VALIDASI METODE THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DALAM KOPI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DALAM
KOPI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Ariel Stanley
NIM: 158114055

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR
KAFEIN DALAM KOPI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Ariel Stanley
NIM: 158114055

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini kupersembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus, yang selalu merancang
hal indah diluar ekspektasiku, yang selalu menyediakan hal-hal luar biasa yang
tidak pernah dilihat, didengar maupun timbul dari dalam hati. Kepada Papi,
Mami, dan Adik sebagai bentuk pencapaian atas doa dan dukungan. Kepada
keluarga dan sahabat setia yang selalu mendukung. Serta almamater Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala
berkat dan karunia-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul
“Validasi Metode Thin-Layer Chromatography (TLC)-Densitometri pada
Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi” dapat selesai dengan baik. Skripsi ini disusun
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di
Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama proses penelitian berlangsung hingga selesai penulis mendapat
banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin
menyampaikan terima kasih kepada:
1. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, sekaligus selaku dosen
pembimbing yang telah bersedia membimbing dengan kesabaran, dukungan,
arahan, serta saran selama proses penelitian hingga berakhirnya skripsi.

3. Bapak Maywan Hariono, M.Sc., Ph.D., Apt.selaku dosen penguji untuk segala
masukan, kritik, dan saran hingga skripsi tersusun.
4. Bapak Michael Raharja Gani M.Farm., Apt. selaku dosen penguji untuk untuk
segala masukan, kritik, dan saran hingga skripsi tersusun.
5. Ibu Rita Suhadi M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik atas
bimbingannya selama ini.
6. Ibu Damiana Sapta Candrasari S.Si. M.Sc. selaku Kepala Penanggung jawab
Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin penggunaan
laboratorium untuk kepentingan penelitian.
7. Laboran Mas Bimo, Pak Kayat, Pak Parlan yang baik hati membantu,
menemani, dan mendukung proses penelitian di laboratorium.
8. Keluarga tercinta Papi Arifin, Mami Kardia Sofia, dan Adik Kezia yang selalu
memberikan dukungan dan doa.

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9. Rekan penelitian Cinna Cindy dan Galung Istri Setyoningsih, untuk dukungan,
pengertian, dan bantuan sehingga mampu melewati suka-duka proses penelitian

untuk menyelesaikan skripsi.
10. Seluruh teman-teman FSMB 2015 dan teman-teman PH Foundation yang selalu
mendorong, mendukung, memotivasi dan membantu dalam suka dan duka, serta
pihak-pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu.

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI

Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................... v
PRAKATA ....................................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................ vii
DAFTAR ISI .................................................................................................... viii
DAFTAR TABEL ............................................................................................ ix
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ x
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xi
INTISARI ......................................................................................................... xii
ABSTRACT ....................................................................................................... xiii
PENDAHULUAN ............................................................................................ 1
METODE PENELITIAN .................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 9
KESIMPULAN ................................................................................................ 18
SARAN ............................................................................................................ 18
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 19
LAMPIRAN ..................................................................................................... 21
BIOGRAFI PENULIS ...................................................................................... 68

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL
Tabel I. Nilai recovery yang diterima untuk berbagai konsentrasi sampel .......... 8
Tabel II. Nilai presisi yang diharapkan untuk bermacam konsentrasi sampel ..... 8
Tabel III. Data resolusi kafein ........................................................................... 12
Tabel IV. Data perolehan AUC dari enam seri baku kafein ............................... 14
Tabel V. Data akurasi dan presisi larutan seri baku kafein ................................. 16
Tabel VI. Data akurasi dan presisi dengan adisi baku kafein ............................. 17

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kafein dan auksokrom-kromofor ........................................ 10
Gambar 2. Spektrum serapan seri baku kafein konsentrasi 200, 250, 300, 350,
400, dan 450ppm .............................................................................................. 11
Gambar 3. Kromatogram kafein pada larutan baku 150ppm (a), sampel kopi
tanpa adisi baku (b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 150ppm (c) ...... 13
Gambar 4. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein dengan respon (AUC) .... 15
Gambar 5. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein dengan respon (AUC) .... 17

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein .................................................... 21
Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk ......................................................... 22
Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein .............................. 24
Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang kafein ............................................. 25
Lampiran 5. Hasil kromatogram kurva baku 3x replikasi................................... 27
Lampiran 6. Kromatogram seri baku kafein – linearitas .................................... 38
Lampiran 7. Kromatogram seri baku kafein – akurasi dan presisi ...................... 42
Lampiran 8. Kromatogram adisi baku kafein (replikasi 9x) – presisi dan
akurasi .............................................................................................................. 51

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

INTISARI
Kafein atau 1,3,7-trimetilksantin adalah senyawa alkaloid yang ditemukan
dalam tanaman kopi, teh, yerba mate, dsb. Kafein dapat meningkatkan kinerja,
kewaspadaan, dan kinerja seseorang. Namun penggunaan kafein berlebihan yakni,
≥200mg dapat menyebabkan insomnia, sakit kepala, gugup, sehingga diperlukan
penetapan kadar kafein pada kopi. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi
metode TLC-Densitometri pada penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk murni.
Penelitian
ini
bersifat
non-eksperimental
deskriptif.
Metode yang digunakan yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri
dengan menggunakan fase diam silika gel 60 GF254, komposisi fase gerak metanol:
etil asetat: ammonia 25% (13:77:10), volume yang dianalisis 2µL, dan panjang
gelombang pengamatan 275nm.
Parameter validasi metode yang digunakan pada penelitian meliputi
selektivitas, linearitas dan rentang, akurasi, dan presisi. Hasil yang diperoleh
menunjukkan hasil selektivitas yang baik dengan nilai resolusi (Rs) 4,545 pada
sampel kopi, dan 5,400 pada sampel kopi dengan penambahan baku kafein

(150ppm) serta linearitas yang baik dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,9980. Nilai
akurasi dan koefisien variasi yang baik untuk baku kafein pada konsentrasi 350 ppm
dan 450 ppm secara berturut-turut adalah 10,943; 3,1554% dan 15,925; 3,6898%.
Rentang pengukuran pada konsentrasi 150-750 ppm. Berdasarkan hasil tersebut,
maka metode ini memiliki validitas yang baik untuk penetapan kadar kafein dalam
kopi bubuk.
Kata kunci: kafein, kopi, thin layer chromatography, densitometri, validasi metode

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
Caffeine also known as 1,3,7 trimethylxanthine is an alkaloid compound
that can be found in coffee, tea, and yerba mate plant. Caffeine in body has effect
in enhancing both performance and allertness. The excessive intake of caffeine
more than 200mg/day would cause many effect such as insomnia, headache, and
nervous. So, it is necessary to determine caffeine concentration in coffee. This study
aims to validate the Thin-Layer Chromatography-Densitometry method to
determine caffeine concentration in coffee powder.

This is non-experimental descriptive research using TLC-Densitometry
method by using silica gel 60 GF254 as stationary phase, methanol-ethyl acetateammonia 25% (13:77:10) as the mobile phase, sample volume 2µL, solvent front
within 75mm and wavelength detection at 275nm.
Validity parameter is defined basing on selectivity, linearity and range,
accuracy, and precission. The result shows that the method has good selectivity with
the resolution (Rs) of coffee sample was 4,545 and coffee sample with caffeine
addition (150ppm) was 5,400, a good linearity with coefficient correlation (r)
0,9980. Recovery value and coefficient variation of caffeine standard at the
concentration 350 ppm and 450 ppm were 10,943; 3,1554% and 15,925; 3,6898%
respectively. The series of standard curve concentration was within 150-750 ppm.
In conclusion, this method is valid to determine caffeine concentration in coffee
powder.
Keyword: caffeine, coffee, thin layer chromatography, densitometry, validation
method.

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Kopi adalah tumbuhan yang hidup di tempat tropis dan subtropis, terlebih
pada bagian ekuator dengan kondisi ketinggian di antara 200-2000 meter pada suhu
18-22℃. Ada banyak jenis spesies kopi, contohnya yang terkenal adalah kopi
arabika (Coffea arabica L.) dan kopi robusta (Coffea robusta L.) (Patay, Bencsik,
Papp, 2016).
Kopi mengandung senyawa alkaloid kafein, serta beberapa antioksidan.
Kafein atau 1,3,7-trimethylxanthine terdapat di lebih dari 60 spesies tanaman
subtropis seperti pada teh, biji kakao, kopi, dan tanaman yerba mate. Secara
farmakologis kafein diketahui dapat mengatasi berbagai penyakit seperti asma,
hidung tersumbat, serta pusing atau sakit kepala (Preedy, 2012). Kafein juga
diketahui dapat meningkatkan daya ingat, meningkatkan tingkat kewaspadaan,
serta memperbaiki suasana hati/psikorelaksan (Alsunni, 2015). Oleh karena itu kopi
banyak dimanfaatkan oleh masyarakat, bukan hanya sekedar minuman, tapi guna
mendapatkan efek yang membantu mengoptimalkan produktivitas sehari-hari.
Ketentuan kandungan kafein diatur oleh pemerintah dalam sebuah
Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia No.
HK.00.05.23.3644. Di dalam Keputusan Kepala BPOM tentang Pengawasan
Suplemen Makanan tersebut, tercantum bahwa kandungan kafein pada suplemen
makanan sebanyak 150mg/hari dan minimal dibagi dalam 3 (tiga) dosis (BPOM RI,
2004). Dapat diartikan dalam satu kali konsumsi produk kopi tidak boleh
mengandung lebih dari 50mg kafein. Beberapa produk minuman yang mengandung
kafein di dalamnya adalah suplemen (minuman berenergi) dan kopi itu sendiri.
Kopi di pasaran terbagi menjadi beberapa bentuk contohnya kopi bubuk instant,
kopi bubuk murni, kopi dekafeinasi, dan juga permen kopi. Permasalahan yang
timbul adalah produk kopi yang ada tidak mencantumkan kadar kafein pada
kemasan serbuk kopi, sehingga masyarakat tidak mengetahui berapa kadar kafein
yang diminum dalam 1 (satu) kali penyajian kopi. Padahal jika terlalu banyak
mengkonsumsi kopi maka seseorang dapat mengalami gejala intoksikasi berupa
gelisah, gugup, insomnia, hiperurinasi, denyut jantung tidak beraturan, gangguan
pencernaan (Alsunni, 2015). Upaya untuk menghindari gejala intoksikasi kafein

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

adalah dengan menetapkan kadar kafein yang terdapat dalam satu bungkus kopi
agar tiap kali penyajian kopi memenuhi batas konsumsi kafein harian.
Beberapa penelitian kafein menggunakan metode TLC-Densitometri telah
dilakukan, di antaranya adalah Palacios, et al (2017) yang meneliti tentang kadar
kafein dengan sampel tablet parasetamol-kafein; serbuk kopi; dan minuman
berenergi; menggunakan fase diam silika gel 60 G; komposisi fase gerak etil asetatmetanol-ammonium hidroksida (85:10:5), Torres, et al (2015) menggunakan
sampel minuman berenergi; fase gerak metanol-etil asetat (3:1); fase diam polyester
backed silica gel, Bochenska (2013) menggunakan sampel tablet; fase gerak
heksana-aseton-asam asetat glasial (5:5:1); fase diam silika gel 60 F254.
Penelitian oleh Isnindar, dkk (2016) melakukan metode optimasi isolasi
“Optimization Method of Caffeine Isolation of Merapi Green Coffee beans”
menggunakan komposisi fase gerak kloroform : etil asetat (1:3), fase diam silika
gel F254 mampu menghasilkan pemisahan yang baik pada kafein kopi. Selain itu,
penelitian oleh Riswanto, dkk (2015) tentang “Validasi dan determinasi piridoksin,
nikotinamid, dan kafein pada minuman berenergi menggunakan TLCDensitometri”, telah memberikan hasil yang memenuhi parameter akurasi, presisi,
linearitas, selektivitas, dan rentang.
Oleh karena itu pada penelitian ini hendak melakukan validasi metode
mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Riswanto, dkk (2015) untuk dapat
menetapkan kadar kafein pada kopi bubuk murni menggunakan metode TLCDensitometri (KLT-densitometri) dan menjamin penetapan kadar kafein yang
dilakukan dapat dipertanggungjawabkan dengan memenuhi parameter validasi
metode meliputi parameter selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan yaitu sampel kopi bubuk merek “X”, baku kafein
(Certificate of Analysis no. 001/WS/I/2018), plat silika gel F254, metanol (analytical
grade), etil asetat (analytical grade), ammonia 25% (analytical grade),
aquadestilata.
Alat dan instrumentasi
Alat yang digunakan yaitu seperangkat alat densitometer (CAMAG TLC
Scanner 3 CAT. No. 0277.6485 SER. No. 160602), autosampler (CAMAG
Linomat 5 CAT. No. 027.7808. SER. No. 170610), neraca kasar, neraca analitik
(Scaltec SBC 22 max 60/210 g; min 0,001 g; d=0,01/0,1 mg; e=1 mg), seperangkat
komputer merk Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP
France S.A.S, peralatan gelas (gelas beaker, labu takar), pipet volume, CAMAG
flat bottom chamber, oven (POSTBUS 7018-3502 KA Ultretch), mikrotube,
mikropipet 100-1000μL (Socorex ACURA 825).
Metode Penelitian
Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan terdiri dari metanol, etil asetat & ammonia
25%. Fase gerak ini dipilih dengan mengacu pada penelitian Riswanto, dkk (2015).
Pencampuran fase gerak dilakukan di dalam labu takar 100mL dengan
perbandingan metanol : etil asetat : ammonia 25% (13:77:10) v/v.
Penjenuhan chamber/bejana
Fase gerak yang akan digunakan metanol : etil asetat : ammonia 25%
(13:77:10) dituang ke dalam dasar bejana/chamber, dicelupkan kertas saring pada
fase gerak. Bejana ditutup, lalu fase gerak dibiarkan menguap hingga membasahi
kertas saring selama kurang lebih 1 jam atau bila fase gerak telah mencapai tujuh
perdelapan tinggi kertas saring (FI V, 2014).
Aktivasi plat KLT silika gel F254
Plat silika gel 60 GF254 dengan ukuran 20x20cm disiapkan, kemudian
dipotong dengan ukuran 10x20cm. Plat KLT diaktivasi dengan pemanasan di oven
pada suhu 120℃ selama kurang lebih 45 menit.

3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Pembuatan larutan stok kafein
Baku kafein ditimbang seksama lebih kurang 50,0mg. Kafein dilarutkan
dengan metanol (pro analysis grade) hingga batas tanda di dalam labu takar 50mL
sehingga didapat konsentrasi larutan stok kafein 1000ppm.
Preparasi larutan seri kafein
Larutan seri kafein dibuat dengan mengambil masing-masing 200, 250,
300, 350, 400, dan 450µL larutan stok kafein yang dimasukkan kedalam mikrotube
berbeda. Ditambahkan metanol pada masing-masing konsentrasi berturut-turut
sebanyak 800, 750, 700, 650, 600, dan 550µL sehingga volume akhir yang
diperoleh 1 mL dan didapat larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 200, 250,
300, 350, 400, dan 450ppm.
Penentuan panjang gelombang maksimal
Larutan seri kafein konsentrasi 200, 250, 300, 350, 400 dan 450ppm ditotol
menggunakan instrument autosampler linomat sebanyak 2µl pada plat KLT yang
telah diaktivasi pada suhu 120℃ selama ±45 menit. Tiap totolan diberi jarak 1cm,
jarak dari samping kanan-kiri 1cm, dan jarak dari bawah 2cm. Plat KLT tersebut
dielusi hingga jarak 75mm pada chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak
(metanol : etil asetat : ammonia 25%). Plat dikeringkan, kemudian dibaca serapan
pada

rentang

panjang

gelombang

200-400nm

menggunakan

instrument

densitometer. Panjang gelombang maksimal yang diperoleh dari nilai serapan
paling optimal (tinggi) digunakan untuk menganalisis kafein pada sistem KLTDensitometri (Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri).
Penentuan kurva baku
Larutan seri dengan konsentrasi 200, 250, 300, 350, 400, 450ppm ditotol
menggunakan instrument autosampler linomat sebanyak 2µL pada plat KLT yang
telah diaktivasi pada suhu 120℃ selama ±45 menit. Tiap totolan diberi jarak 1cm,
jarak dari samping kanan-kiri 1cm, dan jarak dari bawah 2cm. Plat KLT tersebut
dielusi hingga jarak 75mm pada chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak
(metanol : etil asetat : ammonia 25%). Plat dikeringkan kemudian dibaca serapan
menggunakan densitometer dengan panjang gelombang maksimal yang telah

4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

didapatkan sebelumnya. Dibuat persamaan garis y=bx+a hubungan antara
konsentrasi dengan respon (AUC).
Preparasi sampel kopi robusta dan arabika
i. Kopi robusta
Sampel kopi bubuk robusta ditimbang seksama lebih kurang 2,0 gram
kemudian dilarutkan dalam 150,0mL aquadestilata suhu 100°C. Larutan kopi
robusta siap digunakan untuk analisis kadar dengan metode Kromatografi Lapis
Tipis - Densitometri.
ii. Kopi arabika
Sampel kopi bubuk arabika ditimbang seksama lebih kurang 10,0 gram
kemudian dilarutkan dalam 150,0 mL aquadestilata suhu 100℃. Larutan kopi
arabika disaring menggunakan kertas saring untuk menghilangkan sisa endapan
serbuk kopi. Larutan kopi arabika siap digunakan untuk analisis kadar dengan
metode Kromatografi Lapis Tipis - Densitometri.
Validasi metode analisis
i. Penentuan selektivitas dan spesifitas
Nilai resolusi dihitung dari hasil pengukuran baku kafein konsentrasi
150ppm, sampel kopi, dan sampel kopi yang ditambah dengan baku kafein
konsentrasi 150ppm dengan cara menghitung jarak puncak yang dihasilkan
senyawa kafein dengan puncak terdekat yang timbul pada densitogram. Nilai Rf
(retention factor) antara senyawa kafein dengan Rf senyawa lain yang terdapat di
dalam sampel kopi, sehingga didapatkan nilai resolusi senyawa kafein.
ii. Penentuan linearitas dan rentang
Larutan seri konsentrasi 150, 250, 350, 450, 550, 650, dan 750ppm ditotol
menggunakan instrument autosampler linomat sebanyak 2µL pada plat KLT yang
telah diaktivasi pada suhu 120℃ selama 45 menit. Tiap totolan diberi jarak 1cm,
jarak dari samping kanan-kiri 1cm, dan jarak dari bawah 2cm. Plat KLT tersebut
dielusi hingga jarak 75mm pada chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak
(metanol : etil asetat : ammonia 25%). Plat dikeringkan kemudian dibaca serapan
menggunakan densitometer dengan panjang gelombang maksimal yang telah

5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

didapatkan sebelumnya. Dibuat persamaan garis kurva baku hubungan antara
konsentrasi dengan respon (AUC).
iii. Penentuan akurasi dan presisi
Larutan seri kafein dibuat dengan mengambil sebanyak 200, 350, dan
450µL larutan baku kafein kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube berbeda,
setelah itu ditambahkan pelarut metanol pada masing-masing seri berturut-turut
sebanyak 800, 650, dan 550 µL, didapatkan volume akhir 1 mL sehingga didapat
larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 200, 350, dan 450 ppm. Masing-masing
ditotol menggunakan instrument autosampler Linomat sebanyak 2µL pada plat
KLT yang telah diaktivasi pada suhu 120℃ selama ±45 menit. Tiap totolan diberi
jarak 1cm, jarak dari samping kanan-kiri 1cm, dan jarak dari bawah 2cm. Plat KLT
tersebut dielusi hingga jarak 75mm pada chamber yang telah dijenuhkan dengan
fase gerak (metanol : etil asetat : ammonia 25%). Plat dikeringkan kemudian dibaca
serapan menggunakan densitometer pada panjang gelombang maksimal. Hasil
AUC diplotkan terhadap persamaan garis kurva baku (y=bx+a) yang telah
diperoleh, dilakukan 3x replikasi. Dihitung nilai akurasi dan presisi yang berupa
nilai SD, %perolehan kembali, dan CV kemudian dibandingkan dengan nilai
akurasi dan presisi mengacu Association of Official Analytical Chemist (AOAC).
iv. Validasi metode dengan adisi baku kafein
Larutan sampel kopi yang telah dipreparasi dipindahkan pada 4
mikrotube berbeda, masing-masing sebanyak 400µL. Pada mikrotube pertama
ditambahkan aquadestilata sebanyak 600µL. Mikrotube kedua ditambahkan baku
kafein sebanyak 50µL (50ppm), kemudian ditambahkan aquadestilata sebanyak
550µL. Mikrotube ketiga ditambahkan baku kafein sebanyak 100µL (100ppm),
kemudian ditambahkan aquadestilata sebanyak 500µL. Mikrotube keempat
ditambahkan baku kafein sebanyak 150µL (150ppm), kemudian ditambahkan
aquadestilata sebanyak 450µL. Diperoleh 4 mikrotube dengan volume akhir 1mL.
Kemudian sampel pada keempat mikrotube dianalisis sesuai prosedur bagian iii.

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Analisis Hasil
i. Selektivitas dan spesifitas
Selektivitas dilihat berdasarkan hasil resolusi pada densitogram, antara
senyawa kafein dan senyawa lain dalam sampel yang memiliki puncak berdekatan.
Syarat resolusi yang baik yakni Rs≥2,00 (AOAC, 2013). Spesifitas dilihat dari
kedekatan nilai Rf yang dihasilkan antar senyawa kafein yang dianalisis.
ii. Linearitas
Nilai linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari
AUC baku kafein yang diplotkan terhadap konsentrasi baku kafein. Linearitas
ditentukan dengan nilai koefisien korelasi ≥0,99 (AOAC, 2013).
iii. Rentang
Konsentrasi larutan seri diplotkan terhadap respon AUC masing-masing
seri, kemudian diperoleh persamaan y=bx+a. Rentang ditentukan dari konsentrasi
terendah dan tertinggi dari seri baku kafein yang memiliki linearitas yang baik,
ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi ≥ 0,99 (AOAC, 2013).
iv. Akurasi dan recovery
Akurasi ditentukan dari hasil kadar yang diuji dengan kadar baku dan
dinyatakan dalam bentuk persen. Hasil akurasi yang didapatkan dibandingkan
dengan standar akurasi dari AOAC, (2013). Perolehan kembali ditentukan dari
metode adisi baku kafein pada sampel. Kadar penambahan baku kafein dihitung
dan dibandingkan dengan standar perolehan kembali dari AOAC (2013). Tabel I
menunjukkan nilai recovery yang diterima untuk berbagai konsentrasi sampel.
Akurasi =
Perolehan kembali =

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

𝑥 100%

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎−𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

7

𝑥 100%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel I. Nilai recovery yang diterima untuk berbagai konsentrasi sampel (AOAC, 2013)

Konsentrasi

Limit Recovery
(%)

100 %

98-101

10 %

95-102

1%

92-105

0,1 %

90-108

0,01%

85-110

10µg/g (ppm)

80-115

1µg/g

75-120

10µg/kg (ppb)

70-125

v. Presisi
Presisi ditentukan dari nilai koefisien variasi dan dihitung dengan
menggunakan rumus. Hasil perhitungan presisi yang didapatkan dibandingkan
dengan standar presisi dari AOAC, (2013). Tabel II menunjukkan nilai presisi yang
diterima dari berbagai konsentrasi.
KV =

𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)
𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎

𝑥 100%

Tabel II. Nilai presisi yang diharapkan untuk bermacam konsentrasi sampel (AOAC, 2013).

Konsentrasi

Repeatability
(RSDr) %

100 %

1

10 %

1,5

1%

2

0,1 %

3

0,01%

4

10µg/g (ppm)

6

1µg/g

8

10 µg/kg (ppb)

15

8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode dilakukan untuk menjamin sebuah metode penetapan
kadar dapat dipertanggungjawabkan kesahihannya, dibuktikan dengan beberapa
parameter validasi yang dilakukan meliputi selektivitas, spesifitas, linearitas,
rentang, akurasi, dan presisi. Validasi metode penetapan kadar kafein dilakukan
secara Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri dengan menggunakan kopi bubuk
arabika dan robusta sebagai sampel. Penelitian ini menggunakan instrument
CAMAG TLC Scanner 3 sebagai densitometer untuk melakukan analisis, serta
CAMAG Linomat 5 sebagai autosampler untuk melakukan penotolan baku kafein
dan sampel kopi pada plat KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Fase gerak yang
digunakan yakni, metanol; etil asetat; dan ammonia 25% dengan perbandingan
berturut-turut 13:77:10 (v/v) mengacu pada penelitian dari Riswanto, dkk (2015)
Plat KLT yang digunakan berjenis silika gel 60 GF254. Plat silika gel 60 GF254
digunakan karena merupakan plat yang umum digunakan untuk metode
Kromatografi Lapis Tipis (Spangenberg, et al 2011). Plat silika gel 60 GF254
memiliki ukuran pori-pori 60Å, simbol F254 menunjukkan bahwa plat dapat
berfluorosensi dibawah sinar ultraviolet yang mempermudah uji kualitatif senyawa
dibawah sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254nm. Aktivasi plat KLT silika
gel 60 GF254 dilakukan di dalam oven pada suhu 120℃ selama 45 menit untuk
menghilangkan kelembaban serta kemungkinan kandungan air pada plat silika.
Menurut Spangenberg, Poole, dan Weins (2011) gugus silanol pada silika gel
mampu membentuk hingga tiga layer ikatan dengan air, sehingga suhu aktivasi
dilakukan pada suhu ≥120℃ dan ≤180℃. Bejana (chamber) yang digunakan dalam
penelitian adalah bejana CAMAG flat bottom chamber dengan ukuran 20x20cm
dengan penutup stainless steel. Proses penjenuhan bejana (chamber) dilakukan
mengacu pada Farmakope Indonesia V (2014) yakni didiamkan selama kurang
lebih 1 jam atau hingga fase gerak membasahi 7/8 tinggi kertas saring. Hasil dari
optimasi sebelumnya didapatkan panjang gelombang maksimal 275nm yang
memberikan serapan paling optimal, dan volume yang dianalisis sebanyak 2µL.
Jarak elusi sepanjang 75mm dilakukan mengacu pada penelitian dari Riswanto, dkk

9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(2015). Pada penelitian digunakan sampel kopi bubuk instant jenis arabika dan
robusta.
Penentuan panjang gelombang optimal kafein
Senyawa kafein memiliki gugus kromofor dan auksokrom, sehingga dapat
dilakukan analisis dengan densitometer, dengan prinsip memantulkan intensitas
cahaya yang dipancarkan oleh analit. Penentuan panjang gelombang maksimal
dilakukan pada larutan seri baku kafein sebelum tahap penentuan linearitas. Larutan
seri baku kafein konsentrasi 200, 350, dan 450ppm ditotol menggunakan instrument
autosampler Linomat sebanyak 2µL dan dilakukan elusi hingga jarak 75mm
dengan fase gerak metanol-etil asetat-ammonia 25% (13:77:10) kemudian
dilakukan pembacaan absorbansi pada rentang panjang gelombang 200-400nm.

Gambar 1. Struktur kafein dan auksokrom-kromofor

Pada penelitian ini ditentukan hasil panjang gelombang maksimal yang
memberikan serapan paling optimal senyawa kafein yakni pada panjang gelombang
275nm. Menurut Moffat, Osselton, dan Widdop (2011) panjang gelombang teoritis
kafein yakni 273nm. Menurut Spangenberg, Poole, dan Weins (2011) Pergeseran
panjang gelombang hingga ± 2,5nm masih dapat diterima, sedangkan perbedaan
diluar dari ± 2,5nm memerlukan pembacaan ulang. Sehingga penelitian Validasi
Metode penetapan kadar kafein pada kopi dengan KLT-Densitometri dapat
menggunakan panjang gelombang pengamatan 275nm.

10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Gambar 2. Spektrum serapan seri baku kafein konsentrasi 200, 250, 300, 350, 400, dan 450ppm

Preparasi sampel kopi
Menurut (Spangenberg, et al 2011) salah satu keuntungan analisis
menggunakan metode kromatografi lapis tipis adalah sampel yang akan digunakan
tidak perlu melalui banyak proses preparasi, sehingga sampel kopi disiapkan sesuai
dengan prosedur pembuatan kopi yang terdapat pada masing-masing bungkus kopi.
i. Kopi robusta
Ditimbang seksama lebih kurang 2,0gram bubuk kopi dilarutkan dalam
sejumlah aquadestilata di dalam gelas ukur. Sampel siap digunakan untuk analisis.
ii. Kopi arabika
Ditimbang seksama lebih kurang 10,0gram bubuk kopi dilarutkan dalam
sejumlah aquadestilata. Sampel kopi disaring menggunakan kertas saring untuk
menghilangkan sisa endapan bubuk yang tidak larut air. Sampel siap digunakan
untuk analisis.
Preparasi sampel kopi dibuat sesuai dengan aturan pembuatan pada
kemasan untuk menyesuaikan keadaan dengan aturan minum yang diacu konsumen.
Preparasi sampel kopi dilakukan menggunakan aquadestilata yang telah dididihkan

11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

sebelumnya sehingga suhu aquadestilata kurang lebih 100℃. Pada sampel kopi
arabika terdapat sisa bubuk yang tidak larut air, maka dilakukan penyaringan
menggunakan kertas saring untuk menghilangkan sisa-sisa bubuk kopi yang dapat
menyumbat pori-pori plat dan mengganggu proses elusi yang terjadi. Pada sampel
kopi robusta tidak terdapat sisa endapan bubuk, maka tidak dilakukan penyaringan.
Penentuan selektivitas
Proses penentuan selektivitas dilakukan dengan menambahkan sejumlah
baku kafein ke dalam sampel kopi yang telah dipreparasi, kemudian ditotol
menggunakan instrument autosampler Linomat sejumlah 2µL pada plat. Selektivitas
digunakan untuk melihat kemampuan metode mengukur analit di dalam sebuah
sampel atau matriks.
Tabel III. Data resolusi kafein

Keterangan

Data resolusi

Nilai Rf

Baku kafein 150ppm

-

0,70

Sampel kopi

4,545

0,74

Sampel kopi + baku kafein 150ppm 5,400

0,74

Menurut (AOAC, 2013) selektivitas yang baik ditunjukkan dengan nilai
resolusi (Rs) ≥2. Menurut (Spangenberg, et al 2011) nilai resolusi ≥1,25 dapat
digunakan untuk melakukan kuantifikasi metode kromatografi lapis tipis. Pada
(Tabel III) disajikan nilai resolusi kafein pada baku kafein 150ppm, sampel kopi dan
sampel kopi dengan adisi baku kafein 150ppm. Pada baku kafein tidak memiliki
resolusi karena pada larutan baku kafein tidak terdapat senyawa lain. Pada sampel
kopi memiliki nilai resolusi 4,545, dan sampel kopi dengan adisi baku kafein
memiliki resolusi 5,400. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa metode
memenuhi kriteria selektivitas yang baik memenuhi kriteria AOAC Rs ≥2. Metode
yang dilakukan memenuhi parameter selektivitas karena dapat secara spesifik
mengukur dan memisahkan analit (kafein) didalam sebuah sampel kopi, serta
nilainya memenuhi parameter yang diharapkan.

12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

y = respon
n

x = Rf

y = respon
n

(a)

x = Rf
(b)

y = respon
n

x = Rf
(c)
Gambar 3. Kromatogram kafein pada larutan baku 150ppm (a), sampel kopi tanpa adisi baku
(b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 150ppm (c)
Keterangan : Komposisi fase gerak metanol, etil asetat, dan ammonia 25% (13:77:10), plat
silika gel 60 GF254, jarak elusi 75mm, dan panjang gelombang pengamatan 275nm

13

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Dari kromatogram (Gambar 3) dapat diketahui bahwa nilai Rf baku kafein
150ppm, sampel kopi tanpa adisi baku kafein, dan sampel kopi dengan adisi baku
kafein 150ppm berturut-turut 0,70; 0,74; dan 0,74. Dari metode didapatkan nilai Rf
≥0,33 menunjukkan analit mampu terelusi dengan baik karena ikatan yang terjadi
antara analit dengan fase diam lebih kecil dibanding ikatan yang terjadi antara analit
dengan fase gerak, sehingga pemisahan analit kafein dengan senyawa lain optimal.
Penentuan kurva baku
Kurva baku dalam sebuah metode menunjukkan hubungan antara
konsentrasi seri baku dengan respon dari sebuah instrument. Respon ditunjukkan
dengan nilai AUC (Area Under Curve). Pada penelitian, penetapan kurva baku
dilakukan dengan seri baku kafein konsentrasi 200, 250, 300, 350, 400, dan 450ppm
dilakukan 3x replikasi dan dilakukan elusi pada waktu yang sama, kemudian dari
ketiga replikasi didapatkan nilai AUC yang setara dengan konsentrasi dan
menunjukkan regresi linear terbaik.
Tabel IV. Data perolehan AUC dari enam seri baku kafein

Konsentrasi
(ppm)

AUC
Replikasi 1

AUC
Replikasi 2

AUC
Replikasi 3

200,84
251,05
301,26
351,47
401,68
451,89
a
b
r2

7464,70
8530,90
10494,0
12250,8
13725,9
15327,4
a = 32,239
b = 777,25
r2 = 0,9961

6327,10
10169,9
11159,5
11598,9
13413,3
14335,1
a = 28,443
b = 0,9093
r2 = 0,9093

7529,80
10186,7
11883,4
12165,3
14524,5
14588,4
a = 27,649
b = 2789.5
r2 = 0,9323

r

r = 0,9980

r = 0,9535

r = 0,9655

Dari ketiga replikasi didapatkan kurva baku yang memiliki koefisien
korelasi paling baik dan dapat digunakan untuk kuantifikasi analit. Pada Tabel (IV)
berturut-turut dari 1 hingga 3 memiliki nilai (koefisien korelasi) r = 0,9980; 0,9535;
dan 0,9655. Berdasarkan AOAC (2013) nilai koefisien korelasi yang diharapkan
yakni ≥ 0,99. Kurva baku terpilih memiliki nilai koefisien korelasi (r) 0,9980 dengan

14

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

persamaan garis kurva baku y = 32,239x + 777,25 digunakan untuk menghitung
kadar kafein dalam sampel kopi.

RESPON (AUC)

20000
15327.4
13725.9
12250.8

15000
10494

10000

7464.7

8530.9

y = 32,239x + 777,25
r² = 0,9961
r = 0,9980

5000
0
0

100

200

300

400

500

KONSENTRASI

Gambar 4. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein (200,250,300,350,400, dan 450ppm)
dengan respon (AUC)

Penentuan akurasi dan presisi
Akurasi adalah ketepatan suatu metode analisis yang ditunjukkan dengan
kedekatan nilai yang dihasilkan dan diterima dibandingkan dengan nilai/kadar
sesungguhnya (Spangenberg, et al 2011). Presisi adalah kemampuan suatu metode
analisis untuk menunjukkan hasil yang mendekati sebenarnya, dengan proses
pengukuran yang berulang dan hasilnya dinyatakan dengan CV (Koefisien variasi)
(Spangenberg, et al 2011). Dari penelitian dilakukan penentuan akurasi dan presisi
dari larutan seri baku kafein dan adisi baku kafein ke dalam sampel (perolehan
kembali). Untuk penetapan akurasi dan presisi dari larutan seri baku dilakukan
dengan 3x replikasi. Nilai AUC yang dihasilkan kemudian diplotkan pada
persamaan garis kurva baku yang sudah diperoleh sebelumnya, sehingga diperoleh
konsentrasi terukur dan konsentrasi yang sebenarnya. Menurut AOAC (2013)
kriteria akurasi pada konsentrasi 100ppm yakni 90-108%. Konsentrasi low, mid, dan
high (200, 350 dan 450ppm) memenuhi kriteria akurasi dengan nilai yang dihasilkan
berturut-turut dari konsentrasi rendah ke tinggi sebesar 97,58%; 98,67%; dan
95,51%. Menurut AOAC (2013) kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi
100ppm tidak lebih dari 6%. Presisi konsentrasi mid, dan high (350 dan 450ppm)
memenuhi kriteria yang diharapkan dengan nilai KV yang dihasilkan dari
konsentrasi tengah ke tinggi berturut-turut 3,1544%; dan 3,6898%, sedangkan

15

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

konsentrasi rendah (200ppm) tidak memenuhi kriteria penerimaan presisi dengan
nilai KV 10,251%
Tabel V. Data akurasi dan presisi larutan seri baku kafein

Konsentrasi baku
kafein (ppm)

Kadar terukur
(ppm)

Akurasi (%)

200,84
(low)

172,81

86,048

206,56

102,85

208,57

103,85

334,26

95,106

351,76

100,08

354,40

100,83

418,78

92,674

426,61

94,406

449,43

99,457

351,47
(mid)

451,59
(high)

ratarata(%)

SD

CV
(%)

97,584

20,090

10,251

98,675

10,943

3,1554

95,512

15,925

3,6898

Pada penelitian ini juga dilakukan penentuan akurasi dengan metode adisi
baku kafein. Baku kafein yang ditambahkan sebesar 50ppm, 100ppm, dan 150ppm.
Validasi metode dengan adisi baku dilakukan 3x replikasi kemudian dihitung kadar
kafein yang terukur dengan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Menurut
AOAC (2013) nilai penerimaan akurasi pada konsentrasi 100ppm sebesar 90-108%
dan presisi tidak lebih dari 6%. Penambahan baku pada konsentrasi rendah (50ppm)
memiliki nilai akurasi sebesar 116,05% sehingga tidak memenuhi kriteria
penerimaan akurasi, sedangkan pada penambahan baku 100ppm dan 150ppm
memenuhi kriteria penerimaan akurasi dengan nilai yang didapatkan berturut-turut
sebesar 103,16% dan 93,920%. Presisi penambahan baku kafein pada konsentrasi
50, 100 dan 150ppm memenuhi kriteria penerimaan dengan nilai KV yang dihasilkan
berturut-turut sebesar 2,52%; 3,20%; dan 5,65%. Ditunjukkan dengan tabel VI.

16

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel VI. Data %penerimaan kembali dan presisi dengan adisi baku kafein

Penambahan

Kadar

Kadar

kadar adisi

Perolehan

baku kafein

non adisi

adisi

baku-non adisi

kembali

(ppm)

(ppm)

(ppm)

(ppm)

(100%)

287,88

58,260

116,05

2,5233

333,21

103,60

103,16

3,2067

371,08

141,47

93,920

5,6519

50
229,61

100
150

CV (%)

Penentuan linearitas dan rentang
Rentang sebuah metode menunjukkan konsentrasi terendah dan tertinggi
yang dapat memenuhi parameter validasi metode (linearitas, akurasi dan presisi).
Pada penelitian didapatkan bahwa rentang pengukuran seri baku kafein dari
konsentrasi 150 hingga 750ppm memiliki nilai koefisien korelasi (r) 0,9982 dan nilai
koefisien determinasi (r2) 0,9965. Maka pada penelitian ini pengukuran kafein
dinyatakan linear pada rentang 150-750ppm.
25000
20007.5
20000

17495.7
15566.1
13392.6

15000
11266.4
8755

10000

y = 22,969x + 2851,6
r² = 0,9965
r = 0,9982

5830.1

5000
0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

Gambar 5. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein (150, 250, 350, 450, 550, 650, dan
750ppm) dengan respon (AUC)

17

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

KESIMPULAN
Metode penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk dengan metode TLCDensitometri memenuhi parameter validasi yang baik dengan selektivitas Rs >2;
linearitas r = 0,9980; memenuhi kriteria %perolehan kembali pada konsentrasi
350ppm (tengah) dan 450ppm (tinggi); memenuhi kriteria penerimaan akurasi pada
50ppm (rendah), 100ppm (tengah), dan 150ppm (tinggi); memenuhi kriteria presisi
pada konsentrasi 50, 100, 150, 250, 350, dan 450ppm; serta rentang pengukuran
kadar pada konsentrasi 150 hingga 750ppm.

SARAN
Penelitian ini dapat digunakan untuk menetapkan kadar kafein dalam
sampel kopi bubuk.

18

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA
Alsunni, A.A., 2015. Energy Drink Consumption : Beneficial and Adverse
Health
Effects. International Journal of Health Sciences., 9 (4),
469-471.
AOAC, 2013. Guideline for dietary supplements and botanicals. Association of
Official Analytical Chemists.
Anonim, 2014. Farmakope Indonesia.
Bochenska, P, and Alina, P. 2013. Use Of Tlc For The Quantitative
Determination Of Acetylsalicylic Acid, Caffeine, And Ethoxybenzamide
In Combined Tablets. Journal of Liquid Chromatography & Related
technologies. 37 (20), 2929-2941.
BPOM RI, 2004. Ketentuan Pokok Pengawasan Suplemen Makanan.
Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan.
Isnindar, Wahyuono, S., Widyarini, S., Yuswanto., 2016. Optimization Method
of Caffeine Isolation of Merapi Green Coffee Beans. International
Journal of Pharmtech Research. 9 (5) 255-259.
Moffat, A. C., Osselton, M. D., Widdop, B. Clarke’s Analysis of Drugs and
Poisons.
Palacios, C., Salatino, M.L.F., Salatino, A. 2017. TLC Procedure for
Determination of Approximate Contents of Caffeine in Food and
Beverages. World Journal of Chemical Education. 5 (5). 148- 152.
Patay, E.B., Bencsik, T., Papp, N., 2016. Phytochemical overview and
medicinal importance of Coffea species from past until now. Asian
Pacific
Journal of
Tropical Medicine. 9 (12). 1127-1135
Patil, P.N., 2012. Caffeine in Various Samples and Their Analysis with HPLC
– A Review. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res. 16 (2). 76–83.
Preedy, V.R., 2012. Caffeine : Chemistry, Analysis, Function and Effects. The
Royal Society of Chemistry.
Pubchem,
2018.
Caffeine.
(Online),
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/caffeine#section=Top
Acessed 5 Mei 2018.
Riswanto, F.D.O., Lukitaningsih, RR. E., Martono, S., 2015. Analytical Method
Validation and Determination of Pyridoxine, Nicotinamide, and Caffeine
in Energy Drinks Using Thin Layer Chromatography-Densitometry.
Indones. J. Chem. 15 (1), 9-15.
Spangenberg, B., Poole, C.F., and Weins, C., 2011. Quantitative Thin Layer
Chromatography: A Practical Survey.
Torres, et al, 2015. Separation of Caffeine from Beverages and Analysis Using
Thin-Layer Chromatography and Gas Chromatography–Mass
Spectrometry. J.Chem. Educ. 92 (5), 900-902.

19

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein

20

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk
1. Kopi Robusta

21

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Kopi Arabika

22

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein
a. Perhitungan konsentrasi larutan stok kafein
Sejumlah 50,0mg kafein dilarutkan dengan pelarut hingga 50 mL
Konsentrasi larutan stok kafein 50,0mg/50mL = 1000µg/mL = 1000ppm
b. Perhitungan larutan seri kafein
Sejumlah 200µL larutan stok kafein (1000ppm) diencerkan dengan pelarut
hingga 1mL
Konsentrasi larutan seri kafein (1000ppm x 200µL) / 1000µL = 200ppm
Perhitungan lainnya dilakukan sama seperti contoh sesuai dengan jumlah
larutan stok kafein yang diambil.
Seri
ke-

Jumlah larutan stok
kafein yang diambil
(µL)

Jumlah metanol p.a

Konsentrasi seri yang

yang ditambahkan (µL)

didapat (µg/mL)

1

200

800

200

2

250

750

250

3

300

700

300

4

350

650

350

5

400

600

400

6

450

550

450

23

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang kafein

24

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

25

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 5. Hasil kromatogram kurva baku 3x replikasi

26

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

27

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Kurva baku replikasi 1
1. Konsentrasi 200ppm

2. Konsentrasi 250 ppm

28

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Konsentrasi 300 ppm

4. Konsentrasi 350 ppm

29

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Konsentrasi 400 ppm

6. Konsentrasi 450 ppm

30

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Kurva baku replikasi 2
1. Konsentrasi 200 ppm

2. Konsentrasi 250 ppm

31

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Konsentrasi 300 ppm

4. Konsentrasi 350 ppm

32

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Konsentrasi 400 ppm

6. Konsentrasi 450 ppm

33

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Kurva baku replikasi 3
1. Konsentrasi 200 ppm

2. Konsentrasi 250 ppm

34

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Konsentrasi 300 ppm

4. Konsentrasi 350 ppm

35

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Konsentrasi 400 ppm

6. Konsentrasi 450 ppm

36

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 6. Kromatogram seri baku kafein – linearitas
1. Konsentrasi 150 ppm

2. Konsentrasi 250 ppm

37

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Konsentrasi 350 ppm

4. Konsentrasi 450 ppm

38

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Konsentrasi 550 ppm

6. Konsentrasi 650 ppm

39

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7. Konsentrasi 750 ppm

40

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 7. Kromatogram seri baku kafein – akurasi dan presisi
1. Konsentrasi 200ppm replikasi 1

2. Konsentrasi 200ppm replikasi 2

41

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Konsentrasi 200ppm replikasi 3

4. Konsentrasi 250ppm replikasi 1

42

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Konsentrasi 250ppm replikasi 2

6. Konsentrasi 250ppm replikasi 3

43

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7. Konsentrasi 300ppm replikasi 1

8. Konsentrasi 300ppm replikasi 2

44

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9. Konsentrasi 300ppm replikasi 3

10. Konsentrasi 350ppm replikasi 1

45

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

11. Konsentrasi 350ppm replikasi 2

12. Konsentrasi 350ppm replikasi 3

46

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

13. Konsentrasi 400ppm replikasi 1

14. Konsentrasi 400ppm replikasi 2

47

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

15. Konsentrasi 400ppm replikasi 3

16. Konsentrasi 450ppm replikasi 1

48

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

17. Konsentrasi 450ppm replikasi 2

18. Konsentrasi 450ppm replikasi 3

49

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 8. Kromatogram adisi baku kafein (replikasi 9x) – presisi dan akurasi
1. Non adisi replikasi 1

2. Non adisi replikasi 2

50

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

3. Non adisi replikasi 3

4. Non adisi replikasi 4

51

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Non adisi replikasi 5

6. Non adisi replikasi 6

52

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7. Non adisi replikasi 7

8. Non adisi replikasi 8

53

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

9. Non adisi replikasi 9

10. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 1

54

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

11. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 2

12. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 3

55

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

13. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 4

14. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 5

56

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

15. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 6

16. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 7

57

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

17. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 8

18. Adisi baku kafein 50ppm replikasi 9

58

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

19. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 1

20. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 2

59

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

21. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 3

22. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 4

60

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

23. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 5

24. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 6

61

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

25. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 7

26. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 8

62

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

27. Adisi baku kafein 100ppm replikasi 9

28. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 1

63

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

29. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 2

30. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 3

64

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

31. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 4

32. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 5

65

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

33. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 6

34. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 7

66

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

35. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 8

36. Adisi baku kafein 150ppm replikasi 9

67

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BIOGRAFI PENULIS
Penulis

skripsi

berjudul

“Validasi

Metode

Thin-Layer

Chromatography (TLC)-Densitometri pada Penetapan Kadar
Kafein dalam kopi memiliki nama lengkap Ariel Stanley.
Penulis lahir di Semarang pada tanggal 27 Februari 1998
sebagai putra pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Arifin
dan Kardia Sofia. Pendidikan formal yang pernah ditempuh
penulis yaitu TK Nasional Pelita Hati Demak (2002-2004), SD
Nasional Pelita Hati (2004-2010), SMP Kristen YSKI Semarang (2010-2013),
SMA Kristen YSKI (2013-2015). Pendidikan dilanjutkan pada 2015 ke perguruan
tinggi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat
aktif dalam beberapa kegiatan kepanitiaan dan asisten praktikum di kampus yaitu
menjadi koordinator divisi Perlengkapan Pelepasan Wisuda I 2017, Ketua
Pelepasan Wisuda II 2017, anggota divisi Perlengkapan TITRASI 2017, anggota
divisi Perlengkapan Pharmalympic 2017, koordinator Humas Kampanye Informasi
Obat 2017,

anggota divisi Perlengkapan FACTION 2017, asisten praktikum

Farmakologi-Toksikologi
Biofarmasetika

2018,

2017,
serta

asisten

asisten

68

praktikum

praktikum

Kimia

FarmakokinetikaAnalisis

2018.