Analisis komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow menggunakan teknik kombinasi HPLC dan PCA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Analisis Komposisi Asam Amino Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Pada

Marshmallow Menggunakan Teknik Kombinasi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan PCA

(Principal Component Analysis)

SKRIPSI

HESTY PRISKA APRINA NIM : 108102000009

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA DESEMBER 2012

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Analisis Komposisi Asam Amino Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Pada

Marshmallow Menggunakan Teknik Kombinasi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan PCA

(Principal Component Analysis)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

HESTY PRISKA APRINA NIM : 108102000009

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA DESEMBER 2012

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Hesty Priska Aprina

NIM : 108102000009

Tanda Tangan :

ABSTRAK

Nama : Hesty Priska Aprina Program Studi : Farmasi

Judul :Analisis komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow menggunakan teknik kombinasi HPLC dan PCA

Gelatin sering digunakan secara luas dalam industri farmasi dan industri makanan. Dalam industri makanan, gelatin dapat digunakan dalam produk marshmallow yang berfungsi sebagai pembentuk gel dan penstabil. Mengkonsumsi produk yang berasal dari derivat babi tidak diperbolehkan bagi umat muslim. Untuk mengetahui perbedaan profil asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow digunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Teknik ini cepat dan dapat dipercaya untuk menganalisis asam amino pada gelatin dengan menggunakan detektor fluoresen. Sampel disiapkan dengan menghidrolisis marshmallow dengan HCl dan dilakukan derivatisasi dengan Aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC). Asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki kadar yang lebih tinggi daripada gelatin sapi. Teknik yang digunakan untuk mendeteksi dan mengklasifikasikan antara produk marshmallow yang berasal dari gelatin sapi dan gelatin babi adalah dengan menggunakan analisis komponen utama (PCA) berdasarkan profil asam amino gelatin. Berdasarkan analisis komponen utama didapatkan bahwa teknik ini mampu membedakan komposisi asam amino gelatin babi dan gelatin sapi dalam marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan sampel uji.

Kata kunci : gelatin sapi, gelatin babi, AQC, asam amino, analisis komponen utama (PCA)

ABSTRACT

Nama : Hesty Priska Aprina Program Studi : Farmasi

Judul : Analysis of Amino Acid Composition of Bovine Gelatin and Porcine Gelatin in Marshmallow Using a Combination of HPLC and PCA technique

Gelatin is widely used in the pharmaceutical industry and food industry. In food industry, gelatin can be used in a marshmallow product that serves as a gelling agent and stabilizer. Consume products derived from porcine derivatives prohibited for Muslims. To determine differences in the amino acid profile of bovine gelatin and porcine gelatin in marshmallows used High Performance Liquid Chromatography. This technique is fast and reliable for analysis of amino acids in gelatin using a fluorescent detector. Samples prepared to hydrolyze marshmallow with HCl and derivatization with Aminokuinolil- N- hidroksisuksini- midil carbamate (AQC). The amino acid glycine, proline and arginine in porcine gelatin had higher than bovine gelatin. The technique used to detect and classify between marshmallow products derived from bovine gelatin and porcine gelatin is to use principal component analysis (PCA) based on the amino acid profile of gelatin. Based on principal component analysis found that this technique was able to distinguish the amino acid composition of porcine gelatin and bovine gelatin in marshmallows are made from gelatin standards and test samples.

Keywords: bovine gelatin, porcine gelatin, AQC, amino acids, principal component analysis (PCA)

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmatnya saya dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Bapak.Drs.Umar Mansur selaku Ketua Jurusan Program Studi Farmasi

3. Ibu Zilhadia, M.Si, Apt selaku pembimbing I yang telah memberikan ilmu dan bimbingan selama penulisan skripsi ini.

4. Ibu Nurmeilis, M.Si, Apt, selaku pembimbing II yang telah memberikan masukan dan kemudahan selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

5. Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik yang telah membimbing dan memberikan pengarahan kepada saya selama masa perkuliahan.

6. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Teman teman zulfa, mega A, megawati, eva, inda dan nana yang telah membantu selama penelitian.

8. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Jakarta, November 2012

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Hesty Priska Aprina NIM : 108102000009 Program studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis karya : Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi / karya ilmiah saya, dengan judul :

ANALISIS KOMPOSISI ASAM AMINO GELATIN SAPI DAN GELATIN

BABI PADA MARSHMALLOW MENGGUNAKAN TEKNIK KOMBINASI

HPLC DAN PCA

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 28 Desember 2012 Yang menyatakan,

DAFTAR ISI

HALAMANJUDUL...ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS...iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ...iv

HALAMAN PENGESAHAN ... ...v

ABSTRAK ... ...vi

ABSTRACT ... ...vii

KATA PENGANTAR ... ...viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ... ...x

DAFTAR ISI ... ...xi

DAFTAR TABEL ... ...xii

DAFTAR GAMBAR ... ...xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... ...xiv

BAB I PENDAHULUAN ... ...1

1.1 Latar Belakang ... ...1

1.2 Rumusan Masalah... ...3

1.3 Tujuan Penelitian ... ...3

1.4 Manfaat Penelitian ... ...3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... ...4

2.1 Gelatin ... ...4

2.1.1 Pengertian Gelatin ... ...4

2.1.2 Tipe Gelatin ... ...6

2.1.3 Komposisi gelatin ... ...6

2.2 Protein ... ...7

2.3 Kolagen ... ...8

2.4 Marshmallow ... ...8

2.5 Asam Amino ... ...9

2.5.1 Pembagian asam amino ... ...10

2.5.2Analisis Asam Amino ... ...11

2.6 Analisis asam amino dengan HPLC ... ...12

2.6.1 HPLC ... ...13 Halaman

2.6.2 Analisis komponen utama (PCA) ... ...16

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... ...17

3.1 Lokasi dan waktu penelitian ... ...17

3.2 Alat dan Bahan ... ...17

3.2.1 Alat ... ...17

3.2.2 Bahan ... ...17

3.3 Prosedur kerja ... ...18

3.3.1 Pengumpulan produk marshmallow uji coba . ...18

3.3.2 Pembuatan marshmallow ... ...18

3.3.3 Ekstraksi asam amino ... ...18

3.4 Analisis data ... ...19

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... ...20

4.1 Penyiapan sampel ... ...20

4.1.1 Hidrolisis gelatin... ...20

4.1.2 Derivatisasi asam amino ... ...21

4.2 Analisis asam amino ... ...23

4.3 Analisis AA dalam gelatin dan dalam marshmalow ...27

4.4 Analisis PCA dari gelatin dan sampel marshmallow ...28

4.5 Analisis sampel marshmallow uji coba ... ...35

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... ...37

5.1 Kesimpulan ... ...37

5.1 Saran ... ...37

DAFTAR TABEL

Tabel . ... Halaman 2.1. Komposisi asam amino gelatin kulit sapi dan kulit babi ... . 5 2.2. Daftar rantai samping asam amino ... . 9 4.1. Hasil analisis asam amino gelatin dan marshmallow ... . 27

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Struktur asam amino dalam bentuk ion Zwitter ... . 10

Gambar 2 Diagram alat dan komponen KCKT... . 15

Gambar 3 Reaksi derivatisasi asam amino oleh AQC ... . 22

Gambar 4 Profil standar asam amino ... . 23

Gambar 5 Profil asam amino standar gelatin sapi ... . 24

Gambar 6 Profil asam amino standar gelatin babi ... . 24

Gambar 7 Profil asam amino marshmallow sapi ... . 25

Gambar 8 Profil asam amino marshmallow babi ... . 25

Gambar 9 Profil asam amino sampel uji 1 ... . 26

Gambar 10 Profil asam amino sampel uji 2 ... . 26

Gambar 11 Worksheet PCA ... . 29

Gambar 12 Window session hasil proses PCA ... . 30

Gambar 13 Scree plot PCA ... . 31

Gambar 14 Score plot PCA ... . 31

Gambar 15 Kurva biplot... . 33

Gambar 16 Kurva loading plot ... . 35

Gambar 17 Score plot PCA ... . 37

DAFTAR ISTILAH

PCA : Principal Component Analysis

AQC : Aminokuinolil-N-Hidroksisuksini-midilkarbamat AABA : α Aminobutyric Acid

BSG : Bovine Skin Gelatin

PSG : Porcine Skin Gelatin

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

FTIR : Fourier Transform Infra Red

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent assay

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Makanan adalah kebutuhan dasar bagi kehidupan manusia (Fadzlillah et al., 2011). Islam sebagai agama yang syamil sangat

memperhatikan faktor makanan. Hal ini tertulis didalam alqur’an surat Al

-Baqarah:168 yang memerintahkan manusia untuk memakan makanan yang halal dan toyib, karena itu sudah menjadi kewajiban seorang muslim untuk mengkonsumsi dan menggunakan produk yang halal (Mursydi, 2012).

Nemati et al (2004) telah berhasil melakukan pembedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor fluorosens, dan dikombinasikan dengan teknik kemometrik analisis komponen utama. Principal component analysis (PCA) adalah teknik proyeksi data yang sangat membantu dalam klasifikasi suatu objek (Miller and Miller, 2005).

Berdasarkan studi literatur, belum pernah dilaporkan penelitian mengenai analisis perbedaan gelatin sapi dan gelatin babi dalam marshmallow

berdasarkan komposisi asam amino. Pada penelitian ini analisis asam amino gelatin sapi dan babi dalam marshmallow dilakukan menggunakan HPLC dengan detektor fluorosens, lalu profil asam amino yang diperoleh dianalisis dengan PCA.

Derivat babi adalah salah satu alternatif yang sering digunakan dalam produk makanan, sehingga menjadikan produk makanan menjadi tidak halal jika dikonsumsi oleh umat muslim. Hal ini dikarenakan derivat babi memiliki harga yang jauh lebih rendah jika dibandingkan dengan sumber halal yang berasal dari sapi dan domba (Rohman, 2012). Diantara sekian banyak produk yang beredar yang rentan akan kehalalannya adalah produk berbasis gelatin. Gelatin adalah struktur ireversibel dari protein yang berasal dari kolagen dari tulang, kulit dan jaringan ikat hewan seperti babi, sapi, domba, unggas dan ikan.

Sumber produksi gelatin dunia adalah 46 % berasal dari kulit babi, 29.4 % kulit sapi, 23.1 % berasal dari tulang dan 1.5 % berasal dari sumber lain (Karim and Rajeev, 2009). Pada tahun 2011 produksi gelatin dunia mencapai 300.000 ton dan diperkirakan akan meningkat hingga 360.000 ton pada tahun 2015 (Yetim, 2011). Berdasarkan data ini dapat dilihat bahwa penggunaan bagian tubuh babi sebagai sumber gelatin merupakan hal yang harus diwaspadai.

Gelatin banyak digunakan karena gelatin memiliki karakteristik yang unik. Dalam industri makanan gelatin digunakan untuk pembuatan es krim, yogurt, keju, jelly, coklat, kue, permen, mentega, produk daging, makanan hewan dan marshmallow (Sahilah et al., 2012). Pada penelitian ini akan dilakukan analisis komposisi asam amino pada marshmallow. Marshmallow

merupakan makanan ringan sejenis permen yang mempunyai tekstur yang begitu lembut seperti busa, ringan, kenyal dan memiliki rasa yang manis dan aroma tertentu. Marshmallow ini sangat banyak dijual dipasaran dengan bentuk dan warna yang beraneka ragam (Sartika, 2009). Umumnya

marshmallow merupakan produk yang sangat disukai anak anak dan remaja (Trilaksani, 2009).

Menurut Nhari et al (2012) untuk menganalisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi pada produk makanan dapat dilakukan dengan menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra Red), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) dan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Sedangkan menurut penelitian yang dilakukan oleh Rohman (2012) metode analisis yang lebih akurat untuk mendeteksi kehalalan pada makanan adalah dengan menggunakan FTIR dan HPLC. Pada penelitian ini analisa dilakukan dengan menggunakan HPLC.

HPLC merupakan instrumen yang banyak digunakan untuk menganalisis asam amino dan ditunjang dengan peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom yang sangat efisien dan dibawah tekanan yang besar, sehingga analisis asam amino dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti (Rediatning et al., 1987).

1.1 Rumusan Masalah

Bagaimanakah perbedaan komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi dalam marshmallow menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang dikombinasikan dengan teknik principal component analysis (PCA) ?

1.2 Tujuan Penelitian.

Mengetahui perbedaan profil asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow.

1.3 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada produk

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Gelatin

2.1.1 Pengertian gelatin

Gelatin adalah protein yang berasal dari hidrolisis kolagen yang berasal dari jaringan ikat dan tulang vertebrata. Karena bentuknya seperti gel dan dapat digunakan sebagai stabilizer, gelatin umumnya digunakan sebagai bahan pengikat dalam berbagai macam produk makanan seperti marshmallow, permen dan daging. Dalam industri farmasi, gelatin digunakan untuk membuat kapsul keras, kapsul lunak, tablet, granulasi, suplemen makanan dan lapisan pelindung untuk obat-obatan (Cai hui et al., 2011).

Istilah gelatin mulai populer sekitar tahun 1700 dan berasal dari bahasa

latin ‘gelatus’ yang berarti kuat atau kokoh. Secara fisik gelatin berbentuk

padat, kering, tidak berasa dan transparan. Ada tiga sifat yang paling menonjol pada gelatin yaitu: kemampuan untuk membentuk gel, kekenyalan dan kekuatan lapisan tinggi. Gelatin merupakan polimer tinggi alami yang memiliki berat molekular dari 20.000 sampai 70.000. Gelatin ini dipersiapkan dari bahan yang mengandung kolagen termasuk kulit, tulang dan tendon dengan pemecahan hidrolisis melalui pendidihan dengan air atau dengan menggunakan uap panas yang tinggi. (Perwitasari, 2008).

Gelatin ini praktis tidak berbau, tidak larut dalam aseton, kloroform, etanol (95%), eter, dan metanol. Sifatnya yang larut dalam gliserin, asam, dan basa. Walaupun di dalam asam kuat atau basa kuat dapat menyebabkan pengendapan. Gelatin tidak larut dalam air dingin, tetapi hanya akan mengembang. Perendaman dalam air dingin menjadikan gelatin lunak dan berangsur-angsur menyerap air 5 sampai 10 kali bobot air. Gelatin larut dalam air panas. Setelah pendinginan sampai 35-40° C, gelatin akan membentuk gel. Pada suhu 40°C akan berbentuk sol (Singh et al., 2002).

Dalam industri makanan, gelatin merupakan suatu polimer yang larut air sehingga digunakan sebagai bahan untuk meningkatkan elastisitas, konsistensi dan stabilitas suatu produk makanan (Tavakolivour, 2011). Gelatin terutama mengandung asam amino glisin sebesar 33% , prolin 22% dan

hidroksiprolin 22 %. Gelatin komersial terdiri dari 84–90% protein, 8-12% air dan 2-4 % adalah garam mineral. Mayoritas bahan baku untuk pembuatan gelatin berasal dari kulit babi, walaupun gelatin juga bisa dihasilkan dari kulit dan tulang domba. Semua bahan yang digunakan dalam produksi gelatin berasal dari rumah pemotongan hewan. Gelatin berasal dari kolagen yang telah dihidrolisis ( Wolinsky, 2004 ).

Tabel 2.1 Komposisi asam amino gelatin kulit sapi dan kuilt babi (Nhari et al, 2011).

Komposisi asam amino mempengaruhi sifat fisika dan kimia gelatin. Analisis asam amino gelatin menunjukkan bahwa struktur molekul gelatin

memiliki perbedaan yang terlihat pada kandungan asam amino Asam amino BSG (residu per

1000 total residu asam amino )

PSG (residu per 1000 total residu

asam amino ) Non polar hidrofobik

Alanin Valin Leusin Isoleusin Fenilalanin Metionin Prolin Total 33 10 12 7 10 4 63 139 80 26 29 12 27 10 151 335 Polar tidak bermuatan

Glisin Serin Threonin Tirosin Total 108 15 10 2 135 239 35 26 7 307 Asam polar Asam aspartat Asam glutamat Total 17 34 51 41 83 124 Basa polar Lisin Arginin Histidin Total 11 47 Tidak terdeteksi 58 27 111 Tidakterdeteksi 138

(Nhari et al., 2011). Gelatin memiliki kadar asam amino yang rendah pada metionin, sistein dan tirosin. Hal ini disebabkan karena ketiga asam amino ini mengalami kerusakan karena hidrolisis pada proses pembuatan gelatin (Hafidz et al., 2011). Perbedaan komposisi asam amino pada gelatin kulit sapi dan kulit babi ditunjukkan oleh tabel 1.

Dari tabel 1 dapat dilihat bahwa komposisi asam amino dinyatakan sebagai residu per 1000 residu asam amino. Bovine skin gelatin (BSG) dan

Porcine skin gelatin (PSG) keduanya memiliki kandungan glisin, prolin dan arginin dalam jumlah yang tinggi. PSG mengandung jumlah asam amino glisin, prolin dan arginin yang lebih tinggi dibandingkan dengan BSG. Kedua gelatin memiliki jumlah tirosin yang rendah dan histidin tidak terdeteksi pada keduanya (Nhari et al., 2011).

2.1.2 Tipe gelatin

Gelatin dapat diklasifikasikan berdasarkan proses perendamannya yakni gelatin tipe A dan tipe B. Gelatin tipe A (asam) adalah gelatin yang biasanya secara khusus diproduksi dari kulit babi dan proses perendamannya menggunakan larutan asam. Gelatin yang diperoleh setelah melalui proses asam akan mempunyai titik isoeletrik antara pH 6 dan 9.

Gelatin tipe B merupakan gelatin yang diproduksi dari kulit sapi, kambing dan kerbau atau dari tulang binatang binatang yang sudah dihilangkan mineralnya (demineralised bones). Gelatin tipe B ini mempunyai titik isoelektrik antara pH 4,7 hingga 5 (Jaswir, 2007).

2.1.3 Komposisi Gelatin

Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir sepertiga dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyd). Struktur gelatin yang umum adalah:-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyd-Gly-Pro-. Kandungan 4Hyd berpengaruh terhadap kekuatan gel gelatin, makin tinggi asam amino ini, kekuatan gel juga lebih baik. Meskipun diturunkan dari protein hewani, gelatin tergolong sebagai protein dengan nilai biologis yang rendah dan sering juga dianggap protein tidak lengkap. Hal ini disebabkan

karena tidak adanya triptophan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).

2.2 Protein

Protein berasal dari kata proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh (Podjiadi,1994).

Protein merupakan salah satu kelompok bahan makronutrien. Tidak seperti bahan makronutrien lain (karbohidrat dan lemak), protein lebih berperan dalam pembentukan biomolekul daripada sebagai sumber energi. Meskipun demikian, bila organisme sedang kekurangan energi, maka protein ini juga dapat digunakan sebagai sumber energi. Protein merupakan polimer dengan asam asam amino sebagai monomer. Dua asam amino berikatan melalui ikatan peptida dengan melepas satu molekul air. Protein merupakan polipeptida yang pada bagian tengah adalah rantai panjag dengan salah satu ujungnya adalah gugus karboksilat dan ujung yang lainnya adalah gugus amina (Rohman, 2007).

Protein dapat diperoleh dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan yang berasal dari tumbuhan disebut protein nabati. Tumbuhan membentuk protein dari CO2 , H2O dan senyawa nitrogen. Hewan yang makan tumbuhan

mengubah protein nabati menjadi protein hewani. Disamping digunakan untuk pembentukan sel sel tubuh, protein juga dapat digunakan sebagai sumber energi apabila tubuh kita kekurangan karbohidrat dan lemak. Komposisi rata rata unsur kimia yang terdapat dalam protein adalah karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0 – 3 % dan fosfor 0 – 3 %. Protein mempunyai molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim , protein akan menghasilkan asam asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam asam amino ini terikat satu dengan lain oleh

ikatan peptida. Protein mudah dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH dan pelarut organik (Poedjiadi, 1994).

2.3 Kolagen

Kolagen merupakan komponen protein utama yang berlimpah didalam tubuh hewan, lebih dari sepertiga protein pada hewan adalah kolagen. Kolagen dapat ditemukan pada ruas ruas tulang belakang, jaringan kulit, otot dan diseluruh membran dasar pada tulang (Perwitasari, 2008).

Diantara protein hewani, kolagen merupakan yang terbanyak dengan jumlah 25 % dari total protein. Kolagen membentuk serat serat yang tidak larut yang terdapat sebagai protein struktural disegala tempat dalam organisme ,baik di dalam matriks maupun di dalam jaringan ikat (Koolman, 2001). Kolagen dapat ditemukan pada struktur alveolar dan diantara jaringan paru. Struktur molekular kolagen ini mempunyai karakteristik yang sangat baik. Molekul kolagen mempunyai tiga bentuk rantai polipeptida (rantai α ) yang

terbentuk dari triple helix. Selama kolagen berada pada rantai α ,residu dari

glisin, prolin dan hidroksiprolin muncul sebagai triplet dari gly –pro – x ( dimana x biasanya adalah hidroksiprolin ). Struktur ini akan terus terjadi perulangan selama berada dalam rantai polipeptida ( Gilberga, 2004 ).

2.4 Marshmallow

Marshmallow merupakan makanan ringan sejenis permen yang bertekstur seperti busa yang lembut, ringan, kenyal dalam berbagai bentuk, aroma, rasa dan warna. Marshmallow bila dimakan meleleh di dalam mulut karena merupakan hasil dari campuran gula atau sirup jagung, putih telur, gelatin dan bahan perasa yang dikocok hingga mengembang. Selama ini bahan utama marshmallow yang banyak digunakan berasal dari gelatin sapi atau babi. Gelatin dipandang memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan gum dan karagenan karena gelatin ternyata memiliki kekenyalan yang khas (Sartika, 2009).

2.5 Asam amino

Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein mempunyai gugus –

NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –COOH ( Podjiadi, 1994 ). Asam

amino dapat ditemukan pada keadaan bebas atau sebagai rantai linear pada peptida dan protein. Pada tabel 2 terdapat data rantai samping asam amino: Tabel 2.2. Daftar rantai samping asam amino (Bailey, 1990).

Bila suatu protein dihidrolisis dengan asam, alkali atau enzim maka akan dihasilkan campuran asam asam amino. Asam amino terdiri dari sebuah gugus amino, sebuah gugus karboksil , atom hidrogen , dan gugus R yang terikat pada sebuah atom C yang dikenal sebagai karbon alpha (Cα), serta gugus R merupakan rantai cabang. Asam amino dalam kondisi netral berada dalam bentuk ion dipolar atau disebut juga ion zwitter. Pada asam amino yang dipolar , gugus amino mendapat tambahan sebuash proton dan gugus karboksil terdisosiasi.

Asam

Amino Rantai Samping

Asam

Amino Rantai Samping Asam

aspartat —CH2—COOH Tirosin —CH2— —OH Serin —CH2—OH Lisin —(CH2)4—H2N

Glutamat —(CH2)2—COOH _Metionin —(CH2)2— SCH3

Glisin —H Valin —CH2(CH3)2

Histidin

N

—CH2—

NH

Fenilalanin —CH2—

Arginin

NH

—(CH2)3NH—C

NH2+ Isoleusin

—CH(CH3)—C2H5

Treonin —CHOH—CH3 _Leusin —CH2—CH(CH3)2

Gambar 1.Struktur asam amino dalam bentuk ion Zwitter (Copeland,1994 )

Derajat ionisasi dari asam amino sangat dipengaruhi oleh pH. Pada pH yang rendah misalnya pada pH 1, gugus karboksilnya tidak terdisosiasi , sedang gugus aminonya menjadi ion. Pada pH yang tinggi misalnya pada pH 11, karboksilnya terdisosiasi sedang gugus aminonya tidak ( Winarno, 1997 ). Asam amino yang ada pada gelatin adalah semua asam amino kecuali tryptophan. Dan memiliki kandungan asam amino yang rendah seperti metionin, cystine dan tyrosin karena asam amino ini telah terdegradasi ketika dihidrolisis. Kandungan asam amino dan urutan (sequence) dalam gelatin berbeda dari satu sumber dengan sumber yang lain, tetapi selalu terdiri dari glysin, proline dan hydroxiproline dalam jumlah yang besar (Hafidz ,et al).

2.5.1 Pembagian Asam Amino

Pembagian asam amino ini didasarkan pada struktur kimia dari rantai samping dan polaritas asam amino.Yang termasuk asam amino alifatik ( kelas I) adalah glisin, alanin, valin, leusin dan isoleusin.Rantai samping asam amino tersebut tidak mengandung hetero – atom (N, O, atau S) dan tidak mempunyai struktur cincin.Yang menonjol jelas dari rantai samping asam amino ini adalah sifat non polarnya.Yang juga bersifat non polar adalah asam amino yang mengandung sulfur yaitu sistein dan metionin ( kelas II ).

Asam amino aromatik ( kelas III) mengandung struktur cincin yang distabilkan secara mesomerik pada rantai samping. Pada kelompok kelas III ini hanya fenilalain yang jelas mempunyai sifat non polar.Tirosin dan triptofan cukup polar dan histidin mempunyai sifat sangat polar. Asam amino yang netral (kelas IV ) mengandung gugus hidroksil yaitu serin dan treonin. Atau mengandung gugus asam karbonat amida yaitu asparagin dan glutamin. Gugus karboksil dari rantai samping asam amino yang bersifat asam ,seperti asam

aspartat dan asam glutamat ( kelas V ) pada nilai pH fisiologik hampir seluruhnya terionisasi.

Juga rantai samping dari asam amino yang bersifat basa seperti lisin dan arginin ( kelas VI ) pada pH netral seluruhnya terprotonisasi. Asam amino yang sifat basanya sangat kuat dan karena itu menjadi sangat polar adalah arginin dengan gugus guanidinnya. Suatu pengecualian terdapat pada prolin yang dikelompokan dalam kelas VII. Rantai samping dari asam amino ini

bersama sama dengan atom C α dan gugus α-amino membentuk suatu cincin

segi lima (Koolman dan Heinrich, 1995 ).

2.5.2 Analisis Asam Amino

Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi adanya asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin dengan sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas, kemudian kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya. Hidrolisis dapat dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat, atau menggunakan enzim spesifik untuk memperoleh asam amino (Bailey ,1990 ).

Pada hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6M, suhu 1100 C dan waktu 24 jam. Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang tertutup. Sementara itu pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M pada 1000C. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein, serin dan treonin. Selain itu adapula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal sebagai peptidase. Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N. Tahap selanjutnya, yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah dengan cara kromatografi. Diantara teknik kromatografi yang dapat dilakukan untuk pemisahan yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi kertas, dan kromatografi cair kinerja tinggi ( Bailey ,1990 ).

Kromatografi penukar ion umumnya sangat efisien dalam memisahkan campuran asam amino. Metode ini menggunakan kolom penukar ion secara paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel sehingga teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis campuran asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan asam amino berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki afinitas kuat terhadap molekul air ,yang terbentuk oleh ikatan hidrogen dengan gugus OH pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat dipisahkan dengan sempurna dengan kromatografi kertas sederhana,maka kromatogram dua dimensi dapat dicoba. HPLC tidak umum digunakan pada pemisahan asam amino.Akan tetapi ,pemisahan asam amino dengan HPLC fase balik juga cukup efisien asalkan beberapa asam amino dibuat turunannya. Bahkan apabila derivat yang dipilih menjadi kromofor kuat pada daerah UV, analisis dengan HPLC menjadi cepat efisien dan sensitif ( Bailey ,1990 ).

2.6 Analisis Asam Amino dengan HPLC

Salah satu analisis asam amino adalah dengan kromatografi partisi cair cair atau sering disebut dengan metode HPLC. Metode ini akhir akhir ini banyak juga digunakan dalam analisis asam amino. Metode ini telah ditunjang oleh peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom yang efisien dibawah tekanan besar sehingga dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat. Untuk mendeteksi asam amino, dapat menggunakan detektor UV, sinar tampak, dan floresensi. Dalam hal ini asam amino harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya dapat membentuk derivat yang dapat menyerap cahaya UV, tampak atau fluoresensi (Rediatning, 1978 ).

Penggunaan alat HPLC ini dipilih karena alat ini kerjanya lebih cepat dan merupakan alat yang dapat diandalkan dalam pemisahan dan analisis kuantitatif pada makanan. Alat ini juga merupakan alat yang telah dikembangkan untuk mendeteksi adanya derivat babi dalam produk makanan (Rohman, 2012).

2.6.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / HPLC

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan cuplikan antara fase yang bergerak dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam dapat berupa zat cair atau zat padat. Kromatografi ini ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903 (Johnson dan Stevenson, 1991). HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan metode pilihan untuk analisis asam asam amino karena merupakan metode yang serba guna, mempunyai kapasitas yang tinggi, dan dapat dipercaya.

Karena kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel, maka asam asam amino tidak dapat dideteksi dengan menggunakan detektor spektrofotometer UV- Vis yang merupakan detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengembangkan prosedur prosedur derivatisasi yang membuat asam amino lebih mudah dideteksi. Suatu pereaksi penderivat harus mempunyai syarat syarat sebagai berikut :

a) Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri.

b) Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin.

c) Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi ( Abdul Rohman, 2007 ).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri makanan (Sudjadi, 2007).

High Performance Liquid Chromatography adalah jenis yang khusus dari kromatografi kolom. Metode ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase gerak ( Gottfried, 1988).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa senyawa tertentu seperti asam asam amino,asam asam nukleat,protein protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa aktif obat, proses hasil samping proses sintetis, memonitor sampel sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan suatu senyawa dalam suatu campuran (Sudjadi, 2007).

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut solut ini diatur oleh distribusi solut oleh fase gerak dan fase diam. Fase gerak haruslah mempunyai sifat yang murni, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan

memperoleh kembali cuplikan dan harganya cukup terjangkau. (Johnson dan Stevenson, 1991).

Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair.

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Gambar2. Diagram alat dan komponen HPLC (Sumber : Wiley, Practical User Guide )

Dari diagram alat diatas akan dijelaskan secara singkat komponen komponen

High Performance Liquid Chromatography:

1. Pompa :Fase gerak dalam HPLC sudah tentu zat cair dan untuk menggerakkannya melalui kolom diperlukan adanya pompa.

2. Injektor :Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. 3. Kolom :Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan

analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. 4. Detektor :Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen

cuplikan didalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berbunyi, rentang tanggapan linearnya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa (Johnson dan Stevenson, 1991). Keuntungan metode High Performance Liquid Chromatography

adalah :

1. Waktu analisis cepat

2. Mempunyai daya pisah yang baik dan Kolom dapat digunakan kembali 3. Peka dan Mudah memperoleh kembali cuplikan

4. Ideal untuk molekul besar dan ion ( Johnson dan Stevenson, 1991).

2.6.2 Analisis Komponen Utama ( PCA)

Principal component analysis (PCA) merupakan teknik yang diketahui paling baik untuk analisis multivariat. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Pearson pada tahun 1901 dan dikembangkan secara luas oleh Hotelling pada tahun 1933. Principal component analysis (PCA) adalah suatu teknik untuk mengurangi dimensi dari sekumpulan data yang terdiri dari sebagian besar variabel yang saling berhubungan (Jolliffe, 2002).

Principal component analysis digunakan untuk mengekstrak informasi penting dari suatu data dan menampilkan informasi tersebut sebagai variabel baru yang disebut principal component (komponen utama). Principal component tersebut didapatkan sebagai kombinasi linear dari variabel asal. Nilai dari variabel baru tersebut disebut factor scores (Abdi dan Wiliams,2010).

PCA dapat digunakan untuk menggambarkan hubungan suatu data untuk mengevaluasi hubungan antara variabel dan mengekstrak faktor yang dapat menyebabkan variasi pada variabel tertentu (Hilman et al., 2007). Hasil dari analisis principal component analysis adalah eigenvalue, variansi data dan PC loading (Stathis dan Myronidis, 2009). Teknik PCA ini telah diakui secara universal didalam ilmu kemometrik (Widyaninggar dan Rohman, 2012). Prinsip metoda PCA adalah melakukan pengurangan terhadap variabel variabel yang mempunyai korelasi, sehingga teknik PCA menjadi tidak bermanfaat apabila antar variabel tidak terdapat korelasi ( Miller and Miller, 2005).

Analisis komponen utama (PCA) digunakan dalam proses parameter puncak untuk mendapatkan komponen utama dan melakukan pengklasifikasian. PCA adalah suatu metode yang tidak disupervisi. Dalam analisis komponen utama terdapat komponen utama (PC1) dan komponen

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat Dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Saraswanti Indo Genetech, Bogor dan Laboratorium Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.Waktu pelaksanaan dari bulan September 2012 hingga November 2012.

3.2 Alat Dan Bahan 3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1 set perangkat

High Performance Liquid Chromatography (Waters), lemari pendingin (refrigerator), oven, neraca analitik, alat homogenizer, hote plat, labu ukur, erlenmeyer, kaca arloji , tabung reaksi bertutup, mikro pipet beserta tip nya, spatula, gelas ukur, beaker glass, vortex, inkubator, pipet tetes, pinset, syringe filter, termometer, membran filter 0,45 µm ,vial, cawan porselen, batang pengaduk.

. 3.2.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: standar asam amino yaitu: asam L- aspartat, L- serin, asam L- glutamat, glisin, L- histidin, L- arginin, L- treonin, L-alanin, L- prolin, L- sistein, L- tirosin, L- valin, L- metionin, L- lisin, L- isoleusin, L- leusin, L- fenilalanin, triptofan, standar gelatin sapi (sigma aldrich), standar gelatin babi (sigma aldrich), internal standar AABA (alpha amino butiric acid), Accq-fluor borat, reagen fluor A, HCl, asetonitril grade HPLC, Sampel marshmallow, pati jagung, sukrosa, glukosa, dan pewarna makanan, aquabidest.

3.3 PROSEDUR KERJA

3.3.1. Pengumpulan produk marshmallow uji coba

Sampel yang digunakan terdiri dari 2 sampel produk marshmallow

uji coba

3.3.2. Pembuatan marshmallow dari gelatin babi dan gelatin sapi

Ditimbang masing masing sebanyak 3.5 gram gelatin sapi dan gelatin babi. Gelatin dibasahi dengan 15 ml air dan diaduk diatas penangas listrik. Ditempat yang terpisah sukrosa sebanyak 5 gr, glukosa sebanyak 2 gr dan amilum sebanyak 0,25 gr dibasahi dengan 10 ml air dan diaduk diatas penangas ±7 menit. Kemudian pindahkan kedua adonan ke dalam alat homogenizer lalu dilakukan pengadukan dengan homogenizer hingga merata dan mengembang selama 15 menit. Lalu dilakukan penambahan flavour dan setelah itu dilakukan penuangan ke dalam wadah dan didiamkan selama 5 jam dalam refrigerator sampai menjadi marshmallow.

3.3.3. Ekstraksi asam amino dari produk marshmallow dengan hidrolisis menggunakan HCl 6N pada suhu 1100C selama 22 jam

Sebanyak 0,1 gram sampel marshmallow dihidrolisis dengan menggunakan larutan HCl 6 N sebanyak 5 ml, vortex. Lalu dialiri Nitrogen dan di oven pada suhu 1100C selama 22 jam. Setelah dihidrolisis, campuran didinginkan pada suhu ruang. Pindahkan isi tabung reaksi bertutup ke dalam labu ukur 50 ml, tambahkan aquabides sampai tanda batas. Saring dengan filter 0,45µm. Pipet 500 µl filtrat lalu tambahkan 40 µl AABA (alpha aminobutyric acid) dan 460 µl aquabides. Pipet 10 µl larutan, tambahkan 70 µl AccQ Fluor borate, vortex. Tambahkan 20 µl reagen fluor A, vortex, diamkan selama 1 menit. Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu suntikkan pada HPLC. Dengan kondisi kromatografi menggunakan kolom C18, temperatur 370C, fase gerak asetonitril 60% dan 40 % air , detektor fluoresen, laju alir 1 ml/ menit dan volume penyuntikan 5µl.

3.4 Analisis data

Analisis komposisi masing masing asam amino dalam sampel dapat dihitung dengan perhitungan :

Kadar asam amino dalam (mg / 100 gram)

(Area komponen / area AABA)sampel x Cstd x BM x fp x 100%

(Area komponen / area AABA)standar x 1000000 x gr x 1000

Dan untuk analisis komponen utama (PCA) dilakukan dengan perangkat lunak Minitab versi 15. Nilai persen tinggi puncak masing masing asam amino adalah variabel variabel yang akan dimasukkan ke dalam analisis data statistik dengan PCA.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1Penyiapan sampel

Dalam penelitian ini sampel disiapkan dengan membuat

marshmallow dari gelatin sapi standar dan gelatin babi standar.

Marshmallow dibuat dengan menambahkan sukrosa, air, glukosa, amilum dan penambahan flavour pandan. Marshmallow yang dihasilkan berwarna hijau, kenyal, mempunyai rasa manis, dan meleleh di mulut saat dimakan. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Nemati et al, analisa kandungan asam amino gelatin sapi dan gelatin babi dilakukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Sebelum dilakukan analisis asam amino menggunakan HPLC, sampel gelatin sapi standar, gelatin babi standar, dan sampel marshmallow dipersiapkan untuk dipreparasi terlebih dahulu sebelum di injeksikan kedalam HPLC dengan cara menghidrolisis gelatin menjadi asam amino – asam amino penyusunnya dan menderivatisasinya agar menghasilkan derivat yang mampu berfluoresensi.

4.1.1 Hidrolisis gelatin

Hidrolisis dilakukan dengan menimbang sampel sebanyak 0,1 gram kemudian dimasukan ke dalam tabung bertutup ulir lalu dihidrolisis menggunakan HCl 6N dengan konsentrasi 2%, kemudian dialiri sedikit gas nitrogen untuk mencegah terjadinya oksidasi pada sampel setelah itu dimasukkan ke dalam oven pada suhu 1100C selama 22 jam. Setelah dihidrolisis campuran didinginkan pada suhu ruang. Kemudian isi tabung dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan aquabides sampai tanda batas sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,2%. Hasil dari proses hidrolisis akan menghasilkan asam amino dalam keadaan bebas. Hasil hidrolisis menghasilkan larutan hitam kecoklatan, sehingga tidak bisa langsung di injeksikan kedalam HPLC. Sebelum dilakukan injeksi kedalam alat HPLC hasil hidrolisis di filter terlebih dahulu dengan

menggunakan membran filter berpori 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dari komponen lain yang dapat mengganggu proses pada saat analisis dan menghilangkan zat yang dapat merusak kolom HPLC. Setelah proses filtrasi menggunakan membran filter 0,45 µm, larutan akan terlihat bening dan bersih.

Setelah itu dipipet 500 µl filtrat lalu ditambahkan 40 µl AABA (alpha aminobutyric acid) dan 460 µl aquabides sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,1%. Hidrolisis ini dilakukan untuk melepaskan asam amino - asam amino yang terdapat dalam gelatin, yaitu melalui pemotongan ikatan peptida asam amino penyusun gelatin. Selama proses hidrolisis ini, hubungan antara ikatan rantai polipeptida dari kolagen dengan ikatan rantai polipeptida yang lain akan menjadi terpisah. Hal ini disebabkan karena rusaknya struktur fibrosa dari kolagen (See et al., 2010).

Asam amino yang dilepaskan selanjutnya akan dianalisis berdasarkan profil asam amino gelatin yang akan menjadikan pedoman dalam pembedaan sumber gelatin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh nemati et al., hidrolisis dilakukan dengan menggunakan HCl karena HCl dapat memecah ikatan peptida secara sempurna (Masuda dan Domae, 2011).

4.1.2 Derivatisasi asam amino

Derivatisasi asam amino dilakukan dengan menambahkan 70 µl AccQ fluor borat dan 20 µl reagen fluor A ke dalam 10 µl filtrat dengan konsentrasi 0,01%. Kemudian vortex dan diamkan selama 1 menit. Lalu inkubabasi pada suhu 550C selama 10 menit dan disuntikan pada HPLC. Asam amino adalah senyawa yang secara umum tidak memiliki gugus kromofor kecuali asam amino fenilalanin, tirosin dan triptofan. Oleh karena itu dalam penelitian ini perlu dilakukan proses derivatisasi asam amino yang bertujuan agar menghasilkan derivat yang mampu berfluoresensi sehingga pengukuran menjadi lebih selektif dan sensitif (Rohman dan Sumantri, 2007).

Reaksi derivatisasi harus mempunyai beberapa persyaratan, diantaranya adalah: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri , proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin dan produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi (Rohman dan Sumantri, 2007).

Ada beberapa agen penderivat yang dapat digunakan untuk menderivatisasi asam amino sebelum dilakukan analisis dengan HPLC, antara lain adalah NBD- F (7-fluoro -4-nitrobenzo diazole), aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC), FMOC- Cl ( 9-fluoronylmethyl- chloroformate dan o-ftalaldehid (Masuda dan Domae, 2011). Agen penderivat yang digunakan dalam penelitian ini adalah AQC (aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat).

Pereaksi penderivat AQC ini telah disentesis dan telah digunakan secara sukses untuk pemisahan dan analisis kuantitatif asam amino dalam hidrolisat protein, baik dengan menggunakan detektor fluoresen atau detektor UV. Derivatisasi dengan AQC ini sangat cepat ( hanya beberapa detik) dan sederhana. Lebih lanjut, produk yang dihasilkan stabil dan adanya kelebihan AQC tidak mengganggu proses pemisahan (Rohman dan Sumantri, 2007). AQC ini merupakan agen penderivat yang paling stabil jika dibandingkan dengan agen penderivat lainnya. Agen penderivat AQC ini stabil selama 7 hari pada suhu ruang. Selain itu juga AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder (Masuda dan Domae, 2011) sehingga paling cocok digunakan dalam proses derivatisasi.

4.2Analisis asam amino

Pada penelitian ini dilakukan analisis terhadap standar asam amino, analisis terhadap gelatin standar, analisis terhadap marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan analisis terhadap sampel uji pada konsentrasi 100 pmol. Hasil analisis asam amino tersebut dengan HPLC dapat dilihat pada kromatogram dibawah.

Dari hasil profil standar asam amino (gambar 4) dapat dilihat bahwa ada 17 asam amino yang terdeteksi yaitu asam aspartat, serin, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, prolin, tirosin, valin, metionin, lisin, isoleusin, leusin, fenilalanin dan triptofan.

Gambar 4. Profil standar asam amino Keterangan :

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9 : prolin; 10: tirosin ; 11 : valin ; 12 : metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin; 17: triptopan

Gambar 5. Profil asam amino standar gelatin sapi

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6: arginin; 7: treonin; 8 :alanin ; 9:prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 6. Profil asam amino standar gelatin babi

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 7. Profil asam amino marshmallow sapi

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 8. Profil asam amino marshmallow babi

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 9. Profil asam amino sampel uji 1

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 10. Profil asam amino sampel uji 2

1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

4.3Analisis asam amino dalam gelatin standar, dalam sampel marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan sampel uji

1. Analisis komposisi asam amino

Tabel 4.1 Hasil analisis kadar asam amino gelatin standar, marshmallow

yang di buat dari gelatin standar dan sampel uji.

Asam Amino

Kadar asam amino dalam % b/b Gelatin

sapi

Gelatin babi

Marshmall ow gelatin

sapi

Marshmallo w gelatin

babi

Sampe l 1

Sampe l 2 Asam aspartat 4.471 5.258 0.496 0.518 0.220 0.108 Serin 3.017 3.213 0.487 0.579 0.208 0.105 Asam glutamat 7.344 8.219 0.948 1.005 0.416 0.205 Glisin 20.493 21.944 3.211 3.461 1.339 0.673 Histidin 1.552 1.642 0.159 0.210 0.051 0.029 Arginin 9.319 11.448 1.305 1.593 0.463 0.239 Treonin 1.934 2.360 0.301 0.351 0.114 0.063 Alanin 6.187 6.659 0.931 1.012 0.404 0.205 Prolin 9.542 10.274 1.160 1.150 1.024 0.524 Sistein 0.201 0.461 0.000 0.000 0.000 0.000 Tirosin 0.474 0.925 0.389 0.388 0,266 0.139 Valin 2.361 2.635 0.331 0.348 0.180 0.104 Metionin 0.856 0.648 0.155 0.161 0.117 0.069 Lisin HCl 2.647 2.771 0.357 0.275 0.074 0.066 Isoleusin 1.616 1.347 0.183 0.146 0.079 0.036 Leusin 2.879 2.900 0.339 0.359 0.147 0.072 Fenilalanin 2.276 3.229 0.333 0.419 0.112 0.070

Triptofan - - - -

Berdasarkan penelitian Nhari et al, gelatin dari kulit babi (PSG) mengandung kadar asam amino glisin (239), prolin (151) dan arginin (111) yang lebih tinggi dari pada gelatin dari kulit sapi (BSG) glisin (108), prolin (63), arginin (47). Pada penelitian ini juga dihasilkan asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi yang memiliki kadar yang lebih tinggi

jika dibandingkan dengan gelatin sapi. Berdasarkan hasil analisis asam amino gelatin pada tabel diatas diketahui bahwa asam amino triptofan tidak terdeteksi. Hal ini disebabkan karena asam amino triptofan tidak terkandung dalam gelatin (Hafidz, et all).

4.4 Analisis komponen utama (PCA) dari gelatin standar dan sampel marshmallow yang dibuat di laboratorium dari gelatin standar

Pengelompokan gelatin yang bersumber dari sapi dan babi selanjutnya dilakukan dengan principal component analysis (PCA). Dalam PCA dibuat suatu variabel baru yang merupakan kombinasi linier dari variabel asal. Variabel baru tersebut disebut principal component.

PCA merupakan suatu teknik untuk mengurangi dimensi dari sekumpulan data yang terdiri dari sebagian besar variabel yang saling berhubungan, ketika terdapat adanya kemungkinan variasi dalam sekumpulan data (Jolliffe, 2002). Prinsip dari metode PCA adalah melakukan pengurangan terhadap variabel variabel yang mempunyai korelasi (Miller dan Miller, 2005).

Score plote mampu mengungkapkan perbedaan karakteristik variabel dari suatu data, yang mana score plot ini menyatakan nilai nilai komponen utama (PC1) dan komponen utama kedua (PC2). Dari proses PCA (principal component analysis) dihasilkan beberapa komponen utama (Principal components) yang dapat mengekstrak informasi keragaman data sampai jumlah tertentu. Nemati et al menggunakan PCA untuk pengolahan parameter puncak kromatogram dalam mengekstrak komponen utama dan mengklasifikasikan gelatin sapi dan babi. Dalam penelitian ini variabel adalah % tinggi puncak masing masing asam amino dalam kromatogram.

Variabel % tinggi puncak dipilih karena % tinggi puncak berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino pada sampel. Jumlah variabel pada penelitian ini adalah 17 variabel (% tinggi puncak 17 asam amino). Hasil pembedaan sumber hewan penghasil gelatin (sapi atau babi) akan disajikan dalam kurva score plot yang menyatakan nilai nilai pada principal component 1 (PC1) dan principal component 2 (PC2). Dalam penelitian ini

dimasukkan data % tinggi puncak masing masing asam amino dari kromatogram hasil analisis marshmallow sapi, analisis marshmallow babi, sampel uji coba marshmallow serta gelatin sapi dan gelatin babi kemudian dimasukkan dalam worksheet Minitab gambar 11. Setelah itu dilakukan proses PCA.

Gambar 11. Worksheet pada penyusunan data variabel tinggi puncak asam amino dengan principal component analysis (PCA)

Hasil proses PCA akan ditampilkan dalam jendela window session

sebagaimana gambar 12. Dari gambar 12 dapat diketahui bahwa ada dua

principal component yang memiliki nilai eigenvalue lebih dari satu, sehingga dapat disimpulkan bahwa sebanyak dua principal component

sudah dapat digunakan untuk menganalisis data tersebut. Principal component ketiga memiliki eigenvalue lebih kecil dari satu sehingga kurang bermakna untuk menganalisis pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi.

Principal component keempat dan seterusnya memiliki eigenvalue 0, artinya beberapa principal component tersebut dapat diabaikan. PC1 dapat mengekstrak sebanyak 85,9 % informasi (0,859 bagian) dan PC2 dapat mengekstrak 13,3 % informasi. Secara kumulatif, kedua principal component dapat mengekstrak sebanyak 99,1 % dari keseluruhan informasi yang disediakan oleh data. Hubungan antara nilai eigenvalue

dengan principal component dapat dilihat dalam scree plot yang dihasilkan pada gambar 13.

Variable PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 Asp 0.261 0.012 0.150 0.032 0.041 0.120 0.286 -0.265 Ser 0.258 0.019 -0.427 -0.129 0.077 0.211 -0.100 0.082 Glu 0.261 -0.013 0.192 0.074 -0.161 0.231 -0.451 -0.019 Gly 0.260 0.074 -0.067 0.014 -0.489 0.023 0.376 -0.207 His 0.261 -0.054 -0.054 -0.235 -0.200 -0.192 -0.178 -0.383 Arg 0.248 -0.208 -0.157 -0.016 -0.132 0.094 0.067 0.338 Thr 0.257 -0.106 -0.241 -0.013 0.349 -0.098 0.138 0.523 Ala 0.259 0.094 0.044 0.016 -0.040 -0.347 -0.046 -0.019 Pro -0.262 0.013 -0.054 -0.043 0.248 0.246 -0.359 -0.182 Cys 0.237 -0.242 0.568 0.119 0.275 -0.100 0.119 -0.039 Tyr -0.229 -0.307 0.356 0.012 -0.041 -0.073 0.215 0.199 Val 0.261 -0.021 -0.094 -0.328 0.136 -0.222 0.117 -0.043 Met -0.024 0.659 0.282 -0.180 -0.214 0.294 0.164 0.365 Lys 0.256 0.110 0.298 -0.120 -0.101 -0.251 -0.511 0.279 Iso 0.210 0.396 0.102 -0.108 0.577 0.119 0.112 -0.240 Leu 0.258 0.110 -0.081 0.827 0.015 0.123 -0.056 -0.001 Phe 0.210 -0.397 0.141 -0.234 -0.026 0.639 -0.002 -0.000 Variable PC9 PC10 PC11 PC12 PC13 PC14 PC15 PC16 Asp 0.248 0.135 0.150 -0.166 0.682 -0.056 -0.066 0.136 Ser 0.558 0.150 0.054 0.028 -0.145 -0.341 0.427 0.008 Glu 0.219 -0.332 -0.090 -0.073 0.109 0.175 -0.088 -0.619 Gly -0.006 -0.263 -0.328 0.411 -0.045 0.248 0.274 0.118 His -0.138 0.237 -0.049 -0.608 -0.108 0.262 0.144 0.116 Arg -0.150 -0.316 -0.411 -0.369 -0.013 -0.390 -0.283 0.222 Thr -0.059 -0.020 0.028 -0.068 0.125 0.614 0.164 -0.039 Ala -0.352 -0.169 0.359 -0.012 -0.158 -0.293 0.360 -0.187 Pro -0.159 -0.497 -0.021 -0.041 0.252 0.059 0.390 0.386 Cys 0.342 -0.258 0.117 -0.045 -0.391 0.044 0.014 0.286 Tyr -0.066 0.125 -0.271 -0.147 0.247 -0.202 0.530 -0.289 Val -0.145 -0.295 0.264 0.190 0.292 -0.200 -0.172 -0.121 Met -0.017 -0.070 0.227 -0.255 -0.046 0.026 0.082 0.087 Lys -0.014 0.295 -0.209 0.344 0.218 -0.052 0.015 0.328 Iso -0.192 0.114 -0.499 0.040 -0.123 -0.092 0.003 -0.187 Leu -0.233 0.120 0.094 -0.034 0.067 -0.078 0.067 0.072 Phe -0.388 0.243 0.219 0.198 -0.127 0.014 0.006 0.017

Gambar 12.Window session hasil PCAgelatin standar dan marshmallow yang dibuat dengan gelatin standar.

16 14 12 10 8 6 4 2 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Component Number Ei ge nv a lu e

Scree Plot of Asp; ...; Phe

Gambar13. Hubungan antara principle component dan eigenvalue pada analisis gelatin dan marshmallow

4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 2 1 0 -1 -2 First Component S e co n d C o m p o n e n t 4 3 2 1 Score Plot of Asp; ...; Phe

Gambar 14. Kurva yang menyatakan score plot PC1 dan PC2 berbagai sampel

Keterangan:

1: Gelatin sapi ; 2: Gelatin babi ; 3: Marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi ; 4: Marshmallow yang dibuat dari gelatin babi

Berdasarkan hasil yang dapat dilihat pada gambar 14 dihasilkan suatu kurva score plot yang memuat nilai PC1dan PC2 untuk berbagai

sampel (gelatin standar dan marshmallow yang dibuat dari gelatin standar). Pada score plot, nilai PC1 dan PC2 dari berbagai sampel digunakan sebagai dasar pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi.

Sebagai absis pada score plot adalah hasil perhitungan PC1 dari masing masing sampel dan sebagai ordinat adalah hasil perhitungan PC2 dari masing masing sampel. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, makin besar pula kemiripannya berdasarkan perhitungan PC1 dan PC2. Sampel dengan nilai score plote yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama. Pada minitab, pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif ataukah negatif. Gambar 14 merupakan kurva yang menyatakan score plot PC1 dan PC2 dari berbagai sampel diantaranya : gelatin sapi, gelatin babi dan marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi dan babi.

Dari score plot yang dihasilkan pada gambar 14, tampak bahwa

marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi (titik 3) berada pada kuadran kiri atas yang memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif. Marshmallow

yang dibuat dari gelatin sapi tersebut dapat terbedakan dari marshmallow

yang dibuat dari gelatin babi (titik 4) yang berada pada kuadran kiri bawah yang keduanya memiliki nilai PC1 dan PC2 yang negatif. Dapat disimpulkan bahwa marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi dan babi memiliki perbedaan sifat fisika kimia. Hal ini dapat dibedakan dengan baik oleh sistem HPLC dan dengan principal component analysis (PCA).

Sementara itu gelatin sapi dan gelatin babi standar yang tidak diformulasi menjadi marshmallow (titik 1 dan 2) berada pada kuadran yang berbeda dengan marshmallow yang dibuat dari kedua gelatin tersebut. Hal ini berarti bahwa gelatin sapi dan gelatin babi memiliki sifat fisika kimia yang berbeda dengan marshmallow yang dibuat dari gelatin yang sama.

Hal ini dapat disebabkan karena pada saat formulasi dilakukan pemanasan, pengadukan dan penambahan bahan bahan tambahan yang dapat mempengaruhi komposisi asam amino. Untuk melihat variabel asam

amino apa saja yang menyumbangkan nilai negatif atau positif terhadap principal component pertama dan kedua, dapat dilihat pada kurva biplot yang dihasilkan oleh proses PCA dengan Minitab gambar 15.

4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 2 1 0 -1 -2 First Component S e c o n d C o m p o n e n t Phe Leu Iso Lys Met Val Tyr Cys Pro Ala Thr Arg His Gly Glu SerAsp Biplot of Asp; ...; Phe

Gambar 15. Kurva biplot

Variabel asam amino yang berkontribusi terhadap pembentukan besarnya nilai PC1 dan PC2 dapat dilihat dari kurva biplot gambar 15. berdasarkan kurva biplot tersebut, variabel yang berkontribusi positif terhadap pembentukan principal component pertama (PC1) adalah asam aspartat, serin, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, sistein,valin, lisin, isoleusin, leusin, dan fenilalanin. Dan variabel yang berkontribusi negatif adalah prolin, tirosin dan metionin.

Sementara itu untuk PC2 variabel- variabel yang memberikan nilai positif adalah asam aspartat, serin, glisin, alanin, prolin, metionin, lisin, isoleusin dan leusin. Asam amino lainnya seperti asam glutamat, histidin, arginin, treonin, sistein, tirosin, valin, dan fenilalanin berkontribusi negatif terhadap pembentukan principal component kedua.

Berkontribusi negatif, bukan berarti variabel - variabel tersebut akan mengganggu analisis pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dalam

marshmallow, melainkan hal ini disebabkan karena variabel- variabel yang berkontribusi negatif tersebut memiliki % tinggi puncak asam amino yang besar. Jadi semakin besar nilai % tinggi puncak asam amino tersebut, maka akan menghasilkan nilai PC1 dan PC2 yang semakin negatif.

Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh terhadap pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat dari kurva

loading plot yang dihasilkan dari proses PCA. Loading plot ini digunakan untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi dalam pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel dari titik asalnya (0,0) ,maka kontribusinya terhadap proses PCA akan semakin besar (Widyaninggar et al., 2011). Gambar 16 adalah kurva yang menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2.

Dari loading plot diketahui bahwa variabel asam aspartat, histidin, valin dan prolin memiliki jarak horisontal terjauh dari garis x = 0. Artinya variabel tersebut memiliki kontribusi paling besar terhadap pembentukan nilai PC1. Hal ini dapat dibuktikan dengan melihat window session

(gambar12), yang mana asam aspartat, histidin, valin dan prolin merupakan variabel yang memiliki nilai koefisien yang paling mendekati ( + 1 ) atau ( - 1) dibandingkan variabel variabel lain, masing masing bernilai 0.261, 0.261, 0.261 dan – 0.262.

Sedangkan variabel – variabel yang berkontribusi paling besar terhadap pembentukan PC2 (memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y = 0 adalah metionin, isoleusin dan fenilalanin dengan nilai koefisien masing masing 0.659, 0.396 dan - 0.397. Variabel variabel lain dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap berpengaruh pada nilai PC1 dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada score plot dan menentukan hasil pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi. Walaupun demikian kontribusinya tidak sebesar variabel variabel utama diatas.

0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 0.75 0.50 0.25 0.00 -0.25 -0.50 First Component S e c o n d C o m p o n e n t Phe Leu Iso Lys Met Val Tyr Cys Pro Ala Thr Arg His Gly Glu SerAsp Loading Plot of Asp; ...; Phe

Gambar 16. Loading plot profil asam amino yang menyusun

marshmallow

4.5Analisis sampel marshmallow uji coba

1. Komposisi asam amino marshmallow uji coba

Setelah dilakukan pembedaan terhadap marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi dan gelatin babi, dilakukan pula analisis asam amino dalam marshmallow uji coba dengan teknik PCA. Sebelumnya telah dilakukan perhitungan konsentrasi asam amino dalam sampel

marshmallow uji coba. Hasil perhitungan disajikan dalam tabel 1.

2. Principal Component Analysismarshmallow uji coba

Hasil analisa data PCA dari sampel marshmallow uji dapat dilihat pada kurva score plot yang dapat dilihat pada gambar 17. Score plot inilah yang menentukan dalam pembedaan atau pengklasifikasian hewan penghasil gelatin dalam marshmallow.

Jika suatu sampel berada pada kuadran yang sama dengan kuadran dimana marshmallow gelatin sapi berada, hal ini berarti bahwa

berdasarkan analisis PCA yang dihasilkan dapat disimpulkan bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan profil asam amino dengan

marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi. Begitu pula sebaliknya jika suatu sampel berada pada kuadran yang sama dengan marshmallow yang terbuat dari gelatin babi, maka hal ini berarti bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan dengan gelatin babi. Score plot yang dihasilkan dari data profil asam amino marshmallow yang yang dibuat dari gelatin standar dan marshmallow uji coba akan ditampilkan dalam gambar 17.

5.0 2.5 0.0 -2.5 -5.0 2 1 0 -1 -2 First Component S e c o n d C o m p o n e n t 6 5 4 3 2 1

Score Plot of Asp; ...; Phe

Gambar 17. Kurva yang menyatakan score plot sampel

marshmallow uji coba Keterangan:

1: Gelatin sapi ; 2: Gelatin babi ; 3: Marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi ; 4: Marshmallow yang dibuat dari gelatin babi ; 5: sampel 1 ; 6: sampel 2

Dari score plot diatas dapat dilihat bahwa sampel marshmallow

gambar segitiga5 berada pada kuadran yang sama dengan dengan

marshmallow yang dibuat dari gelatin babi. Hal ini berarti bahwa sampel 1 memiliki kemiripan secara fisika kimia dengan gelatin babi. Selain itu juga

sampel 2 gambar segitiga6 berada pada kuadran yang sama dengan sampel

marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi. Hal ini menunjukkan bahwa sampel 2 memiliki kemiripan secara fisika kimia dengan gelatin sapi.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. Sampel marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi dan gelatin babi memiliki komposisi asam amino yang sama dengan kadar yang berbeda. Marshmallow yang terbuat dari gelatin babi memiliki kadar asam amino serin, asam aspartat, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, valin, metionin, leusin dan fenilalanin yang lebih tinggi dibanding marshmallow dari gelatin sapi.

2. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode HPLC yang dikombinasikan dengan PCA pada penelitian ini mampu membedakan komposisi asam amino pada sampel marshmallow uji coba dan sampel marshmallow yang dibuat di laboratorium dari gelatin sapi standar dan gelatin babi standar.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap analisa komposisi asam amino pada marshmallow yang dibuat dari campuran gelatin sapi dan gelatin babi standar.

2. Mencoba mengkombinasikan dengan analisis multivariat lainnya untuk menjelaskan hewan penghasil gelatin pada sampel

DAFTAR PUSTAKA

Abdi,H dan Williams,L.J. 2010. Principal component analysis. Willey interdisciplinary reviews.

Amiza.M.A dan Aishah S.D.2011.Effect of Drying and freezing of Cobia (Rachycentron canadum) skin on its gelatin properties. International Food Research Journal 18 : 159 -166

Azira.N, Amin dan Che Man, Y.B.2012. Differentiation of bovine and porcine gelatins in processed products via sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and principal component analysis (PCA) techniques. International Food Research Journal 19(3): 1175- 1180 (2012)

Bailey ,P.D.1990. An Introduction to peptide Chemistry. Wiley Interscience. New York

Cai,H, Gu,X, Scanlan,M.S, Ramatlapeng,D.H, Lively,C.R. 2011. Real time PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Journal of food composition and analysis. YJFCA- 2154

Copeland,R.A. 1994.Methods for Protein Analysis : A Practical Guide to Laboratory Protocols.New York: Chapman & Hall

Fadzlillah, N.A dan Che Man Y.B ., 2011. Halal Food Issues From Islamic and Modern Science Perspectives.International Conference onHumanities, Historical and Social Science.IPEDR vol 17.IACSIT Press, Singapore.

Gilberga,Mariona Pinart. 2004. Time course of biochemical and histological changes for the assesment of inflammation and remodelling in a bleomycin induced murine model of lung injury. University of Barcelona.

Hafidz,R.M, Che Man,Y.B.,Amin,I., Norfaizan,A. 2011. Chemical and functional properties of bovine and porcine skin gelatin. International Food Research Journal 18: 813- 817.

Hou,S., Hehongbo., Zhang,W., Xie,H., Zhang,S. 2009. Determination of soil amino acids by high performance liquid chromatography- electro

spray ionization- mass spectrometry derivatized with 6- aminoquinolyl- N- hydroxysuccinimidyl carbamate.Journal talanta TAL -10657.

Hilman,Y., Rahim,A.B., Musa,M.H dan Hashim,A. 2007. Principal Component Analysis of factors determining phospate rock dissolution on acid soils. Indonesian journal of agricultural science 8(1),2007;10-16. Jaswir,Irwandi.2007.Memahami gelatin , http//www.BeritaIptek.com Johnson,E.L dan Stevenson,R.1991.Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB

Jolliffe,I.T, 2002. Principal component analysis.2th edition.Springer: New York

Karim,A.A dan Bhat.R.2009. Fish gelatin;properties,challeges,and prospects as an alternative to mammalian gelatin,Trends in food science and technology 19 (2008) 644 – 656.

Khiari,Z. 2010. Functional and bioactive components from mackerel and blue whiting processing waste.School of food science and enviromental health Dublin Institute of Technology.

Koolman,J dan Heinrich,K.1995.Biokimia.germany :Hipokrates.

Masuda,A dan Dohmae,N. 2011. Amino acid analysis of sub- picomolar amounts of proteins by precolom fluoresence derivatization with 6 – aminoquinolyl –N- hydroxysuccinimidyl carbamate. Jepang. Bioscience Trends;5(6):231 – 238. DOI: 10.5582/bst.v5.6.231

Miller,J.N, Miller,J.C. 2005. Statistics and chemometrics for analytical chemistry 5th edition.Pearson education prentice hall england.

Munson,James.W. 1991.Analisis farmasi metode modern. Volume 11. Surabaya : Airlangga university press.

Mursydi, Achmad. 2012. The Role of Chemical Analysis in the Halal Authentication of Food and Pharmaceutical Products.Journal Food Pharm.Sci,1 (2012).

Nemati,M, Oveisi,M.R., Abdollahi, H., Sabzevari,O., 2004, Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins Using Principal Component Analysis,

JPharm. Biomed. Anal. 34: 485

Nhari, R.M.H.R ., Ismail,A ., Che Man,Y.B. Analytical Methods for Gelatin Differentiation from Bovine and Porcine Origins and Food products,Journal in food science vol 71, Nr.1,2012.

Norakasha,R., Hashim,D.M., Che Man,Y.B., Shuhaimi,M. 2009.Potential use of amino acids analysis for distinguishing bovine and porcine gelatins.International simposium on halal science and management.

Perwitasari,D.S. 2008. Hidrolisis tulang sapi menggunakan HCl untuk pembuatan gelatin. Makalah seminar nasional soebardjo brotohardjono.ISSN 1978-0427.

Poedjiadi,A dan Supriyanti,F.M.T.1997.Dasar dasar biokimia.Jakarta: UI press

Rediatning,W, dan Kartini,N. 1987. Analisis Asam Amino dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi secara Derivatisasi Prakolom dan Pascakolom.Procedings ITB vol 20.

Rohman,A dan Che Man,Y.B. 2011. Analysis of Pig Derivatives for Halal Authentication Studies,Food review international, 28:97-112.

Rohman,A dan Sumantri, 2007. Analisis Makanan.Jogjakarta :Gadjah Mada University press.

Roth,H.J dan Blaschke,G. 1988. Analisis farmasi. Gadjah Mada University press.

Sartika,D. 2009. Pengembangan produk marshmallow dari gelatin kulit ikan kakap merah.Institut pertanian Bogor.

Sahilah,A.M., Fadly,M.L., Norrakiah,A.S., Aminah,A., Aida,W., Khan,M.A .2012. Halal market surveillance of soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and southern-hybridization on the biochip analysis.International Food Research Journal 19 (1) : 371-375 (2012).Malaysia.

LAMPIRAN 9

Rekaman pengujian asam amino HPLC

Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : (gelatin babi)

Analit Cstd BM Area std Area sampel

mg/100 gr AA (mg/kg)

AA (%)

AMQ 796163 1123855

L-aspartic acid 100 133.1 4725358 15116735 5258.48 52584.78 5.258 L-serine 100 105.09 7375208 18256802 3212.70 32127.03 3.213 L-glutamic acid 100 147.13 4940839 22348579 8218.81 82188.15 8.219 Glycine 100 75.07 5923590 14020757 21943.79 219437.9 21.94 L-histidine 100 155.16 8534760 7314828 1642.30 16422.96 1.642

NH3 20395978 16400618

L-arginine 100 174.29 7570931 40268248 11448.40 114483.9 11.44 L-threonine 100 119.12 8316656 13339987 2359.66 23596.64 2.360 L-alanine 100 89.1 8842355 53510016 6658.92 66589.17 6.659 L-proline 100 115.13 5041137 36426441 10273.90 102739.0

4

10.27

AABA 11363621 6475360

L-cystine 50 121.16 1019268 628498 461.32 4613.21 0.461 L-tyrosine 100 181.19 8231930 3404317 925.38 9253.83 0.925 L-valine 100 117.15 14748268 26857898 2634.71 26347.05 2.635 L-methionine 100 149.21 12584381 4427060 648.25 6482.47 0.648 L-lysine HCl 100 146.19 7599370 11663669 2770.98 27709.8 2.771 L-isoleucine 100 131.18 19617019 16306635 1346.66 13466.59 1.347 L-leucine 100 131.18 20950991 37498003 2899.55 28995.4 2.900 L-phenylalanine 100 165.19 26845888 42496995 3229.41 32294.08 3.229 Triptophan 49.1

6

204.23 1437266 0 0.00 0.00 0.00 85.93 Bobot sampel Volu

m 1µl

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

Total asam amino tanpa tryptophan

Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2239 (marshmallow sapi)

Analit Cstd BM Area std Area sampel

mg/100 gr AA (mg/kg)

AA (%)

AMQ 694072 614435

L-aspartic acid 100 133.1 5011375 1696954 496.18 4961.82 0.496 L-serine 100 105.09 6851302 2883258 486.88 4868.80 0.487 L-glutamic acid 100 147.13 5581628 3265268 947.57 9475.65 0.948 Glycine 100 75.07 6158082 23926178 3211.03 32110.29 3.211 L-histidine 100 155.16 9487098 885442 159.42 1594.25 0.159

NH3 8864900 4489223

L-arginine 100 174.29 8875606 6035782 1304.84 13048.42 1.305 L-threonine 100 119.12 9245295 2122878 301.12 3011.19 0.301 L-alanine 100 89.1 8411766 7986963 931.37 9313.70 0.931 L-proline 100 115.13 51570488 47211480 1160.34 11603.39 1.160

AABA 13820010 8840363

L-cystine 50 121.16 1432643 0 0.00 0.00 0.000 L-tyrosine 100 181.19 11668301 2272961 388.57 3885.69 0.389 L-valine 100 117.15 19895558 5112206 331.39 3313.94 0.331 L-methionine 100 149.21 17288139 1629194 154.80 1548.01 0.155 L-lysine HCl 100 146.19 8642058 1914926 356.62 3566.17 0.357 L-isoleucine 100 131.18 23270818 2944106 182.71 1827.09 0.183 L-leucine 100 131.18 23937655 5616870 338.87 3388.68 0.339 L-phenylalanine 100 165.19 30072227 5505656 332.95 3329.49 0.333

Rekaman pengujian asam amino hplc

Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2240 (marshmallow babi)

Analit Cstd BM Area std Area sampel

mg/100 gr AA (mg/kg)

AA (%)

AMQ 694072 519099

L-aspartic acid 100 133.1 5011375 1660265 518.05 5180.54 0.518 L-serine 100 105.09 6851302 3215796 579.50 5795.00 0.579 L-glutamic acid 100 147.13 5581628 3245493 1005.07 10050.73 1.005 Glycine 100 75.07 6158082 24165712 3460.96 34609.63 3.461 L-histidine 100 155.16 9487098 1094526 210.30 2103.05 0.210

NH3 8864900 5235244

L-arginine 100 174.29 8875606 6906986 1593.45 15934.54 1.593 L-threonine 100 119.12 9245295 2317577 350.81 3508.12 0.351 L-alanine 100 89.1 8411766 8132140 1011.98 10119.80 1.012 L-proline 100 115.13 51570488 43840269 1149.84 11498.39 1.150

AABA 13820010 8237657

L-cystine 50 121.16 1432643 0 0.00 0.00 0.000 L-tyrosine 100 181.19 11668301 2127837 388.19 3881.87 0.388 L-valine 100 117.15 19895558 5032998 348.17 3481.68 0.348 L-methionine 100 149.21 17288139 1588133 161.03 1610.32 0.161 L-lysine HCl 100 146.19 8642058 1382216 274.70 2746.96 0.275 L-isoleucine 100 131.18 23270818 2203661 145.94 1459.41 0.146 L-leucine 100 131.18 23937655 5570354 358.63 3586.29 0.359 L-phenylalanine 100 165.19 30072227 6488936 418.76 4187.63 0.419 Triptophan 49.1

6

204.23 1275052 0 0.00 0.00 0.000 11.97 Bobot sampel Volu

m 1µl

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

Total asam amino tanpa tryptophan

0.1428 5000 0

Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2236 ( sampel 1)

Analit Cstd BM Area std Area sampel

mg/100 gr AA (mg/kg)

AA (%)

AMQ 694072 692934

L-aspartic acid 100 133.1 5011375 925023 219.63 2196.29 0.220 L-serine 100 105.09 6851302 1518456 208.21 2082.12 0.208 L-glutamic acid 100 147.13 5581628 1764392 415.77 4157.68 0.416 Glycine 100 75.07 6158082 12288803 1339.20 13392.03 1.339 L-histidine 100 155.16 9487098 348373 50.93 509.34 0.051

NH3 8864900 5458137

L-arginine 100 174.29 8875606 2635256 462.61 4626.08 0.463 L-threonine 100 119.12 9245295 989098 113.93 1139.25 0.114 L-alanine 100 89.1 8411766 4264615 403.82 4038.18 0.404 L-proline 100 115.13 51570488 51300574 1023.82 10238.24 1.024

AABA 13820010 13123427

L-cystine 50 121.16 1432643 0 0.00 0.00 0.000 L-tyrosine 100 181.19 11668301 1918958 266.38 2663.84 0.266 L-valine 100 117.15 19895558 3425789 180.33 1803.28 0.180 L-methionine 100 149.21 17288139 1512996 116.74 1167.36 0.117 L-lysine HCl 100 146.19 8642058 490735 74.21 742.10 0.074 L-isoleucine 100 131.18 23270818 1577141 79.48 794.77 0.079 L-leucine 100 131.18 23937655 3010512 147.48 1474.83 0.147 L-phenylalanine 100 165.19 30072227 2283866 112.15 1121.51 0.112

Rekaman pengujian asam amino hplc

Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2237 (sampel 2)

Analit Cstd BM Area std Area sampel

mg/100 gr

AA (mg/kg)

AA (%)

AMQ 694072 709492

L-aspartic acid 100 133.1 5011375 798024 108.45 1084.48 0.108 L-serine 100 105.09 6851302 1341155 105.26 1052.57 0.105 L-glutamic acid 100 147.13 5581628 1520600 205.09 2050.87 0.205 Glycine 100 75.07 6158082 10796436 673.42 6734.18 0.673 L-histidine 100 155.16 9487098 347133 29.05 290.49 0.029

NH3 8864900 4182220

L-arginine 100 174.29 8875606 2377408 238.87 2388.70 0.239 L-threonine 100 119.12 9245295 960800 63.34 633.40 0.063 L-alanine 100 89.1 8411766 3787271 205.26 2052.58 0.205 L-proline 100 115.13 51570488 45852955 523.77 5237.67 0.524

AABA 13820010 9653326

L-cystine 50 121.16 1432643 0 0.00 0.00 0.000 L-tyrosine 100 181.19 11668301 1744029 138.57 1385.68 0.139 L-valine 100 117.15 19895558 3442218 103.71 1037.07 0.104 L-methionine 100 149.21 17288139 1570664 69.36 693.61 0.069 L-lysine HCl 100 146.19 8642058 767050 66.39 663.91 0.066 L-isoleucine 100 131.18 23270818 1261312 36.38 363.80 0.036 L-leucine 100 131.18 23937655 2560646 71.80 717.99 0.072 L-phenylalanine 100 165.19 30072227 2500534 70.28 702.80 0.070 Triptophan 49.1

6

204.23 1275052 0 0.00 0.00 0.000 2.709 Bobot sampel Volu

m 1µl

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

Total asam amino tanpa tryptophan

0.2798 5000 0

Pipet 40 µl mix standar asam amino, lalu tambahkan 40 µl standar internal

AABA, 920 µl aquabides kemudian di homogenkan. Ambil 10 µl standar, lalu

tambahkan 70 µl AccQ.Fluor borat , vortex dan diamkan selama 1 menit.

Kemudian inkubasi selama 10 menit pada suhu 55

0

C lalu suntikkan pada

HPLC.

Perhitungan kadar asam amino gelatin sapi:

Kadar asam amino dalam (mg / 100 gram)

(Area komponen / area AABA)

sampel

x C

std

x BM x fp x 100%

(Area komponen / area AABA)

standar

x 1000000 x gr x 1000

Asam aspartat = 16039621 /9215166 x 100 x 133.1 x100.000 x 100 %

4725358 /11363621 x 1000000 x 0.1246 x 1000

= 231.669 / 5.1812 x 100%

= 4471.3 mg /100 gr