Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1 Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etilasetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru (Diospyros blancoi A.DC.).

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK

METANOLIK KULIT BATANG APEL BELUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Theresia Nindyati Krissantini NIM : 098114110

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv .

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini kupersembahkan untuk

Tuhan Yesus yang menjadi sumber kekuatanku dan senantiasa menyertaiku Bapak dan Ibu tercinta yang merawat dan

mendidikku dari kecil hingga saat ini Kakak, sahabat, teman, dan almamaterku

Yeremia 29:11

Sebab Aku ini mengetahui

rancangan-rancangan apa yang ada pada-Ku mengenai

kamu, demikianlah firman TUHAN, yaitu

rancangan damai sejahtera dan bukan

rancangan kecelakaan, untuk memberikan

kepadamu hari depan yang penuh harapan

Amsal 19:21

vii PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Kulit Batang Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan arahan dan bimbingan.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji atas pengarahan, bimbingan dan kesediaannya memberikan ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan pengarahan kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Jeffry Julianus, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini.

5. Dra. M.M.Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendidik dan memberikan nasihat positif.

viii

6. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

7. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi Fitokimia (Mas Wagiran) dan Kimia Fisika (Mas Agung) atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

8. Bapak Stephanus Robertus Suripto dan Ibu Fransisca Sri Maryati, S.Pd. atas doa dan kasih sayang serta dukungan yang telah diberikan baik moril maupun materil sehingga skripsi ini dapat selesai.

9. Kakak tercinta Monica Tita Kristantika atas perhatian dan doa serta dukungan dalam menyelesaikan skripsi ini.

10.Yulio Nur Aji Surya dan Johanes Baptista Yunio Rahmawan yang merupakan tim DPPH yang kompak dan hebat, terimakasih atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam penelitian ini.

11.Wisnu Brahmana Putra, Haris Witantyo, Arvi Mahendra, Augustinus Teti, Putut Wibisono dan Febrin Nessy yang selalu memberikan semangat dan dukungan kepada penulis.

12.Teman-teman KONCO KEKAL, Eric Antonius, Is Sumitro, Tri Pamulatsih, Sisilia Mirsya, Lucia Shinta, Tiatira Metri, Yustisia Laras, Novia Sarwoningtyas yang membantu dan memberi semangat disaat penulis merasa putus asa.

13.Teman-teman Farmasi kelas C angkatan 2009 dan FST 2009 yang telah memberikan doa, dukungan dan keceriaan selama ini.

ix

14.Teman-teman tercinta Vincentia Adelina, Lani Agustina, Agnes Mutiara, Silvia Agustina, Maria Rosari, Sheilla Ardhistia, Vincentia Septima, Giovani Anggasta dan Dara Nastiandari yang setia memberikan semangat dan dukungan kepada penulis.

15.Teman-teman “Kost Dewi 2” yang memberi semangat dan dukungan kepada penulis.

16.Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang farmasi.

Yogyakarta, 19 Juli 2013

x DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………. ii

HALAMAN PENGESAHAN………. iii

PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS ……… iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA …… v

HALAMAN PERSEMBAHAN……….. vi

PRAKATA……… vii

DAFTAR ISI……….. x

DAFTAR TABEL……… xiv

DAFTAR GAMBAR………. xv

DAFTAR LAMPIRAN………... xvii

INTISARI……….. xviii

ABSTRACT………. xix

BAB I PENGANTAR………. 1

A. Latar Belakang………. 1

1. Permasalahan………... 3

2. Keaslian penelitian……….. 3

3. Manfaat penelitian………... 4

B. Tujuan Penelitian ... …. 5

BAB II PENELAHAAN PUSTAKA………. 6

xi

1. Nama tumbuhan ..………... 6

2. Sinonim tumbuhan………... 6

3. Sistematika tumbuhan…..………... 7

4. Gambaran umum apel beludru……… 7

5. Asal dan penyebaran tanaman………. 8

6. Kandungan kimia apel beludru………..…. 8

B. Senyawa Fenolik………... 9

C. Metode Folin-Ciocalteu………. 10

D. Radikal Bebas………... 11

E. Antioksidan ... …. 12

F. Metode DPPH ……… 12

G. Ekstraksi….……… 13

H. Spektrofotometri Visibel ………... 14

I. Landasan Teori ……… 15

J. Hipotesis ……….. 16

BAB III METODELOGI PENELITIAN……….. ….. 17

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………... 17

B. Variabel Penelitian………. 17

1. Variabel bebas……….. 17

2. Variabel tergantung……… 17

3. Variabel pengacau terkendali……… 17

4. Variabel pengacau tak terkendali……… 17

xii

D. Bahan dan Alat Penelitian ... …. 18

1. Bahan penelitian ... …. 18

2. Alat penelitian ... …. 19

E. Tata Cara Penelitian ... …. 19

1. Determinasi tanaman ... …. 19

2. Pengumpulan dan penyiapan bahan (simplisia) ... …. 19

3. Ekstraksi simplisia ... …. 20

4. Pembuatan fraksi etil asetat ... …. 20

5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji……….. 21

6. Uji pendahuluan ... … 23

7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ... …. 23

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ... …. 24

9. Penetapan kandungan fenolik total ... …. 25

10. Uji aktivitas antioksidan ... ….. 25

F. Analisis Hasil………. 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... …. 28

A. Hasil Determinasi Tanaman ... … 28

B. Hasil Pengumpulan Bahan ... …. 28

C. Hasil Preparasi Sampel ... … 29

1. Hasil ekstraksi sampel ... ….. 29

2. Hasil fraksinasi ekstrak ... ….. 32

D. Hasil Uji Pendahuluan ... ….. 34

xiii

2. Uji pendahuluan senyawa antioksidan ………. 36

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total……….. 37

1. Penentuan operating time(OT)………. 37

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( maks)…….. 38

F. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total……….….………..39

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…….…..…………. 42

1. Penentuan panjang gelombang maksimum ( maks)...…………... 42

2. Penentuan operating time(OT)……….…………..………... 45

H. Hasil Estimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total ..………. 47

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………. 57

A. Kesimpulan……… 57

B. Saran……….. 57

DAFTAR PUSTAKA………. 58

LAMPIRAN……… 62

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang

direaksikan dengan Folin-Ciocalteu ... 39 Tebel II . Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan

dengan Folin-Ciocalteu ……… 41 Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak

metanolik kulit batang apel beludru ... 42 Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH pada berbagai

konsentrasi ……… 44 Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH… 50 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit

batang apel beludru dengan metode DPPH ... 51 Tabel VII. Hasil perhitungan IC50kuersetin ... 52 Tabel VIII. Hasil perhitungan IC50 fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit

batang apel beludru………. 53 Tabel IX. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan fraksi etil

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Tanaman apel beludru (Morton,1987)……… 6

Gambar 2. Struktur dasar flavonoid (Apak dkk., 2007)……….. 9

Gambar 3. Struktur kimia beberapa tipe flavonoid (Apak dkk., 2007)…… 10

Gambar 4. Struktur asam galat (Kalita, Kar dan Handique, 2011)………. 10

Gambar 5. 1,1-diphenyl-2picrylhidrazyl (radikal bebas) dan 1,1-diphenyl -2-picryhydrazyl (non radikal) (Molyneux, 2004)……….. 13

Gambar 6. Skema jalannya penelitian……….………. 27

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan senyawa fenolik………...………... 35

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan……….. 36

Gambar 9. Grafik penentuan operating time asam galat ……… 37

Gambar 10. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat kulit batang apel beludru……….. 38

Gambar 11. Reaksi asam galat dengan molybdenum yang merupakan komponen Folin-Ciocalteu……… 40

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier asam galat dalam penetapan fenolik total……… 41

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH……… 43

Gambar 14. Scanning panjang gelombang maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi………. 45

xvi

Gambar 16. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat kulit batang apel beludru (replikasi 1)……… 46 Gambar 17. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan

antioksidan (Witt, Lalk, Hager dan Voigt, 2010)……….. 47 Gambar 18. Struktur kuersetin (Apak dkk, 2007)……….. 48 Gambar 19. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin.. 52 Gambar 20. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat Pengesahan Determinasi Tanaman Apel Beludru………. 62 Lampiran 2. Gambar Tanaman Apel Beludru Yang Diambil Di Kampus III

Universitas Sanata Dharma.…. ... …. 63 Lampiran 3. Kulit Batang Apel Beludru………... 64 Lampiran 4. Hasil Ekstrak Metanol dan Perhitungan Rendemen Fraksi Etil

Asetat Ekstrak Metanolik Kulit Batang Apel Beludru ………. 64 Lampiran 5. Data Penimbangan Bahan Pengujian Aktivitas Antioksidan… 65 Lampiran 6. Data Perhitungan Konsentrasi DPPH, Larutan Pembanding dan

Larutan Uji . ... …. 66 Lampiran 7. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan………. 71 Lampiran 8. Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH . .... 75 Lampiran 9. Perhitungan Nilai IC50 Kuersetin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak

Metanolik Kulit Batang Apel Beludru ... …. 78 Lampiran 10. Data Penimbangan Bahan untuk Uji Kandungan Fenolik Total 79 Lampiran 11. Optimasi Penentuan Fenolik Total ... .. 79

Lampiran 12. Penentuan Kandungan Fenolik Total……… 82 Lampiran 13. Uji Statistika……….. 86

xviii INTISARI

Penyakit degeneratif dan gangguan fungsi dan struktur sel serta mutasi dapat disebabkan oleh radikal bebas. Salah satu cara untuk menangkal radikal bebas yaitu menggunakan antioksidan. Apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) diketahui memiliki kandungan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Penelitian ini bertujuan untuk penetapan kandungan fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan kulit batang apel beludru. Kulit batang apel beludru diekstrak menggunakan campuran metanol : air (9:1) dan (1:1) kemudian difraksinasi dengan etil asetat. Penentuan kandungan fenolik total menggunakan senyawa Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dalam massa ekivalen asam galat dan aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dalam Inhibition Concentration (IC50).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak kulit batang apel beludru mempunyai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru sebesar 1311,3 ± 72,80 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat (taraf kepercayaan 95 %) dan aktivitas antioksidan sangat kuat yang dinyatakan dengan IC50 sebesar 14,3 ± 1,42 µg/mL (taraf kepercayaan 95%).

Kata kunci : fraksi etil asetat kulit batang apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), DPPH, kandungan fenolik total, antioksidan

xix ABSTRACT

Degenerative diseases and disorders of cell structure and function, and mutations can be caused by free radicals. One way to counteract the free radicals using antioxidants. Velvet apple (Diospyros blancoi A. DC.) known to contain phenolic compounds that have antioxidant activity.

This study aimed at the determination of total phenolic content and antioxidant activity velvet apple of bark. Velvet apple bark was extracted using a mixture of methanol: water (9:1) and (1:1) and then fractionated with ethyl acetate. Determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu compounds are expressed in gallic acid equivalent mass and antioxidant activity using 1,1-diphenyl-2 pikrilhidrazil radical (DPPH) which is expressed in the Inhibition Concentration (IC50).

The results showed that the ethyl acetate fraction of the velvet apple stem bark methanolic extract has a total phenolic content 1311.3 ± 72.80 mg gallic acid equivalents per gram fraction (95% confidence level) and antioxidant activity very strong expressed by IC50 14.3 ± 1.42 g / mL (95% confidence level).

Keywords: ethyl acetate fraction of the stem bark velvet apple (Diospyros blancoi A. DC.), DPPH, total phenolic content, antioxidant

1 BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit degeneratif, gangguan fungsi dan struktur sel, serta mutasi dapat disebabkan oleh radikal bebas. Radikal bebas merupakan kumpulan atom yang reaktif dan tidak stabil, karena memiliki satu elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya. Untuk mencapai kestabilan atom, radikal bebas akan bereaksi dengan molekul disekitarnya untuk mendapatkan pasangan elektronnya. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan dapat memulai terjadinya penyakit degeneratif. Oleh karena itu, tubuh memerlukan suatu substansi penting yaitu antioksidan yang mampu menghambat mekanisme oksidatif yang menyebabkan penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof dan Miller, 2001).

Antioksidan merupakan senyawa kimia yang dapat menangkal radikal bebas karena dapat menyumbangkan satu elektron kepada radikal bebas (Suhartono, 2002 cit., Sunardi, 2007). Antioksidan alami mampu melindungi tubuh dari kerusakan akibat spesies oksigen reaktif dan menghambat penyakit degeneratif (Sunarni, 2005 cit., Sunardi, 2007). Contoh antioksidan alami yaitu vitamin C, vitamin E, karotenoid dan senyawa fenolik. Paling sedikit ada 4 macam sumber antioksidan, yaitu enzim (superoksida dismutase, glutation peroksidase dan katalase), molekul besar (albumin, ceruliplasmin, feritin, protein

lain), molekul kecil (asam askorbat, glutation, asam urat, tokoferol, karotenoid, polifenol) dan beberapa hormon (estrogen, angiotensin, melatonin) (Prior, Wu dan Schaich, 2005). Adanya kemungkinan efek samping yang belum diketahui dari antioksidan sintetik, maka antioksidan alami menjadi alternatif untuk menangkal radikal bebas (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005 cit., Sunardi, 2007). Hal inilah yang menyebabkan adanya penelitian eksplorasi sumber antioksidan alami yang berasal dari tanaman.

Senyawa fenolik merupakan senyawa antioksidan alami yang terdapat dalam bentuk senyawa aktif dalam makanan. Senyawa fenolik dapat mencegah berbagai jenis penyakit, seperti kanker dan jantung koroner. Senyawa ini pun berperan sebagai faktor pelindung terhadap bahaya oksidasi pada tubuh manusia (Ningsih, 2007).

Pada tanaman dengan profil kandungan kimia satu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan kandungan kimia yang mirip (Muharni, 2010). Tanaman Diospyros virginiana L yang masih satu genus dengan apel beludru ditemukan adanya kuersetin (Duke, 2001). Kuersetin merupakan senyawa golongan fenolik yang berperan sebagai antioksidan. Menurut penelitian Lee, Jiang, Juan, Lin dan Hou (2006) ekstrak tanaman apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) mengandung konstituen fenolik lebih dari 30 mg asam galat tiap gram dan IC50 sebesar 12,9-28,5 µg/mL dari ekstrak tanaman sehingga dapat digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari apel beludru terutama pada bagian kulit batang.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan kulit batang apel beludru menggunakan radikal DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Radikal DPPH memiliki kemampuan untuk direduksi atau distabilisasi oleh antioksidan diukur dengan mengukur penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm. Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah IC50 konsentrasi ekstrak atau fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebesar 50 % (Zou, Lu dan Wei, 2004). Penentuan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu yang menyatakan ekivalen asam galat pada uji aktivitas antioksidan sumber tumbuhan (Aqil, Ahmad dan Mehmood, 2006).

1. Permasalahan

a. Berapa kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

b. Berapa nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian uji aktivitas antioksidan kulit batang apel beludru sebelumnya pernah dilakukan oleh Das, Hamid, Bulbul, Sultana dan Islam (2010) dalam penelitiannya menggunakan bagian daun, buah, dan kulit batang apel beludru yang didapatkan dari Departemen Botani Universitas Dhaka. Bagian tanaman Diospyros discolor dalam keadaan kering diekstrak dengan metanol 97% selama tujuh hari. Pengujian aktivitas antioksidan

dilakukan dengan metode DPPH dan penetapan kandungan fenolik total menggunakan instrumen spektrofotometer visibel.

Penelitian ini berbeda dengan penelitian sebelumnya, karena penelitian ini menggunakan kulit batang apel beludru yang diperoleh dari Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Kulit batang apel beludru dikeringkan kemudian diserbuk dan dimaserasi menggunakan metanol : air (9:1) dan metanol : air (1:1) selama satu hari. Penelitian ini dilakukan proses fraksinasi dengan petroleum eter dan dilanjutkan dengan etil asetat, sehingga diperoleh fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru. Hasil fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru inilah yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH dan penetapan kandungan fenolik total dengan menggunakan instrumen spektrofotometer visibel.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis.Memberikan pengetahuan dan bukti ilmiah mengenai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

b. Manfaat praktis. Memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan kulit batang apel beludru, sehingga bisa dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif pemeliharaan kesehatan manusia.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum. Menguji kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu dan aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dari fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang tanaman apel beludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

6 BAB II

PENELAHAAN PUSTAKA

A. Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.)

Gambar 1. Tanaman apel beludru (Morton, 1987)

1. Nama tumbuhan

Buah mabolo kadang-kadang disebut dengan apel beludru. Di India disebut dengan persik mekar. Di Malaya disebut dengan buah mantega (buah mentega). Mabolo (atau mabulo) adalah nama umum di daerah Filipina, dengan nama lain kamagon (Spanyol) (Morton, 1987).

2. Sinonim tumbuhan

Sinonim tumbuhan apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) yaitu

Diospyros discolor Willd. dan Diospyros philippensis (Desr.) Guerke (United States Department of Agriculture NRCS, 2013).

3. Sistematika tumbuhan

Berikut sistematika tumbuhan apel beludru Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division :Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Dilleniidae Order : Ebenales Family : Ebenaceae Genus : DiospyrosL.

Species : Diospyrosblancoi A. DC.

(United States Department of Agriculture NRCS, 2013). 4. Gambaran umum apel beludru

Menurut IPNI (2013), A. DC. pada nama latin apel beludru merupakan singkatan dari nama author tanaman, yaitu Alphonse Louis Pierre Pyramus de Candolle. Mabolo (apel beludru) memiliki ciri bentuk pohon kecil dengan cabang terkulai, tinggi pohon 60-100 kaki (18-33 m). Pertumbuhan tanaman apel beludru agak lambat. Daun berwarna hijau gelap berbentuk persegi panjang (membujur), menunjuk pada apeks, bulat, panjang 6-9 inci (15-22,8 cm), lebar 2-3,5 inci (5-9 cm), kasar, di bagian permukaan atas halus dan mengkilap, di bagian bawah berbulu halus keperakan. Daun muda berwarna hijau muda hingga merah muda dan berbulu halus. Bunga jantan berukuran 0,25 inci (6 mm) dan bunga betina

berukuran 0,5 inci (12,5 mm). Buah apel beludru berbentuk bulat memiliki ukuran kira-kira 1-4 inci (5-10 cm). Buah muda berwarna coklat kemerahan yang berubah menjadi merah terang, kemudian agak kusam jika matang. Daging buah berwarna keputihan, agak keras, padat, dan kering. Rasanya manis agak sepat dan berbau khas seperti keju. Biji berbentuk baji dengan ukuran panjang sekitar 1,5 inci (4 cm) dan lebar 1 inci (2,5 cm) (Morton, 1987).

5. Asal dan penyebaran tanaman apel beludru

Mabolo (apel beludru) berasal dari hutan dataran rendah dan menengah Kepulauan Filipina dari pulau Luzon ke Key dari Kepulauan Sulu, dan umumnya yang dibudidayakan adalah buah dan bahkan lebih sebagai pohon peneduh untuk pinggir jalan. Pohon itu mulai diperkenalkan ke Jawa dan Malaya pada tahun 1881, dan masuk ke Calcutta Botanical Garden di Singapura. Benih dikirim ke Amerika Serikat Departemen Pertanian oleh WS Lyon, Biro Filipina Pertanian dan bibit berkembang di Pabrik Stasiun Pendahuluan di Miami . Ada spesimen yang tumbuh di tempat lain yaitu di Florida selatan dan beberapa tersebar di sekitar wilayah Karibia, di Jamaika, Puerto Rico, Kuba, Trinidad dan Lancetilla Taman Eksperimental di Honduras dan tanaman diterima dari Filipina pada tahun 1926 serta biji dari Kuba pada tahun 1927 (Morton, 1987).

6. Kandungan kimia apel beludru

Apel beludru mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, tanin dan gula (Howlader, Rahman, Khalipha, Ahmed dan Rahman, 2012). Apel beludru mengandung konstituen fenolik lebih dari 30 mg asam galat tiap gram dan IC50 sebesar 12,9-28,5 µg/mL dari ekstrak tanaman (Lee dkk., 2006).

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan sumber dari antioksidan alami yang aman digunakan dan termasuk dalam golongan mayoritas senyawa yang berperan sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik terjadi karena kemampuan mereduksi radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil (Marxen dkk., 2007). Senyawa fenolik terdiri dari beberapa molekul besar dengan karakteristik utama adalah adanya cincin aromatik yang memiliki gugus hidroksil. Selain itu, senyawa fenolik memiliki kemampuan membentuk senyawa kelat dengan logam, mudah teroksidasi dan membentuk polimer yang menimbukan warna gelap. Kebanyakan dari senyawa fenolik termasuk dalam kelompok flavonoid (Pratt dan Hudson, 1990 cit., Ningsih, 2007).

Flavonoid merupakan antioksidan yang menetralisir radikal bebas. Flavonoid adalah bagian dari senyawa fenolik yang terdapat pada pigmen tumbuh-tumbuhan.. Flavonoid terbagi menjadi 7 kelompok, yaitu antosianin, proantosianin, isoflavon, flavonon, flavonol, flavanol, dan flavon. Flavonoid memiliki aktivitas antiokasidan di dalam tubuh sehingga disebut bioflavonoid (Apak dkk., 2007). Manfaat utama flavonoid adalah untuk melindungi struktur sel, membantu memaksimalkan manfaat vitamin C, mencegah keropos tulang, sebagai antibiotik dan antiinflamasi (Fadhli, 2008)

Fenol Flavanols Flavonols

Flavones Flavanones Isoflavones

Gambar 3. Struktur kimia beberapa tipe flavonoid (Apak dkk., 2007)

C. Metode Folin-Ciocalteu

Metode Folin-Ciocalteu merupakan metode pengukuran kadar polifenol dengan standar asam galat (Nely, 2007).

Gambar 4. Struktur asam galat (Kalita, Kar dan Handique, 2011)

Pada tahun 1927, metode Folin-Ciocalteu pertama kali dikembangkan untuk menganalisis asam amino tirosin. Reagen asam fosfomolibdat-tungstat akan mengoksidasi senyawa fenolik menghasilkan produk senyawa berwarna yang

dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 745-750 nm. Metode Folin-Ciocalteu terjadi dalam suasana basa, sehingga dalam penentuan kadar fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu digunakan natrium karbonat yang bertujuan untuk membentuk suasana basa.

D. Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul (kumpulan atom) yang memiliki elektron tidak berpasangan. Elektron tidak berpasangan pada radikal bebas cenderung akan mencari pasangan dengan cara menarik atau menyerang elektron dari senyawa lain sehingga reaktivitas radikal bebas menjadi tinggi. Senyawa radikal bebas juga dapat mengubah suatu molekul menjadi radikal. Target utama radikal bebas, yaitu asam lemak tak jenuh, lipoprotein dan protein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Banyak kemungkinan yang terjadi akibat radikal bebas yaitu gangguan fungsi dan struktur sel bahkan mutasi sehingga memicu timbulnya penyakit (Winarsi, 2007).

Secara umum, tahapan pembentukan radikal bebas ada 3, yaitu :

1. Tahap inisiasi merupakan awal pembentukan radikal bebas dan reaksinya, yaitu RH  R* + H*

2. Tahap propagasi, merupakan tahap pemanjangan rantai radikal R* + O2  ROO*

ROO* + RH  ROOH +R*

3. Tahap terminasi, merupakan tahap mulai bereaksinya radikal dengan radikal lain membentuk molekul yang stabil dan reaksinya, yaitu :

ROO* +ROO* non radikal

R* + ROO* non radikal

R* + R* non radikal (Winarsi, 2007).

E. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa kimia yang dapat menangkal radikal bebas karena dapat menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas (Suhartono, 2002 cit., Sunardi, 2007). Antioksidan dapat menghambat ROS (Reactive Oxygen Species) dan radikal lainnya sehingga dapat mencegah terjadinya penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas seperti kardiovaskuler, karsinogenesis, dan penuaan (Gutteridge dan Halliwell, 2000).

Karakteristik antioksidan, yaitu kemampuannya untuk menangkap radikal bebas. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat, polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil dan juga menghambat mekanisme oksidatif yang menyebabkan penyakit degeneratif (Prakash dkk., 2001).

F. Metode DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang sangat mudah dan cepat untuk mengevaluasi aktivitas antiradikal pada antioksidan, tetapi juga menyajikan model kinetika reaksi DPPH yang stabil. Prinsip metode ini dengan melihat kemampuan antioksidan dengan cara mengukur pengurangan intensitas warna dari DPPH akibat penangkapan elektron radikal DPPH oleh antioksidan yang berikatan

dengan hidrogennya DPPH-H. Hasil dari pengurangan intensitas warna adalah stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap (Bondet, Brand-Williams dan Berset, 1997).

Parameter yang digunakan untuk uji penangkapan radikal DPPH adalah

IC50 yaitu konsentrasi ekstrak atau fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebesar 50 % (Zou dkk., 2004). Menurut Rohman, Riyanto, Dahliyanti dan Pratomo (2009) menyatakan bahwa nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak atau fraksi uji dan % penangkapan radikal. Semakin kecil nilai IC50 maka semakin aktif ekstrak atau fraksi (senyawa uji) tersebut sebagai penangkap radikal DPPH dan semakin aktif sebagai antioksidan.

Gambar 5. A : picrylhydrazyl (radikal bebas) dan B : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (non radikal) (Molyneux, 2004)

G. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut. Pada ekstraksi cair-cair, satu komponen bahan atau lebih dari suatu campuran dipisahkan dengan bantuan pelarut. Ekstraksi cair-cair digunakan bila pemisahan campuran dengan cara

destilasi tidak mungkin dilakukan. Ekstraksi cair-cair selalu terdiri dari sedikitnya dua tahap, yaitu pencampuran secara intensif bahan ekstraksi dengan pelarut dan pemisahan kedua fase cair itu sesempurna mungkin (Wibawa, 2007).

Maserasi merupakan suatu teknik penyarian yang sederhana, dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang di dalam cairan penyari dan tidak mengandung benzoin. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan akan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif kemudian zat aktif akan menjadi larut. Larutan yang paling pekat akan terdesak keluar karena adanya perbedaan konsentrasi dari larutan zat aktif yang ada di dalam dan di luar sel. Peristiwa tersebut akan terjadi secara berulang-ulang hingga tercapai kesetimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel (Depkes RI, 1986).

Keuntungan dari teknik penyarian dengan cara maserasi yaitu cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sangat sederhana. Namun, kerugian cara maserasi adalah butuh waktu yang lama untuk proses pengerjaan dan penyarian yang kurang sempurna (Depkes RI, 1986).

H. Spektrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel menggunakan sinar atau energi berupa cahaya tampak (visibel). Cahaya visibel termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380

sampai 750 nm. Semua cahaya yang dapat dilihat oleh mata, warna putih, merah, biru, hijau atau warna apapun , maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visibel). Prinsip dari spektrofotometri visibel adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap (Fatimah, 2012).

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), ada tiga macam proses penyerapan energi sinar tampak, yaitu penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, penyerapan oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks, dan penyerapan oleh perpindahan muatan.

I. Landasan Teori

Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan. Radikal bebas akan mencari pasangan elektron di sekitar orbital terluarnya untuk mencapai kestabilan atom, misalnya radikal bebas akan menyerang molekul alami dalam tubuh seperti protein, karbohidrat dan DNA sehingga memungkinkan terjadinya gangguan fungsi sel, kardiovaskuler, dan mutasi sehingga dapat memicu timbulnya penyakit. Antioksidan adalah senyawa yang dapat menangkal radikal bebas karena dapat menyumbangkan satu elektron pada radikal bebas, sehingga dapat mencegah timbulnya penyakit akibat radikal bebas.

Senyawa fenolik merupakan suatu senyawa yang berperan sebagai sumber antioksidan alami. Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa fenolik dan berperan untuk melindungi fungsi dan struktur sel. Apel beludru merupakan

sumber antioksidan alami dan mengandung kuersetin yang merupakan flavonoid yang memiliki kemampuan untuk menangkal radikal bebas.

Metode DPPH merupakan metode yang mudah dan cepat dilakukan untuk mengevaluasi aktivitas antiradikal dari antioksidan. Parameter yang digunakan untuk aktivitas antioksidan, yaitu IC50 yang menyatakan konsentrasi ekstrak atau fraksi uji yang dibutuhkan untuk menangkap radikal DPPH sebesar 50%. Metode Folin-Ciocalteu merupakan metode yang spesifik digunakan untuk mengukur senyawa fenolat yang ada di dalam sampel.

J. Hipotesis

1. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru dapat ditentukan kadar fenolik total dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

2. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru dapat ditentukan nilai aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai IC50.

17 BAB III

METODELOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental rancangan acak sederhana karena subjek uji diberi perlakuan

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.

2. Variabel tergantung berupa % IC fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu panen, umur kulit batang apel beludru, cara pemanenan , cahaya matahari, dan jumlah (g) kulit batang yang digunakan.

4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, curah hujan, dan kelembapan udara.

C. Definisi Operasional

1. Kulit batang apel beludru adalah kulit batang (stem bark) yang diambil dari bagian dasar pohon, yaitu dari bagian tanah 80-100 cm, kemudian dipotong melintang sepertiga dari besarnya kulit batang dengan tinggi 10 cm dan jarak pengambilan berikutnya sebesar 20 cm dari tanaman apel beludru dengan kondisi tanaman yang sedang berbuah dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma , Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.

2. Ekstrak metanolik adalah ekstrak cair kulit batang apel beludru yang diperoleh dari hasil maserasi dengan pengadukan pada orbital shaker menggunakan campuran metanol dan air (9:1) dan (1:1) selama satu hari serta telah dihilangkan kandungan metanolnya.

3. Fraksi etil asetat merupakan hasil fraksi ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang telah difraksinaasi menggunakan petroleum eter kemudian menggunakan etil asetat.

4. Persen inhibition concentration (% IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru untuk menangkap radikal DPPH.

5. Persen inhibition concentration 50 (IC50) adalah konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: kulit batang apel beludru yang berasal dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma , Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta ; akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma). Bahan kimia kualitas pro analitik (E.Merck) meliputi metanol. Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi kuersetin, DPPH , reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: metanol, petroleum eter , etil asetat.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu), vortex (Junke & Kunkel) , corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), tabung reaksi bertutup, ayakan nomor mesh 40, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States Department of Agriculture NRCS (2013).

2. Pengumpulan dan penyiapan bahan (simplisia) a. Pengumpulan bahan

Kulit batang apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada bulan Januari 2013 saat pagi hari. Pemanenan kulit batang apel beludru dilakukan dengan cara mengambil kulit batangbagian dasar pohon, yaitu dari bagian tanah 80-100 cm, kemudian dipotong melintang sepertiga dari besarnya kulit batang dengan tinggi 10 cm dan jarak pengambilan berikutnya sebesar 20 cm dari tanaman apel beludru dengan kondisi tanaman yang sedang berbuah dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.

b. Penyiapan bahan (simplisia)

Sebanyak 200 g kulit batang apel beludru ditimbang, dibersihkan , dicuci dengan air mengalir, lalu dikeringanginkan, kemudian dikeringkan pada oven dengan suhu 40-60oC. Kulit batang yang telah dikeringkan kemudian ditumbuk dan diserbuk menggunakan alat penyerbuk dan diayak dengan ayakan nomor mesh 40.

3. Ekstraksi simplisia

Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 100 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian ditambah pelarut pertama berupa campuran metanol : air (9:1) sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi dengan penggojogan pada orbital shaker pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua yaitu campuran metanol : air (1:1) selama satu hari, lalu disaring. Filtrat hasil penyaringan pertama dan kedua digabungkan, kemudian filtrat diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak metanolik kulit batang apel beludru.

4. Pembuatan fraksi etil asetat

Ekstrak metanolik kulit batang apel beludru diekstraksi cair-cair menggunakan petroleum eter dengan perbandingan ekstrak cair : petroleum eter (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Hasil fraksinasi akan terbenruk dua lapisan, fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase petroleum eter berada pada bagian atas. Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi,

yaitu fraksi petroleum eter dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental kemudian dioven selama satu hari sehingga diperoleh ekstrak kering. Lalu hasil fraksi etil asetat tersebut digunakan untuk analisis lebih lanjut. 5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan DPPH

Sebanyak 15,9 mg DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok dan larutan intermediet kuersetin

Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 1 mL dari larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0

g/mL.

c. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin

konsentrasi 100,0 g/mL kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5;

d. Pembuatan larutan uji

1) Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a 10 mL sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian diambil 1,0 mL dari larutan tersebut kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar

100,0 g/mL.

2) Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan diambil 1 mL stok larutan uji lalu ditambahkan metanol p.a hingga 10,0 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100,0 g/mL. Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 g/mL.

3) Pembuatan larutan baku asam galat

Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang kemudian ditambahkan 10 mL akuades : metanol p.a (1:1) hingga didapatkan konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

6. Uji pendahuluan

a. Uji keberadaan senyawa fenolik

Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 g/mL dan larutan pembanding

asam galat 150,0 g/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL

pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 2 mL, kemudian amati warna larutan tersebut. Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air : metanol (1:1) ditambah pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Larutan DPPH diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 g/mL, dan larutan

uji 200,0 g/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.

7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007).

a. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL

akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga

untuk larutan uji 100 g/mL dengan waktu pengamatan selama 60 menit.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 g/mL ditambahkan

dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, absorbansinya dibaca pada maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding

kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 g/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan

selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 7,5; 12,5; 17,5 g/mL.

9. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 g/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada maksimum

terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanolik p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan tiga kali.

b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 100 g/mL, kemudian dilanjutkan

sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Dilakukan tiga kali replikasi.

10. Uji aktivitas antioksidan

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH lalu ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat operating time dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 mL kemudian ditambahkan dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian vortex selama 30 detik dan diamkan selama operating time. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.

c. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 8a dan 8b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat kulit batang apel beludru.

F.Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus : Absorbansi (larutan kontrol) – Absorbansi sampel (larutan pembanding atau uji) X 100%

Absorbansi larutan kontrol

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah % IC. Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.

Gambar 6. Skema jalannya penelitian Determinasi tanaman

Pengumpulan Bahan

Pembuatan ekstrak metanolik kulit batang apel beludru Ekstraksi cair-cair dengan petroleum eter dan air

Fraksi petroleum eter Fraksi air Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Fraksi air II Uji pendahuluan

Fraksi etil asetat

Analisis stastistik dengan uji R 2.14.1 Estimasi aktivitas antioksidan

Optimasi uji antioksidan

28 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi merupakan suatu langkah awal dan syarat awal yang harus dilakukan dalam suatu penelitian menggunakan tanaman. Determinasi tanaman bertujuan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian serta untuk meminimalisir adanya kesalahan yang terjadi saat pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tanggal 31 Mei 2013 dengan acuan Julia F. Morton (1987) dan United States Department of Agriculture NRCS (2013). Pembuktian determinasi ini diperkuat dengan adanya surat determinasi yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada lampiran 1 yang menyatakan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah benar-benar kulit batang apel beludru (Diospyros blancoi

A. DC.) yang diambil dari tanaman apel beludru.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Kulit batang apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta pada bulan Januari 2013. Kulit batang apel beludru diambil dari satu tempat saja, hal ini untuk menghindari adanya variasi kandungan senyawa aktif dari tanaman. Pengambilan

kulit batang apel beludru dilakukan saat pagi hari agar kandungan metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan belum berkurang (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008). Pengambilan kulit batang apel beludru dilakukan pada kondisi tanaman yang sedang berbuah dengan cara mengambil kulit batang dengan jarak 80-100 cm dari bagian dasar tanaman, yaitu bagian tanah dan dipotong melintang sepertiga dari ukuran kulit batang dengan tinggi 10 cm, dengan jarak pengambilan kulit batang berikutnya, yaitu 20 cm agar sampel yang digunakan representatif. Tanaman apel beludru (Lampiran 2) yang diambil merupakan tanaman budidaya dan bukan tanaman liar, karena penggunaan tanaman budidaya sebagai tanaman penelitian jauh lebih baik dibandingkan dengan tanaman liar. Kerugian dari penggunaan tanaman liar, yaitu ketidakpastian dari kondisi dan perlakuan tanaman, terkait pemupukan dan intensitas cahaya matahari yang diterima tanaman sehingga kandungan metabolit sekunder menjadi berbeda. Ketidakpastian umur tanaman yang sama karena dengan adanya perbedaan umur tanaman juga akan mempengaruhi kandungan metabolit sekunder yang ada.

C. Hasil Preparasi Sampel 1. Hasil ekstraksi sampel

Ekstraksi sampel bertujuan untuk menarik senyawa kimia yang terkandung di dalam kulit batang apel beludru menggunakan pelarut yang sesuai yang kemungkinan senyawa kimia tersebut dapat berperan sebagai antioksidan. Menurut Andersen dan Markham (2006), dalam penelitian digunakan tanaman yang telah dikeringkan karena tanaman yang masih segar dapat mengalami

kerusakan yang disebabkan suatu enzim pada tanaman yang dapat merusak senyawa antioksidan sehingga perlu proses pengeringan untuk mengurangi terjadinya kerusakan senyawa antioksidan pada tanaman tersebut sehingga pada penelitian ini juga digunakan tanaman dengan proses pengeringan.

Proses pembuatan ekstrak simplisia kulit batang apel beludru dimulai dengan proses penyortiran dan pencucian kulit batang apel beludru menggunakan air mengalir yang bertujuan menghilangkan kontaminasi dari benda asing seperti tanah debu, dan bagian tanaman lain yang dapat mengacaukan penelitian. Kemudian, kulit batang apel beludru diangin-anginkan dengan tujuan menghilangkan air karena proses pencucian. Mursyidi (1990) menyatakan bahwa pengeringan dengan suhu di bawah 100oC tidak akan mengubah molekul flavonoid, karena proses pemanasan dimaksudkan untuk mencegah kerja enzim dan panas yang digunakan tidak terlalu tinggi. Oleh karena itu, proses selanjutnya adalah proses pengeringan pada oven dengan suhu 40-60oC hingga kulit batang apel beludru menjadi kering, rapuh dan mudah untuk dipatahkan.

Kulit batang yang telah kering kemudian ditumbuk terlebih dahulu untuk mempermudah proses penyerbukan, setelah itu dilanjutkan dengan penyerbukan menggunakan alat penyerbuk hingga halus. Serbuk simplisia kemudian diayak dengan ayakan nomor mesh 40. Tujuan dari proses penyerbukan adalah untuk memperkecil ukuran partikel simplisia, sehingga luas permukaan simplisia menjadi lebih besar yang mampu mengoptimalkan kontak antara serbuk simplisia dengan cairan penyari sehingga hasil penyarian menjadi lebih optimal.

Metode ekstraksi yang dipilih adalah maserasi karena ekstraksi dengan maserasi tidak melibatkan pemanasan sehingga dapat mengurangi terjadinya perubahan senyawa pada simplisia. Proses maserasi dilakukan dengan perendaman ekstrak tumbuhan dengan pelarut organik yang menyebabkan dinding dan membran sel pecah karena adanya perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada di sitoplasma akan larut pada pelarut organik dan ekstraksi senyawa menjadi sempurna. Hal inilah yang menjadi keuntungan proses maserasi untuk isolasi senyawa dari bahan alam.

Cairan penyari yang dipilih adalah metanol karena metanol merupakan pelarut universal dan kemampuan penetrasi ke dalam sel tanaman lebih kuat dibandingkan etanol ataupun penyari yang lain (Depkes RI, 2000). Kepolaran metanol lebih tinggi dibandingkan dengan etanol, yaitu metanol 5,1 dan etanol 4,3 sehingga metanol lebih mudah untuk berinteraksi dengan senyawa fenolik yang memiliki sifat polar (like dissolve like) (Snyder, 1997). Penyari yang digunakan untuk proses maserasi adalah campuran metanol dan air karena penggunaan campuran metanol dan air akan menghasilkan jumlah rendemen lebih banyak dibandingkan dengan campuran lain (Sultana, 2009). Pelarut pertama adalah metanol : air (9:1), sedangkan pelarut kedua adalah metanol : air (1:1) (Mursyidi, 1990).

Maserasi dilakukan menggunakan pelarut pertama yaitu metanol : air (9:1). Proses maserasi dilakukan selama satu hari karena maserasi menggunakan mesin pengaduk, yaitu shaker sehingga waktu yang digunakan dapat dipersingkat menjadi satu hari (Depkes RI, 1986). Selain itu, tujuan maserasi dibantu dengan

shaker agar proses maserasi menjadi efektif karena kontak antara penyari dengan sel-sel kulit batang apel beludru lebih banyak dibandingkan jika hanya didiamkan saja dan untuk menghindari terjadinya pengendapan. Pengendapan dapat mengurangi kontak antara penyari dengan serbuk simplisia diakibatkan oleh luas kontak serbuk dengan penyari menjadi lebih kecil karena adanya ikatan yang kuat antar partikel tersebut. Setelah dimaserasi selama satu hari kemudian dilakukan proses penyaringan menggunakan corong Buchner dan kertas saring dengan bantuan pompa vakum untuk mempercepat proses penyaringan. Ampas hasil penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua, yaitu metanol : air (1:1) selama satu hari kemudian dilakukan proses penyaringan dengan bantuan pompa vakum.

Filtrat yang diperoleh dari proses penyaringan pertama dan kedua digabung kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dengan tujuan agar filtrat metanol yang diuapkan tidak kontak langsung dengan panas karena dapat merusak kandungan senyawa yang ada di filtrat metanol. Hasil ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang diperoleh yaitu, 400 mL.

2. Hasil fraksinasi ekstrak

Hasil ekstrak metanolik yang diperoleh diekstraksi lagi menggunakan petroleum eter yang bertujuan untuk menghilangkan senyawa yang yang bersifat non polar seperti lipid yang dapat mengganggu dalam penelitian. Menurut Snyder (1997) indeks polaritas petroleum eter, yaitu 0,1 berarti bersifat sangat non polar.

Metode ekstraksi cair-cair merupakan metode yang digunakan dalam pemisahan senyawa non polar menggunakan petroleum eter di mana pemisahan senyawa berdasarkan pada kepolaran senyawa dengan dua pelarut yang memiliki

tingkat kepolaran berbeda. Ekstrak metanolik diekstraksi cair-cair menggunakan petroleum eter dengan menggunakan petroleum eter dengan perbandingan 1:1 pada corong pisah kemudian digojog dengan perlahan yang bertujuan sehingga memudahkan dalam pemisahan dengan pencampuran. Fase air akan berada di bagian bawah karena air memiliki berat jenis yang lebih besar dibandingkan petroleum eter, yaitu 0,730 sedangkan air sebesar 0,996 (Depkes RI, 1995). Fraksi air akan digunakan analisis lebih lanjut.

Fraksinasi bertujuan untuk menarik senyawa yang lebih larut dalam etil asetat untuk menguji aktivitas antioksidan sehingga akan lebih mendapatkan hasil yang spesifik pada senyawa flavonoid dengan golongan isoflavones, flavanones, methylated flavones, and flavonols (Andersen dan Markham, 2006). Fraksi air yang merupakan hasil fraksinasi menggunakan petroleum eter akan difraksinasi kembali dengan etil asetat. Indeks polaritas etil asetat yaitu 4,4 (Snyder, 1997). Etil asetat berfungsi untuk mengekstraksi aglikon polihidroksi misalnya aglikon flavonon, flavon dan flavonol (Rathee, Patro, Mula, Gamre dan Chattopadadhyay, 2006).

Metode ekstraksi cair-cair juga digunakan untuk pemisahan fraksi etil asetat dengan perbandingan fraksi air hasil pemisahan dengan petroleum eter dan etil asetat yaitu 1:1. Tujuan dibuat perbandingan yang sama, yaitu untuk meminimalisir resiko terjadinya perpindahan solute karena adanya perbedaan jumlah pelarut. Fraksi air kemudian diekstraksi sebanyak tiga kali. Tujuan dilakukannya ekstraksi berulang-ulang yaitu untuk memaksimalkan perpindahan zat sesuai kepolarannya sehingga akan diperoleh hasil yang efisien.

Fraksi etil asetat yang digunakan untuk analisis lebih lanjut kemudian diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak pekat. Penggunaan vacuum rotary evaporator bertujuan untuk meminimalkan terjadinya kerusakan senyawa fenolik karena adanya proses pemanasan. Sisa fraksi etil asetat kemudian dioven selama satu hari untuk menguapkan sisa pelarut sehingga didapatkan ekstrak kering. Sebelumnya cawan porselen yang masih kosong ditimbang untuk mendapatkan bobot fraksi etil asetat. Fraksi kering etil asetat kemudian ditaruh dalam cawan porselen yang dibungkus ditutup dengan alumunium foil supaya tidak terpapar udara dan sinar UV dan dapat mendegradasi senyawa fenolik yang terkandung. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus kemudian disimpan dalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 8,25 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 4,125%.

D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan fenolik

Tujuan uji pendahuluan fenolik yaitu untuk mengetahui secara kualitatif kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada fraksi etil asetat kulit batang apel beludru. Menurut Prior, dkk (2005) prinsip uji pendahuluan fenolik yaitu reagen asam fosfomolibdat-tungstat akan mengoksidasi senyawa fenolik menghasilkan produk senyawa berwarna biru yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 745-750 nm. Makin tinggi kadar fenol dalam sampel,

maka semakin banyak kromagen (biru), sehingga makin besar intensitas warna biru yang terbentuk.

Kontrol positif digunakan asam galat ditambahkan dengan Folin Ciocalteu dan Na2CO3. Pengujian fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru menunjukkan hasil positif yaitu warna biru setelah direaksikan dengan Folin Ciocalteu dan Na2CO3 berarti fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru mengandung senyawa fenolik. Hal ini berbeda ketika hanya kontrol negatif tanpa larutan uji berwarna bening yang memiliki warna mirip dengan asam galat.

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan fenolik. Gambar A merupakan Folin Ciocalteu dan Na2CO3, gambar B adalah asam galat ditambah Folin Ciocalteu dan Na2CO3 , gambar C

larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru ditambah Folin Ciocalteu dan Na2CO3) , gambar D adalah asam galat gambar E : larutan uji (fraksi etil

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahuluan bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru secara kualitatif. Uji ini menggunakan radikal DPPH dan senyawa uji yaitu fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru. Menurut Badarinath, Mallikarjuna, Chetty, Madhu, Rajan dan Gnanaprakash (2010) prinsip metode DPPH untuk mengetahui aktivitas antioksidan yaitu berdasarkan reaksi reduksi DPPH. DPPH adalah suatu radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan berwarna violet dalam metanol. Radikal DPPH ketika bereaksi dengan antioksidan akan merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai pemberi warna violet sehingga menjadi warna kuning Kontrol positif yaitu radikal DPPH ditambahkan dengan kuersetin. Pengujian fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit batang apel beludru menunjukkan hasil positif yaitu warna kuning saat direaksikan dengan DPPH yang berarti fraksi etil asetat kulit batang apel beludru memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan DPPH (Gambar A merupakan DPPH, gambar B adalah DPPH dan kuersetin, gambar C merupakan DPPH dan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru, gambar D

adalah kuersetin, gambar E yaitu fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru)

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total 1.Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu optimum dimana reaksi antara larutan baku pembanding (asam galat) dan larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru) terhadap reagen Folin-Ciocalteu. Penentuan operating time diperoleh ketika waktu absorbansi baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen sudah mulai stabil. Estimasi waktu yang digunakan adalah dalam tiga puluh menit dengan selang waktu lima menit. Waktu akan dihitung setelah reagen dicampurkan dan absorbansi pertama dihitung setelah lima menit pertama. Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang gelombang maksimum teoritis, yaitu 750 nm.

Gambar 10. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat

Gambar 9 merupakan gambar yang mewakili penentuan operating time

asam galat dari 3 replikasi dan dan diperoleh operating time asam galat, yaitu 20 menit karena pada waktu ini reaksi sudah bereaksi sempurna dan reaksi mulai stabil. Gambar 10 adalah penentuan operating time fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru dan diperoleh OT 40 menit. Makin lama waktu yang digunakan maka absorbansi yang dihasilkan juga semakin tinggi. 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( maks)

Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH. Pada panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitifitas yang tinggi, sehingga dengan sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar. Absorbansi sampel dihitung dengan autozero menggunakan pelarut metanol : air (1:1) dengan tujuan untuk mengetahu tidak adanya gangguan (interferensi) serapan dari pelarut atau kontaminasi yang tercemar dalam metanol.

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu

Konsentrasi larutan Asam galat (µg/mL)

maksimum hasil scanning (nm)

maksimum yang digunakan(nm)

maksimum teoritis (nm)

50 751

751 750

100 751

150 751

Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocateu dengan menggunakan tiga konsentrasi dan diperoleh panjang gelombang maksimum, yaitu 751 nm.

F. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total

Senyawa fenolik merupakan senyawa yang berperan penting dalam aktivitas antioksidan yaitu kemampuannya untuk menangkap radikal bebas dan menghambat peroksidasi lipid. Mekanisme senyawa fenolik yaitu sebagai agen pereduksi dan pendonor elektron. Penentuan kandungan fenolik total dilakukan secara spektrofotometri dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteu menggunakan

asam galat sebagai pembanding. Asam galat digunakan sebagai pembanding dalam

menetapkan kadar senyawa fenolik total karena merupakan senyawa yang mempunyai 3 gugus hidroksi fenolik, mempunyai kemurnian tinggi dan stabil dan lebih murah dibandingkan standar lain (Andayani dkk., 2008).

Gambar 11. Reaksi asam galat dengan molybdenum yang merupakan komponen Folin-Ciocalteu

Metode Folin-Ciocalteu adalah metode yang digunakan untuk penetapan kandungan fenolik total. Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi fenol menggunakan garam alkali (natrium karbonat) dan mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten, sehingga nilai yang didapat signifikan dengan konsentrasi ion fenolat. Reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu akan membentuk suatu kompleks warna biru. Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat. Selain itu, makin pekat warna biru yang terbentuk berarti semakin banyak kompleks dari fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singleton danRossi, 1985).

Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu

Asam galat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi terukur Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi terukur Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi terukur 51,00 0,231 51,00 0,242 50,50 0,221 76,50 0,354 76,50 0,363 75,75 0,346 102,00 0,485 102,00 0,489 101,00 0,481 127,50 0,632 127,50 0,637 126,25 0,626 153,00 0,767 153,00 0,769 151,50 0,760 y = 5,294.10-3x - 0,0462

r= 0,9995

y = 5,2078.10-3 x -0,0312 r = 0,9994

y = 5,378.10-3 x -0,0564 r = 0,9997

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier asam galat dalam penetapan fenolik total fraksi

etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru

Tabel II adalah tabel hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu. Berdasarkan tabel II, semakin besar konsentrasi yang digunakan maka semakin besar pula absorbansi terukur dengan nilai r paling baik pada replikasi ketiga, yaitu r = 0,9997 yang digunakan untuk penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrk metanolik kulit batang

apel beludru. Gambar 12 merupakan gambar untuk penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru berdasarkan pada persamaan regresi linier asam galat dari tiga replikasi dan dipilih replikasi III dengan y = 5,378.10-3 x -0,0564 dan nilai r yang paling baik yaitu r= 0,9997.

Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru

Replikasi

Fenolik total (mg ekivalen asam galat)

rata-rata

SD

I 1229,41

II 1335,80 1311,3 72,80

III 1368,71

Tabel III merupakan hasil penentuan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru yang dihitung dari persamaan regresi linear yaitu y = 5,378.10-3 x -0,0564 sehingga diperoleh kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru sebesar 1311,3 ± 72,80 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang maksimum ( maks)

Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan absorbansi (daerah serapan) maksimum DPPH sehingga didapatkan hasil linearitas dari pengukuran kurva baku. Menurut Dehpour dkk., (2009), DPPH memiliki panjang gelombang maksimum, yaitu 517 nm dan memberikan warna violet. Hal ini tergantung dari instrumen yang digunakan untuk pengukuran, maka perlu dilakukan scanning pada panjang gelombang maksimum. Warna yang

ditimbulkan pada DPPH, karena DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Kromofor merupakan semua gugus atau atom yang dapat menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak, dimana merupakan gugus tak jenuh yang dapat menjalani transisi π→π* dan n→π* dan auksokrom adalah gugus yang tidak dapat

menjalani transisi π→π* tetapi dapat menjalani transisi elektron n) (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom radikal DPPH

Metode DPPH digunakan dalam menentukan aktivitas antioksidan karena merupakan metode yang cepat, efisien jika dibandingkan dengan deoksiribosa yang terlebih dahulu membentuk radikal hidroksil fenton dan perlu adanya penambahan sampel sehingga membutuhkan waktu lebih lama.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi larutan DPPH

maksimum hasil scanning(nm)

maksimum yang digunakan

(nm)

maksimum teoritis (nm)

0,02 mM 516

516 517

0,04 mM 515,5

0,08 mM 516

Penentuan panjang gelombang maksimum menggunakan tiga konsentrasi yaitu 0,020; 0,040; dan 0,080 mM dengan tujuan agar dapat mempresentasikan panjang gelombang maksimum dari setiap konsentrasi untuk pembuatan kurva baku. Absorbansi sampel dihitung dengan autozero menggunakan pelarut yang digunakan yaitu metanol yang bertujuan agar tidak ada gangguan serapan dari metanol dan kontaminan dari metanol yang digunakan. Hasil scanning panjang gelombang maksimum pada tiga konsentrasi diperoleh rata-rata sebesar 515,8 nm sehingga dibulatkan menjadi 516 nm dan menjadi panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran.

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), alasan penggunaan panjang gelombang maksimal, yaitu pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya maksimal sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar. Pada panjang gelombang maksimal jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang sangat kecil.

Gambar 14. Scanning panjang gelombang maksimum DPPH pada beberapa konsentrasi

2. Penentuan operating time

Penentuan operating time dilakukan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu optimum reaksi antara baku pembanding, yaitu kuersetin dan larutan uji berupa fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru terhadap reagen DPPH. Dasar dari penentuan operating time yaitu waktu ketika absorbansi baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil. Estimasi waktu yang dilihat, yaitu dalam waktu satu jam dengan selang waktu lima menit. Waktu akan dihitung setelah reagen DPPH dicampurkan baik pada baku pembanding ataupun larutan uji dan absorbansi pertama dihitung setelah lima menit pertama. Panjang gelombang maksimum yang digunakan merupakan hasil dari penetapan panjang gelombang maksimal, yaitu 516 nm.

Gambar 15 .Grafik penentuan operating time kuersetin (Replikasi 3)

Gambar 16. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru (replikasi 1)

Gambar 15 dan 16 merupakan grafik yang mewakili penentuan operating time dari ketiga replikasi dan dipiilih yang memiliki nilai r paling baik. Grafik penentuan OT kuersetin dipilih replikasi ketiga dengan nilai r = 0,9997, sedangkan fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru dipilih replikasi 1 dengan nilai r = 0,9924. Penentuan operating time baku pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat) diperoleh OT 30 menit. Penentuan

waktu operating time 30 menit karena pada waktu ini reaksi sudah bereaksi sempurna dan reaksi mulai stabil. Menurut Molyneux (2004) operating time 30 menit merupakan waktu yang sering digunakan dalam mereaksikan DPPH. Makin lama waktu penentuan operating time, maka semakin besar absorbansi yang dihasilkan.

H. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

Metode DPPH merupakan suatu metode uji kuantitatif untuk mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat kulit batang apel beludru. Badarinath dkk (2010) menyatakan bahwa metode DPPH memiliki beberapa keuntungan, yaitu efektif, teknik yang mudah dan cepat dalam pengerjaan penelitian karakteristik ekstrak tanaman, serta potensi sampel dapat diketahui.

Gambar 17. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan (Witt, Lalk, Hager dan Voigt, 2010)

Gambar 17 merupakan perubahan warna larutan reaksi DPPH dengan antioksidan. Molyneux (2004) menyatakan bahwa senyawa antioksidan akan mendonorkan H pada radikal DPPH sehingga DPPH menjadi tereduksi membentuk DPPH-H tereduksi. Perubahan DPPH menjadi DPPH-H tereduksi akan menyebabkan perubahan warna larutan DPPH yang semula berwarna ungu menjadi kuning yang diikuti dengan penurunan absorbansi DPPH yang digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan.

Pada tanaman dengan profil kandungan kimia satu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan kandungan kimia yang mirip (Muharni, 2010). Menurut Duke (2001) tanaman Diospyros virginiana L yang masih satu genus dengan apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) ditemukan adanya kuersetin (Duke, 2001).Peneliti menduga bahwa kulit batang apel beludru memiliki potensi sebagai antioksidan karena secara empiris tanaman apel beludru ini memiliki khasiat untuk mengobati luka, demam, disentri dan diare (Das dkk., 2010). Kuersetin merupakan senyawa flavonoid yang cukup kuat sebagai senyawa antioksidan.

Gambar 18. Struktur kuersetin (Apak dkk., 2007)

Parameter yang digunakan untuk mengetahui besarnya kemampuan senyawa sebagai antioksidan, yaitu IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa antioksidan yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50 % (Zou dkk., 2004). Menurut Rohman, dkk (2009) nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak atau fraksi uji dan % penangkapan radikal. Makin kecil nilai IC50 maka semakin aktif ekstrak atau fraksi (senyawa uji) tersebut sebagai penangkap radikal DPPH dan semakin aktif sebagai antioksidan.

Reaksi penghambatan radikal bebas DPPH oleh senyawa kuersetin dimulai dengan radikal bebas DPPH yang bereaksi dengan senyawa antioksidan akan mengikat H yang berasal dari antioksidan, yaitu kuersetin, sehingga sifat radikal bebas yang dimiliki DPPH menjadi hilang. DPPH-H yang tidak lagi berbentuk radikal maka delokalisasi elektron tidak terjadi sehingga intensitas warna menjadi berkurang. Reaksi lain yang mungkin muncul ketika kuersetin telah menjadi radikal yaitu transformasi dari radikal dengan DPPH maupun dimerisasi dengan sesama kuersetin sehingga terjadi polimerisasi.

Nilai IC50 fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru akan dibandingkan dengan nilai IC50 baku pembanding, yaitu kuersetin. Molyneux (2004) menyatakan bahwa pelarut metanol digunakan karena metanol terbukti tidak mengganggu (interferensi) dalam reaksi DPPH. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum yang didapatkan, yaitu 516 nm.

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi kontrol

Absorbansi

kuersetin % IC

Persamaan regresi linier

5,10 0,701 17,82

7,65 0,564 33,88

I 10,20 0,853 0,468 45,13 y = 5,2365x -7,786

12,75 0,345 59,55 r=0,9987

15,30 0,241 71,75

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi kontrol Absorbansi

kuersetin % IC

Persamaan regresi linier II 5,05 0,862

0,707 17,98

y =5,3620x -8,5773 r=0,9996

7,58 0,577 33,06

10,10 0,472 45,24

12,63 0,354 58,93

15,15 0,235 72,74

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi kontrol Absorbansi

kuersetin % IC

Persamaan regresi linier III 4,95 0,858

0,698 18,65

y =5,5988x -8,5157 r=0,9997

7,43 0,567 33,92

9,90 0,456 46,85

12,38 0,338 60,61

Kandungan fenolik total = x .

= 1229,41 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Sampel replikasi 2

Bobot sampel = 10,0 mg Absorbansi sampel = 0,662

y = 5,378.10-3x-0,0564 0,662 = 5,378 .10-3 x-0,0564

= 133,58 µg/mL

Kandungan fenolik total = x .

= 1335,80 mg ekivalensi asam galat per g fraksi.

Sampel replikasi 3

Bobot sampel = 10,1 mg Absorbansi sampel = 0,687

y = 5,378.10-3x-0,0564

0,687 = 5,378.10-3x-0,0564

Kandungan fenolik total = x .

=1368,71 mg ekivalensi asam galat per g fraksi

Lampiran 13. Uji Statistika

Uji Statistik dalam mengolah data menggunakan program R 2.14.1

a. Uji normalitas

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidarzil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Kulit Batang Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.) memiliki nama lengkap Theresia Nindyati Krissantini. Dilahirkan di kota Solo, 19 Mei 1991 dari pasangan Bapak Stephanus Robertus Suripto dan Fransisca Sri Maryati, S.Pd. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Indriyasana Solo pada tahun 1995 hingga 1997 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Pangudi Luhur II Solo pada tahun 1997 hingga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Pangudi Luhur Bintang Laut Solo pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMA Regina Pacis Solo pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif di BEMF Farmasi Periode 2012-2013 sebagai Koordinator Divisi Organisasi. Penulis juga aktif sebagai Asisten Dosen mata kuliah praktikum Formulasi Teknologi Sediaan Semisolid Liquid (2012) dan Asisten Dosen mata kuliah praktikum Farmasi Fisika (2013). Penulis juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: dalam kegiatan UKF Basket; dalam kepanitiaan seperti Panitia Pelepasan Wisuda (2009), Panitia Titrasi (2010, 2012), Panitia Pelantikan Apoteker (2011), Panitia Peringatan Dies Natalis ke-56 (2011).

xviii

INTISARI

Penyakit degeneratif dan gangguan fungsi dan struktur sel serta mutasi dapat disebabkan oleh radikal bebas. Salah satu cara untuk menangkal radikal bebas yaitu menggunakan antioksidan. Apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) diketahui memiliki kandungan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Penelitian ini bertujuan untuk penetapan kandungan fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan kulit batang apel beludru. Kulit batang apel beludru diekstrak menggunakan campuran metanol : air (9:1) dan (1:1) kemudian difraksinasi dengan etil asetat. Penentuan kandungan fenolik total menggunakan senyawa Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dalam massa ekivalen asam galat dan aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) yang dinyatakan dalam Inhibition Concentration (IC50).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak kulit batang apel beludru mempunyai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru sebesar 1311,3 ± 72,80 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat (taraf kepercayaan 95 %) dan aktivitas antioksidan sangat kuat yang dinyatakan dengan IC50 sebesar 14,3 ± 1,42 µg/mL (taraf

kepercayaan 95%).

Kata kunci : fraksi etil asetat kulit batang apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), DPPH, kandungan fenolik total, antioksidan

xix ABSTRACT

Degenerative diseases and disorders of cell structure and function, and mutations can be caused by free radicals. One way to counteract the free radicals using antioxidants. Velvet apple (Diospyros blancoi A. DC.) known to contain phenolic compounds that have antioxidant activity.

This study aimed at the determination of total phenolic content and antioxidant activity velvet apple of bark. Velvet apple bark was extracted using a mixture of methanol: water (9:1) and (1:1) and then fractionated with ethyl acetate. Determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu compounds are expressed in gallic acid equivalent mass and antioxidant activity using 1,1-diphenyl-2 pikrilhidrazil radical (DPPH) which is expressed in the

Inhibition Concentration (IC50).

The results showed that the ethyl acetate fraction of the velvet apple stem bark methanolic extract has a total phenolic content 1311.3 ± 72.80 mg gallic acid equivalents per gram fraction (95% confidence level) and antioxidant activity very strong expressed by IC50 14.3 ± 1.42 g / mL (95% confidence level).

Keywords: ethyl acetate fraction of the stem bark velvet apple (Diospyros blancoi