POLIMORFISME GEN APOLIPOPROTEIN-B (APO-B) PADA TIKUS PUTIHYANG DffiERI PAKAN ATEROGENIKDAN KURKUMINOID EKSTRAKTEMULAWAK - repository civitas UGM
Prosiding Seminar Nasional PPDH
PENINGKATAN
KIJALITAS DOKTEB DEWAN
BEBBASIS RISET
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
21 Desember 2012
Presiding Seminar Nasional PPDH
PENINGIL\TAN
KUMITAS DOKTEB DllWAN
BEBBASIS BISET
Hak Cipta dilindungi oleh
Undang-undang Hak Cipta tahun 1987
Dilarang memproduksi dengan cara apapun
tanpa seijin tertu!is dari penerbit.
ISBN: 978-979-961114-6-I
Diterbitkan oleh :
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
21 Desember 2012
Pengolahan Feses Sapi Potong dan Sampah Organik secara Biokimiawi
/:;
Aris Purwantoro ....................................................................................... 185
Aktivitas Venom Ular Viper Hidung Pipih (Trimeresurns puniceus)
Pada Eritrosit Sapi
Slamet Rahrujo, Yanuartono, dan Soedarmanto Indrujulianto ...... ,.......... 195
Pengaruh Pemberian L-Carnitine Terbadap Bernt Badan, Berat Karkas
dan Lemak AbdomenAyam Pedaging
Antasiswa Windraningtyas Rosetyadewi, Sarifuddin Tato, Puspa Wlkan
Sari, Agustina Dwi Wijayanti, Gagak Dony Satria, Dwi Cahyo Budi
Setiawan ................. .................................................................................. 204
Respon Fisiologis Terhadap Profil Rasio Neutrofil/ Limfosit pada Sapi
Peranakan Ongo1e yang Ditransportasikan Selama Empat Jam
Retno Wulan Sari, Luthfiralda Sjahfirdi, Soedarmanto Indrujulianto,
Pudji Astnti ··················'······ ....................................................................... 211
Polimorfisme Gen Apoliprotein-B (Apo-B) pada Tikus Putih yang
Diberi Pakan Aterogenik dan Kurkuminoid Ekstrak Temu Lawak
Trini Susmiati, Rini Widaya_nti, Pamungkas Bagus Satriyo .................... 230
Potensi Daun Sambiloto terhadap Kesembuhan Luka Iris pada Anjing
Agus Budi Santosa, Slamet Rahrujo, dan Sri Hartati .............................. 241
Pengembangan Tanaman Obat sebagaiAlternatifPengobatan dan
Kewirausaha
Nurfina Aznam ........................................................................... .............. 251
Upaya dan Langkah-Langkah Pembebasan Brucellosis di Wilayah Keija
Balai Besar Veteriner Denpasar
I Ketnt Diarmita ........................................................................................ 259
Vlll
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
POLIMORFISME GEN APOLIPOPROTEIN-B (APO-B) PADA
TIKUS PUTIHYANG DffiERI PAKAN ATEROGENIKDAN
KURKUMINOID EKSTRAKTEMULAWAK
Trini Susmiati', Rini Widayanti', Pamungkas Bagus Satriyo'
' Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
'Mahasiswa Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gruljah Mada
ABSTRAK
Aterosklerosis dapat mempengaruhi dinding vaskular yang
menyebabkan tetjadinya penyakit arteri koroner dan stroke. Pemahaman akan
inflarnasi dan mekanisme imunologi merupakan faktor yang berpengaruh
terhadap inisiasi dan perkembangan lesi aterosklerosis. Low density
lipoprotein (LDL) termodifikasi merupakan salah satn imunogen yang
berperan dalam perkembangan aterosklerosis. Penelitian pendahuluan pada
tilrns yang dll>eri pakan aterogenik dan diinduksi ekstrak: kurlruminoid
temulawak: memperlihatkan adanya kenaikan kolesterol LDL manpun total
kolesterol plasma. Demikian juga apabila konsentrasiApolipoprotein-b (Apob) plasma tinggi menandakan lipoprotein aterogenik beredar dalam sirkolasi
darah. Tujuan penelitian ini untok mengkaji polimorfisme genApo-b dengan
tehnik PCR-RLFP menggukan enzim restriksi Rsa-1, pada DNA yang
menyandi gen Apo-b pada tikos putih yang diberi pakan aterogenik dan
kurkominoid ekstrak temulawak. Metode penelitian yang digunakan yaitu
DNA genom diisolasi dengan menggunakan kit-DNA (qiagen), DNA basil
isolasi diamplipikasi dengan menggunakan primer: Apo-B, F: 5,-AGG ACA
CCAAAACTGCATAT-3';Apo-B,R:5'CAGCATCCTTGT1TACCAGT-3'.
Hasil PCR kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi Rsa- 1. Profil
DNAhasilamplifikasiPCRdanrestrksienzimdianalisisdenganmenggunakan
elektrroforese gel agarosa 2%. Hasil penelitian diperolah bahwa, dari masingmasing kelompok memperlihatkan adanya polimorfisme pada gen apo-b
dengantehnik:PCR-RLFPmenggunakanenzimrestriksiRsa-1.
Kata Knnci: Apolipoprotein-b; Enzim Restriksi; Elektroforesis
230
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
POLYMORPHISM OF APOLIPOPROTEIN B (APO-B) GENE IN
RATS BEING FED WITH ATHEROGENIC FEED AND CURCUMA
EXTRACT CURCUMINOID
ABSTRACT
Atherosclerosis can affect vascular wall and cause coronary .disease
and stroke. Understanding upon inflammation and mechanism of immunology
is an influential factor on the initiation and development of atherosclerosis
lesion. Modified low desity lipoprotein (LDL) is one of immunogens that is
influential to the development of atherosclerosis. Initial research on rats fed
with atherogenic feed and induced with curcuma extract curcuminoid showed
the rise of WL as well as plasma total cholesterol, thus indicating that
Apolipoprotein-B (Apo-B) also circulates in the blood-stream. The putpose of
this research was to stody the polymorphism of Apo-B gene with the result of
DNA amplification being digested by restriction enzyme Rsa-1 at the DNA
expressing Apo-B gene on rats fed with atherogenic feed and curcuma extract
curcuminoid. Research method was initiated with isolation of DNA genome
using DNA-kit (Qiagen), then the DNA as the result of amplification was
amplified with primer: Apo-B, F: 5,-AGG ACA CCAAAA CTG CAT AT-3';
Apo-B,R: 5'CAGCATCCTTGTTTACCAGT-3'. TheresultoftbisPCR was
then digested with restriction enzyme Rsa-1. Profile ofDNA as the result of
PCR amplification and enzyme restriction was analyzed with electroforesis gel
agarose 2%. The result showed that each group showed polymorphism on gene
Apo-B withPCR-RLFPtechniqueusingrestrictionenzymeRsa-1.
Key words: Apolipoprotein-B, restriction enzyme, electrophoresis
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
231
PENDAHULUAN
Aterosk:lerosis merupakan kelainan degeneratif pada pembuluh darah
besar dan sedang yang dicirikan oleh penebalan pembuluh darah.
Aterosklerosis pada umumnya dapat menyerang arteri koronaria, aorta, iliaka,
femoral dan arteri serebralis (Ross & ·Glomset 1973). Pembentukaan plak
aterosklerosis diawali dengan tingginya kolesterol peredaran darah. Selain
kolesterol atau kolesterol .ester, pada lesi aterosklerosis terdapat juga protein,
karbohidrat, maupun komponen seluler termasuk sel ototpolos, makrofag, dan
Iimfosit (Kaplan & Aviram, 2001). Menurut Hansson (2009), aterosklerosis
merupakan penyakit intlamasi dan proses aterosk:lerosis dimulai saat LDL
terakumu,lasi di intima sehingga akan mengaktifkan sel-sel endotel dan
meningkatkan pengambilan monosit maupun seJ· T. Monosit akan
berdeferensiasi membentuk makrofag, mengubah lipoprotein dan pada
akhimya manjdi sel-sel busa, sedangkan sel T pada lesi akan
mengenali
antigen lokal yang berkontribusi pada pebentukan plak. Dalam metabolisme
lipoprotein, Ko!esterol dapat berasal dari hati atau dari lipoprotein seperti
remnant kilomikron. Lipid ini dibawa dari hati dalam bentuk VLDL yang
mengandung apo-b, apo-C danapo-E (Me. Namara,2000; Neste!, 1990).
Apolipoprotein-b (Apo-b) adalah protein yang merupakan bagian dari
kolesterol LD, walaupun fungsinya kurang dipahami, tingkat Apo-b yang
berkorelasi dengan kondisi genetik (hiperlipidemia) yang berkorelasi dengan
risiko lebih tinggi untuk penyakit jantung (Benn, 2009 ) . Apo-b merupakan
suatu parameter yang sangat menentukan teJjadinya suatu endapan Jemak.
Dilaporkan pada Quebec Cardiovascular Study, hila LDL- kolesterol rendah
232
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
dan Apo B tinggi maka akan teJjadi endapan lemak (Walldius dan Jungner,
2008).
Menurut Kwak eta!. (200 1), ada tiga komponen utama untuk teJjadinya
plak aterosklerosis: (1) se1 endotelial, sel otot po1os, makrofag, dan limfosit T;
(2)
matriks ekstraseluler jaringan konektivus;
dan (3) timbunan lipid
intrase1uler dan ekstrase1uler. Ketiga komponen tersebut dapatteJjadi di dalam
berbagai proporsi pada p1ak yang berbeda yang menggambarkan peningkatan
lesi. Khususnya serabut permukaan yang menyusun se1 otot polos yang
menebal dan sedikit meradang. Beberapa teori mengenai sifat aterogenisitas
sLDL yaitu: 1) afinitas sLDL terhadap reseptor LDL kurang dibandingkan LDL
normal; 2) sLDL cenderung diambil oleh dinding vaskuler perifer daripada di
hati;3) klirens melalui jalur reseptor bukan jalur yang dominan; 4) lamanya
waktu kontak antara sLDL dan sepanjang pembuluh darah endctel sehingga
menginduksi degenerasi oksidatif sLDL di endotel dan di sirkulasi darah.(StPierreetal., 2005; Yoshino eta!. 2002; Neste!, 1990).
Berbagai faktor penyebab utama dan derajat keparahan aterosklerosis,
serta mekanisme proses awal teJjadinya patogenesis aterosklerosis sudah
banyak diketabui dengan pasti. Namun seberapa jauh kemampuan
kurkurninoid/kurkurnin dapat menghambat aktivitas lipoproten teroksidasi
dan berpengaruh terhadap sel endote! (arteri koronaria tikus putih), padaproses
awal patogenesis aterosklerosis ditingkat seluler masih perlu diteliti.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
233
MATERIDANMETODE
Bahan yang digunakan: etanol absolut, , metanol, kloroform,
Phosphate Buffer Saline (PBS), Agarose, TAE Buffer, 6X Sample Loading
Buffer,DNA!adderstandard, KitDNAQiagen, TAEBuffer(4.84gTrisBase,
1.14ml GlacialAceticAcid, 2 ml 0.5MEDTA/pH 8.0), primer DNA Apo-b F:
5,- AGGACACCAAAACTGCATAT-3';Apo-b R: 5'CAGCATCCTTGT
TTACCAGT-3'
Alatyang digunakan: Sentrifus berkecepatanrendahBackman dengan
rotor swing Bucket 3750 rpm, Vortex, waterbath, Seperangkat Elektroforesa
(Electrophoresis chamber, Power supply, and combs) , Gloves, Pipette , tips,
mesinPCR.·
IsolasiDNAdanPCR
Isolasi DNA total. Sampel diambil dari darah ayam, kemudian
diekstraksi denganmenambahkan buffer ekstraksi (100 mM Tris-HCI, 20 mM
EDTA, 1.4 MNaCl, 2% CTAB, 1%mercapto-ethanol). Selanjulnya diinkubasi
pada suhU: 65°C, kemudian sampel disentrifus pada kecepatan 7600 rpm.
Selanjulnya dilakukan sesuai dengan prosedur yang ada pada Kit DNA
(Qiageu).
Amplifikasi DNA. Terdiri atas tiga tabap: Tahap denaturasi (melting),
kondisi suhu95°C, DNAmenjadi benangtonggal berlangsungselama3 menit.
Tahapannealing, primer(Apo-b F:5,- AGGACACCAAAACTGCATAT3'; Apo-b R:5'CAG CAT CCT TGTTTA CCA GT-3') meuempel pada bagian
234
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
DNA letakan yang komplementer urutan basanya,
pada suhu 58°C.
Penempelan ini bersifat spesifik dengan durasi tahap ini l-2 menit. Tahap
elongasi atau pemanjangan. Selama proses suhu yang digunakan 72 oc, selama
lmenit.
Hasil PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi {Rsa-l ).
Sebanyak
5 J!l
basil PCR, dimasukkan dalam tabuog volume 200 jli,
kemudian ditambah 1 J!l enzim restriksi Rsa-1 (berisi 10 uniU J!l), kemudian
ditambahkan l ,5 111 bufer enzim (satu paket dengan enzim restriksi Rsa-1 ), dan
2,5!11 dlf,O. Diinkubasi dalam penangas air (waterbatb) pada suhu 37° C
overnight. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi Rsa-1 dielektroforesis
dengan gel agarosa2%.
Elektroforesis DNA : Hasil PCR-RLFP selanjutnya dielektroforesis
menggunakan gel agarosa 2 %, dengan arus listrik 50 Volt selama 30 menit
Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan komposisi
2 J.1l DNA dan 1 J.1l loading buffer. Hasil elektroforesis diamati dengan
menggunakan sinarultraviolet
HASIL DAN PEMBAHASAN
Molekul DNA genom basil isolasi sel darah putih tikus yang diberi
pakan aterogenik 10% dan diberi ekstrak temulawak dengan berbagai
konsentrasi seperti terlihat pada Gambar I. Pada Gambar terlihat dengan jelas
pita DNAsetelah dilakukan elektroforesis.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
235
A
B
C
D
E
F
M
Gambar2. Profil DNA genom basil Elektroforess dengan agarose 2 % dari
sel darah merah tilrus putih yang dlberi pakan aterogenik dan
diinduksi dengankurlaiminoid ekstraktemulawak
Keterangan: A:
B :
C :
D:
E :
F :
kelompokkontrolpakan(pakannonnal);
kelompokkontrolekstrak(pakannonnal+ekstrak5%);
kelompokperlakuan pakankolesteroll 0% tanpa ekstrak;
kelompokperlak:uanpakankolesteroll00/o,ekstrak5%;
kelompokperlak:uanpakankolesterollO%, ekstrak:IO%;
kelompok perlak:uan pakan kolesterol 10% ,ekstrak 20%
dan
M: :inaikerDNA.
Amplifikasi DNA dilalrukan dengan menggunakan metode
Polymorphism Chain Reaction (PCR), dengan primer pimer F:5,- AGG ACA
CCAAAA CTG CAT AT-3'; dan R: 5'CAG CAT CCT TGT TTA CCA GT-3'.
PrimerinimerupakanprimeruntukgenApo-b.Profilgenhasilamplifikasidari
PCRdiamatidenganmenggunakan Ge1Agarosa2% (Gambai-2).
236
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
MABCMDEF
Gambar 2: Profil DNA ( Gen Apo b) basil PCR
Dalam penelitian ini, primer Apo-b dapat menempel pada DNA
cetakan terjadi pada suhu 58 'C. Hasillektroforesis, temyatapita DNA terletak
berkisar pada antara 200-300 bp.
Gen Apo-B merupakan gen penyandi
lipoprotein yang dapat menyebabkan aterosklerosis dan dapat berakibat fatal
babkan kematian. Ada dua jenis Apo-B yaitu Apo-B 100 dan Apo-B48.
Perubahan dalam metabolisme 1emak dan genetik predisposisi adalab faktor
risiko utama untuk arteri koroner penyakit. Variasi gen yang terlibat dalam
metabo1isme lipid dapat bertindak sinergis untuk memberikan perlindungan
terhadap faktor risiko. Dalam penelitian ini juga diharapkan tidak terjadi
mutasi pada gen yang menyandi apo B akibat terjadinya aterosklerosis, pada
kelompok yang dJ.oeri kurkuminoid ekstrak temulawak maupun kontrol tanpa
ekstrak. Evaluasi sensitivitas keberhasilan penelitian ini, dilakukan
pemotongan DNAhasilPCRyangmenyandi genApo-b dengan menggunakan
enzimRSa-1. Pemotongangen denganenzimRsa-1, sepertipada Gambar 3.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
237
Gambar 3: Profil DNA (GEN Apo b) basil restriksi Enzim Rsa 1.
Profil pita DNA sete1ah dipotong dengan enzim restriksi Rsa-1 dan
dielektroforesis, makake1ompok A, B, C, D, danE masing masing terbentok3
pita DNA, sedangkan ke1ompok F terdapat 4 pita DNA. Kondisi ini
menunjnkkan adanya · heterozigot dari masing-masing ke1ompok yang
dipero1eh dari kedua induk jantan dan betina, atau kemungkinan juga dipero1eh
akibat gen yang mengalami mutasi. Mutasi dapat diSebabkrul oleh berbagai
macam falctor seperti bahan kimia. Da1am penelitian ini kemungkinan akibat
pakan yang diberi kolesterol cukup tinggi. Penelitian yang dilakukan o1eh
Trini dkk. (2010), kurkuminoid 8 ppm yang diberikan padamakrofagMacaca
nemestrina lnainp11 menghambat oksidasi LDL secara in vitro. Dalam
penelitlan, dosis ekStrakkurkom.inoid 5 %, 10 % dan 20% yang
PENINGKATAN
KIJALITAS DOKTEB DEWAN
BEBBASIS RISET
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
21 Desember 2012
Presiding Seminar Nasional PPDH
PENINGIL\TAN
KUMITAS DOKTEB DllWAN
BEBBASIS BISET
Hak Cipta dilindungi oleh
Undang-undang Hak Cipta tahun 1987
Dilarang memproduksi dengan cara apapun
tanpa seijin tertu!is dari penerbit.
ISBN: 978-979-961114-6-I
Diterbitkan oleh :
Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
21 Desember 2012
Pengolahan Feses Sapi Potong dan Sampah Organik secara Biokimiawi
/:;
Aris Purwantoro ....................................................................................... 185
Aktivitas Venom Ular Viper Hidung Pipih (Trimeresurns puniceus)
Pada Eritrosit Sapi
Slamet Rahrujo, Yanuartono, dan Soedarmanto Indrujulianto ...... ,.......... 195
Pengaruh Pemberian L-Carnitine Terbadap Bernt Badan, Berat Karkas
dan Lemak AbdomenAyam Pedaging
Antasiswa Windraningtyas Rosetyadewi, Sarifuddin Tato, Puspa Wlkan
Sari, Agustina Dwi Wijayanti, Gagak Dony Satria, Dwi Cahyo Budi
Setiawan ................. .................................................................................. 204
Respon Fisiologis Terhadap Profil Rasio Neutrofil/ Limfosit pada Sapi
Peranakan Ongo1e yang Ditransportasikan Selama Empat Jam
Retno Wulan Sari, Luthfiralda Sjahfirdi, Soedarmanto Indrujulianto,
Pudji Astnti ··················'······ ....................................................................... 211
Polimorfisme Gen Apoliprotein-B (Apo-B) pada Tikus Putih yang
Diberi Pakan Aterogenik dan Kurkuminoid Ekstrak Temu Lawak
Trini Susmiati, Rini Widaya_nti, Pamungkas Bagus Satriyo .................... 230
Potensi Daun Sambiloto terhadap Kesembuhan Luka Iris pada Anjing
Agus Budi Santosa, Slamet Rahrujo, dan Sri Hartati .............................. 241
Pengembangan Tanaman Obat sebagaiAlternatifPengobatan dan
Kewirausaha
Nurfina Aznam ........................................................................... .............. 251
Upaya dan Langkah-Langkah Pembebasan Brucellosis di Wilayah Keija
Balai Besar Veteriner Denpasar
I Ketnt Diarmita ........................................................................................ 259
Vlll
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
POLIMORFISME GEN APOLIPOPROTEIN-B (APO-B) PADA
TIKUS PUTIHYANG DffiERI PAKAN ATEROGENIKDAN
KURKUMINOID EKSTRAKTEMULAWAK
Trini Susmiati', Rini Widayanti', Pamungkas Bagus Satriyo'
' Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada
'Mahasiswa Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gruljah Mada
ABSTRAK
Aterosklerosis dapat mempengaruhi dinding vaskular yang
menyebabkan tetjadinya penyakit arteri koroner dan stroke. Pemahaman akan
inflarnasi dan mekanisme imunologi merupakan faktor yang berpengaruh
terhadap inisiasi dan perkembangan lesi aterosklerosis. Low density
lipoprotein (LDL) termodifikasi merupakan salah satn imunogen yang
berperan dalam perkembangan aterosklerosis. Penelitian pendahuluan pada
tilrns yang dll>eri pakan aterogenik dan diinduksi ekstrak: kurlruminoid
temulawak: memperlihatkan adanya kenaikan kolesterol LDL manpun total
kolesterol plasma. Demikian juga apabila konsentrasiApolipoprotein-b (Apob) plasma tinggi menandakan lipoprotein aterogenik beredar dalam sirkolasi
darah. Tujuan penelitian ini untok mengkaji polimorfisme genApo-b dengan
tehnik PCR-RLFP menggukan enzim restriksi Rsa-1, pada DNA yang
menyandi gen Apo-b pada tikos putih yang diberi pakan aterogenik dan
kurkominoid ekstrak temulawak. Metode penelitian yang digunakan yaitu
DNA genom diisolasi dengan menggunakan kit-DNA (qiagen), DNA basil
isolasi diamplipikasi dengan menggunakan primer: Apo-B, F: 5,-AGG ACA
CCAAAACTGCATAT-3';Apo-B,R:5'CAGCATCCTTGT1TACCAGT-3'.
Hasil PCR kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi Rsa- 1. Profil
DNAhasilamplifikasiPCRdanrestrksienzimdianalisisdenganmenggunakan
elektrroforese gel agarosa 2%. Hasil penelitian diperolah bahwa, dari masingmasing kelompok memperlihatkan adanya polimorfisme pada gen apo-b
dengantehnik:PCR-RLFPmenggunakanenzimrestriksiRsa-1.
Kata Knnci: Apolipoprotein-b; Enzim Restriksi; Elektroforesis
230
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
POLYMORPHISM OF APOLIPOPROTEIN B (APO-B) GENE IN
RATS BEING FED WITH ATHEROGENIC FEED AND CURCUMA
EXTRACT CURCUMINOID
ABSTRACT
Atherosclerosis can affect vascular wall and cause coronary .disease
and stroke. Understanding upon inflammation and mechanism of immunology
is an influential factor on the initiation and development of atherosclerosis
lesion. Modified low desity lipoprotein (LDL) is one of immunogens that is
influential to the development of atherosclerosis. Initial research on rats fed
with atherogenic feed and induced with curcuma extract curcuminoid showed
the rise of WL as well as plasma total cholesterol, thus indicating that
Apolipoprotein-B (Apo-B) also circulates in the blood-stream. The putpose of
this research was to stody the polymorphism of Apo-B gene with the result of
DNA amplification being digested by restriction enzyme Rsa-1 at the DNA
expressing Apo-B gene on rats fed with atherogenic feed and curcuma extract
curcuminoid. Research method was initiated with isolation of DNA genome
using DNA-kit (Qiagen), then the DNA as the result of amplification was
amplified with primer: Apo-B, F: 5,-AGG ACA CCAAAA CTG CAT AT-3';
Apo-B,R: 5'CAGCATCCTTGTTTACCAGT-3'. TheresultoftbisPCR was
then digested with restriction enzyme Rsa-1. Profile ofDNA as the result of
PCR amplification and enzyme restriction was analyzed with electroforesis gel
agarose 2%. The result showed that each group showed polymorphism on gene
Apo-B withPCR-RLFPtechniqueusingrestrictionenzymeRsa-1.
Key words: Apolipoprotein-B, restriction enzyme, electrophoresis
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
231
PENDAHULUAN
Aterosk:lerosis merupakan kelainan degeneratif pada pembuluh darah
besar dan sedang yang dicirikan oleh penebalan pembuluh darah.
Aterosklerosis pada umumnya dapat menyerang arteri koronaria, aorta, iliaka,
femoral dan arteri serebralis (Ross & ·Glomset 1973). Pembentukaan plak
aterosklerosis diawali dengan tingginya kolesterol peredaran darah. Selain
kolesterol atau kolesterol .ester, pada lesi aterosklerosis terdapat juga protein,
karbohidrat, maupun komponen seluler termasuk sel ototpolos, makrofag, dan
Iimfosit (Kaplan & Aviram, 2001). Menurut Hansson (2009), aterosklerosis
merupakan penyakit intlamasi dan proses aterosk:lerosis dimulai saat LDL
terakumu,lasi di intima sehingga akan mengaktifkan sel-sel endotel dan
meningkatkan pengambilan monosit maupun seJ· T. Monosit akan
berdeferensiasi membentuk makrofag, mengubah lipoprotein dan pada
akhimya manjdi sel-sel busa, sedangkan sel T pada lesi akan
mengenali
antigen lokal yang berkontribusi pada pebentukan plak. Dalam metabolisme
lipoprotein, Ko!esterol dapat berasal dari hati atau dari lipoprotein seperti
remnant kilomikron. Lipid ini dibawa dari hati dalam bentuk VLDL yang
mengandung apo-b, apo-C danapo-E (Me. Namara,2000; Neste!, 1990).
Apolipoprotein-b (Apo-b) adalah protein yang merupakan bagian dari
kolesterol LD, walaupun fungsinya kurang dipahami, tingkat Apo-b yang
berkorelasi dengan kondisi genetik (hiperlipidemia) yang berkorelasi dengan
risiko lebih tinggi untuk penyakit jantung (Benn, 2009 ) . Apo-b merupakan
suatu parameter yang sangat menentukan teJjadinya suatu endapan Jemak.
Dilaporkan pada Quebec Cardiovascular Study, hila LDL- kolesterol rendah
232
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
dan Apo B tinggi maka akan teJjadi endapan lemak (Walldius dan Jungner,
2008).
Menurut Kwak eta!. (200 1), ada tiga komponen utama untuk teJjadinya
plak aterosklerosis: (1) se1 endotelial, sel otot po1os, makrofag, dan limfosit T;
(2)
matriks ekstraseluler jaringan konektivus;
dan (3) timbunan lipid
intrase1uler dan ekstrase1uler. Ketiga komponen tersebut dapatteJjadi di dalam
berbagai proporsi pada p1ak yang berbeda yang menggambarkan peningkatan
lesi. Khususnya serabut permukaan yang menyusun se1 otot polos yang
menebal dan sedikit meradang. Beberapa teori mengenai sifat aterogenisitas
sLDL yaitu: 1) afinitas sLDL terhadap reseptor LDL kurang dibandingkan LDL
normal; 2) sLDL cenderung diambil oleh dinding vaskuler perifer daripada di
hati;3) klirens melalui jalur reseptor bukan jalur yang dominan; 4) lamanya
waktu kontak antara sLDL dan sepanjang pembuluh darah endctel sehingga
menginduksi degenerasi oksidatif sLDL di endotel dan di sirkulasi darah.(StPierreetal., 2005; Yoshino eta!. 2002; Neste!, 1990).
Berbagai faktor penyebab utama dan derajat keparahan aterosklerosis,
serta mekanisme proses awal teJjadinya patogenesis aterosklerosis sudah
banyak diketabui dengan pasti. Namun seberapa jauh kemampuan
kurkurninoid/kurkurnin dapat menghambat aktivitas lipoproten teroksidasi
dan berpengaruh terhadap sel endote! (arteri koronaria tikus putih), padaproses
awal patogenesis aterosklerosis ditingkat seluler masih perlu diteliti.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
233
MATERIDANMETODE
Bahan yang digunakan: etanol absolut, , metanol, kloroform,
Phosphate Buffer Saline (PBS), Agarose, TAE Buffer, 6X Sample Loading
Buffer,DNA!adderstandard, KitDNAQiagen, TAEBuffer(4.84gTrisBase,
1.14ml GlacialAceticAcid, 2 ml 0.5MEDTA/pH 8.0), primer DNA Apo-b F:
5,- AGGACACCAAAACTGCATAT-3';Apo-b R: 5'CAGCATCCTTGT
TTACCAGT-3'
Alatyang digunakan: Sentrifus berkecepatanrendahBackman dengan
rotor swing Bucket 3750 rpm, Vortex, waterbath, Seperangkat Elektroforesa
(Electrophoresis chamber, Power supply, and combs) , Gloves, Pipette , tips,
mesinPCR.·
IsolasiDNAdanPCR
Isolasi DNA total. Sampel diambil dari darah ayam, kemudian
diekstraksi denganmenambahkan buffer ekstraksi (100 mM Tris-HCI, 20 mM
EDTA, 1.4 MNaCl, 2% CTAB, 1%mercapto-ethanol). Selanjulnya diinkubasi
pada suhU: 65°C, kemudian sampel disentrifus pada kecepatan 7600 rpm.
Selanjulnya dilakukan sesuai dengan prosedur yang ada pada Kit DNA
(Qiageu).
Amplifikasi DNA. Terdiri atas tiga tabap: Tahap denaturasi (melting),
kondisi suhu95°C, DNAmenjadi benangtonggal berlangsungselama3 menit.
Tahapannealing, primer(Apo-b F:5,- AGGACACCAAAACTGCATAT3'; Apo-b R:5'CAG CAT CCT TGTTTA CCA GT-3') meuempel pada bagian
234
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
DNA letakan yang komplementer urutan basanya,
pada suhu 58°C.
Penempelan ini bersifat spesifik dengan durasi tahap ini l-2 menit. Tahap
elongasi atau pemanjangan. Selama proses suhu yang digunakan 72 oc, selama
lmenit.
Hasil PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi {Rsa-l ).
Sebanyak
5 J!l
basil PCR, dimasukkan dalam tabuog volume 200 jli,
kemudian ditambah 1 J!l enzim restriksi Rsa-1 (berisi 10 uniU J!l), kemudian
ditambahkan l ,5 111 bufer enzim (satu paket dengan enzim restriksi Rsa-1 ), dan
2,5!11 dlf,O. Diinkubasi dalam penangas air (waterbatb) pada suhu 37° C
overnight. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi Rsa-1 dielektroforesis
dengan gel agarosa2%.
Elektroforesis DNA : Hasil PCR-RLFP selanjutnya dielektroforesis
menggunakan gel agarosa 2 %, dengan arus listrik 50 Volt selama 30 menit
Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan komposisi
2 J.1l DNA dan 1 J.1l loading buffer. Hasil elektroforesis diamati dengan
menggunakan sinarultraviolet
HASIL DAN PEMBAHASAN
Molekul DNA genom basil isolasi sel darah putih tikus yang diberi
pakan aterogenik 10% dan diberi ekstrak temulawak dengan berbagai
konsentrasi seperti terlihat pada Gambar I. Pada Gambar terlihat dengan jelas
pita DNAsetelah dilakukan elektroforesis.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
235
A
B
C
D
E
F
M
Gambar2. Profil DNA genom basil Elektroforess dengan agarose 2 % dari
sel darah merah tilrus putih yang dlberi pakan aterogenik dan
diinduksi dengankurlaiminoid ekstraktemulawak
Keterangan: A:
B :
C :
D:
E :
F :
kelompokkontrolpakan(pakannonnal);
kelompokkontrolekstrak(pakannonnal+ekstrak5%);
kelompokperlakuan pakankolesteroll 0% tanpa ekstrak;
kelompokperlak:uanpakankolesteroll00/o,ekstrak5%;
kelompokperlak:uanpakankolesterollO%, ekstrak:IO%;
kelompok perlak:uan pakan kolesterol 10% ,ekstrak 20%
dan
M: :inaikerDNA.
Amplifikasi DNA dilalrukan dengan menggunakan metode
Polymorphism Chain Reaction (PCR), dengan primer pimer F:5,- AGG ACA
CCAAAA CTG CAT AT-3'; dan R: 5'CAG CAT CCT TGT TTA CCA GT-3'.
PrimerinimerupakanprimeruntukgenApo-b.Profilgenhasilamplifikasidari
PCRdiamatidenganmenggunakan Ge1Agarosa2% (Gambai-2).
236
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
MABCMDEF
Gambar 2: Profil DNA ( Gen Apo b) basil PCR
Dalam penelitian ini, primer Apo-b dapat menempel pada DNA
cetakan terjadi pada suhu 58 'C. Hasillektroforesis, temyatapita DNA terletak
berkisar pada antara 200-300 bp.
Gen Apo-B merupakan gen penyandi
lipoprotein yang dapat menyebabkan aterosklerosis dan dapat berakibat fatal
babkan kematian. Ada dua jenis Apo-B yaitu Apo-B 100 dan Apo-B48.
Perubahan dalam metabolisme 1emak dan genetik predisposisi adalab faktor
risiko utama untuk arteri koroner penyakit. Variasi gen yang terlibat dalam
metabo1isme lipid dapat bertindak sinergis untuk memberikan perlindungan
terhadap faktor risiko. Dalam penelitian ini juga diharapkan tidak terjadi
mutasi pada gen yang menyandi apo B akibat terjadinya aterosklerosis, pada
kelompok yang dJ.oeri kurkuminoid ekstrak temulawak maupun kontrol tanpa
ekstrak. Evaluasi sensitivitas keberhasilan penelitian ini, dilakukan
pemotongan DNAhasilPCRyangmenyandi genApo-b dengan menggunakan
enzimRSa-1. Pemotongangen denganenzimRsa-1, sepertipada Gambar 3.
Prosiding Seminar Nasional PPDH FKH-UGM
237
Gambar 3: Profil DNA (GEN Apo b) basil restriksi Enzim Rsa 1.
Profil pita DNA sete1ah dipotong dengan enzim restriksi Rsa-1 dan
dielektroforesis, makake1ompok A, B, C, D, danE masing masing terbentok3
pita DNA, sedangkan ke1ompok F terdapat 4 pita DNA. Kondisi ini
menunjnkkan adanya · heterozigot dari masing-masing ke1ompok yang
dipero1eh dari kedua induk jantan dan betina, atau kemungkinan juga dipero1eh
akibat gen yang mengalami mutasi. Mutasi dapat diSebabkrul oleh berbagai
macam falctor seperti bahan kimia. Da1am penelitian ini kemungkinan akibat
pakan yang diberi kolesterol cukup tinggi. Penelitian yang dilakukan o1eh
Trini dkk. (2010), kurkuminoid 8 ppm yang diberikan padamakrofagMacaca
nemestrina lnainp11 menghambat oksidasi LDL secara in vitro. Dalam
penelitlan, dosis ekStrakkurkom.inoid 5 %, 10 % dan 20% yang