Terdapat 4 jenis utama teknik HPLC
Terdapat 4 jenis utama teknik HPLC, yaitu jenis HPLC fase normal [Normal-Phase Chromatography
(NP)], jenis HPLC fase terbalik [Reversed-Phase HPLC ( RP HPLC, RPLC)], jenis HPLC penukar Ion
[ Ion-Exchange Chromatography (IEC)] dan terakhir jenis HPLC Size-Exclusion Chromatography (SEC).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan
teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada
senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara
kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan
pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa
diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan,
resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan
aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta
dengan adanya kompetisi 2 fasa (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding
dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fasa diam akan bergerak
lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:
Bagan Alat HPLC
Keunggulan HPLC diantaranya adalah:
a.
Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada
suhu kamar.
b.
Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
c.
Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti
polimer.
Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu :
a.
Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini
menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut juga kromatografi fasa normal.
b.
Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi
ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam. Salah
satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa.
Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c.
Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan
saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan.
Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai
alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan
zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1)
Merupakan fasa yang stabil
2)
Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-solut
bervariasi.
3)
Kolom mempunyai umur panjang.
4)
Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5)
Lebih ekonomis.
d.
Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul yang
dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan tempat berikatan
dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan
terhadap permukaan penukar ion.
e.
Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran.
Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom. Molekul-molekul
yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah
volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat
molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul
2000 atau lebih.
Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain :
a.
Eluen (pelarut)
Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan
larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari gas/udara. Hal ini
dikarenakan:
1)
Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat mengakibatkan
tersumbatnya aliran pelarut tersebut.
2)
Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah volume
tetap yang dipakai akan terganggu.
3)
Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1)
Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2)
Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai fase
diam.
3)
Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4)
Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.
b.
Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :
1)
Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
2)
Keluaran yang bebas denyut
3)
Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 – 10 ml/menit
4)
Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik
5)
Tahan terhadap korosi.
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1)
Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya
kecil sekitar 35 – 400 μl, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi
gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan
solven.
2)
Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan
yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan
dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan
cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3)
Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi,
dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi
gradien.
c.
Injeksi sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat
menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya,
volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 μl.
Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringe yang
digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran dihentikan sementara saat injeksi dan
dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa gerak.
Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakan sampling
loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas beragam 0,5 hingga 500 μl (Skoog et
al., 1998)
d.
Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di
bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom
berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain.
Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm. Kolom dari jenis ini mempunyai
40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan
kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 – 5 μm.
Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm
dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah
solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous
particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau
polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis
polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 – 10 μm terbuat
dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian
dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap
permukaannya. (Skoog et al., 1998)
e.
Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1)
Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10 -8 hingga 10-15 gram zat
terlarut per pembacaan
2)
Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3)
Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4)
Waktu respon yang singkat
5)
Kemudahan pada penggunaan
6)
Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1)
Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk
meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil mungkin. Ukuran
volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan
tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki
detektor.
2)
Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer.
Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan filter untuk
mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik
dengan gratting sebagai monokromatornya.
3)
Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel
akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk
mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4)
Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi
terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah pada
penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5)
Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan
alir 10 – 50 μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada
analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.
(NP)], jenis HPLC fase terbalik [Reversed-Phase HPLC ( RP HPLC, RPLC)], jenis HPLC penukar Ion
[ Ion-Exchange Chromatography (IEC)] dan terakhir jenis HPLC Size-Exclusion Chromatography (SEC).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan
teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada
senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara
kromatografi gas.
Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya yaitu berdasarkan
pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2 komponen yang berbeda fasanya (fasa
diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan,
resin penukar ion, atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan
aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada temperatur rendah serta
dengan adanya kompetisi 2 fasa (gerak dan diam). Migrasi dari molekul komponen akan sebanding
dengan koefisien distribusinya, maka komponen dengan distribusi tinggi pada fasa diam akan bergerak
lebih perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.
Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk
mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.
Secara sistematik diagram alat HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:
Bagan Alat HPLC
Keunggulan HPLC diantaranya adalah:
a.
Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada
suhu kamar.
b.
Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
c.
Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti
polimer.
Jenis-jenis kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) yaitu :
a.
Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis kromatografi ini
menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut juga kromatografi fasa normal.
b.
Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi
ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam. Salah
satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa.
Karena keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
c.
Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan
saat ini. Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki persamaan.
Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai
alkil sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan
zat cair non polar.
Keuntungan kromatografi fasa terikat, yaitu :
1)
Merupakan fasa yang stabil
2)
Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-solut
bervariasi.
3)
Kolom mempunyai umur panjang.
4)
Memiliki keterulangan waktu retensi yang baik.
5)
Lebih ekonomis.
d.
Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul yang
dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan tempat berikatan
dengan fasa diam. Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan
terhadap permukaan penukar ion.
e.
Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran.
Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori paking kolom. Molekul-molekul
yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah
volume terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat
molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan senyawa-senyawa dengan berat molekul
2000 atau lebih.
Di bawah ini beberapa komponen-komponen KCKT secara umum, antara lain :
a.
Eluen (pelarut)
Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan
larutan yang digunakan untuk KCKT haruslah terbebas dari partikel-partikel dari gas/udara. Hal ini
dikarenakan:
1)
Adanya partikel dalam larutan bisa terbawa masuk ke dalam pompa, hal ini dapat mengakibatkan
tersumbatnya aliran pelarut tersebut.
2)
Udara yang masuk ke dalam pompa dapat mengganggu kestabilan pemompaan dan jumlah volume
tetap yang dipakai akan terganggu.
3)
Selain itu pada kolom dan detektor akan mengalami gangguan.
Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1)
Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.
2)
Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai fase
diam.
3)
Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4)
Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.
b.
Sistem Pemompaan
Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan :
1)
Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
2)
Keluaran yang bebas denyut
3)
Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 – 10 ml/menit
4)
Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik
5)
Tahan terhadap korosi.
Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1)
Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya
kecil sekitar 35 – 400 μl, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi
gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan
solven.
2)
Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan
yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan
dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan
cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3)
Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas
bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi,
dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi
gradien.
c.
Injeksi sampel
Sistem injeksi sampel merupakan keterbatasan dari sistem kromatografi cair. Masalah ini dapat
menyebabkan pelebaran puncak sebagai akibat kolom yang kelebihan kapasitas. Sebagai akibatnya,
volume injeksi harus dibatasi hingga kisaran maksimum 500 μl.
Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringe yang
digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi. Aliran dihentikan sementara saat injeksi dan
dikembalikan setelah sampel masuk ke aliran fasa gerak.
Metode pemasukkan sampel yang paling umum digunakan adalah dengan menggunakan sampling
loop. Seringkali disatukan dalam sistem KCKT dengan kapasitas beragam 0,5 hingga 500 μl (Skoog et
al., 1998)
d.
Kolom KCKT
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di
bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom
berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain.
Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm. Kolom dari jenis ini mempunyai
40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan
kinerja tinggi. Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 – 5 μm.
Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm
dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah
solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi
(chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular dan partikel berpori (porous
particle). Jenis pellicular terdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau
polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis
polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 – 10 μm terbuat
dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian
dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap
permukaannya. (Skoog et al., 1998)
e.
Detektor
Detektor ideal pada sistem KCKT mempunyai persyaratan :
1)
Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari 10 -8 hingga 10-15 gram zat
terlarut per pembacaan
2)
Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3)
Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4)
Waktu respon yang singkat
5)
Kemudahan pada penggunaan
6)
Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1)
Detektor Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom kromatografi. Untuk
meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam volume yang sekecil mungkin. Ukuran
volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel detektor mampu menahan
tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan diperlukan sebelum aliran memasuki
detektor.
2)
Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada spektrofluoro-fotometer.
Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri sebagai sumber cahaya dan filter untuk
mengisolasi panjang gelombang emisi radiasi. Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik
dengan gratting sebagai monokromatornya.
3)
Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel
akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk
mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4)
Detektor Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik. Perubahan arus akan dideteksi
terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah pada
penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5)
Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan
alir 10 – 50 μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada
analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa.