Tampilan Imunohistokimia Latent Membrane Protein-1 (LMP-1) Epstein-Barr Virus Pada Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut
57
LAMPIRAN 1
Alur Pikir
1. Lesi pada rongga mulut merupakan suatu reaksi akibat iritasi kronis yang secara
mikroskopis dijumpai perubahan sel berupa metaplasia dan displasia. Keadaan ini
masih bersifat reversible dan iritasi kronis dihilangkan maka sel ini dapat kembali
ke bentuk normal tapi pada keadaan iritasi yang terus-menerus, Sel displasia dapat
mengalami perubahan menjadi sel anaplasia yang dikategorikan sebagai
karsinoma. (Yen CY, Lu MC, Tzeng CC , 2009)
2. Karsinoma sel skuamosa merupakan tumor ganas yang berasal dari sel sepitel
skuamous. Neoplasma ganas disebut kanker dan istilah kanker digunakan untuk
menyebut neoplasma ganas khususnya jenis epiteal yaitu karsinoma.(M. Taha
Ma’ruf, 2007)
3. Di Medan menurut data penelitian yang didapat Octavia (2003) dan Puspasari
(2008) pada tahun 1997-2012 yang dilakukan di laboratorium patologi anatomi
Medan, didapatkan angka insidensi KSS rongga mulut adalah diantara 86%90,5% dari seluruh keganasan di rongga mulut
4. Etilogi terjadinya karsinoma sel skuamosa adalah faktor lokal (iritasi
kronis,trauma mekanis atau restotasi yang tidak tepat) Faktor luar ( kebiasaan
merokok,makanan dan status nutrisi, sinar UV, infeksi virus (HPV,EBV,HSV ) dan
jamur, debu industry) Faktor co-carcinogen Faktor yang membantu bahan kimia
lain untuk menimbulkan terjadinya keganasan seperti usia,jenis-kelamin,genetik.
(Taha Ma’ruf M ,2007)
5.
Pemeriksaan Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar
dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein
terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. (Ramos-Vara, 2005).
Universitas Sumatera Utara
58
6. EBV merupakan salah
satu
penyebab karsinoma sel skuamosa rongga
mulut.karsinoma sel skuamosa yang terjadi pada penduduk Okinawa jepang sudah
diteliti dan hasilnya ternyata terkait dengan infeksi EBV . (Higa et al, 2002)
7. Infeksi EBV sering terjadi,di Amerika serikat hampir 50% dari anak-anak yang
berumur di bawah lima tahun, dan 95% orang dewasa pernah mengalami infeksi
EBV. (Budhy TI 2005)
8. EBV diketahui sebagai salah satu penyebab utama dari terjadinya penyakit ini.
EBV memiliki potensial dan kemampuan untuk menjadi karsinogenesis (Budhy TI
2005)
9. Genom EBV yang berada pada sel inang berbentuk Latent episome. Dimana pada
latent episome terdapat gen antara lain Lmp-1,EBNA,EBER. (Budhy TI 2005)
10. EBV biasanya ditularkan melalui air liur yang terinfeksi dan memulai infeksi di
orofaring. replikasi virus terjadi pada sel epitel faring dan kelenjar ludah. EBV
adalah penyebab dari mononucleosis infeksiosa. Sel B yang terinfeksi virus
mensintesis imunoglobin. Mononukleosis merupakan transformasi poliklonal sel B.
selama perjalanan infeksi mayoritas penderita antibody heterofil.(M. Taha Ma’ruf
,2007)
11.Lmp-1 secara langsung berhubungan dengan oncogenesi karena Lmp-1 mempunyai
kemampuan menginhibisi terjadinya apoptosis dan dapat meningkatkan konsentrasi
Bcl 2 . Apoptosis merupakan hal penting dalam perkembangan dan homeostatsis
jaringan normal (Shao JY, 2004)
12. Lmp-1 mengaktifasi jalan NF-κB , lebih jauh lagi Lmp-1 menginduksi faktor proangiogenik seperti VEGF, FGF-2, MMP9, and COX2, yang memberi kontribusi
menjadi onkogenik. (Robbin and Cotran, 1999)
Universitas Sumatera Utara
59
13. EBV yang telah menginfeksi epitel akan menetap secara laten dan secara periodik menjadi aktif. Pada Hairy leukoplakia ditemukan partikel EBV sampai 100%
(Hu li Fu, 1995)
14. Lmp-1 merupakan gen laten EBV yang pertama ditemukan yang dapat
mentransformasi jalur sel dan merubah fenotip sel karena potensi onkogeniknya
(Yenita, Asri A, 2012)
15. EBV dapat menginfeksi oral mukosa yang laten. Tampilan Lmp-1 sebagai penanda
onkoprotein dari virus pada kasus EBV positif diindikasikan bahwa infeksi laten
bisa menjadi salah satu penyebab transformasi onkogeni dari oral ephitelium yang
terinfeksi. (Gonzalez M dkk , 2002)
Berdasarkan uraian diatas, maka peneliti ingin melakukan penelitian dengan
melihat tampilan produk gen latent membrane protein-1 (Lmp-1) pada kasus
karsinoma sel skuamosa rongga mulut. Dengan mengkaji ekspresi gen EBV pada
karsinoma sel skuamosa rongga mulut dapat digunakan sebagai upaya pencegahan
dini.
Masalah
Bagaimana tampilan immonohistokimia Lmp-1 yang dihasilkan EBV yang pada
KSS rongga mulut?
Universitas Sumatera Utara
60
Tujuan
1. Untuk melihat karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang menampilkan gen
latent membrane protein-1 (Lmp-1).
2. Untuk melihat tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada sub-tipe karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
3. Untuk melihat hasil tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
Manfaat
1. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk
mengetahui tampilan Latent membrane peotein-1 (Lmp-1) dengan Karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
2. Memberikan informasi mengenai EBV sebagai salah satu karsinogen
3. Data awal untuk penelitian lanjutan
Universitas Sumatera Utara
61
LAMPIRAN 2
Kerangka Teori
Kerusakan sel normal oleh:
• Khemis
• Radiasi
• Virus
Infeksi Epstein-barr virus
erusakan DNA yan
tidak dapat
diperbaiki
Sel Epitel normal
Peradangan
Mutasi gen
Aktivasi onkogenesis
Inaktivasi tumor
suppresor gen
Pencegahan apoptosis
Pre-kanker (Displasia)
Karsinoma Rongga mulut
Universitas Sumatera Utara
62
LAMPIRAN 3
Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 pada KSS rongga mulut
A
Gambar 1. Kontrol positif (kontrol internal)
hasil pewarnaan imunohistokia
Lmp-1 pada KSS rongga mulut
dengan tampilan warna coklat
paling kuat pada membran
(A).inti sel tumor pembesaran
40x (dokumentasi).
Gambar 2. Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 tampilan negatif pada
KSS rongga mulut pembesaran
40x (dokumentasi).
Universitas Sumatera Utara
63
A
Gambar 3. Hasil pewarnaan imunohistokimia
Lmp-1 yang tertampil sedang
pada (A) Inti sel KSS rongga
mulut
pembesaran
40x
(dokumentasi).
A
Gambar 4. Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 tertampil kuat pada
(A) Inti sel KSS rongga mulut
pembesaran 40x (dokumentasi).
Universitas Sumatera Utara
64
LAMPIRAN 4
Alat dan Bahan
Gambar 5. Tissue Embading centre compressor
cooled colid spot
Gambar 6. Semi motorized rotary microtome
Universitas Sumatera Utara
65
Gambar 7. Deparafinization and target retrieval PT Link DACO
A
B
C
Gambar 8. A. IHC diluent , B.antibodi monoclonal Lmp-1 ,
C. larutan kromogen DAB
Universitas Sumatera Utara
66
LAMPIRAN 5
5a. Pembuatan sediaan mikroskopis dari blok parafin.
1. Pemotongan Blok Parafin dengan Mikrotom
2. Potongan tipis parafin diambil menggunakan
spuit
3. Potongan tipis parafin dimasukkan ke dalam
waterbath
Universitas Sumatera Utara
67
4. Potongan tipis parafin ditempelkan ke kaca
objek
5. Slide diletakkan diatas hotplate
6. Slide yang telah dikeringkan diatas hotplate
dicelupkan ke dalam cairan xylol sebanyak 3
kali masing-masing 5 menit
Universitas Sumatera Utara
68
7. Slide dicelupkan ke dalam cairan alkohol
96%,80%,
8. Slide disusun di rak untuk dimasukkan ke
PT Link DACO
9. Setelah slide disusun di rak. Rak tersebut
dimasukkan ke dalam Deparafinazitaion
and target retrieval. kemudian waktu
diatur.
Universitas Sumatera Utara
69
5b. Proses Pemulasan Imunohisokimia antibodi Lmp-1
1. Pap Pen daerah disekeliling jaringan
2. Blocking dengan Peroksidase block
selama 10 menit
3. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
70
4. Blocking dengan Normal Horse serum
(NHS) 3% selama 15 menit
5. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
6. Blocking dengan antibodi primer
Lmp-1 (Ready to use) kemudian
inkubasi selama 1 jam.
7. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS)
pH 7,4 selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
71
8. Dako real Envision Rabbit 30 menit
9. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
10. Blocking dengan
DAB+ substrat
kromogen solution
dengan pengenceran
20 µ DAB:1000 µ
substrat selama
5 menit
Universitas Sumatera Utara
72
11. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
12. Counterstrain dengan Hematoxylin
selama 5 menit
13. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
14. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
Universitas Sumatera Utara
73
15. Dehidrasi dengan Alkohol
80%,96%,Abs selama masingmasing 5 menit
16. Clearing dengan Xylol 1,2,3 selama
masing-masing 5 menit
17. Mounting kemudian ditutup cover glass
Universitas Sumatera Utara
74
LAMPIRAN 6
Universitas Sumatera Utara
75
Universitas Sumatera Utara
LAMPIRAN 1
Alur Pikir
1. Lesi pada rongga mulut merupakan suatu reaksi akibat iritasi kronis yang secara
mikroskopis dijumpai perubahan sel berupa metaplasia dan displasia. Keadaan ini
masih bersifat reversible dan iritasi kronis dihilangkan maka sel ini dapat kembali
ke bentuk normal tapi pada keadaan iritasi yang terus-menerus, Sel displasia dapat
mengalami perubahan menjadi sel anaplasia yang dikategorikan sebagai
karsinoma. (Yen CY, Lu MC, Tzeng CC , 2009)
2. Karsinoma sel skuamosa merupakan tumor ganas yang berasal dari sel sepitel
skuamous. Neoplasma ganas disebut kanker dan istilah kanker digunakan untuk
menyebut neoplasma ganas khususnya jenis epiteal yaitu karsinoma.(M. Taha
Ma’ruf, 2007)
3. Di Medan menurut data penelitian yang didapat Octavia (2003) dan Puspasari
(2008) pada tahun 1997-2012 yang dilakukan di laboratorium patologi anatomi
Medan, didapatkan angka insidensi KSS rongga mulut adalah diantara 86%90,5% dari seluruh keganasan di rongga mulut
4. Etilogi terjadinya karsinoma sel skuamosa adalah faktor lokal (iritasi
kronis,trauma mekanis atau restotasi yang tidak tepat) Faktor luar ( kebiasaan
merokok,makanan dan status nutrisi, sinar UV, infeksi virus (HPV,EBV,HSV ) dan
jamur, debu industry) Faktor co-carcinogen Faktor yang membantu bahan kimia
lain untuk menimbulkan terjadinya keganasan seperti usia,jenis-kelamin,genetik.
(Taha Ma’ruf M ,2007)
5.
Pemeriksaan Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar
dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein
terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. (Ramos-Vara, 2005).
Universitas Sumatera Utara
58
6. EBV merupakan salah
satu
penyebab karsinoma sel skuamosa rongga
mulut.karsinoma sel skuamosa yang terjadi pada penduduk Okinawa jepang sudah
diteliti dan hasilnya ternyata terkait dengan infeksi EBV . (Higa et al, 2002)
7. Infeksi EBV sering terjadi,di Amerika serikat hampir 50% dari anak-anak yang
berumur di bawah lima tahun, dan 95% orang dewasa pernah mengalami infeksi
EBV. (Budhy TI 2005)
8. EBV diketahui sebagai salah satu penyebab utama dari terjadinya penyakit ini.
EBV memiliki potensial dan kemampuan untuk menjadi karsinogenesis (Budhy TI
2005)
9. Genom EBV yang berada pada sel inang berbentuk Latent episome. Dimana pada
latent episome terdapat gen antara lain Lmp-1,EBNA,EBER. (Budhy TI 2005)
10. EBV biasanya ditularkan melalui air liur yang terinfeksi dan memulai infeksi di
orofaring. replikasi virus terjadi pada sel epitel faring dan kelenjar ludah. EBV
adalah penyebab dari mononucleosis infeksiosa. Sel B yang terinfeksi virus
mensintesis imunoglobin. Mononukleosis merupakan transformasi poliklonal sel B.
selama perjalanan infeksi mayoritas penderita antibody heterofil.(M. Taha Ma’ruf
,2007)
11.Lmp-1 secara langsung berhubungan dengan oncogenesi karena Lmp-1 mempunyai
kemampuan menginhibisi terjadinya apoptosis dan dapat meningkatkan konsentrasi
Bcl 2 . Apoptosis merupakan hal penting dalam perkembangan dan homeostatsis
jaringan normal (Shao JY, 2004)
12. Lmp-1 mengaktifasi jalan NF-κB , lebih jauh lagi Lmp-1 menginduksi faktor proangiogenik seperti VEGF, FGF-2, MMP9, and COX2, yang memberi kontribusi
menjadi onkogenik. (Robbin and Cotran, 1999)
Universitas Sumatera Utara
59
13. EBV yang telah menginfeksi epitel akan menetap secara laten dan secara periodik menjadi aktif. Pada Hairy leukoplakia ditemukan partikel EBV sampai 100%
(Hu li Fu, 1995)
14. Lmp-1 merupakan gen laten EBV yang pertama ditemukan yang dapat
mentransformasi jalur sel dan merubah fenotip sel karena potensi onkogeniknya
(Yenita, Asri A, 2012)
15. EBV dapat menginfeksi oral mukosa yang laten. Tampilan Lmp-1 sebagai penanda
onkoprotein dari virus pada kasus EBV positif diindikasikan bahwa infeksi laten
bisa menjadi salah satu penyebab transformasi onkogeni dari oral ephitelium yang
terinfeksi. (Gonzalez M dkk , 2002)
Berdasarkan uraian diatas, maka peneliti ingin melakukan penelitian dengan
melihat tampilan produk gen latent membrane protein-1 (Lmp-1) pada kasus
karsinoma sel skuamosa rongga mulut. Dengan mengkaji ekspresi gen EBV pada
karsinoma sel skuamosa rongga mulut dapat digunakan sebagai upaya pencegahan
dini.
Masalah
Bagaimana tampilan immonohistokimia Lmp-1 yang dihasilkan EBV yang pada
KSS rongga mulut?
Universitas Sumatera Utara
60
Tujuan
1. Untuk melihat karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang menampilkan gen
latent membrane protein-1 (Lmp-1).
2. Untuk melihat tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada sub-tipe karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
3. Untuk melihat hasil tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
Manfaat
1. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk
mengetahui tampilan Latent membrane peotein-1 (Lmp-1) dengan Karsinoma sel
skuamosa rongga mulut.
2. Memberikan informasi mengenai EBV sebagai salah satu karsinogen
3. Data awal untuk penelitian lanjutan
Universitas Sumatera Utara
61
LAMPIRAN 2
Kerangka Teori
Kerusakan sel normal oleh:
• Khemis
• Radiasi
• Virus
Infeksi Epstein-barr virus
erusakan DNA yan
tidak dapat
diperbaiki
Sel Epitel normal
Peradangan
Mutasi gen
Aktivasi onkogenesis
Inaktivasi tumor
suppresor gen
Pencegahan apoptosis
Pre-kanker (Displasia)
Karsinoma Rongga mulut
Universitas Sumatera Utara
62
LAMPIRAN 3
Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 pada KSS rongga mulut
A
Gambar 1. Kontrol positif (kontrol internal)
hasil pewarnaan imunohistokia
Lmp-1 pada KSS rongga mulut
dengan tampilan warna coklat
paling kuat pada membran
(A).inti sel tumor pembesaran
40x (dokumentasi).
Gambar 2. Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 tampilan negatif pada
KSS rongga mulut pembesaran
40x (dokumentasi).
Universitas Sumatera Utara
63
A
Gambar 3. Hasil pewarnaan imunohistokimia
Lmp-1 yang tertampil sedang
pada (A) Inti sel KSS rongga
mulut
pembesaran
40x
(dokumentasi).
A
Gambar 4. Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 tertampil kuat pada
(A) Inti sel KSS rongga mulut
pembesaran 40x (dokumentasi).
Universitas Sumatera Utara
64
LAMPIRAN 4
Alat dan Bahan
Gambar 5. Tissue Embading centre compressor
cooled colid spot
Gambar 6. Semi motorized rotary microtome
Universitas Sumatera Utara
65
Gambar 7. Deparafinization and target retrieval PT Link DACO
A
B
C
Gambar 8. A. IHC diluent , B.antibodi monoclonal Lmp-1 ,
C. larutan kromogen DAB
Universitas Sumatera Utara
66
LAMPIRAN 5
5a. Pembuatan sediaan mikroskopis dari blok parafin.
1. Pemotongan Blok Parafin dengan Mikrotom
2. Potongan tipis parafin diambil menggunakan
spuit
3. Potongan tipis parafin dimasukkan ke dalam
waterbath
Universitas Sumatera Utara
67
4. Potongan tipis parafin ditempelkan ke kaca
objek
5. Slide diletakkan diatas hotplate
6. Slide yang telah dikeringkan diatas hotplate
dicelupkan ke dalam cairan xylol sebanyak 3
kali masing-masing 5 menit
Universitas Sumatera Utara
68
7. Slide dicelupkan ke dalam cairan alkohol
96%,80%,
8. Slide disusun di rak untuk dimasukkan ke
PT Link DACO
9. Setelah slide disusun di rak. Rak tersebut
dimasukkan ke dalam Deparafinazitaion
and target retrieval. kemudian waktu
diatur.
Universitas Sumatera Utara
69
5b. Proses Pemulasan Imunohisokimia antibodi Lmp-1
1. Pap Pen daerah disekeliling jaringan
2. Blocking dengan Peroksidase block
selama 10 menit
3. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
70
4. Blocking dengan Normal Horse serum
(NHS) 3% selama 15 menit
5. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
6. Blocking dengan antibodi primer
Lmp-1 (Ready to use) kemudian
inkubasi selama 1 jam.
7. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS)
pH 7,4 selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
71
8. Dako real Envision Rabbit 30 menit
9. Cuci dengan Tris Buffered saline
(TBS) pH 7,4 selama 5 menit.
10. Blocking dengan
DAB+ substrat
kromogen solution
dengan pengenceran
20 µ DAB:1000 µ
substrat selama
5 menit
Universitas Sumatera Utara
72
11. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
12. Counterstrain dengan Hematoxylin
selama 5 menit
13. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
14. Cuci dengan air mengalir selama
5 menit
Universitas Sumatera Utara
73
15. Dehidrasi dengan Alkohol
80%,96%,Abs selama masingmasing 5 menit
16. Clearing dengan Xylol 1,2,3 selama
masing-masing 5 menit
17. Mounting kemudian ditutup cover glass
Universitas Sumatera Utara
74
LAMPIRAN 6
Universitas Sumatera Utara
75
Universitas Sumatera Utara