UJI KESESUAIAN SISTEM KEL 18 (ULFHA DENI & UTI)
NAMA : ULFHA DENI SWINCHE (1548201108) UTI KHAIRINI KELOMPOK : 18 (III C)
UJI KESESUAIAN SISTEM
Kualitas pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan melakukan serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi:
1. Efisiensi kolom
2. Resolusi atau daya pisah
3. Simetrisitas puncak
4. Faktor retensi atau kapasitas kolom Beberapa hal yang menyangkut analisis khususnya kromatografi antara lain validasi metode analisis dan uji kesesuaian system. Uji kesesuaian sistem ini memang harus dilakukan secara rutin karena mempunyai tujuan untuk menentukan bahwa apakah sistem analisis beroperasi secara benar atau tidak.
1. Efisiensi Kolom Salah satu karakteistik system kromatografi yang paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Bilangan lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya sebanding dengan semakin panjangnya kolom (L) dan semakin kecilnya nilai H. Istilah nilai H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP (High Eqivalent Theoritical Plate), yang mana merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoritis. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi, dan karenanya kolom yang baik mempunyai nilai H yang rendah. Semakin kecil ukuran partikel, maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis. Kondisi optimum diperoleh dengan melihat hubungan antara tinggi lempeng
2. Resolusi (daya pisah) Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih atau tidak tumpang tindih.
3. Faktor Asimetri Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran (tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetri. Kromatogram yang memberikan harga TF=1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF>1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Rohman, 2009). Ada dua cara yang digunakan untuk pengukuran derajat asimetri puncak, yakni factor ikutan dan factor asimetris. Faktor ikutan/tailing factor (Tf) seperti yang diterangkan dalam Farmakope Amerika Serikat (USP) Edisi Ketigapuluh dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya dituliskan sebagai berikut:
Tf =a+b
2a
Dengan nilai a dan b merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 5% seperti yang ditunjukkan pada gambar 5 Gambar . Pengukuran derajat asimetri puncak (sumber Dolan, 2003). s
Sementara itu, factor asimetri/asymmetry factor (A ) dihitung dengan rumus
berikut:A s a
=
B
Namun, nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah
lebar puncak pada ketinggian 10% seperti yang ditunjukkan di Gambar 5. Jika
nilai a sama dengan b, maka faktor ikutan dan asimetri bernilai 1. Kondisi ini
menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna (Dolan, 2003).4. Faktor retensi atau kapasitas kolom
Efesiensi kolom
Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konseplempeng teoritis pada distilasi. Jumlah lempeng (N) dihitung dengan: Yang mana: tR : waktu retensi solut σt : simpangan baku lebar puncak Wh/2 : lebar setengah tinggi puncak Wb : lebar dasar puncak
Gambar dibawah menjelaskan bagaimana cara menghitung tR; Wh/2; Wb; dan σ suatu puncak kromatogram.
Cara mengukur tR; Wh/2; Wb; dan σ suatu puncak kromatogram.
Kapasitas kolom
Faktor kapasitas kolom dirumuskan dengan: Yang mana: k’ = faktor kapasitas tM = waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali). Volume retensi yang bersesuaian juga dapat digunakan karena volume retensi berbanding lurus dengan waktu retensi. Volume retensi kadang-kadang terpilih dibanding waktu retensi karena tR bervariasi dengan kecepatan alir. Volume retensi selanjutnya dihitung dengan rumus:
V = (Vr-Vm)/Vm
Yang mana Vr= volume retensi solut; Vm = volume retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali).
Proses Pemisahan dalam Kolom Kromotografi Cair
Pemisahan dalam kromatografi cair disebabkan oleh distribusi kesetimbangan dari senyawa-senyawa yang berbeda antara partikel fase diam dan larutan fase gerak (Synder dan Kirkland, 1979). Contohnya, campuran dua komponen dimasukkan kedalam sistem kromatografi (partikel dan ) (Gambar 4a). Di mana komponen cenderung menetap di fase diam dan komponen lebih cenderung didalam fase gerak (Gambar 4b). Masuknya eluen (fase gerak) yang baru ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru: molekul sampel dalam fase gerak diadsorpsi sebagian oleh permukaan fase diam berdasarkan pada koefisien distribusinya, sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan mumcul kembali di fase gerak (Gambar 4c). Setelah proses ini terjadi berulang kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen yang lebih suka dengan fase gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen yang cenderung menetap di fase diam, sehingga komponen akan muncul terlebih dahulu dalam kromatogram, kemudian baru diikuti oleh komponen akan muncul terlebih dahulu dalam kromatogram, kemudian baru diikuti oleh komponen (Gambar 4c) (Meyer, 2004).
a. Validasi Metode
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Menurut Farmakope Amerika Serikat (USP/United State Pharmacopeia) Edisi Ketigapuluh, ada 8 karakteristik utama yang digunakan dalam validasi metode, yakni akurasi, presisi, spesivisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linearitas, rentang dan kekuatan.
b. Akurasi (Kecermatan)
Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya, kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spike placebo recovery) dan metode penambahan baku (standard addition method).
c. Presisi (Keseksamaan)
Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku relatif dari jumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistic (Rohman, 2007). Berdasarkan rekomendasi ICH (The
International Conference on the Harmonisation), karakteristik presisi dilakukan pada 3
tingkatan, yakni keterulangan (repeatability), presisi antara (intermediate precision), dan reprodusibilitas (reproducibility). Keterulangan dilakukan dengan cara menganalisis sampel yang sama oleh analisis yang sama menggunakan instrumen yang sama dalam periode waktu yang singkat. Presisi antara dikerjakan oleh analis yang berbeda.
Sedangkan reprodusibilitas dikerjakan oleh analis yang berbeda dan dilaboratorium yang berbeda (Epshtein, 2004).
d. Spesifisitas (Selektivitas)
Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur at tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004).
e. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)
Batas deteksi didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantitasi. Batas deteksi merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit diatas atau dibawah nilai tertentu (Rohman, 2009).
f. Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/ LOQ)
Batas kuantitasi didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunkan (Rohman, 2009).
g. Linearitas
Linearitas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran analit atau sampel yang di-spiked pada konsentrasi sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi yang mencakup seluruh rentang seluruh konsentrasi kerja (Ermer, 2005).
h. Rentang
Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita, 2004).
i. Kekuatan (Robustness)
Kekuatan dievaluasi dengan melakukan perubahan parameter dalam melakukan metode analitik seperti pH larutan dapar, suhu kolom KCKT, waktu pengekstraksian analit, komposisi pengekstaksi, perbandingan konsentrasi fase gerak, laju alir fase gerak dan tipe kolom serta pabrik pembuat kolom (Epshtein, 2004)
REFERENSI