1.1. Latar Belakang - Laporan penelitian POTENSI BIJI ANGGUR (Vitis vinifera) SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI - Unika Repository
1. PENDAHULUAN 1.1.
Latar Belakang
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu contoh mikroorganisme yang menguntungkan dan mempunyai peran penting dalam industri pangan, seperti dalam proses fermentasi makanan sehingga dapat memperpanjang umur simpan produk. BAL selain menguntungkan bagi industri pangan juga memiliki keuntungan bagi kesehatan, terutama bagi pencernaan manusia. Hasil proses fermentasi oleh bakteri asam laktat berupa asam laktat dan sebagian kecil asam-asam lain seperti asam asetat, etanol, dan CO
2 yang berperan menghambat aktivitas bakteri pembusuk dan patogen. Contohnya
pada penelitian aktivitas antimikroba bakteri asam laktat yang diisolasi dari daging sapi (Al-Allaf et al., 2009), susu fermentasi (Savadogo et al., 2004), dan minuman fermentasi tradisional Etiopia (Tadasse et al., 2005). Kegunaan BAL dalam industri pangan mendorong dilakukannya eksplorasi strain BAL dari berbagai sumber seperti pada produk fermentasi buah dan sayuran (Rahayu & Margino, 1997).
Isolasi serta identifikasi BAL dari berbagai sumber bahan pangan terus dikaji seperti pada penelitian Rahayu (2003) ditemukan BAL spesies Lactobacillus plantarum dan
Lactobacillus plantarum-pentosus yang diperoleh dari hasil fermentasi mandai
cempedak yang berasal dari daerah Banjarmasin. Sedang Forouhandeh et al., (2010), menemukan bahwa di dalam yoghurt yang berasal dari Bahmenj Iran menghasilkan BAL spesies Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei. Penelitian Yuliana & Dizon (2011), pada tempoyak (fermentasi durian) yang berasal dari daerah Filipina terdapat BAL dengan spesies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sp , Weissella paramesenteroides, dan Pediococcus acidilactici.
Pertumbuhan BAL sangat dipengaruhi faktor intrinsik dan ekstrinsik sehingga adanya perbedaan dari kondisi suatu daerah dapat memungkinkan terjadinya perbedaan jenis BAL yang diperoleh walaupun bahan yang digunakan sama. Diharapkan bakteri asam bambu betung (Dendrocalamus asper) Lokal Mranggen dapat bermanfaat bagi keragaman bakteri asam laktat bahan baku lokal. Hal ni berarti menambah temuan bakteri asam laktat yang bersumber dari bahan baku lokal. Dalam industri pangan manfaat bakteri asam laktat diantaranya dapat berguna sebagai probiotik dalam makanan ataupun minuman (Soomro et al., 2002). BAL digunakan sebagai probiotik karena sebagian strain BAL bukan merupakan bakteri patogen dan kemampuannya untuk hidup di saluran pencernaan serta dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen (sifat antimikrobial) sehingga dapat dimanfaatkan untuk kesehatan tubuh (Rolfe, 2000). Secara umum beberapa genus BAL telah diketahui memiliki peranan penting dalam industri pangan adalah Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus dan Streptococcus. Berdasarkan revisi terbaru, genus yang saat ini termasuk dalam BAL meliputi
Aeroccous, Carnobacterium (Lactobacillius atopikal), Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tertragenococcus
atau Pediococcus halophilus, Weisella, dan Vaganococcus (Rahayu & Margino, 1997).
1.2. Tinjauan Pustaka
1.2.1 Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat merupakan bakteri chemotrophic, yang memiliki ciri-ciri khas seperti: (i) tergolong gram positif; (ii) berbentuk cocci, rod-shape, coccobacilli umumnya membentuk rantai; (iii) hanya membutuhkan sedikit oksigen (micro-
aerophilic ); (iv) tidak membentuk spora; (v) tidak bergerak (non-motile); dan (vi)
bereaksi negatif terhadap hidrogen peroksida (H
2 O 2 ). Bakteri asam laktat tidak
menghasilkan enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Beberapa bakteri yang memerlukan oksigen akan membentuk hidrogen peroksida, yang merupakan produk sampingan metabolisme aerob yang bersifat toksik. Bakteri yang mampu menghasilkan enzim katalase, akan bertahan hidup dalam kondisi aerobik (Tadesse et al., 2005; Battcock & Azam-Ali, 1998). Menurut Josephsen & Jespersen dalam Hui et al. (2004), bakteri asam laktat menghasilkan asam laktat dan
BAL terbagi dalam dua golongan, yaitu bakteri homofermentatif dan bakteri heterofermentatif. Bakteri homofermentatif memecah gula menjadi asam laktat, sedangkan bakteri heterofermentatif mengubah gula menjadi asam laktat, asam asetat, dan etanol (Battcock & Azam-Ali, 1998). Proses biokimia pembentukan asam laktat pada bakteri homofermentatif (Gambar 1) dan heterofermentatif (Gambar 2). Asam laktat yang dihasilkan dari aktivitas metabolisme bakteri asam laktat menyebabkan kondisi bahan mentah (makanan) menjadi asam. Hal ini justru menguntungkan, mengingat kondisi pH rendah menghambat hampir semua mikroba perusak (food
spoilage microbes ).
Glukosa
Heksokinase
Glukosa-6-fosfat
Fosfoglukosa isomerase
Fruktosa-6-fosfat
Fosfofruktokinase
Fruktosa-1,6-bifosfat
Aldolase
Gliseraldehid-3-fosfat
Gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase
1,3-bifosfogiserat
Fosfogliserat kinase
3-fosfogliserat
Fosfogliserat mutase
2- fosfogliserat
Enolase
Fosfoenolpiruvat
Piruvat kinase
Piruvat
Glukosa-6-fosfat Heksokinase dehidrogenase
Glukosa Glukosa-6-fosfat 6-fosfoglucono- δ-lakton
Laktonase
6-fosfoglukonat
6-fosfoglukonat dehidrogenase
Ribulose 5-fosfat
Fosfopentose epimerase
Xilulose-5-fosfat
Xilulose-5-fosfat fosfoketolase
Asetil fosfat Gliseraldehid-3-fosfat
Gliseraldehid-3- Acetat kinase fosfat dehidrogenase
Etanal 1,3-bifosfogiserat
Asam asetat Fosfogliserat kinase 3-fosfogliserat
Etanol
Fosfogliserat mutase
2- fosfogliserat
Enolase
Fosfoenolpiruvat
Piruvat kinase
Piruvat
1.2.2. Fermentasi Durian, Dami Nangka dan Rebung Kuning Bambu Betung 1.2.2.1.
Fermentasi Durian (Durio zibethinus Murr.) Durian (Durio zibethinus Murr.) seringkali disebut
“king of fruit” (Gambar 3) semakin
dikenal oleh masyarakat luas karena mempunyai rasa yang enak. Durian yang memiliki rasa kurang enak seperti rasa yang asam seringkali hanya dibuang begitu saja tanpa ada pengolahan lebih lanjut (Rukmana, 1996).
Gambar 3. Durian (Durio zibethinus Murr.) yang digunakan sebagai bahan fermentasi tempoyak (Dokumentasi Hengky Saputra, 2011) Kandungan air dalam 100 gram durian adalah 67 g (Tabel 1). Kandungan air yang tinggi dapat menyebabkan durian mudah rusak atau busuk. Proses fermentasi merupakan salah satu cara pengolahan dan pengawetan durian menghasilkan produk yang dikenal dengna nama lokal “tempoyak”. Bahan utama yang diperlukan untuk membuat tempoyak adalah daging durian dan garam. Fermentasi berlangsung secara alami tanpa penambahan inokulum. Penambahan garam diperlukan untuk membentuk tekstur dan menyediakan lingkungan hidup bagi bakteri asam laktat sehingga hanya mikroorganisme tahan garam yang dapat hidup. Garam akan membentuk tekstur durian menjadi lunak karena terjadinya pengeluaran cairan dari durian (peristiwa osmosis)
Tabel 1. Kandungan gizi dalam 100 gram buah durian (Durio zibethinus Murr.) Kandungan gizi Kadar Air (g)
67 Protein (g) 2,5 Lemak (g) 2,5 Karbohidrat (g) 28,3 Serat (g)
1,4 Abu (g)
0,8 Kalsium (mg)
20 Fospor (mg)
63 Kalium (mg) 601 Tiamina (mg) 0,27 Riboflavin (mg) 0,29 Vitamin C (mg)
57 Sumber: (Verheij & Coronel, 1997).
1.2.2.2. Fermentasi Dami Nangka (Artocarpus heterophyllus Lamk)
Dami nangka (Gambar 4) merupakan bagian nangka yang dapat diolah dan diproses sebagai bahan makanan tradisional. Jika tidak diolah lebih lanjut, dami nangka sering di buang atau merupakan limbah dan menempati porsi 40-50% dari total limbah yang dihasilkan dari buah nangka. Proses fermentasi dami nangka dengan penambahan garam menghasilkan produk yang dikenal dengan nama “mandai” tanpa penambahan inokulum (Nur, 2009).
1.2.2.3. Fermentasi Rebung Kuning Bambu Betung (Dendrocalamus asper)
Rebung merupakan tunas muda tanaman bambu yang muncul dipermukaan dasar rumpun. Tunas muda bambu dapat dikonsumsi, sehingga digolongkan ke dalam sayuran. Rebung yang dapat dikonsumsi adalah rebung yang berasal dari bambu betung (Dendrocalamus asper), bambu temen (Gigontochloa verticillata), bambu kuning (Dendrocalamus litiforus), dan bambu hijau (Bambusa aldhami) (Andoko, 2003). Morfologi rebung berbentuk kerucut, setiap ujung glugut memiliki bagian seperti ujung daun bambu dengan warna kekuningan (Gambar 5). Rebung mentah mempunyai kandungan air sekitar 90% setiap berat bersihnya (Rai, 2007).
Gambar 5. Rebung kuning bambu betung (Dendrocalamus asper) (Dokumentasi Donny Setiadi, 2011)
Proses fermentasi rebung dilakukan dengan menambahkan larutan garam. Larutan garam berfungsi agar cairan yang terdapat dalam rebung tertarik keluar melalui proses osmosis dan juga berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen sehingga diharapkan hanya bakteri asam laktat saja yang tumbuh. Hasil akhir proses fermenatasi sering disebut asinan rebung. Pada proses fermentasi rebung, tidak ditambahkan inokulum.
1.3. Tujuan Penelitian
Melakukan uji terhadap bakteri asam laktat dengan menggunakan API 20 STREP
test kit
dan API 50 CHL 2.
MATERI DAN METODE
Penelitian akan dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Teknologi Pertanian, Unika Soegijapranata untuk fermentasi durian (Durio zibethinus Murr.) lokal Gunung Pati, dami nangka (Artocarpus heterophyllus Lamk) var. salak, Gunung Pati, rebung kuning bambu betung (Dendrocalamus asper) Lokal Mranggen
2.1. Materi 2.1.1. Alat
Peeralatan yang digunakan adalah tabung reaksi, tabung durham, labu takar 100 ml, cawan petri, Erlenmeyer (250 ml dan 500 ml), mikropipet, bluetip, yellowtip, bunsen,
autoclave
Hirayama HL36AE, jarum ose, blender, penangas air (Yellow Line MAG HS 7), vortex (Thermolyne 37600), mixer, timbangan digital (Ohaus), mikroskop trinokuler (Olympus BX41) dengan kamera Olympus DP20, kaca preparat, pipet ukur, pipet tetes dan eppendorf tube.
2.1.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah durian (Durio zibethinus Murr.) lokal Gunung Pati, Semarang, dami nangka (Artocarpus heterophyllus Lamk) var. salak, Gunung Pati, rebung kuning bambu betung (Dendrocalamus asper) Lokal Mranggen. Media agar MRS (Pronadisa) dan broth MRS (Merck, Gemany), CaCO
3 , 96% alkohol, larutan 1 M
NaOH, larutan 1 M HCl, reagensia pengecatan gram dan spora (larutan ungu kristal, larutan iodium gram, larutan safranin, hijau melakit), 3% larutan hidrogen peroksida (H
2 O 2 ), indikator fenolftalein 1% dan akuades steril.
2.2. Metode
Tempoyak, Pengujian Total asam mandai, asinan laktat (Amin, et al, 2004) rebung kuning
- 1 -7
Pengenceran menggunakan pepton water steril 10 sd 10 Isolasi pada media MRS agar dari masing-masing pengenceran
Identifikasi
Morfologi (Sneath et al., 1984) Pewarnaan gram (Hadioetomo, 1993) Pewarnaan spora (Lay, 1994) Aktivitas katalase (Lay, 1994) Uji Motilitas (Rahayu & Margino, 1997) Uji Produksi gas (Rahayu & Margino, 1997).
Pertumbuhan pada berbagai pH, suhu dan NaCl (Rahayu & Margino, 1997)
Identifikasi spesies API 50 CHL dan 20 STREP test kit dan asinan rebung.
Pembuatan Tempoyak, Mandai dan Asinan Rebung Kuning 2.2.1.1.
Pembuatan Tempoyak Sejumlah 125 g daging durian matang ditambahkan 3,75 g garam (3% (b/b)), dicampur hingga rata. Campuran yang sudah rata dimasukkan dalam wadah plastik dan ditutup rapat.
Fermentasi akan berlangsung secara alami selama 8 hari pada suhu ruang (28-34
C) (Yuliana & Dizon, 2011).
2.2.1.2. Pembuatan Mandai Dami nangka sejumlah 100 g dicampur dengan larutan garam sejumlah 15% dari berat dami nangka yang digunakan. Dami nangka direndam sampai seluruh permukaan terendam.
Kontainer ditutup dan proses fermentasi berlangsung selama 7 hari pada suhu ruang sekitar
o 30 C (Rahayu, 2003).
2.2.1.3. Pembuatan Asinan Rebung Kuning Rebung kuning bambu betung yang telah dibersihkan sejumlah 200 g direndam dalam larutan garam 2,5% sebanyak 350 ml (seluruh bagian rebung terendam air larutan garam), kemudian kontainer ditutup. Proses fermentasi berlangsung selama 7 hari pada suhu ruang
o sekitar 30 C (Rahayu, 2003).
2.2.2. Pengujian Total Asam Laktat
Masing-masing sampel (tempoyak, mandai, asinan rebung kuning) ditimbang 10 g, dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan dengan air destilasi sampai tanda tera. Sejumlah 5 ml sampel yang telah diencerkan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 2 tetes indikator fenolftalein 1%. Selanjutnya dititrasi menggunakan larutan 0,1 N NaOH sampai berwarna merah muda. Total asam tertitrasi diasumsikan sebagai total asam laktat (%). Penghitungan total asam tertitrasi adalah sebagai berikut: g sampel (Amin et al., 2004) 2.2.3.
Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat
Sejumlah 25 g sampel diencerkan ke dalam 225 ml 0,1% pepton steril (merupakan
- 1 -6
pengenceran 10 ) dan dilakukan pengenceran hingga 10 . Setiap pengenceran diambil 0,1 ml dan diinokulasikan pada media agar MRS yang mengandung 1% CaCO
3 dengan metode spread plate
secara aspetis dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Koloni yang membentuk zona bening, diidentifikasi sebagai bakteri asam laktat. Kultur dimurnikan dengan metode dan media yang sama (Yuliana & Dizon, 2011; Amin et al., 2006). Setiap koloni yang terbentuk diamati dan diidentifikasi hingga tahap genus berdasarkan morfologi, pewarnaan gram, pewarnaan spora, aktivitas katalase, uji motilitas, dan uji produksi gas. Kemudian diseleksi dengan menumbuhkan isolat pada berbagai suhu, pH, dan NaCl (Rahayu & Margino,1997). Penamaan taksonomi dilakukan menggunakan
Bergey’s manual of Determinative Bacteriology
(Sneath et al., 1984).
2.2.4. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Karakter Morfologikal
Identifikasi isolat bakteri asam laktat berdasarkan jumlah isolat dan bentuk (coccus, rod-
shape, coccobacillus ) dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop (Sneath, et
al., 1984).2.2.4.1. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Pewarnaan Gram
Isolat bakteri asam laktat dioleskan pada gelas obyek, kemudian diberi 2 tetes larutan ungu kristal dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, sisa larutan ungu kristal dibuang dan gelas obyek dibilas menggunakan akuaes. Pengecatan dilanjutkan dengan larutan iodium gram selama 3 menit, dan dibilas menggunakan akuades. Setelah itu, dilakukan pemucatan menggunakan alkohol 95% setetes demi setetes selama 20 detik, kemudian bilas dengan akuades. Pengecatan terakhir dilakukan menggunakan larutan safranin selama 1
- – 2 menit,
2.2.4.2. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Pewarnaan Spora
Isolat bakteri asam laktat dioleskan pada kaca objek dan difiksasi di atas api bunsen. Kaca objek diletakkan di atas kaki tiga dan kaca objek ditutup dengan kertas saring, diberi pewarna hijau melakit dan dipanaskan selama 5 menit. Panas akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga hijau melakit dapat masuk ke dalam spora. Kaca objek didinginkan selama 1 menit kemudian kertas saring dibuang dan dibilas dengan air. Diberi pewarna safranin dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air. Pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 X 100 (Lay, 1994).
2.2.5. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Aktivitas Katalase
Satu ose isolat bakteri asam laktat dioleskan pada kaca objek yang telah diberi alkohol, kemudian ditetesi dengan larutan H
2 O 2 . Katalase positif ditandai oleh pembentukan gelembung udara pada koloni dan sekitarnya (Lay, 1994).
2.2.6. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Motilitas
Isolat bakteri asam laktat diambil secara aseptis menggunakan jarum ose yang lurus bagian ujungnya, kemudian isolat bakteri ditusukkan ke dalam MRS agar lunak tegak (konsentrasi agar pada MRS diturunkan sampai 0,5%). Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 48 jam. Isolat non motil hanya tumbuh pada sekitar tusukan inokulasi sedangkan isolat motil akan tumbuh menyebar (Rahayu & Margino, 1997).
2.2.7. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Produksi Gas
Isolat ditumbuhkan pada 5 ml media MRS broth yang diberi tabung durham terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat selama dalam pertumbuhannya. diidentifikasi sebagai bakteri heterofermentatif, sedangkan isolat yang tidak menghasilkan gelembung gas disebut homofermentatif (Rahayu & Margino, 1997).
2.2.8. Kemampuan Pertumbuhan Bakteri pada Berbagai Suhu, pH, dan NaCl 2.2.8.1.
C, 45
C, dan 50
C) Pertumbuhan Bakteri pada Suhu (10
Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan dalam 5 ml media MRS broth dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. Kemudian dari 5 ml inokulum bakteri asam laktat, diambil 50 μl inokulum dan diinokulasikan ke dalam 5 ml medium MRS broth. Kemudian diinkubasi pada suhu 10
C, 45
C, dan 50 C selama 48 jam. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan mengukur nilai absorbansi pada panjang gelombang 700 nm jam ke-24 dan ke-48 (Rahayu & Margino, 1997).
2.2.8.2. Pertumbuhan Bakteri pada pH (4,4 dan 9,6)
Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan dalam 5 ml media MRS broth dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. Kemudian dari 5 ml inokulum bakteri asam laktat, diambil 50 μl inokulum dan diinokulasikan ke dalam 5 ml medium MRS broth yang memiliki pH
4,4 dan 9,6 dengan larutan 1 M HCl atau larutan 0,5 M NaOH kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan mengukur nilai absorbansi pada panjang gelombang 700 nm jam ke-24 dan ke-48 (Rahayu & Margino, 1997).
2.2.8.3. Pertumbuhan Bakteri pada Kadar NaCl (6,5% dan 18%)
Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan dalam 5 ml media MRS broth dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. Kemudian dari 5 ml inokulum bakteri asam laktat, diambil 50 μl inokulum dan diinokulasikan ke dalam 5 ml MRS broth dengan konsentrasi NaCl
6,5% dan 18% kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan mengukur nilai absorbansi pada panjang gelombang 700 nm jam ke-24 dan ke-48 (Rahayu & Margino, 1997).
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Menggunakan API 20 STREP test kit
API 20 STREP test kit (Bio Merieux SA, France) merupakan alat identifikasi spesies genus
Aerococcus, Alloiococcus, Enterococcus, Gemella, Gardnerella, Globicatella,
Granulicatella, Lactococcus Leuconoctoc, Listeria, Pediococcus dan Streptococcus.
Spesies bakteri asam laktat diidentifikasi berdasarkan kemampuannya dalam memfermentasi 20 jenis sumber karbon yang terdapat pada API 20 STREP test kit. Pembacaan hasil identifikasi menggunakan API WEB software (API bioMerieux) (Pelinescu et al., 2009).
2.2.10. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Menggunakan API 50 HCL test kit
API 50 CHL adalah test kit yang digunakan untuk identifikasi genus Lactobacillus hingga ke tingkat spesies. Test kit tersusun atas 49 jenis gula (49 tube) yang selanjutnya akan difermentasi oleh isolat yang akan diidentifikasi. Apabila isolat yang diuji mampu memfermentasi sumber gula dan menghasilkan asam, maka indikator bromkresol ungu akan mengubah warna larutan gula dari ungu menjadi kuning. Pembacaan hasil identifikasi menggunakan API WEB software (API bioMerieux) (Pelinescu et al., 2009).
2.2.11. Pembuatan Stok Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat yang telah diidentifikasi dapat disimpan apabila akan digunakan
o
kembali dalam bentuk kultur stok dalam freezer dengan suhu hingga -10 C pada media MRS broth yang mengandung gliserol 15% dalam tabung eppendorf (Gawad et al., 2010).
HASIL PENELITIAN
Proses fermentasi untuk durian, dami nangka dan rebung kuning berlangsung sekitar 7 hari secara fakultatif anaerob. Setelah proses fermentasi selesai, tekstur tempoyak menjadi lunak dan berwarna kuning krem (Gambar 7.a.). Fermentasi dami nangka yang sudah selesai teksturnya menjadi lunak dan beraroma alkohol (Gambar 7.b.). Setelah proses fermentasi asinan rebung kuning selesai, menghasilkan aroma alkohol yang menyengat, tekstur yang lunak dan warna rebung berubah menjadi kuning cerah (Gambar 7.c.).
b a c
Gambar 7. Tempoyak (a), mandai (b) dan asinan rebung (c) yang digunakan sebagai sumber bakteri asam laktat yang telah melalui proses fermentasi sekitar 7 hari total asam laktat adalah 0,495% pada awal fermentasi dan terus meningkat hingga menjadi 1,770% pada akhir fermentasi. Total asam laktat mandai terus meningkat seiring dengan waktu fermentasi, hasilnya berkisar antara 0,0495% - 0,207%. Sedang kandungan asam laktat pada asinan rebung kuning bambu betung semakin meningkat siring bertambahnya waktu fermentasi. Total asam laktat pada hari ke
- –0 sebesar 0,285% dan pada hari akhir fermentasi (hari ke-7) adalah 0,534 %.
3.1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Lakat Pada Tempoyak, Mandai, Dan Asinan Rebung Kuning Menggunakan Tes Biokimia
Koloni yang tumbuh pada media agar MRS yang mengandung 1% CaCO
3 membentuk zona
bening dan diidentifikasi sebagai bakteri asam laktat, kemudian dimurnikan pada media yang sama hingga membentuk koloni tunggal (Gambar 8).
Gambar 8. Isolat bakteri asam laktat yang membentuk koloni tunggal dan membentuk zona bening
3.1.1. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Tempoyak
Setiap koloni asam laktat diidentifikasi lebih lanjut hingga tahap genus berdasarkan morfologi, pewarnaan gram, pewarnaan spora, aktivitas katalase, uji motilitas, produksi gas. Pada Tabel 2 diketahui bahwa dari 24 isolat, 7 isolat tidak termasuk bakteri asam laktat karena tidak membentuk zona bening (tanda *) sehingga tidak dilakukan pengujian lebih lanjut. Hasil pengujian menunjukkan semua isolat berbentuk cocci, gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, non-motil, dan tidak membentuk gas (homofermentatif). Sedang 17 isolat lainnya termasuk bakteri asam laktat karena membentuk zona bening dan diidentifikasi lebih lanjut (Tabel 3).
Keterangan: “c” = bakteri bentuk cocci : “*” = tidak dilakukan pengujian lebih lanjut : “+” = positif / membentuk : “-“ = negatif / tidak membentuk : ”B” = Bakteri asam laktat : “NB” = Non-Bakteri asam laktat / bukan bakteri asam laktat
13 34 - * * * * * * NB
23 62 + c + - - - - B
22 61 + c + - - - - B
21 54 + c + - - - - B
20 53 + c + - - - - B
19 52 + c + - - - - B
18 51 + c + - - - - B
17 44 - * * * * * * NB
16 43 + c + - - - - B
15 42 - * * * * * * NB
14 41 + c + - - - - B
12 33 + c + - - - - B
No Isolat Zona bening Bentuk sel Pewarnaan Gram Pewarnaan Spora Katalase Motilitas Produksi Gas BAL
11 32 + c + - - - - B
10 31 - * * * * * * NB
9 24 - * * * * * * NB
8 23 + c + - - - - B
7 22 + c + - - - - B
6 21 - * * * * * * NB
5 15 + c + - - - - B
4 14 + c + - - - - B
3 13 + c + - - - - B
2 12 + c + - - - - B
1 11 - * * * * * * NB
24 63 + c + - - - - B
NaCl
5 22 + + - - + + - Enterococcus
16 62 + + - - + + - Enterococcus
15 61 + + - - + + - Enterococcus
14 54 + + - - + + - Enterococcus
13 53 + + - - + + - Enterococcus
12 52 + + - - + + - Enterococcus
11 51 + + - - + + - Enterococcus
10 43 + + - - + + - Enterococcus
9 41 + + - - + + - Enterococcus
8 33 + + - - + + - Enterococcus
7 32 + + - - + + - Enterococcus
6 23 + + - - + + - Enterococcus
4 15 + + - - + + - Enterococcus
Keterangan: “+” = tumbuh : “-“ = tidak tumbuh
3 14 + + - - + + - Enterococcus
2 13 + + - - + + - Enterococcus
1 12 + + - - + + - Enterococcus
18
45 50 4,4 9,6 6,5
10
C) pH NaCl (%) Genus
No Isolat Suhu (
isolat yang akan diidentifikasi. Kemampuan bakteri asam laktat untuk memfermentasi berbagai jenis karbon diamati secara kualitatif berdasarkan perubahan warna yang terjadi sesuai dengan tube masing-masing. Isolat yang mampu memfermentasi berbagai sumber karbon, akan mengalami perubahan warna pada tube API 20 STREP test kit seperti Tabel 4.
test kit . API 20 STREP test kit mengandung 20 jenis karbon (20 tube) difermentasi oleh
Isolat yang mempunyai pertumbuhan terbaik dibandingkan dengan isolat lainnya berdasarkan nilai absorbansi pada uji kemampuan pertumbuhan pada berbagai suhu, pH dan NaCl (Lampiran 1; Tabel 12) diidentifikasi lebih lanjut menggunakan API 20 STREP
Berdasarkan pada Tabel 3 dapat diketahui bahwa 17 isolat yang diuji dapat tumbuh pada suhu 10 C dan 45 C, tumbuh pada media dengan pH 9,6 serta tumbuh pada media yang mengandung 6,5% NaCl. Genus Enterococcus merupakan genus bakteri asam laktat yang tumbuh pada suhu 10 dan 45 C, media yang mengandung 6,5% NaCl dan pada pH 9,6.
17 63 + + - - + + - Enterococcus
(Negatif dan Positif)
12 L-arabinose Merah Kuning
20 Glycogen Merah Kuning
19 Starch (2) Merah Kuning
18 Rafginose Merah Kuning
17 Inulin Merah Kuning
16 Trehalose Merah Kuning
15 Lactose Merah Kuning
14 Sorbitol Merah Kuning
13 Mannitol Merah Kuning
11 RribOse Merah Kuning
Tube Komponen aktif
10 Arginine Kuning Merah
9 L-leucine-2-naphtylamide Bening Jingga
6 Naphthol AS-BI_-D-glucuranote Bening Biru 7 2-naphthyl-_-D-galactopyranoside Bening Violet 8 2- naphthyl phosphate Bening Violet
4 Pyrrolidonyl-2-naphthlyamide Bening Jingga 5 6-Bromo-2-naphthyl_-D-dalactopryranosise Bening Violet
3 Esculin Kuning pucat Hitam
2 Hippurate Bening Biru gelap
1 Pyruvate Coklat Merah
Warna hasil fermentasi karbon Negatif Positif
Berdasarkan nilai absorbansi uji kemampuan pertumbuhan pada berbagai suhu, pH dan NaCl (Lampiran 1; Tabel 12), diperoleh 2 isolat yang terbaik dan yaitu isolat 51 dan 63. Isolat 53 dan 61 menunjukkan perbedaan kemampuan memferrmentasi sumber karbon, isolat 51 mampu memfermentasi karbon 2-naphthyl phosphate sedangkan isolate 63 tidak dapat memfermentasi karbon tersebut. Setelah isolat 51 dan 63 diidentifikasi kemampuan memfermentasi berbagai sumber karbon (Tabel 5; Gambar 9), dilanjutkan analisa data dengan menggunakan API WEB software. Hasil identifikasi untuk kedua isolat bakteri asam laktat yang diperoleh adalah Enterococcus faecium (Lampiran 2).
STREP test kit pada tempoyak
Isolat Tube Komponen Aktif
51
63
1 Pyruvate
2 Hippurate
3 Esculin
4
- Pyrrolidonyl-2-naphthlyamide
- 5
- 6-Bromo-2-naphthyl_-D-dalactopryranosise
6 Naphthol AS-BI_-D-glucuranote
- 7
- 2-naphthyl-_-D-galactopyranoside
- 8
- 2- naphthyl phosphate
9 L-leucine-2-naphtylamide
10 Arginine
11 RribOse
12 L-arabinose
13 Mannitol
14 Sorbitol
15 Lactose
16 Trehalose
17 Inulin
- 18
- Rafginose
- 19
- Starch (2)
20 Glycogen
Keterangan: *+* : bakteri asam laktat mampu memfermentasi sumber karbon
- : bakteri asam laktat tidak mampu memfermentasi sumber karbon
51
63 Gambar 9. Hasil identifikasi isolat 51 dan 63 menggunakan API 20 STREP test kit 3.1.2. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Mandai
Berdasarkan isolasi mandai pada media MRS agar dengan 1% CaCO
3 , diperoleh 24 koloni
tunggal yang dapat dipisahkan menjadi dua kelompok yaitu 20 isolat termasuk dalam bakteri asam laktat (BAL) dan 4 isolat tidak termasuk BAL. Identifikasi genus BAL dilakukan berdasarkan morfologi, pewarnaan gram, aktivitas katalase, motilitas, produksi
o o o
gas, dan kemampuan tumbuh pada suhu 10
C, 45
C, dan 50
C, pH 4,4 dan 9,6 serta kemampuan tumbuh pada konsentrasi NaCl 6,5%, dan 18% (Tabel 6 dan 7).
No Isolat Zona bening Bentuk Bakteri Pewarnaan Gram Pewarnaan Spora Katalase Motilitas Produksi Gas BAL
19
4A2 - * * * * * * NB
15
4B1 + b Ungu Merah + * * NB
16
4B2 + b Ungu Merah + * * NB
17
5A1 + b Ungu Merah - - + B
18
5A2 + b Ungu Merah - - + B
5B1 - * * * * * * NB
4A1 + b Ungu Merah + * * NB
20
5B2 + b Ungu Merah - - + B
21
6A1 + b Ungu Merah - - - B
22
6A2 + b Ungu Merah - - - B
23
6B1 - * * * * * * NB
24
6B2 - * * * * * * NB Keterangan : “b” = bakteri bentuk batang : “+” = isolat tumbuh (media keruh) : “-“ = isolat tidak tumbuh (media bening) : “*“ = tidak dilakukan pengujian : “B” = termasuk Bakteri Asam Laktat : “NB“ = tidak termasuk Bakteri Asam Laktat
14
13
1
2A2 + b Ungu Merah - - - B
1A1 + b Ungu Merah - - - B
2
1A2 + b Ungu Merah - - - B
3
1B1 + b Ungu Merah - - - B
4
1B2 + b Ungu Merah - - - B
5
2A1 + b Ungu Merah - - - B
6
7
3B2 + b Ungu Merah - - - B
2B1 + b Ungu Merah - - + B
8
2B2 + b Ungu Merah + * * NB
9
3A1 + b Ungu Merah + * * NB
10
3A2 + b Ungu Merah - - - B
11
3B1 + b Ungu Merah - - - B
12
Pada Tabel 6 diketahui bahwa 15 isolat termasuk dalam BAL karena memiliki ciri-ciri: membentuk zona bening, berbentuk batang, gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, non motil, bersifat obligat homofermentatif, fakultatif heterofermentatif, atau obligat heterofermentatif.
NaCl
C) NaCl (%) pH Genus
10
o
13
5B2 + + + + - + + ND
14
6A1 + - + + - + - Lactobacillus
15
6A2 + - + + - + + ND Keterangan : “+” = isolat tumbuh (media keruh) : “-“ = isolat tidak tumbuh (media bening) : “*“ = tidak dilakukan pengujian : “ND” = Not Detected
Berdasarkan uji kemampuan tumbuh 15 isolat, diketahui bahwa 5 isolat termasuk dalam genus Lactobacillus karena memiliki ciri-ciri: pada umumnya dapat tumbuh pada suhu
10
C, 45
12
o
C, dan 50
o
C, pada pH 4,4, dan pada konsentrasi NaCl 6,5%, serta tidak dapat tumbuh pada pH 9,6 dan konsentrasi NaCl 18%. Sedangkan 10 isolat lain belum dapat diidentifikasi karena ciri-ciri pertumbuhannya tidak termasuk dengan genus bakteri asam laktat lain seperti Carnobacterium (dapat tumbuh pada suhu 10
o
C tetapi tidak dapat tumbuh pada suhu 45
o
C, konsentrasi NaCl 18% dan pada pH 9,6) dan Bifidobacterium (dapat tumbuh pada suhu 45
o C , tetapi tidak dapat tumbuh pada pH 4,4 dan 9,6.
5A2 + + + - - + + ND
5A1 + + + - - + - Lactobacillus
45 50 6,5 18 4,4 9,6
2A1 + + - + - + + ND
1
1A1 - + + + - + - Lactobacillus
2
1A2 + + + - - + + ND
3
1B1 + + + - - + + ND
4
1B2 + + + - - + - Lactobacillus
5
6
No Isolat Suhu ( o
2A2 + + + + - + + ND
7
2B1 + + + - - + + ND
8
3A2 + + + - - + + ND
9
3B1 + - + + - + + ND
10
3B2 + + + + - + - Lactobacillus
11
1; Tabel 13-15), diperoleh 2 isolat yang yang mewakili genus Lactobacillus yaitu isolat
1A1 dan 3B2. Setelah isolat 1A1 dan 3B2 diidentifikasi kemampuan memfermentasi berbagai sumber karbon dengan API 50 CHL test kit (Tabel 8; Gambar 10 dan 11), dilanjutkan analisa data dengan menggunakan API WEB software. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1A1 dan 3B2 merupakan Lactobacillus pentosus dengan tingkat signifikansi 91,6% dan 97,3% (Lampiran 2).
23 AMYgdalin + +
24 ARButin + +
25 ESCulin + +
26 SALicin + +
27 D-CELIobiose + +
28 D-MALtose + +
29 D-LACtose + +
30 D-MELibiose + +
31 D-Sucrose + +
32 D-TREhalose + +
33 INUlin - -
35 D-RAFfinose + +
34 D-MeleZitose + +
36 Starch - -
37 GLYcoGen - -
38 XyLiTol - -
39 GENtibiose + +
40 D-TURanose + +
41 D-LYXose - -
42 D-TAGatose + -
43 D-FUCose - -
44 L-FUCose - -
45 D-ARabitoL - -
46 L-ARabitoL - - 47 potassium GlucoNaTe - - 48 potassium 2-Keto-Gluconate - - 49 potassium 5-Keto-Gluconate - -
22 N-Acetyl-Glucosamine + +
21 α-Methyl-D-Glucoside
20 α-Methyl-D-Mannoside
6 D-XYLose + +
test kit
pada mandai
Tube Komponen Aktif Isolat
1A1
3B2 CONTROL - -
1 GLYcerol - -
2 ERYthritol - -
3 D-ARAbinose - -
4 L-ARAbinose + +
5 D-RIBose + +
7 L-XYLose - -
19 D-SORbitol + +
8 D-ADOnitol - -
9 β-Methyl-D-Xyloside
10 D-GALactose + +
11 D-GLUcose + +
12 D-FRUctose + +
13 D-MaNnosE + +
14 L-SorBosE - -
15 L-RHAmnose - -
16 DULcitol - -
17 INOsitol - -
18 D-MANnitol + +
Keterangan : “+” = sumber karbon terfermentasi oleh bakteri asam laktat : “-“ = sumber karbon tidak terfermentasi oleh bakteri asam laktat untuk memfermentasi 49 jenis gula (Tabel 8). Diketahui adanya perbedaan jenis sumber karbon yang dapat difermentasi oleh isolat 1A1 dan isolat 3B2 yaitu pada kemampuan memfermentasi sumber karbon D-TAGatose. Isolat 1A1 tidak dapat memfermentasi sumber karbon D-TAGatose sedangkan isolat 3B2 dapat memfermentasi sumber karbon D- TAGatose. Perubahan warna dari API 50 CHL test kit dapat dilihat pada Gambar 10 dan 11. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi kuning dan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan warna (tetap biru).
Gambar 10. Hasil identifikasi isolat 1A1 dengan API 50 CHL test kit
Gambar 11. Hasil identifikasi isolat 3B2 dengan API 50 CHL test kit
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Asinan Rebung Kuning
Kultur bakteri asam laktat yang diperoleh dari asinan rebung kuning ditumbuhkan pada media MRS agar dengan 1% CaCO . Hasilnya diperoleh 30 koloni tunggal yang terdiri atas
3
21 isolat termasuk dalam bakteri asam laktat sedangkan 9 isolat tidak termasuk bakteri asam laktat. Identifikasi BAL dilakukan melalui uji biokimia (pewarnaan gram dan spora, uji katalase, uji motilitas, uji pembentukan gas) pada isolat yang diperoleh (Tabel 9) serta
o o o
uji kemampuan pertumbuhan bakteri asam laktat pada suhu 10
C, 45
C, dan 50
C, kemampuan tumbuh pada kadar NaCl 6,5%, dan 18%, serta pH 4,4 dan 9,6 (Tabel 10). kuning
No Isolat Zona bening Pewarnaan Gram Pewarnaan Spora Bentuk Bakteri Katalase Motilitas Produksi Gas BAL
1 111 + + - b - - - B 2 121 - * * * * * * NB 3 112 + + - b - - - B 4 122 + + - b - - - B 5 211 + + - b - - - B 6 221 + + - b - - - B 7 231 - * * * * * * NB 8 212 + + - b - - - B 9 222 - * * * * * * NB 10 232 - * * * * * * NB 11 311 + + - b - - - B 12 321 + + - b - - - B 13 312 + + - b - - - B 14 322 + + - b - - - B 15 411 + + - b - - - B 16 421 + + - b - - - B 17 412 + + - b - - - B 18 422 - * * * * * * NB 19 511 + + - b - - - B 20 521 + + - b - - - B 21 512 - * * * * * * NB 22 522 + + - b - - - B 23 611 + + - b - - - B 24 621 + + - b - - - B 25 631 + + - b - - - B 26 641 - * * * * * * NB 27 711 + + - b - - - B 28 721 + + - b - - - B 29 731 - * * * * * * NB 30 741 - * * * * * * NB
Keterangan : “b” = bakteri bentuk basil : “*” = tidak dilakukan pengujian lebih lanjut : “+”
= positif / membentuk : “-“ = negatif / tidak membentuk : “B” = bakteri asam laktat : “NB” = non-bakteri asam laktat / bukan bakteri asam laktat NaCl
C) NaCl (%) pH Genus BAL
No Isolat Suhu ( o
10
45 50 6,5 18 4,4 9,6 1 111 - + - + - + - Lactobacillus 2 112 + + - + - + - Lactobacillus 3 122 + - - - - + + ND 4 211 + + - + - + + ND 5 221 + + + + - + + ND 6 212 + + - + - + - Lactobacillus 7 311 + + + + - + - Lactobacillus 8 321 - + + - - + - Lactobacillus 9 312 + + - + - + + ND 10 322 + + + + - + - Lactobacillus 11 411 - + - + - + - Lactobacillus 12 421 - + + - - + + ND 13 412 - + + - - + + ND 14 511 + + + + - + - Lactobacillus 15 521 - - - + - + + ND 16 522 + + + + - + + ND 17 611 + + + + - + + ND 18 621 - + + - - + + ND 19 631 + + + + - + + ND 20 711 - + + + - + + ND 21 721 - + + + - + + ND Keterangan
: “+” = tumbuh : “-“ = tidak tumbuh : ND = not detected
Isolat bakteri asam laktat pada asinan rebung kuning tumbuh baik pada suhu 10
o
C hingga
50
o
C kadar NaCl 6,5%, serta pada pH 4,4 dan 9,6 namun tidak dapat tumbuh pada kadar NaCl 18%. Sehingga diperoleh bahwa 8 isolat yang sesuai dengan ciri bakteri asam laktat dengan genus Lactobacillus, dimana genus Lactobacillus memiliki ciri-ciri pertumbuhan spesifik yaitu tidak tumbuh pada kadar NaCl 18% dan pH 9,6. Sedangkan 13 isolat bakteri asam laktat yang lain belum dapat teridentifikasi karena kurang sesuai dengan ciri-ciri genus bakteri asam laktat berbentuk basil yang lain (Tabel 10). Dua isolat (111 dan 321) yang memiliki karakteristik terbaik untuk ciri-ciri pertumbuhan Lactobacillus yang nampak dari nilai absorbansi terendah (Lampiran 1; Tabel 16-18), diuji dengan menggunakan API
50 CHL test kit. Setelah inkubasi selama 48 jam terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning (hasil positif) pada Tabel 11.
35 D-RAFfinose + +
25 ESCulin + +
26 SALicin + +
27 D-CELIobiose + +
28 D-MALtose + +
29 D-LACtose + +
30 D-MELibiose + +
31 D-Sucrose + +
32 D-TREhalose + +
33 INUlin - -
34 D-MeleZitose + +
36 Starch - -
23 AMYgdalin + +
37 GLYcoGen - -
38 XyLiTol - -
39 GENtibiose + +
40 D-TURanose + +
41 D-LYXose - -
42 D-TAGatose + +
43 D-FUCose - -
44 L-FUCose - -
45 D-ARabitoL - -
46 L-ARabitoL - - 47 potassium GlucoNaTe - - 48 potassium 2-Keto-Gluconate - - 49 potassium 5-Keto-Gluconate - -
24 ARButin + +
22 N-Acetyl-Glucosamine + +
test kit
9 β-Methyl-D-Xyloside
pada asinan rebung kuning
Tube Komponen Aktif Isolat 111 321 CONTROL - -
1 GLYcerol - -
2 ERYthritol - -
3 D-ARAbinose - -
4 L-ARAbinose + +
5 D-RIBose + +
6 D-XYLose + +
7 L-XYLose - -
8 D-ADOnitol - -
10 D-GALactose + +
21 α-Methyl-D-Glucoside
11 D-GLUcose + +
12 D-FRUctose + +
13 D-MaNnosE + +
14 L-SorBosE - -
15 L-RHAmnose - -
16 DULcitol - -