Identifikasi Mutasi Gen rpoB526 pada Myc

Identifikasi Mutasi Gen rpoB526 pada Mycobacterium tuberculosis yang
Diisolasi dari Pasien Tuberkulosis Paru RSUP Dr. Mohammad Hoesin
Palembang
Ella Amalia1, Lina Wahyuni Hrp2*, Yuwono1, Subandrate4
1. Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya
2.

Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya
3. Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya
Jl. dr. Moh. Ali Komplek RSMH Palembang Madang Sekip, Palembang, 30126, Indonesia
*Email: linaw23r@gmail.com

Abstrak
Tuberkulosis masih menjadi masalah kesehatan utama di Indonesia. Hal yang paling mengancam dari tuberkulosis ini
adalah munculnya strain M. tuberculosis yang resisten dengan obat antituberkulosis, seperti rifampisin. Resistensi
rifampisin terjadi karena adanya mutasi gen rpoB pada M. tuberculosis, terutama pada posisi kodon 526. Penelitian ini
dilakukan untuk mengidentifikasi mutasi gen rpoB526 yang berkaitan dengan resistensi rifampisin pada isolat
M.tuberculosis. Penelitian ini menggunakan 40 isolat Mycobacterium tuberculosis. Mutasi gen rpoB526 dideteksi
dengan teknik Multiplex Allele Specific PCR. Dari 40 sampel didapatkan genotip wild type dan mutant pada gen
rpoB526, masing masing sebanyak 18 (45 %), dan 12 (30 %) sampel. Sedangkan sisa sepuluh sampel lainnya belum
dapat ditentukan. Pada penelitian ini ditemukan 30 % isolat Mycobacterium tuberculosis yang mengalami mutasi pada

gen rpoB kodon 526.
Kata kunci: Mycobacterium tuberculosis, rpoB526, Resistensi, Rifampisin

Abstract
Identification of rpoB526 Gene Mutation in Mycobacterium tuberculosis Isolated from Pulmonary Tuberculosis
Patients RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang. Tuberculosis remains a major public health problem in
Indonesia. The most threatening aspect of tuberculosis is the emergence of anti-tuberculosis drug resistant strains of M.
tuberculosis, such as rifampicin. Rifampicin resistant is due to rpoB gene mutations in M. tuberculosis, especially at
position codon 526. This study was undertaken to identify rpoB526 gene mutation associated with rifampicin resistance
in M. tuberculosis isolates. This study used 40 isolates of Mycobacterium tubeculosis. The mutation of rpoB526 gene
was detected by Multiplex Allele Specific PCR technique. Of all the 40 samples, 18 (45%) and 12 (30%) samples were
found to be wild type and mutant genotype, respectively. While another ten amplification samples cannot be interpreted.
There were 30% Mycobacterium tuberculosis isolates that have a mutation in rpoB gene codon 526.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, rpoB526, Resistance, Rifampicin

1.

Pendahuluan

Tuberkulosis masih menjadi masalah kesehatan nasional di

Indonesia. Data WHO menempatkan Indonesia sebagai
negara dengan insiden TB terbanyak keempat setelah India,
China, dan Afrika Selatan 1. Setiap tahunnya didapatkan
250.000 kasus baru TB dan ada sekitar 100.000 kematian
karena TB yang terjadi di Indonesia 2.

Masih tingginya angka prevalensi TB di Indonesia
disebabkan pengobatan TB yang tidak mudah.
Pengobatan TB membutuhkan waktu yang lama
minimal 6 bulan, biaya yang besar dan pengawasan
yang ketat. Adapun aspek yang paling mengancam dan
rintangan dalam pengendalian TB yang efektif adalah
munculnya
kasus
–
kasus
resistensi
obat
antituberkulosis 3,4.

Salah satu kasus resistensi obat antituberkulosis yang
sering dilaporkan adalah resistensi terhadap rifampisin,
yang merupakan obat antituberkulosis lini pertama yang
sangat poten. Data mengenai resistensi rifampisin
menjadi semakin penting, mengingat 90 % isolat yang
resisten rifampisin juga resisten terhadap isoniazid 5,6.
Oleh karena itu, seringkali resistensi rifampisin
diasumsikan sebagai marker terhadap MDR-TB, yaitu
kondisi resistensi terhadap isoniazid dan rifampisin.
Berbagai penelitian telah melaporkan bahwa resistensi
rifampisin terjadi akibat adanya mutasi gen rpoB pada
Mycobacterium tuberculosis 7,8.
Mutasi pada gen rpoB menyebabkan resistensi pada
rifampisin. Sebanyak 96,1 % mutasi ditemukan pada
segmen 81-bp kodon 507-533 yang disebut RRDR atau
Rifampicin Resistance Determining Region 9,10. Lokasi
mutasi rpoB paling sering terjadi pada kodon 516, 526,
dan 531 10,11,12. Beberapa penelitian melaporkan mutasi
rpoB pada kodon 526 sebagai lokasi mutasi terbanyak
yang ditemukan 13,14,15.

Kondisi mutasi pada rpoB yang berkaitan dengan
fenotip resisten rifampisin pada M. tuberculosis yang
menyerang penderita TB merupakan informasi yang
sangat penting. Hal ini berguna untuk membangun
strategi diagnosis dan terapi untuk penatalaksanaan
kasus TB yang lebih baik. Oleh karena itu perlu
dilakukan suatu observasi lebih lanjut untuk
mengidentifikasi mutasi gen rpoB526 yang berkaitan
dengan resistensi rifampisin.

2.

Metode Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif
observasional yang dilakukan dari bulan Oktober 2014
sampai Januari 2015. Sampel yang gunakan berjumlah
40 sampel. Dua belas sampel dikumpulkan dari sputum
pasien yang melakukan pemeriksaan BTA di
laboratorium mikobiologi RSMH dan sisanya, sebanyak

dua puluh delapan sampel, diperoleh dari koleksi DNA
Mycobacterium tuberculosis yang disimpan di
laboratorium mikrobiologi RSMH Palembang.
Dilakukan ekstraksi DNA pada spesimen sputum yang
telah dikumpulkan. Ekstraksi DNA dilakukan dengan
teknik ekstraksi DNA-Chelex 100 yang menggunakan
PBS, safonin, dan Chelex.
DNA yang telah diisolasi dilakukan amplifikasi IS6110
untuk
mengkonfirmasi
keberadaan
strain
Mycobacterium tuberculosis, sebagai salah satu kriteria
inklusi sampel. Primer yang digunakan dalam penelitian
ini disajikan pada tabel 1. Reaksi amplifikasi dilakukan
pada volume 25 µl dari 9 µl ddH2O, 10 µl Gotaq Green
dan masing-masing 0,5 µl untuk primer reverse dan
forward serta 5 µl DNA template. Adapun kondisi untuk

amplifikasi IS6110 diatur dengan suhu denaturasi awal

95°C selama 5 menit, satu siklus 95°C selama 20 detik,
45°C selama 360 detik dan 72°C selama 120 detik,
diikuti 30 siklus dari suhu 95°C selama 20 detik, 62°C
selama 60 detik dan 72°C selama 180 detik 15.
Selanjutnya dilakukan proses elektroforesis dan
visualisasi untuk melihat apakah isolat dari spesimen
sputum tersebut positif terhadap IS6110 dalam artian
positif menunjukkan keberadaan strain Mycobacterium
tuberculosis.
Sampel yang menunjukkan hasil positif IS6110,
dilakukan pemeriksaan gen rpoB526 dengan teknik
Multiplex PCR. Sedangkan yang negatif, diekslusi.
Amplifikasi gen rpoB526 menggunakan tiga primer.
Tabel 1. Primer yang Digunakan untuk Amplifikasi IS6110
dan rpoB526 15,16.
Primer
F IS6110
R IS6110
F rpoB526
R rpoB526

I rpoB526

Sekuen
5’-CTCGTCCAGCGC-CGCTTCGG-3’
3’-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-5’
5’-GTCGCC GCGATCAAGGA-3’
5’-TGACCCGCGCGTACAC -3
5’-TGACCCGCGCGTACAC -3’

Pita
130 bp
249 bp
181 bp

Tiga primer yang digunakan pada amplifikasi rpoB
terdiri dari primer forward, reverse, dan inner yang
ditampilkan pada tabel 1. Adapun reaksi amplifikasi
rpoB526 dilakukan pada volume 25 µl dari 8,5 µl
ddH2O, 10 µl Gotaq Green dan masing-masing 0,5 µl
untuk primer reverse, inner dan forward serta 5 µl

DNA template. Reaksi PCR untuk identifikasi mutasi
pada rpoB526 berlangsung dalam tiga tahap berulang
dibawah kondisi berikut: denaturasi awal pada suhu
960C selama 3 menit, lalu 5 kali siklus pada suhu
950C selama 45 detik, 60 0C selama 1 menit, dan 72 0C
selama 30 detik. Lalu 5 siklus pada suhu 95 0C selama
40 detik, 59 0C selama 50 detik dan 72 0C selama 30
detik. Lalu 25 siklus pada 94 0C selama 50 detik, 55 0C
selama 40 detik dan 70 0C selama 30 detik, dengan
tahap elongasi terakhir pada suhu 72 0C Selama 3
menit 16.

3.

Hasil

Terdapat dua belas spesimen sputum yang
dikumpulkan berdasarkan hasil positif pemeriksaan
BTA. Keduabelas spesimen sputum tersebut
dilakukan amplifikasi terhadap gen IS6110 dan

didapatkan hasil bahwa seluruh sampel positif
terhadap IS6110. Hal ini menunjukkan hasil positif
keberadaan Mycobacterium tuberculosis berdasarkan
pemeriksaan PCR konvensional. Dengan demikian,
tidak ada sampel yang diekslusi, dan total sampel
yang digunakan tetap berjumlah 40 sampel. Hasil
visualisasi IS6110 ditampilkan pada gambar 1.

Gambar 2 menunjukkan hasil visualisasi amplikon gen
rpoB526 yang telah dilakukan.

4.

130 bp

Gambar 1. Visualisasi pada Amplikon IS6110
Keterangan: Nomor 1-12 = Nomor sampel. M = DNA Marker
50 bp. K+ = Kontrol positif. IS6110 positif membentuk pita
130 bp.

Gambar 2. Visualisasi amplikon gen rpoB 526.
Keterangan: M = DNA Marker 50 bp. 28-40 = Nomor sampel.
K- = kontrol negatif. Genotip Wild-type (249 bp dan 181 bp)
pada sampel 28, 31, 33, 36, dan 38. Genotip mutant (249 bp)
pada sampel 29, 30, 35, 37, 39, dan 40. Sampel not
determined tidak membentuk pita atau pita yang dibentuk
tidak spesifik pada sampel 32 dan 34.

Amplifikasi gen rpoB kodon 526 dilakukan pada
keseluruhan sampel yang berjumlah empat puluh
sampel. Dari 40 sampel, 18 sampel tergolong wild type
(WT), 12 sampel mutant (M). Sisanya, terdapat 10
sampel yang tidak dapat dianalisis. Delapan diantaranya
adalah sampel non amplifikasi yang tidak membentuk
pita atau band, sedang dua sampel lainnya membentuk
pita-pita non spesifik yang tidak dapat diinterpretasi.
Kesepuluh sampel yang tidak dapat dianalisis ini
digolongkan kedalam kategori not determined (ND).

Pembahasan

Gen rpoB merupakan gen pada Mycobacterium
tuberculosis yang mengkode pembentukan subunit β
dari RNA polimerase dependen DNA. Subunit-β dari
kompleks enzim RNA polimerase (RNAP) ini adalah
lokasi dimana rifampisin, yang merupakan obat poten
antituberkulosis lini pertama, bekerja aktif melawan
perkembangan dan fase statik dari Mycobacterium
tuberculosis. Dengan demikian, jika terjadi mutasi pada
gen rpoB, maka struktur RNAP yang dibentuk akan
mengalami perubahan konformasi yang dapat
mempengaruhi binding site dan/atau afinitas obat.
Akibatnya rifampisin tidak dapat bekerja pada tempat
kerja obat. Hal ini menjadi landasan tentang mekanisme
molekuler terjadinya resistensi rifampisin. Berbagai
penelitian telah membuktikannya melalui laporan
adanya mutasi gen rpoB pada 92,3 % - 98 % isolat
klinis Mycobacterium tuberculosis dengan fenotip
resisten terhadap rifampisin 7,8,11. Penelitian yang
dilakukan Wang et al melaporkan terdapat 98 % isolat
resisten rifampisin yang memiliki mutasi pada gen
rpoB, dan 86,86 % dari isolat tersebut mengalami
mutasi pada kodon 516, 526 dan 531 11. Mengenai
ketiga kodon ini, hampir semua laporan penelitian
sepakat bahwa kodon 516, 526, dan 531 merupakan tiga
kodon dengan lokasi mutasi rpoB yang paling sering
ditemukan.
Pada penelitian ini, observasi difokuskan terhadap
mutasi gen rpoB pada kodon 526. Amplifikasi gen rpoB
kodon 526 dilakukan pada keseluruhan sampel yang
berjumlah empat puluh sampel. Dari 40 sampel, 18
sampel tergolong wild type (WT), 12 sampel mutant
(M). Sisanya, terdapat 10 sampel yang tidak dapat
dianalisis. Delapan diantaranya adalah sampel non
amplifikasi yang tidak membentuk pita atau band,
sedang dua sampel lainnya membentuk pita-pita non
spesifik yang tidak dapat diinterpretasi. Kesepuluh
sampel yang tidak dapat dianalisis ini digolongkan
kedalam kategori not determined (ND).
Penelitian yang dilakukan oleh Mokrousov et al,
melaporkan dari 114 sampel, hanya 110 yang
menunjukkan hasil amplifikasi yang dapat dianalisis,
karena sisanya merupakan sampel nonamplifikasi 17.
Adanya sampel non amplifikasi berkaitan dengan
banyak
faktor.
Sampel
yang
nonamplifikasi
kemungkinan disebabkan karena sedikit atau tidak
adanya fragmen DNA target yang teramplifikasi pada
gen rpoB akibat adanya inhibitor polimerase pada
spesimen tersebut atau adanya perubahan susunan
nukleotida pada DNA target akibat mutasi yang
menyebabkan primer tidak dapat menempel dengan baik
17,18
. PCR merupakaan reaksi enzimatik, sehingga reaksi

pada PCR sensitif terhadap keberadaan inhibitor. Pada
penelitian ini beberapa substansi dari sampel yang
berpotensi sebagai inhibitor antara lain seperti, atau
debris-debris sel, garam atau substansi lain yang
terdapat pada sampel 19. Selain itu, amplifikasi juga
tergantung pada primer yang digunakan. Desain primer
dengan panjang lebih atau sekitar 20 nukelotida sangat
penting. Hal ini dimaksud untuk menurunkan
kemungkinan terjadinya perfect match pada sisi genom
lain. Primer yang tidak kuat ini dapat menimbulkan
produk amplifikasi palsu 20.Oleh karena itu, desain
primer yang baik merupakan proses yang sangat krusial.
Isolat pada penelitian ini menunjukkan adanya mutasi
gen rpoB526 pada 30 % sampel. Berbagai laporan Isolat
Pada penelitian ini didapat adanya mutasi gen rpoB526
pada 30 % sampel. Berbagai laporan menyatakan bahwa
mutasi gen rpoB pada kodon 526 dan 516 hampir selalu
menunjukkan fenotip yang resisten terhadap rifampisin
terhadap rifampisin 14. Berdasarkan asumsi ini, maka
ada sekitar 30 % isolat Mycobacterium tuberculosis
yang resisten terhadap rifampisin. Angka ini
kemungkinan bisa lebih besar atau lebih kecil karena
adanya 10 sampel lain yang belum dapat dianalisis.
Namun, secara tidak langsung hal ini dapat
merefleksikan fenomena resistensi rifampisin di RSMH.
Jika merujuk pada penelitian sebelumnya yang
melaporkan persentase resistensi rifampisin sebesar 7,14
% 21 dan 11,5 % 11, maka persentase yang diperoleh pada
penelitian ini bernilai lebih besar. Situasi ini dapat
dijelaskan salah satunya karena rendahnya tingkat
kepatuhan masyarakat untuk mengikuti protokol
pengobatan. Hayati melaporkan dalam penelitiannya sebesar
43 % pasien tidak patuh terhadap protokol pengobatan
tuberkulosis 22. Ketidakpatuhan dalam pengobatan
merupakan faktor risiko utama berkembangnya kasus
resistensi. Selain itu, pertimbangan bahwa Indonesia
merupakan negara endemis tuberkulosis, serta sampel yang
digunakan merupakan sampel dari pasien yang berobat di
layanan kesehatan tersier, rumah sakit pusat rujukan
provinsi, maka temuan hasil resistensi yang lebih tinggi
dapat dipahami.
Disisi lain, persentase mutasi gen rpoB526 sebesar 30 %
pada penelitian ini, sejalan dengan penelitian lain yang
telah dilaporkan sebelumnya. Salah satunya adalah
publikasi dari Li et al yang melaporkan persentase
mutasi rpoB kodon 526 cukup tinggi. Penelitian
dilakukan terhadap 84 spesimen sputum dengan suspek
TB yang positif menunjukkan keberadaan gen rpoB
pada pemeriksaan PCR, dan hasil penelitian
menunjukkan 51,2 % (n=43) sampel yang mengalami
mutasi pada gen rpoB kodon 526 14.
Adanya persentase yang beragam ini bisa terjadi karena
pengaruh strain yang diisolasi berasal dari wilayah yang
berbeda dan periode waktu pengumpulan yang berbeda 17.
Selain itu, kemungkinan keterbatasan sampel dan bias juga

harus dipertimbangkan. Lebih lanjut, penyebab perbedaan
hasil juga bisa karena pengaruh teknik deteksi yang
berbeda 21.

5.

Kesimpulan

Berdasarkan data hasil penelitian dan pembahasan
mengenai mutasi gen rpoB526 pada Mycobacterium
tuberculosis yang diisolasi dari pasien RSUP dr.
Mohammad Hoesin Palembang, maka dapat
disimpulkan bahwa 30 % dari keseluruhan sampel
mengalami mutasi pada gen rpoB526.

Ucapan Terima Kasih
Terima kasih kepada Ibu Venny S.Pd., M.Kes dari
laboratorium mikrobiologi RSMH Palembang, dan Ibu
Yeni Agustin, S.Si, M.Kes dari laboratorium biologi
molekuler FK Unsri atas an bantuannya selama
penelitian berlangsung.

Daftar Acuan
1. WHO. Global tuberculosis report 2013. Geneva,
Swis: WHO Document Production Services, 2013:
1-97.
2. Kartasasmita, CB. Epidemiologi tuberkulosis. Sari
Pediatri 2009; 11(2):124-128.
3. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Strategi
nasional pengendalian TB di Indonesia 2010-2014.
Jakarta, 2011: 1-80.
4. Makadia JS, Jain A, Patra SK, Sherwai BL, Khanna
A. Emerging trend of mutation profile of rpob gene
in MDR tuberculosis, North India. Ind J Clin
Biochem, 2012; 27(4): 370-374.
5. Kapur V, Li LL, Iordanescu S, Hamrick MR, Wanger
A, Kreiswirth BN, et al. Characterization by
automated DNA sequencing of mutations in the gene
(rpoB) encoding the RNA polymerase beta subunit
in rifampin-resistant Mycobacterum tuberculosis
strains from New York City and Texas. J Clin
Microbiol 1994; 32(4):1095-1098.
6. Fan X, Hu Z, Xu F, Yan Z, Guo S, Li Z. 2003. Rapid
Detection of rpoB gene mutations in rifampinresistant Mycobacterium tuberculosis isolates in
Shanghai by using the amplification refractory
mutation system. J Clin Microbiol, 41(3):993-997.
7. Telenti A, Imboden P, Lowrie D, Cole S, Colston
MJ, Matter L, Schopfer K, Bodmer T. 1993.
Detection of rifampicin-resistance mutations in
Mycobacterium tuberculosis. Lancet, 341: 647-650.
8. Suzuki Y, Katsukawa C, Inoue K, Yin Y, Tasaka H,
Ueba N, Maniko M. 1996. Mutations in rpoB gene
of rifampicin resistant clinical isolates of
Mycobacterium tuberculosis in Japan. J Jpn Assoc
Infect Dis 1996; 69:413-419.
9. McCammon MT, Gillette JS, Thomas DP, Srinivas
V, Ramaswamy, Graviss EA, et al. Detection of

rpoB mutations associated with rifampin resistance
in Mycobacterium tuberculosis using denaturing
gradient gen electrophoresis. Antimicrob Agents
Chemother 2005; 49:2200-2209.
10. Sun A, Fan X, Li L, Wang L, An W, Yan J. Rapid
detection of rpoB gene mutations in rif-resistant
M.tuberculosis
isolates
by
oligonucleotide
microarray. Biomed Environ Sci 2009; 22:253-258.
11. Wang S, Zhao B, Song Y, Zhou Y, Pang Y, Ou X, Li
Q, Xia H, Zhao Y. Molecular characterization of the
rpoB gene mutations of Mycobacterium tuberculosis
isolated from China. J Tuber Res 2013; 1(1):1-8
12. Zakham F, Chaoui I, Enchchaoui AH, Chetioui F, et
al. Direct sequencing for rapid detection of
multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis
strains in Morocco. Infect Drug Resist 2013; 6:208212.
13. Paluch-Oles’ J, Koziol-Montewka M, Magrys’ A.
Mutations in the rpoB gene of rifampin-resistant
Mycobacterium tuberculosis isolates from Eastern
Poland. New Microbiologica 2009; 32: 147-152.
14. Li J, Xin J, Zhang L, Jiang L, Cao H, Li L. Rapid
detection of rpoB mutations in rifampin resistant
M.tuberculosis from sputum samples by denaturing
gradient gel electrophoresis. Int J Med Sci 2012;
9:148-155.
15. Noviana H, Nurachman Z, Ramdani M, Noe A.
Multiplex PCR for rapid detection of rifampin and
isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis
Isolated from Bandung, Indonesia. Microbiol
Indones 2007; 1(3):114-118.
16. Khosravi AD, Goodarzi H, Alavi SY. Detection of
genomic mutations in katG, inhA and rpoB genes of

Mycobacterium
tuberculosis
isolates
using
polymerase chain reaction and multiplex allelespecific polymerase chain reaction. Brazil J Infect
Dis 2012; 16(1):57-62.
17. Mokrousov I, Otten, T, Vyshnevskiy B, Narvskaya
O. Allele-specific rpoB pcr assays for detection of
rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in
sputum smears. Antimicrob Agents Chemother 2003;
47(7): 2331-2235.
18. Maria LR, Bela B, Yasmon A. Deteksi mutasi gen
katG Mycobacterium tuberculosis dengan metode
PCR (polymerase chain reaction) – hidbbridisasi dot
blot menggunakan pelacak oligonukleotida bertanda
32
P. Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop dan Radiasi 2009;
5:54-67.
19. Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR
inhibitors – occurrence, properties and removal. J
Appl Microbiol 2012; 113:1014-1026.
20. Strachan T, Read AP. Human molecular genetics,
Edisi ke-2. New York: Wiley-Liss (Online), 1999.
(http://www.ncbi.nlm.nih.giv/books/NBK7571
diakses tanggal 18 Januari 2015).
21. Syaifudin M, Rosilawati M, Irawan H, Bela B.
Identifikasi Mycobacterium tuberculosis dan analisis
mutasi gen rpoB dan katG penyebab resistensi ganda
dengan teknik molekuler. Laporan Penelitian
Balitbang BATAN. Jakarta, 2007:1-15.
22. Hayati A. Evaluasi kepatuhan berobat penderita
tuberkulosis paru tahun 2010-2011 di Puskesmas
Kecamatan Pancoran Mas Depok. Skripsi Jurusan
Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Indonesia,
2011.