☰ Kategori

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” Skripsi

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” Skripsi

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

Monica Satya Resmi Yunita NIM : 088114171

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012

Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

Pernyataan Keaslian Karya Pernyataan Keaslian Karya Pernyataan Keaslian Karya

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah. dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah. dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- undangan yang berlaku. undangan yang berlaku. undangan yang berlaku.

Yogyakarta, Februari 2012 Yogyakarta, Februari 2012 Yogyakarta, Februari 2012 Penulis Penulis Penulis

Monica Satya Resmi Yunita Monica Satya Resmi Yunita Monica Satya Resmi Yunita

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Dharma: Dharma:

Nama Nama Nama : Monica Satya Resmi Yunita : Monica Satya Resmi Yunita : Monica Satya Resmi Yunita Nomor Mahasiswa : 088114171 Nomor Mahasiswa : 088114171 Nomor Mahasiswa : 088114171

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN

DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” DALAM COKELAT BUBUK MERK “X”

Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. saya sebagai penulis. saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Dibuat di Yogyakarta Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: Pada tanggal: Pada tanggal: Yang menyatakan Yang menyatakan Yang menyatakan (Monica Satya Resmi Yunita) (Monica Satya Resmi Yunita) (Monica Satya Resmi Yunita)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Bapa Yang Maha Kuasa atas segala berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kafein Dan Teobromin Dalam Cokelat Bubuk Merk X” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran, masukan dan diskusi dalam penyusunan skripsi.

4. Dra. M.M Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku dosen penguji atas saran, kritik dan masukan yang telah diberikan.

5. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto dan juga Pak Ketul yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium.

6. Keluarga kedua: Bulik Rini, Pakde Adi, Kris, Rio, Dio, Brio dan si kecil Karin, terima kasih atas bantuan dan dukungannya selama kuliah di Sanata Dharma.

7. Eka Riusinta Wati dan Adi Wirasaputra, terima kasih atas semangat, dukungan, kebersamaan dan kasih sayang yang menemani selama ini.

8. Albertus Radityo Hadi, atas kebersamaan, dukungan dan bantuannya.

9. Melisa Darmawan dan Grup Antistress, atas perjuangan bersama selama ini. Semuanya sangat berarti dan menambah banyak pengalaman.

10. Keluarga bahagia: Oma Dju, Tante Ucan, Brian, Kak Coz, Kak Aldosa, Vica, Cici, Cik Co, Aga dan Dimbeck, keluarga ini begitu berarti. Terima kasih sudah hadir menemani selama di sini.

11. Farmasi kelas C dan FST B 2008, kebersamaan selama ini menjadikan hidup lebih berwarna.

12. Florentinus Dika dan Katarina Kusmiyati, atas bantuan dan dukungannya selama ini.

13. Kost Lovely: Mba Pepenk dan Mas Era, Mba Yuyun, Mba Mel, Mba Pia, Mba Ye, Mba Erna dan Sari. Terima kasih atas ceria dan canda tawa ketika berkumpul bersama.

14. Mas Hendi, Mas Hanung, Mba Vera dan Mba Riris beserta keluarga, terima kasih atas bantuannya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya ilmu pengetahuan pada umumnya.

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL …………………………………………….…………. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……………….................. ii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ……………………...………….… iii HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………………. v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………….. vi PRAKATA…………………………………………………………….......... vii DAFTAR ISI………………………………………………………………... x DAFTAR TABEL…………………………………………………………... xiv DAFTAR GAMBAR……………………………………………………….. xvi DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………... xviii

INTISARI…………………………………………………………………… xx

ABSTRACT………………………………………………………………….. xxi

BAB I PENDAHULUAN…………………………………………………..

1 A. Latar Belakang………………………………………………………

1 1. Perumusan Masalah ………………………………………….....

3

2. Keaslian Penelitian …………………………………………...…

3

3. Manfaat penelitian ………………………………………………

5 B. Tujuan Penelitian …………………………………………………...

5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA……………………………………….......

6

A. Cokelat ……………………………………………………………...

6 B. Teobromin dan Kafein ………………………………………...……

7 C. Ekstraksi Sampel ……………………………………………………

10 D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ………………………………….

13 E. Validasi Metode Analisis ………………...…………………….…...

26 1. Akurasi…………………………………………………………..

27

2. Presisi…..………………………………………………..………

28 3. Linearitas ............................................................................

29 4. Rentang ...............................................................................

29 5. Spesifisitas ...........................................................................

30 F. Uji Kesesuaian Sistem ……………………………………………...

30 G. Landasan teori ………………………………………………..……..

31 H. Hipotesis …………………………………………………………....

32 BAB III METODE PENELITIAN……………………….……….………

33 A. Jenis penelitian …………………………………….........................

33 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional …..………………….

33 1. Klasifikasi Variabel ...........................................................

33

2. Definisi Operasional ……………………………………....…

33 C. Bahan-bahan Penelitian ……………………………...………….…..

34 D. Alat-alat Penelitian …………………………………….…………....

34 E. Tatacara Penelitian ………………………………..………………...

35 1. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein ……………….

35

2. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein…….…

35

3. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran dan Penetapan Kurva Baku……………………………………………………………..

35

4. Penetapan Panjang Gelombang Pengukuran …..………….....…

36 5. Preparasi Sampel …………………………………………...…...

37 6. Validasi Metode Analisis ……………………………………….

37 7. Uji Kesesuaian Sistem ………………………………………….

39 F. Analisis Hasil ………………………………………….……………

39 1. Akurasi………………………………………………….……….

39 2. Presisi …………………………………………………………...

40 3. Linearitas dan Rentang ………………………………………….

40

4. Spesifisitas………………………………………………………

40 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…..……………………..………..

41 A. Pembuatan Fase Gerak …………………………………......………

41 B. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan ………………....……

47 C. Pembuatan Larutan Baku dan Penetapan Kurva Baku………..……

51 D. Preparasi Sampel …… ………………………………………..…….

58 E. Validasi Metode Analisis …………………………………………...

61 1. Akurasi ……………………………….…………...…………….

62 2. Presisi …………………………………………...…………...….

65 3. Linearitas ………………………….………...……….………….

68

4. Rentang …………………………………………………………

69 5. Spesifitas ………………………………………………………..

69 F. Uji Kesesuaian Sistem ................................................................

70

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN..…………….……………….........

73 A. Kesimpulan ……………………………..…………………………..

73 B. Saran ……………………………………..…………………….…....

73 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………....

75 LAMPIRAN …………………………………………………………….......

79 BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………..….….... 124

DAFTAR TABEL

55 Tabel XI Hasil penetapan % recovery baku teobromin …………...…

67 Tabel XX Hasil penetapan CV kafein (spike ke sampel) …………..…

66 Tabel XIX Hasil penetapan CV teobromin (spike ke sampel) …………

66 Tabel XVIII Batasan nilai CV berdasarkan perhitungan ………………..

66 Tabel XVII Hasil penetapan CV Baku Kafein ………………………….

65 Tabel XVI Hasil penetapan CV Baku Teobromin…………………...…

64 Tabel XV Hasil penetapan % recovery baku kafein (spike ke sampel)..

63 Tabel XIV Hasil penetapan % recovery baku teobromin (spike ke sampel) ……………………………………………………..

63 Tabel XIII Nilai rentang % recovery berdasarkan perhitungan ………..

62 Tabel XII Hasil penetapan % recovery baku kafein ………..…………

55 Tabel X Data kurva baku kafein (AUC) …………………………….

Halaman Tabel I

54 Tabel IX Data kurva baku teobromin (AUC) ………………………..

53 Tabel VIII Data kurva baku kafein ( peak height ) …………………….

37 Tabel VII Data kurva baku teobromin ( peak height )………………...

31 Tabel VI Pembuatan larutan campuran tebromin dan kafein .............

29 Tabel V Parameter uji kesesuaian sistem …………………………...

28 Tabel IV Kriteria presisi yang dapat diterima ……………….………

27 Tabel III Kriteria rentang recovery …………………………………..

18 Tabel II Parameter validasi untuk tiap kategori analisis ..................

Nilai indeks polaritas pelarut ………………………………

67

Tabel XXI Hasil uji kesesuaian sistem untuk teobromin …………....…

71 Tabel XXII Hasil uji kesesuaian sistem untuk kafein …………………..

71

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Theobroma cacao ………………………………………...

6 Gambar 2. Struktur Teobromin dan Kafein ……………............……

7 Gambar 3. Alat sokhletasi…………………………………………….

12 Gambar 4. Instrumentasi KCKT………………………………….......

15 Gambar 5. Pemisahan dua senyawa ………………………………….

20 Gambar 6. Cara mengukur t , W dan W suatu kromatogram .....….

21 R h/2 Gambar 7 Difusi Eddy dalam kromatografi kolom ………………….

23 Gambar 8. Transfer massa pada fase diam …………………………...

24 Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak …………………………..

24 Gambar 10. Interaksi Trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C …………………………………………………...……

42

18 Gambar 11. Bagian nonpolar teobromin dan kafein …………………..

43 Gambar 12. Interaksi teobromin dengan fase diam C ……………….

44

18 Gambar 13. Interaksi kafein dengan fase diam C ……………………

44

18 Gambar 14. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% ……………………………………….

45 Gambar 15. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% ……………………………….………

45 Gambar 16. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) 46 dengan flow rate 0,8 mL/menit …………………………..

Gambar 17. Gugus kromofor pada kafein dan teobromin ……….……

48 Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan  = 275 nm pada

maks

49 pelarut akuabides ……………………………………….... Gambar 19.

Spektra serapan kafein dengan  = 275 nm pada

maks

50 pelarut akuabides ………………………………………… Gambar 20 . Kromatogram hasil orientasi sampel dengan fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan

52

flow rate 0,8 mL/menit ……………………………..……

Gambar 21. Kurva hubungan antara konsentrasi teobromin (ppm) vs AUC/40000 ……………......………………………..……

57 Gambar 22. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein (ppm) vs AUC/40000 ………………………..…………………..…

58 Gambar 23. Reaksi pembasaan kafein menggunakan NaOH …………

60 Gambar 24. Reaksi pembasaan teobromin menggunakan NaOH …….

60

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Certificate of Analysis Teobromin …………………....….

80 Lampiran 2. Certificate of Analysis Kafein………………………….....

81 Lampiran 3. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein Replikasi I …………………………………..……............

82 Lampiran 4. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein Replikasi II ……………………………............………….

85 Lampiran 5. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi III ……………………………………….....……

89 Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku…………………………………………….…………

92 Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi I) ………………………………………………

96 Lampiran 8. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi II) ……………………………………..………

98 Lampiran 9. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi III) ………………......………………,………. 100

Lampiran 10. Data penimbangan dan perhitungan recovery …………… 102 Lampiran 11. Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi I ………. 106 Lampiran 12 Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi II ….….. 108 Lampiran 13 Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi III …….. 111 Lampiran 14 Data penimbangan dan perhitungan % recovery

(spike sampel)……...……………………………………... 113 Lampiran 15 Perhitungan Rentang % recovery dan CV ....................... 117 Lampiran 16 Kromatogram hasil uji kesesuaian sistem ....................... 119 Lampiran 17 Perhitungan Tailing factor (Tf), Column Plate Number

122 (N) dan Resolusi (Rs) ..................................................

INTISARI

Teobromin dan kafein merupakan kandungan utama yang ada dalam cokelat bubuk. Kedua senyawa ini termasuk golongan ksantin yang memiliki efek stimulan. Untuk menghindari adanya pemalsuan produk, perlu dilakukan analisis kandungan teobromin dan kafein sebagai senyawa identitas pada cokelat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk.

Penelitian ini bersifat non eksperimental, menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan kolom Kromasil C (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak

18

campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60), kecepatan alir 0,8 mL/menit dan detektor UV 275 nm.

Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode memiliki linearitas yang baik yaitu r = 0,99978 (teobromin) dan r = 0,99989 (kafein). Nilai % recovery dan CV berturut-turut untuk level kadar rendah, sedang dan tinggi adalah 104,12% dan 1,24%; 99,89% dan 1,67%; 99,09% dan 0,90% untuk teobromin serta 109,99% dan 1,41%; 101,55% dan 2,86%; 98,69% dan 0,56% untuk kafein. Rentang pengukuran yaitu 2,5-120 ppm (teobromin) dan 1,25-80 ppm (kafein). Nilai resolusi yang diperoleh yaitu 2,08. Berdasarkan hasil tersebut maka metode ini memiliki validitas yang baik untuk penetapan kadar teobromin dan kafein.

Kata kunci : teobromin, kafein, KCKT fase terbalik, validasi metode

ABSTRACT

Theobromine and caffeine are major component in cocoa powder. Both of them are an alkaloid xanthine which have stimulant effect. To avoid the counterfeit of product, necessary to determine theobromine and caffeine as identity compounds of cocoa powder. This study aims to discover validity of reversed phase HPLC method which is employed in theobromine and caffeine determination.

This is a non experimental descriptive research using reversed phase HPLC method by using Kromasil C (250 x 4,6 mm, 5 m), methanol and

18

aquabidest/TEA 3% mobile phase (40 : 60), flow rate 0,8 mL/minute and UV detector 275 nm.

Validity parameter observed included accuracy, precision, linearity, range and specificity. Result of the study shows that the method holds a decent linearity r = 0,99978 (theobromine) and r = 0,99989 (caffeine). Recovery and CV value respectively are 104,12% and 1,24%; 99,89% and 1,67%; 99,09% and 0,90% for theobromine 20, 60 and 120 ppm whereas caffeine 10, 30 and 60 ppm are 109,99% and 1,41%; 101,55% and 2,86%; 98,69% and 0,56%. Range of the measurement are 2,5-120 ppm for theobromine and 1,25-80 ppm for caffeine. Resolution value is 2,08. Based on the result, it can be summed up that this method is valid to determine theobromine and caffeine.

Keywords : theobromine, caffeine, reversed phase HPLC, method validation

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Produk makanan berbahan dasar cokelat sekarang ini sudah dikonsumsi

secara luas oleh penduduk dunia. Hal ini karena cokelat merupakan makanan bergizi yang mengandung asam amino (kecuali metionin dan arginin), vitamin, mineral, dan lemak (Ramli et al., 2001). Salah satu contoh produk olahan cokelat yang banyak dikonsumsi adalah cokelat bubuk (cocoa powder) yang biasanya digunakan untuk membuat minuman cokelat.

Di dalam cokelat juga mengandung senyawa golongan alkaloid yaitu teobromin dan kafein. Kedua senyawa tersebut termasuk golongan xanthine yang memiliki efek stimulan dan bronkodilator (Henderson and Major, 2006). Oleh karena memiliki efek stimulan, maka tidak dianjurkan untuk dikonsumsi secara berlebihan karena dimungkinkan dapat menyebabkan adiksi (Czech et al., 2011).

Banyaknya minat konsumen akan produk cokelat, maka keadaan ini dijadikan kesempatan bagi banyak produsen untuk memalsukan produk. Banyak produsen yang menggunakan pewarna makanan termasuk pewarna cokelat dengan tujuan untuk mendapatkan keuntungan. Oleh karena itu, untuk menjamin keamanan saat kita mengkonsumsi produk olahan cokelat yang berupa cokelat bubuk, maka perlu dilakukan penelitian untuk menganalisis kandungan teobromin dan kafein sebagai senyawa identitas pada cokelat. Teobromin dan kafein memiliki kemiripan struktur sehingga diperlukan metode yang dapat memisahkan antara teobromin dan kafein agar keduanya dapat diukur secara tepat. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa dengan kemiripan struktur adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Penelitian mengenai teobromin dan kafein dalam produk cokelat telah dilakukan oleh Ramli et al. (2001) menggunakan kolom Bondapak (30 cm x 4,0 mm, 10 µm), fase gerak campuran metanol : asam asetat : air (20 : 1 : 79) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Hasil penelitian ini belum memenuhi syarat linearitas yang baik karena koefisien korelasi (teobromin dan kafein) < 0,999.

Czech et al. (2011) juga telah melakukan penelitian tentang teobromin dan kafein dalam kopi menggunakan fase gerak campuran bufer amonium asetat 20 mM pH 7,5 dan metanol (80 : 20), kolom C Phenomenex Kinetex 2,6 µm dan

18

kecepatan alir 1,0 mL/menit. Hasil penelitian ini memiliki linearitas yang baik tetapi belum dapat memisahkan teobromin dari matriks sampel.

Penelitian terdahulu seperti yang dikemukaan di atas, belum memenuhi persyaratan validasi yang ditetapkan. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan suatu metode yang memenuhi parameter-parameter validasi. Penelitian ini merupakan satu rangkaian penelitian yaitu “Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak Pada Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein Dalam Cokelat Bubuk Dengan Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” oleh Wati (2012) dan “Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Cokelat Bubuk Merk X Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” oleh Darmawan (2012).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Baba et al. (2007), cokelat bubuk mengandung teobromin dan kafein dalam jumlah yang cukup besar sehingga jenis penelitian ini tergolong penelitian kategori 1 yaitu analisis suatu senyawa dengan kadar besar (Snyder et al., 2010). Untuk analisis pada kategori 1, parameter-parameter yang harus divalidasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas. Oleh karena itu, pada penelitian ini parameter-parameter validasi tersebut akan dianalisis untuk mengetahui bahwa metode yang akan digunakan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein pada cokelat bubuk telah valid.

1. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut maka permasalahan yang muncul adalah apakah metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C merek

18 KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA

3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit mempunyai validitas yang baik untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk yang didasarkan pada parameter akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang teobromin dan kafein pada buah cokelat sudah banyak dilakukan. Ramli et al. (2001) telah melakukan penelitian mengenai teobromin dan kafein dalam produk cokelat dengan metode KCKT menggunakan kolom Bondapak (30 cm x 4,0 mm, 10 µm), fase gerak campuran metanol : asam asetat : air (20 : 1 : 79). Dalam penelitian ini digunakan kolom C merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak campuran

18

metanol dan akuabides/TEA 3% (40 : 60). Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis fase gerak dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Ramli et al. dengan penelitian ini.

Czech et al. (2011) juga telah melakukan penelitian tentang teobromin dan kafein dalam kopi dengan metode KCKT menggunakan fase gerak berupa campuran bufer amonium asetat 20 mM pH 7,5 dan metanol (80 : 20) dan kolom C Phenomenex Kinetex 2,6 µm. Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis

18

matriks sampel, fase gerak dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Czech et al. dengan penelitian ini.

Selain itu, Erickson (2011) juga telah melakukan penelitian yang serupa dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran air dan asetonitril (90 : 10) dan kolom C Kinetex 2,6 µm (XB-100A). Pada penelitian ini digunakan

18

sampel daun teh hijau dan produk olahannya. Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis fase gerak, matriks sampel, dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Erickson dengan penelitian ini.

Analisis teobromin dan kafein juga dilakukan oleh Marx et al. (2003) dengan metode kromatografi gas dengan spesifikasi Hewlett-Packard HP 5890, injektor otomatis 7673A dan kolom kapiler BPX 35 (25 m x 0,25 mm, 0,25 µm). Dengan demikian, terdapat perbedaan sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini dengan yang dilakukan oleh Marx et al. (2003).

3. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut:

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai validasi metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk.

b. Manfaat Metodologis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa metode KCKT fase terbalik ini dapat digunakan untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein dengan validitas yang memenuhi persyaratan.

c. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang kefarmasian mengenai parameter- parameter validasi pada penetapan kadar teobromin dan kafein dengan metode KCKT fase terbalik.

B. Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang muncul maka penelitian ini bertujuan untuk melakukan validasi metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak

18

campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan validitas yang baik.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Cokelat

Gambar 1. Theobroma cacao

Theobroma cacao disebut juga pohon cacao atau cocoa yang merupakan

tumbuhan asli dari daerah tropis di benua Amerika. Biji buah cokelat biasanya digunakan untuk membuat produk olahan cokelat berupa cokelat bubuk atau batangan (Anonim, 2011). Cocoa powder adalah produk olahan cokelat yang didapatkan dari transformasi mekanis biji cokelat menjadi serbuk cocoa press

cake. Cokelat bubuk mengandung tidak kurang dari 10-20% cocoa butter dan 80-

90% bahan cocoa bebas lemak yang telah dikeringkan (Alexander et al., 2008).

Produk cokelat sudah dikonsumsi secara luas mengingat produk tersebut telah terbukti sangat bermanfaat terutama karena mengandung asam amino (kecuali metionin dan arginin), vitamin, mineral dan lemak dalam jumlah besar (Ramli et al., 2001). Salah satu produk olahan cokelat adalah cokelat bubuk.

Kandungan yang terdapat dalam cokelat bubuk secara umum untuk tiap 100 g yaitu : 23,0 g protein; 11,5 g lemak; 23,1 g karbohidrat; 26,9 g serat; 7,7 g mineral; 377 mg epikatekin; 135 mg katekin; 158 mg prosianidin B2; 96,1 mg prosianidin Cl; 2192 mg teobromin dan 470 mg kafein (Baba et al., 2007).

B. Teobromin dan Kafein

1. Struktur Teobromin dan Kafein

_{HN N} _{O O} _{N N} _{CH CH}

₃

_{H C} ₃ ₃ _{O N O N} _{CH CH} ₃ N N ₃ (a) (b)

Gambar 2. Struktur Teobromin (a) dan Kafein (b)

Teobromin dan kafein merupakan golongan ksantin yang banyak terdapat dalam kopi, teh, cokelat dan produk-produk olahannya. Teobromin dan kafein merupakan komponen utama golongan metilksantin yang terdapat pada tumbuhan

Theobroma cacao. Kedua senyawa inilah yang memberikan rasa pahit pada

produk cokelat dan memiliki efek farmakologis yaitu stimulan (kafein berefek pada sistem saraf dan teobromin menyebabkan diuresis) (Ramli et al., 2001).

Golongan ksantin diabsorpsi oleh tubuh hampir 100% dan berada dalam sirkulasi darah 5 menit setelah dikonsumsi (Henderson and Major, 2006).

2. Deskripsi Teobromin

Teobromin termasuk golongan alkaloid yang terdapat dalam biji

Theobroma cacao, berbentuk serbuk putih yang dapat menyublim pada suhu

o o

290 C sampai 295

C. Berat molekulnya adalah 180,2 g/mol. Dalam larutan yang

%

bersifat asam memiliki A = 563 pada panjang gelombang 272 nm dan 274 nm

o

dalam larutan basa. pKa teobromin yaitu 10,0 (25 C) (Moffat et al., 2004).

Teobromin mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% C H N O dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Berbentuk

7

8

4

2