Acid (ALA dengan Ciprofloxacin ................................... 35

  Tabel X. Absorbansi Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Furosemide ................................................................................ 37 Tabel XI. Mean dan Standar Deviasi (SD) Variasi Dosis

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Struktur Alpha Lipoic Acid (ALA) ........................................................ 7 Gambar 2. Bagan Mekanisme Fotosensitisasi......................................................... 9 Gambar 3.Mekanisme Fotosensitiser .................................................................... 10 Gambar 4. Spektrum Ultraviolet ........................................................................... 12 Gambar 5. Struktur Furosemide ............................................................................ 12 Gambar 6. Struktur Ciprofloxacin......................................................................... 13 Gambar 7. Peta Microplate ................................................................................... 22 Gambar 8. Gambar Spektrum Ciprofloxacin dengan metode

  MNDO, AM1, dan PM3...................................................................... 26 Gambar 9. Gambar Spektrum Furosemide dengan metode

  MNDO, AM1, dan PM3...................................................................... 28 Gambar 10. Diagram Absorbansi Ciprofloxacin................................................... 31 Gambar 11. Diagram Absorbansi Furosemide ...................................................... 32 Gambar 12. Diagram Absorbansi Variasi Dosis

  Gambar 16. Laminar Air Flow (LAF)................................................................... 74 Gambar 17. Microplate Reader (Anthos Reader 2001) ........................................ 75 Gambar 18. Lampu LIPI UV A............................................................................. 75

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Keseragaman Bobot dan Perhitungan Berat Serbuk

  Mecola Forte® yang ditimbang ....................................................... 47 Lampiran2. SPSS Ciprofloxacin yang diradiasi UV A dan tanpa UV A.............. 48 Lampiran 3. SPSS Furosemide yang diradiasi UV A dan tanpa UV A................ 51 Lampiran 4. SPSS Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Ciprofloxacin ....................................................................... 53 Lampiran 5. SPSS Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan Furosemide .......................................................................... 58 Lampiran 6. Gambar Spektrum Furosemide ......................................................... 64 Lampiran 7. Gambar Spektrum Ciprofloxacin...................................................... 65 Lampiran 8. Cara Komputasi dengan Hyperchem ................................................ 67 Lampiran 9. Foto-Foto .......................................................................................... 74

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penggunaan obat sebagai terapi pengobatan tidak jarang menimbulkan efek samping. Ada beberapa efek samping yang ringan, seperti sakit kepala yang ringan. Ada beberapa efek samping yang bertahan hanya beberapa hari atau minggu,

  sementara yang lain dapat bertahan selama obat yang mengakibatkannya masih dipakai, atau bahkan setelah dihentikan. Ada efek samping yang muncul beberapa hari atau minggu setelah kita mulai penggunaan obat penyebab, ada yang baru menimbulkan masalah setelah obat dipakai berbulan-bulan bahkan bertahun-tahun.

  Fotosensitivitas merupakan salah satu efek samping obat yang responnya tampak pada kulit. Fotosensitivitas dikategorikan dalam 2 bentuk, yaitu fototoksisitas dan fotoalergi. Namun insidensi reaksi fototoksisitas lebih besar dibandingkan dengan reaksi fotoalergi (Buck, 1998; Dubakiene dan Kupriene, 2006; Lugovic, Šitum, Ožanic-Bulic, Sjerobabski-Masnec, 2007). Reaksi fototoksisitas terjadi apabila obat mengabsorbsi UV A dan mengakibatkan kerusakan seluler (Moore, Grossweiner, 1999). Spesies oksigen reaktif dapat dihasilkan baik pada proses normal metabolisme sel maupun kondisi-kondisi prooksidan lainnya seperti akibat paparan sinar ultraviolet (Bogdanoviq, 1997; Lee, 2001). Pada eritrosit, kerusakan oksidatif membran akan berpengaruh pada kerapuhan membran yang akan berakibat timbulnya hemolisis (May, dan Davis, 1998). Banyak peneliti menggunakan eritrosit sebagai model fotoksidasi membran sel (Konig, 1997; Grossweiner, 1999).

  Fotohemolisis dapat terjadi jika terdapat sinar ultraviolet dan atau fotosensitiser. Fotosensitiser adalah reaktivitas suatu senyawa sensitiser terhadap substrat biologis akibat sinar buatan atau sinar matahari yang mengandung sinar ultraviolet. Apabila substrat biologis tersebut berupa membran sel darah merah hingga menyebabkan lisis, maka proses tersebut dinamakan fotohemolisis. Berdasarkan asalnya, fotosensitiser dibedakan menjadi dua, yakni fotosensitiser endogen dan eksogen. Fotosensitiser endogen adalah fotosensitiser yang berasal dari dalam tubuh misalnya flavin dan porfirin, sedangkan fotosensitiser eksogen adalah fotosensitiser yang berasal dari luar tubuh misalnya kosmetik dan obat-obatan.

  Ciprofloxacin dan furosemide merupakan obat yang tergolong fotosensitiser (Dubakiene et al, 2006). Kedua obat ini diinduksi oleh radiasi UVA (Vassileva et al., fotosensitiser dan antibiotik golongan quinolon berspektrum pengobatan luas. Antibiotik quinolon mengandung substituen flourin yang umum disebut sebagai flouroquinolon. Insiden fotosensitasi pada ciprofloxacin dilaporkan antara 1-4% (Stalhmann, 1990).

  Furosemide dilaporkan menimbulkan efek samping berupa fotosensitivitas, fotohemolisis yang tergantung pada oksigen, dan fotoperoksidasi lipid (Broch, Esteve-Romero, Ruiz-Angel, Garcia-Alvarez-Coque, 2002).

  Dalam kehidupan, spesies oksigen reaktif dapat didegradasi oleh antioksidan dan enzim-enzim tertentu yang berkaitan (Bogdanoviq, 1997; Koniq, 2002).

  Alpha Lipoic Acid (ALA) merupakan antioksidan universal yang larut dalam

  air maupun lemak, disintesis dalam mitokondria sel dan berikatan secara kovalen dengan proton melalui lisin, Alpha Lipoic Acid (ALA) mempunya i aktifitas antioksidan direct (secara langsung dengan memakan radikal bebas) dan indirect (mendaur ulang antioksidan lain, seperti vitamin C, vitamin E dan glutation) sehingga antioksidan lain dapat bertahan lebih lama dalam tubuh (Morikawa, 2001; Biewenga, 1997; Naguib, 2004). akibat fotosensitizer ciprofloxacin dan furosemide yang diinduksi ultraviolet A dimana penelitian ini belum banyak dilakukan.

  1. Permasalahan

  a. Apakah Ciproflo xacin (antibiotik) dapat berfungsi sebagai fotosensitiser dengan induksi sinar ultraviolet A? b. Apakah Furosemide (diuretik) dapat berfungsi sebagai fotosensitiser dengan induksi sinar ultraviolet A? c. Apakah variasi dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dapat mencegah fotohemolisis akibat fotosensitizer Ciprofloxacin (antibiotik) dan Furosemide (diuretik) yang diinduksi sinar ultraviolet A?

  2. Keaslian Penelitian

  Sejauh yang diketahui penulis sudah ada penelitian yang serupa mengenai perbandingan potensi Asam Alfa Lipoat dan Glutation berdosis sama kajian pada fotooksidasi membran eritrosit oleh Panonsih et al. Namun, penelitian mengenai prediksi dan pembuktian kemungkinan fotosensitisasi Ciprofloxacin dan Furosemide

3. Tujuan

  a. Tujuan umum Untuk mengetahui apakah Alpha Lipoic Acid (ALA) dapat digunakan untuk mencegah fotohemolisis b. Tujuan khusus

  1. Untuk mengetahui apakah Ciprofloxacin (antibiotik) dapat berfungsi sebagai fotosensitiser dengan induksi sinar ultraviolet A.

  2. Untuk mengetahui apakah Furosemide (diuretik) dapat berfungsi sebagai fotosensitiser dengan induksi sinar ultraviolet A.

  3. Untuk mengetahui apakah Alpha Lipoic Acid (ALA) dapat digunakan untuk mencegah fotohemolisis akibat fotosensitizer Ciprofloxacin (antibiotik) dan Furosemide (diuretik) yang diinduksi sinar ultraviolet A.

B. Manfaat

  Penelitian mengenai prediksi dan pembuktian kemungkinan fotosensitisasi Ciprofloxacin dan Furosemide dengan paparan radiasi UV A dan pencegahannya dengan antioksidan Alpha Lipoic Acid (ALA) diharapkan memiliki beberapa manfaat

  2. Manfaat praktis Manfaat praktis dari penelitian ini adalah dapat diketahui kemungkinan mekanisme fotosensitiser dan penggunaan antioksidan sebagai pencegahannya.

BAB II PENELAHAAN PUSTAKA A. Alpha Lipoic Acid (ALA) O OH S S C

  8 H

  14 O

  2 S

  2 BM 206,32

Gambar 1. Struktur Alpha Lipoic Acid (ALA)

Asam 5-[(3R)-ditiolan-3-il]pentanoat (Anonim, 2008b)

  Alpha Lipoic Acid (ALA) disebut juga thiotic acid. Didalam tubuh Alpha

Lipoic Acid (ALA) mempunyai 2 fungsi yaitu fungsi metabolik dan antioksidan.

  ALA bekerja didalam sel dan membran. Yang paling penting, Lipoic Acid dan metabolitnya berpotensi sebagai antioksidan, yang dapat menghancurkan hampir semua radikal bebas seperti superoksida, hidroperoksida, dan hidroksil (Anonim, 2008c).

  Alpha Lipoic Acid (ALA) merupakan antioksidan universal yang larut dalam sehingga lebih bertahan lama didalam tubuh (Morikawa, 2001; Biewenga, 1997 Naguib, 2004).

B. Fotosensitivitas

  Fotosensitivitas merupakan efek farmakologi yang tidak diinginkan pada kulit yang terjadi ketika seseorang menggunakan senyawa kimia atau obat digunakan secara topikal maupun sistemik, atau keduanya, dan terpapar sinar UV atau tampak, baik secara alami maupun disengaja (Dubakiene et al., 2006; Vassileva et al., 1998).

  Fotosensitivitas dapat dikategorikan menjadi 2 bentuk, yaitu fototoksisitas dan fotoalergi. Namun reaksi fototoksisitas lebih besar dibandingkan dengan reaksi fotoalergi (Buck, 1998; Dubakiene et al., 2006; Lugovic et al., 2007).

  Fototoksisitas dapat terjadi setelah penggunaan obat untuk pertama kali dan tidak berhubungan dengan mediator imunologi. Umumnya, reaksi fototoksisitas muncul pada penggunaan obat secara sistemik. Respon fototoksisitas berupa eritema, edema, dan hiperpigmentasi (Buck, 1998; Dubakiene et al., 2006). Faktor yang mempengaruhi insidensi dan intensitas reaksi fototoksik adalah: 1. konsentrasi, absorpsi, dan farmakokinetika obat; Pada tingkat molekular, umumnya reaksi fototoksisitas menyebabkan kerusakan nukleus, sitoplasma, dan komponen membran sel (Vassileva et al., 1998; Spielmann et al., 1994).

  Salah satu metode invitro untuk melihat reaksi fotosensitivitas adalah fotohemolisis. Fotohemolisis merupakan metode yang digunakan untuk melihat kerusakan membran akibat adanya fotosensitiser (Vassileva et al., 1998; Spielmann et al. , 1994).

  Fotohemolisis adalah suatu istilah yang menggambarkan kerusakan sel darah merah yang diinduksi oleh cahaya dan dimonitor dengan mengukur pelepasan hemoglobin ke dalam medium (de Paolis et al., 1984). Fotohemolisis dapat mendeteksi kerusakan dari fungsi dan integritas selaput sel (Nam et al., 2004).

  2+

  Pada keadaan normal (terjadi fotohemolisis) Fe dari heme akan dioksidasi

  3+

• 3+

  oleh K

3 Fe(CN) 6 menjadi Fe . Selanjutnya Fe akan bereaksi dengan CN dari KCN dan memberikan warna merah (Kim and Stroupe, 1999).

C. Fotosensitiser

  Pada diagram diatas menjelaskan bahwa senyawa yang berada pada groud

  state

  (S ) ketika diinduksi oleh sinar ultraviolet (h?) akan tereksitasi menjadi singlet

  state (S 1 ). Kemudian melalui ISC (Intersystem Crossing) terjadi transfer energi dari singlet state (S 1 ) ke triplet state (T 1 ). Kemudian pada triplet state (T 1 ), senyawa

  1

  berikatan dengan oksigen singlet ( O 2 ) dan terbentuk sensitizer (Baier, 2007).

D. Sinar Ultraviolet

  Sinar matahari memberi efek yang sangat besar terhadap kulit tanpa disadari diantaranya menyebabkan penuaan dini, kanker kulit, dan perubahan sebagian besar kulit. Sembilan puluh persen UV A atau UV B dari sinar matahari menyebabkan penuaan dini pada kulit (Anonim, 2007).

  Sinar matahari memancarkan sinar ultraviolet yang dapat dibagi menjadi 3 jenis berdasarkan panjang gelombangnya yaitu: UVC pada panjang gelombang 100 sampai 290 nm. • UVB pada panjang gelombang 290 sampai 320 nm menyebabkan sunburn. • UVA pada panjang gelombang 320 sampai 400 nm biasa disebut black light. •

  (Anonim, 2007) Sinar UV A menyebabkan kerusakan pada sel target dengan adanya fotosensitiser dan

  reactive oxygen species (ROS) (Peak et al., 1993; de Gruijil, 2000).

  

Gambar 4. Spektrum Ultraviolet (Ting et al., 2003)

E. Furosemide

  COOH H CHN O ₂ O Furosemide dilaporkan menimbulkan efek samping berupa fotosensitivitas, fotohemolisis yang tergantung pada oksigen, dan fotoperoksidasi lipid (Broch et al., 2002). Furosemide memiliki serapan maksimal pada panjang gelombang 330 nm. Furosemide memiliki potensi yang tinggi untuk terdegradasi oleh cahaya (Rubino, 2005). Furosemide menyebabkan reaksi fototoksisitas tetapi tidak menyebabkan fotoalergi.

F. Ciprofloxacin

  C

  17 H

  18 FN

  3 O

  3 BM 331,346

Gambar 6. Struktur Ciprofloxacin

Asam 1-siklopropil-6-fluoro-4 -oxo-7-piperazin-1-ilkuinolin-3- karboksilat (Anonim, 2008a) Ciprofloxacin menunjukkan reaksi fotosensitivitas. Reaksi fotosensitivitas yang ditimbulkan oleh ciprofloxacin tergolong dalam kategori ringan (Ting, Jun- Ling, Xiao-Chao, Jian, Zeng-Hong, 2003).

G. Landasan Teori

  Fotosensitivitas dapat dikategorikan dalam 2 bentuk, yaitu fototoksisitas dan fotoalergi. Namun reaksi fototoksisitas lebih besar dibandingkan dengan reaksi fotoalergi (Buck, 1998; Dubakiene et al., 2006; Lugovic et al., 2007). Ciprofloxacin menunjukkan reaksi fotosensitivitas demikian pula dengan furosemide. Meskipun demikian mekanismenya belum jelas. Oleh karena itu dilakukan prediksi secara komputasi untuk mengetahui jenis sinar UV yang dapat memulai terjadinya reaksi fotosensitasi.

  Alpha Lipoic Acid (ALA) merupakan suatu antioksidan sehingga dapat menghambat fotohemolisis.

H. Hipotesis

  1. Struktur Ciprofloxacin memungkinkan berfungsi sebagai fotosensitiser apabila

I. Rancangan Penelitian

  1. Prediksi energi yang diperlukan agar Ciprofloxacin berfungsi sebagai fotosensitiser dengan komputasi pemodelan molekul.

  2. Prediksi energi yang diperlukan agar Furosemide berfungsi sebagai fotosensitiser dengan komputasi pemodelan molekul.

  3. Pengaruh Alpha Lipoic Acid (ALA) terhadap fotohemolisis akibat fotosensitiser Ciprofloxacin.

  4. Pengaruh Alpha Lipoic Acid (ALA) terhadap fotohemolisis akibat fotosensitiser Furosemide.

  5. Analisis hasil dengan uji signifikansi berbagai perlakuan dengan SPSS 13.0

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. JENIS DAN RANCANGAN PENELITIAN Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni acak pola satu arah. B. VARIABEL DAN DEFINISI OPERASIONAL

  1. Variabel a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis Alpha Lipoic Acid (ALA).

  b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah absorbansi

  c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya, suhu, %CO

  2

  2 d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah O .

  2. Definisi Operasional

  a. Fotosensitivitas merupakan efek farmakologi yang tidak diinginkan yang timbul akibat penggunaan ciprofloxacin dan furosemide sebagai fotosensitiser yang diradiasi UVA dan muncul sebagai reaksi fototoksisitas dan ditunjukkan mengalami fotohemolisis jika absorbansi yang ditunjukkan kelompok tersebut secara signifikan lebih besar daripada absorbansi kelompok kontrol.

  d. Absorbansi adalah serapan yang ditunjukkan lewat pembacaan pada mikroplate reader dan menunjukkan nilai serapan antara 0,100-2,500.

C. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN 1.

   Alat

  Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini, antara lain: Inkubator merk RS Biotek; tabung eppendorf 1,5 ml steril dan rak; Hettich

  Zentrifugen Universal 32R; Laminar Air Flow (LAF) model AUC4A1 nomor serial 2003-5108; micropipet merk BioH-T Proline; blue tip; yellow tip; tabung venoject 3 ml yang mengandung EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) merk BD Franklin Lakes NJ USA; jarum suntik 3 ml merk Terumo; plate 96-well merk Corning; lampu UV (PUVA) merk Slit Kim LIPI; autoklaf; milipore; Reader UV 2001.

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini, antara lain:

D. TATA CARA PENELITIAN

1. Pre -treatment

  a. Pembuatan TCM Buffer II (Konsentrasi 2X) stok 200 ml 1. 200 ml aquadest 2. 1,2 g Tris 3. 0,12 g KCl

  2

  2

  4. 0,6 g CaCl .2H O 5. 0,08 g MgCl

  2 .6H

2 O Kemudian disterilkan dengan autoklaf.

  b. Pembuatan Stok ALA konsentrasi 0,36 mg/ml Timbang 0,0125 g serbuk tablet Mecola Forte®. Larutkan dengan aquadest hingga 25ml. Setelah larut, saring dengan menggunakan milipore.

  c. Pembuatan sediaan ALA yang mengandung TCM Buffer II & 0,03% Albumin masing-masing stok 10 ml

  1. Ambil 0,0125 g serbuk Mecola Forte® dan dilarutkan ke dalam Aquades hingga

  2. Ambil 3 tabung steril 20 mL : v Ambil 10000 µL TCM Buffer II ditambah 24 µL Albumin 25% ditambah 5000 µL larutan A ditambah 4976 µL aquades steril (ALA 0,09 mg/ml = dosis 1) v Ambil 10000 µL TCM Buffer II ditambah 24 µL Albumin 25% ditambah 6660 µL larutan A ditambah 3316 µL aquades steril l (ALA 0,12 mg/ml = dosis 2) v Ambil 10000 µL TCM Buffer II ditambah 24 µL Albumin 25% ditambah 8340 µL larutan A ditambah 1636 µL aquades steril (ALA 0,15 mg/ml = dosis 3) d. Pembuatan sediaan Ciprofloxacin 0,08 mg/ml yang mengandung TCM Buffer II &

  0,03% Albumin stok 50 ml Ambil 10000 µL TCM Buffer II ditambah 24 µL Albumin 25% ditambah 800 µL Ciprofloxacin 2 mg/ml ditambah 9176 µL aquades steril e. Pembuatan sediaan Furosemide 0,008 mg/ml yang mengandung TCM Buffer II & f. Pembuatan larutan TCM Buffer II dan Albumin 0,03% 15.000 µL TCM Buffer II + 36 µL Albumin 25% + 14964 µL aquadest steril.

  2. Pembuatan Pelet Eritrosit

  Darah diambil dari 3 relawan masing-masing 3 ml. Kemudian tempatkan dalam venoject yang mengandung EDTA. Sentrifugasi venoject dengan kecepatan 2100 rpm selama 10 menit. Buang supernatan dengan perlahan dengan bantuan pipet. Kemudian cuci eritrosit dengan menambahkan PBS steril sebanyak 2 ml. Kocok

  

venoject dengan penggoyangan ringan. Kemudian sentrifugasi 4200 rpm selama 5

  menit. Kemudian buang supernatan. Lakukan cara yang sama sampai 3 kali. Semua tahap ini dilakukan pada Laminar Air Flow (LAF).

  3. Treatment HARI I

  Pipet 396 µL TCM Buffer yang mengandung 0,03% albumin dengan berbagai konsentrasi ALA dan masukkan ke dalam eppendorf steril. Tambahkan 4 µL pelet eritrosit ke dalam eppendorf steril, kocok dengan penggoyangan ringan.

  HARI II Sentrifugasi ependorf dengan kecepatan 2100 rpm selama 10 menit.

  Kemudian buang supernatan dengan mikropipet secara perlahan. Tambahkan PBS steril sebanyak 80 µL. Kemudian sentrifugasi eppendorf dengan kecepatan 4200 rpm selama 5 menit. Kemudian buang supernatan dengan mikropipet secara perlahan. Tambahkan 200 µL fotosensitiser (Ciprofloxacin 0,08 mg/ml atau Furosemide 0,008 mg/ml) ke dalam tabung eppendorf. Inkubasi selama 1 jam dengan kondisi inkubator 5% CO 2 pada suhu 37°C.

  Pindahkan suspensi ke dalam microplate steril sesuai peta well. Radiasi

  

2

  2

  dengan UVA dengan energi 18.000 mJ/cm (18 J/cm ). Pindahkan suspensi ke dalam tabung eppendorf kemudian inkubasi selama 24 jam dengan kondisi inkubator 5%

  2 CO pada suhu 37°C. Semua tahap ini dilakukan pada Laminar Air Flow (LAF).

  4. Pengukuran hemolisis Sentrifugasi eppendorf dengan kecepatan 2600 rpm selama 10 menit.

  Kemudian ambil 20 µL supernatan, masukkan ke mikroplate (sesuai peta awal). Tambahkan 180 µL larutan Drabkin dan dikocok dengan penggoya ngan ringan. Baca

  A1F A2F A3F A1C A2C A3C F C

  

Gambar 7. Peta mikroplate

Keterangan: A1F : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,09 mg/ml (dosis 1) dan Furosemide A2F : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,12 mg/ml (dosis 2) dan Furosemide A3F : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,15 mg/ml (dosis 3) dan Furosemide A1C : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,09 mg/ml (dosis 1) dan Ciprofloxacin A2C : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,12 mg/ml (dosis 2) dan Ciprofloxacin A3C : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,15 mg/ml (dosis 3) dan Ciprofloxacin F : Furosemide C : Ciprofloxacin

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Penentuan dosis Alpha Lipoic Acid (ALA), Ciprofloxacin, Furosemide Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) pada penelitian ini diacu dari penelitian Panonsih et al. mengenai perbandingan potensi antioksidan antara asam alpha lipoat

  dan glutation berdosis sama kajian pada fotooksidasi membran eritrosit. Dosis yang digunakan adalah 0,09 mg/ml (setara 450 mg per hari) dan 0,15 mg/ml (setara 750 mg per hari).

  Sedangkan dosis ciprofloxacin dan furosemide yang digunakan adalah penggunaan 1 kali terapi pengobatan, yaitu 0,08 mg/ml (400 mg) dan 0,008 mg/ml (40 mg). Dosis kedua obat tersebut dikonversikan ke dalam satuan mg/ml dengan membagi dosis obat tersebut dengan volume darah, yaitu 5 L.

B. Pemodelan Komputasi Ciprofloxacin dan Furosemide

  Tujuan dari pemodelan dengan komputasi ini adalah untuk mengetahui berapakah energi yang dibutuhkan ciprofloxacin dan furosemide untuk menjadi

1. Pemodelan Komputasi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital ) dan LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital) Ciprofloxacin dan Furosemide

  Untuk mengetahui energi yang dibutuhkan ciprofloxacin dan furosemide agar terbentuk radikal sehingga dapat menjadi fotosensitiser, maka dengan program

  

Hyperchem penulis mencari energi HOMO, LUMO, dan ?energi ciprofloxacin dan

  furosemide. Tabel I dan II dibawah ini menunjukkan hasil komputasi energi HOMO, LUMO, dan ?energi ciprofloxacin dan furosemide:

  

Tabel I. Energi HOMO, LUMO, ?Energi Ciprofloxacin

Metode LUMO (eV) HOMO (eV) ? Energi (eV)

  AM1 - 0,8454623 -9,152633 8,3071707 PM3 - 0,9318895 - 9,036491 8,1046015

  MNDO - 0,9374977 - 9,120571 8,1830733

  

Tabel II. Energi HOMO, LUMO, ?Energi Furosemide

Metode semi empirical LUMO (eV) HOMO (eV) ?Energi (eV)

  AM1 - 0,8592892 - 9,369098 8,5098088 PM3 - 1,04166 - 9,284696 8,243036

  MNDO - 1,521695 - 9,693231 8,171536 Dari hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ?Energi Furosemide lebih besar daripada ?Energi Ciprofloxacin. Hal ini menunjukkan bahwa furosemide

2. Pemodelan Komputasi Spektrum Ciprofloxacin dan Furosemide

  Tujuan dari pemodelan ini adalah untuk mengetahui apakah ciprofloxacin dan furosemide memberikan serapan pada range UV A. Sebelum menentukan spektrum ciprofloxacin dan furosemide, dilakukan optimasi geometri dengan menggunakan 3 metode yaitu MNDO, AM1, dan PM3. kemudian dilakukan penentuan spekrum serapan ciprofloxacin dan furosemide dengan metode semi-

  empirical ZINDO/s.

  

Tabel III. Panjang Gelombang Ciprofloxacin Hasil Komputasi

Panjang Gelombang Metode semi-empirical UV C UV B

  MNDO 208,47 302,04 AM1 214,32 296 PM3 229,553 292,04

  Pada tabel III dapat dilihat hasil spektrum yang diperoleh menunjukkan bahwa ciprofloxacin berada pada range panjang gelombang UV B (290-320 nm) dan UV C (100-290 nm).

  Dibawah ini merupakan spektrum UV C yang diperoleh dari hasil komputasi pada ciprofloxacin sedangkan pada UV B dapat dilihat pada lampiran 7 dibawah ini:

  

Gambar 8. Gambar spektrum Ciprofloxacin dengan metode MNDO, AM1, PM3 (berurutan)

Tabel IV. Panjang Gelombang Furosemide Hasil Komputasi

Metode semi-empirical Panjang Gelombang

  MNDO 247,37 AM1 245,29

  PM3 268,31 Pada tabel IV dapat dilihat hasil spektrum yang diperoleh menunjukkan bahwa furosemide berada pada range panjang gelombang UV C (100-290 nm). Hasil spektrum dapat dilihat pada gambar 9 dibawah ini:

  

Gambar 9. Gambar spektrum Furosemide dengan metode PM3, AM1, MNDO (berurutan)

₂ C. Pengaruh Radiasi UV A 18 J/cm terhadap Fotosensitivitas Ciprofloxacin

0,08 mg/ml dan Furosemide 0,008 mg/ml

  Pada penelitian ini peneliti membagi menjadi 2 kelompok yaitu yang diradiasi UVA dan tanpa diradiasi UV A (Non UV). Kelompok Perlakuan tanpa radiasi UV A digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui apakah pada kelompok

  2 perlakuan yang diradiasi UV A 18 J/cm dapat menimbulkan reaksi fotosensitivitas.

  

Tabel V. Absorbansi Ciprofloxacin dan Furosemide antara UV dan Non UV

  F NUV F UV C NUV C UV 0.133 0.18 0.131

  0.14 0.091 0.162 0.164 0.144 0.135 0.144 0.102 0.146 0.092 0.125 0.217 0.158 0.148 0.133 0.146 0.147 0.129 0.147 0.127 0.138 0.126 0.155 0.125

  0.12 0.146 0.139 0.12 0.153 0.133 0.136 0.131 0.142 0.126 0.129 0.132 0.136 0.138 0.131 0.145 0.149 0.117 0.153 0.118 0.155 0.125 0.14 0.123 0.126 0.142 0.133 0.144 0.131 0.142 0.129 0.132 0.134 0.138 0.118 0.131 0.136 0.132 0.133 0.137 0.148 0.135 0.135 0.144 0.132

  Keterangan: F NUV : Furosemide tidak diradiasi UV A F UV : Furosemide diradiasi UV A C NUV : Ciprofloxacin tidak diradiasi UV A C UV : Ciprofloxacin diradiasi UV A

1. Hasil Pengukuran hemolisis Ciprofloxacin UV dan Non UV

  

Tabel VI. Mean dan Standar Deviasi (SD) Ciprofloxacin

  Kelompok Perlakuan Ciprofloxacin

  Mean Standar Deviasi Non UV 0,137 0,024

  UV 0,141 0,010

  

Gambar 10. Diagram Absorbansi Ciprofloxacin

  Berdasarkan hasil tes normalitas dengan program SPSS 13.0, data kelompok ^{UV non_UV 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000}

  Mean_Absorbansi

Kelompok Perlakuan Ciprofloxacin bermakna secara signifikan antara kelompok ciprofloxacin tanpa radiasi UVA dengan kelompok ciprofloxacin yang diradiasi UVA yaitu dengan p 0,074 (p>0,05).

2. Hasil Pengukuran hemolisis Furosemide UV dan Non UV

  

Tabel VII. Mean dan Standar Deviasi (SD) Furosemide

  Kelompok Perlakuan Furosemide

  Mean Standar Deviasi Non UV 0,129 0,016

  UV 0,140 0,014

  UV Non_UV ^{0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 Mean_Absorbansi}

_{Kelompok Perlakuan Furosemide} tidak berpasangan. Dari uji tersebut diperoleh nilai p 0,160 (p>0,05). Dengan demikian dapat dikatakan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara absorbansi kelompok furosemide 0,008 mg/ml yang tidak diradiasi UVA dengan kelompok furosemide 0,008 mg/ml yang diradiasi UVA.

  Berdasarkan hasil yang telah dipaparkan di atas, tidak terjadi fotohemolisis pada kelompok ciprofloxacin 0,008 mg/ml dan furosemide 0,008 mg/ml yang diradiasi UVA. Ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan tidak terjadinya fotohemolisis pada kelompok tersebut.

  Pada penelitian ini tidak didapat perbedaan bermakna mungkin disebabkan oleh dosis fotosensitiser yang kurang besar sehingga tidak cukup membentuk radikal sehingga ketika berikatan dengan oksigen singlet belum mampu merusak lapisan lipid pada membran sehingga fotohemolisis tidak terjadi.

D. Pengaruh variasi dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) terhadap Fotosensitivitas

  ₂ Ciprofloxacin dan Furosemide yang diradiasi UV A dengan energi 18 J/cm

  Pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek Alpha Lipoic Acid (ALA) dalam mencegah fotohemolisis yang disebabkan oleh fotosensitiser uji One Way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 0,05 yang didahului uji normalitas Shapiro-Wilk dan uji homogenitas.

  

1. Pengukuran hemolisis variasi dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dengan

Ciprofloxacin dengan diradiasi UV A 18 J/cm ² Tabel VIII. Absorbansi Variasi Dosis Alpha Lipoic Acid (ALA) dan Ciprofloxacin

  A1C A2C A3C C UV 0.126 0.158 0.128

  0.14 0.1 0.127 0.143 0.144

  0.125 0.148 0.138 0.146 0.139 0.133 0.136 0.158

  0.16 0.146 0.136 0.147 0.122 0.14 0.125 0.138 0.126 0.122 0.127

  0.12 0.144 0.134 0.134 0.153 0.144 0.11 0.118 0.142 0.132 0.129 0.132 0.136 0.122 0.144 0.117 0.149 0.163 0.135 0.206 0.155 0.134 0.149 0.115 0.126

  0.13 0.138 0.129 0.131 0.134 0.136 0.148 0.132

  Keterangan: A1C : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,09 mg/ml (dosis 1) dan Ciprofloxacin A2C : Alpha Lipoic Acid (ALA) 0,12 mg/ml (dosis 2) dan Ciprofloxacin

  Ciprofloxacin yang diradiasi UVA 0,141 0,010 ALA 0,09 mg/ml dengan Ciprofloxacin 0,133 0,016 ALA 0,12 mg/ml dengan Ciprofloxacin 0,137 0,012 ALA 0,15 mg/ml dengan Ciprofloxacin 0,135 0,022

  

Tabel IX. Mean dan Standar Deviasi (SD) Variasi Dosis ALA dan Ciprofloxacin dengan

Ciprofloxacin yang diradiasi UV A

Kelompok Perlakuan Mean Standar Deviasi