Optimasi volume penyari etanol 96 % dan suhu dalam proses perkolasi daun stevia [Stevia rebaudiana Bertonii.] dengan metode desain faktorial - USD Repository

  

OPTIMASI VOLUME PENYARI ETANOL 96% DAN SUHU DALAM

PROSES PERKOLASI DAUN STEVIA (Stevia Rebaudiana Bertonii.)

DENGAN METODE DESAIN FAKTORIAL

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi oleh : Maria Margaretha Christiani

  NIM : 058114139

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  

OPTIMASI VOLUME PENYARI ETANOL 96% DAN SUHU DALAM

PROSES PERKOLASI DAUN STEVIA (Stevia Rebaudiana Bertonii.)

DENGAN METODE DESAIN FAKTORIAL

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi oleh : Maria Margaretha Christiani

  NIM : 058114139

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

   

   

  Thanks be to God!! He Gives us the victory through and Lord Jesus Christ (1 Corinthus 15:27) Kupersembahkan karya ini bagi: Tuhan Yesusku yang indah dan selalu berbicara dalam diam untuk membuatku kuat Kedua orang tua dan saudaraku Almamaterku

  

Tak takut ku lelah dilikuku...

Ketika ku yakin Tuhan selalu berjalan disampingku..

  

Tak penat ku melangkah...

Ketika ku tau Tuhan selalu siap menggendongku...

  

Tak menangisku disaat mataku tertutup...

Karena ku tahu Tuhan selalu ingin ku tertawa...

  

Kuatku bukan karena diriku..

  

Tangisku tidak untuk diriku..

Kumelangkah tak hanya diriku..

Karena Tuhan menyatu menemaniku..

     

  

Prakata

  Puji dan syukur penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat kasih dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul “Optimasi Volume Penyari Etanol 96% dan Suhu dalam Proses

  

Perkolasi Daun Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii.) dengan Metode Desain

Faktorial” ini dengan baik.

  Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian payung Program Hibah Penelitian Payung PHK A3 Dikti yang berjudul “Optimasi Proses Isolasi dan Studi Preformulasi Steviosida sebagai Pemanis Pengganti Gula“.

  Penulisan skripsi dimaksudkan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi pada program studi Ilmu Farmasi, Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini bukanlah suatu hal yang mudah, banyak pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini dengan baik dan lancar. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

  1. Tuhan Yesus, yang selalu memberi kekuatan disaat penulis mengerjakan skripsi ini.

  2. Mama, Lidya Lementaria Marbun, pemberi sayang terbesar dalam hidupku, dan alasan terbesar penulis mampu menyelesaikan skripsi ini.

  3. Papa, Perjuangan Paulus Simorangkir, abang, Freddy dan Fransiskus Simorangkir, adik, Barnabas Simorangkir, atas dukungan dan kasih sayang yang tulus.

  4. Rita Suhadi, M.Si., Apt., Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., dan Yohanes Martono, M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah memberikan arahan dan mendampingi penulis selama proses penelitian dan penyusunan skripsi.

  6. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., dan Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro,M.Si., selaku dosen penguji yang telah memberikan pendampingan, dukungan, saran, dan kritik.

  7. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat tradisional atas bantuan dan kerja samanya untuk menyediakan simplisia dan gambar tanaman.

  8. Segenap laboran atas bantuan dan kerjanya selama penulis menempuh perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  9. “Sahabat-sahabat terbaik”; Rika, Valen, Indri, Anita, Febri, Desi, Dery, Sinta, Lussy, Agus atas dukungan dan semangat yang diberikan.

  10. Wiwid, Isti, Rina, Rini, Medy, Resty, Rian, Lidia, Andrew atas dukungan, semangat dan keceriaan bersama penulis.

  11. Team Stevia”, Totok, Very, febrian, Diana, Natalia, Tyas, Nia, dan Siska atas keceriaan dan kerjasama selama mengerjakan skripsi ini.

  12. Seseorang, atas waktu, dukungan, kenangan, dan kebersamaan selama proses penyusunan skripsi ini

  13. Teman-teman Kelas C angkatan 2005 dan FST 2005 atas semua kenangan indah selama ini.

  14. Teman-teman di Modist home: Yesse, Sekar, Nolen, Siska, Ika, Ina, Rini, Tyas, Kristi, Tina, Katrin atas kebersamaan, keceriaan, dan kenangan indah selama ini.

  15. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

  Akhirnya, penulis menyadari bahwa tidak ada yang sempurna di dunia ini. Keterbatasan pikiran, waktu, dan tenaga membuat penulisan skripsi ini tidak sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar skripsi ini lebih baik lagi. Akhir kata, semoga skripsi ini bermanfaat untuk menambah ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 13 Januari 2009 Penulis

       

  

INTISARI

  Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui faktor dominan dan pengaruh interaksi antara suhu dan volume penyari etanol 96% serta kombinasi yang optimum untuk memperoleh kadar steviosida terbesar dari proses ekstraksi secara perkolasi.

  Penelitian ini termasuk eksperimental murni menggunakan desain faktorial dengan dua faktor yaitu volume penyari etanol 96%-suhu dan dua level, level rendah dan level tinggi. Penelitian diawali pengumpulan dan determinasi tanaman, pembuatan serbuk simplisia, defatisasi, kemudian penyarian secara perkolasi dengan penyari etanol 96%. Perkolat diuji kualitatif menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan fase diam silika gel GF dan fase gerak

  254

  kloroform:metanol:akuabides (10:15:2 v/v). Identifikasi bercak steviosida dengan pereaksi Iodium, lalu vanilin-asam sulfat pekat, kemudian dipanaskan. Penetapan kadar steviosida dengan mencari nilai AUC (daerah bawah kurva) bercak pada KLT dan dianalisis menggunakan image-J . Dari hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan Yate’s Treatment dengan tingkat kepercayaan 95%.

  Hasil penelitian menunjukkan penggunaan etanol 96% sebanyak 375 ml

  o

  dengan suhu 50 C untuk 30 g serbuk stevia menghasilkan steviosida terbesar yaitu 2297,9388 mg (7,8818 %b/b). Etanol 96% merupakan faktor dominan yang signifikan dengan nilai F hitung 578,35 lebih besar dari F tabel 10,128.

  Kata kunci: daun stevia, perkolasi, steviosida, Image-J, desain faktorial, Yate’s

  Treatment

  

ABSTRACT

  Stevia is the original plants from Brazil and Paraguay with chemistry pregnancy steviosida which use as sweetener. The purpose of this examination is to know the dominant factor and the influence of interaction between temperatures and volume of etanol 96% also combination to get the biggest percent of stevioside from extraction process with percolation.

  This research, which is using factorial design and belong as pure experimental. Examination preced by means of collecting and plant determination, powder simplisia enactment, defatitation, Percolation extraction with ethanol 96 %. Perkolat is tested qualitative Thin Layer Chromatography (TLC) with quiet phase silica gel GF and movement phase chloroform: methanol: aquabidest

  254

  (10:15:2). Pockmarked identification stevioside done with Iodium then vanillin sour sulfate, then heating. Quotation stevioside degree by seeking values of AUC (Curve Under Area) through pocks in TLC and analyzed by Image J. The effect of temperatures and ethanol 96% evaluated with factorial design accordance of statistics analysis Yate's Treatment with 95% level of confidence.

  The result of examination shows volume which using ethanol 96% as

  o

  much as 375 ml with temperature 50 C for 30 gram stevia powder produces 2297,9388 mg (7,8818 %b/b) stevioside. Ethanol 96% be dominant factor with F count ethanol 96% larger ones from F table. F count ethanol 96% 578, 35 while F table 10,128.

  Key word: leaf of stevia, percolation, stevioside, Image-J, Factorial Design, Yate’s

  Treatment

  

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ....................................................................................... i HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................... vii

PRAKATA .......................................................................................................... viii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. xi

  

INTISARI ........................................................................................................... xii

ABSTRACT .......................................................................................................... xiii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xiv

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xviii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xix

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xx

  BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang ................................................................................... 1

  1 Perumusan masalah ..................................................................... 3 2. Keaslian penelitian ......................................................................

  3 3. Manfaat penelitian ......................................................................

  3

  B. Tujuan Penelitian ................................................................................ 4 1. Tujuan umum .............................................................................

  4

  2. Tujuan khusus ............................................................................ 4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Stevia (Stevia Rebaudiana Bertonii.). ................................................ 5

  1. Deskripsi ..................................................................................... 6

  2. Ekologi dan Penyebaran ............................................................. 6

  3. Kandungan Kimia ....................................................................... 6

  B. Steviol Glikosida ............................................................................... 7

  C. Senyawa Steviosida .......................................................................... 8

  D. Sokletasi ........................................................................................... 9

  E. Etanol ................................................................................................ 10

  F. Penyarian ........................................................................................... 10

  G. Perkolasi ............................................................................................ 12

  H. Ekstrak .............................................................................................. 14

  I. Kromatografi Lapis Tipis .................................................................. 14 J. Penetapan Kadar Steviosida .............................................................. 17 K. Metode Desain Faktorial ................................................................... 17 L. Landasan Teori .................................................................................. 19 M. Hipotesis ........................................................................................... 20

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 21 B. Variabel Penelitian ............................................................................ 21 C. Definisi Operasional ........................................................................ 22 D. Alat Penelitian ................................................................................... 23 E. Bahan Penelitian ............................................................................... 23 F. Tata Cara Penelitian ......................................................................... 24

  1. Pengumpulan tanaman ............................................................... 24

  2. Pembuatan serbuk daun Stevia rebaudiana Bertonii .................. 24

  3. Pembuatan ekstrak daun Stevia rebaudiana Bertonii ................. 25

  4. Analisis Kualitatif Steviosida ..................................................... 26

  5. Analisis Kuantitatif Steviosida ................................................... 26

  6. Analisis Hasil .............................................................................. 27

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Stevia ............................................................ 32 B. Pembuatan serbuk daun stevia .......................................................... 33 C. Pembuatan ekstrak daun stevia ......................................................... 34 D. Analisis Kualitatif Steviosida Dalam Ekstrak Stevia dengan KLT .. 36 E. Analisis Kuantitatif Steviosida Dalam Ekstrak Stevia dengan Image-J .............................................................................................. 40

  1. Pembuatan Kurva Baku .............................................................. 40 2. Analisis Kuantitatif Steviosida dengan Image-J .........................

  41 F. Analisis Hasil Steviosida ..................................................................

  43 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan ......................................................................................

  48 B. Saran .................................................................................................

  48 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................

  49 LAMPIRAN .....................................................................................................

  52 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................

  72

  

DAFTAR TABEL

  Tabel I. Rancangan percobaan desain faktorial dengan dua faktor dan dua level ........................................................................... 18 Tabel II. Perbandingan cairan penyari dan suhu untuk 4 gram serbuk

  Stevia ........................................................................................ 26 Tabel III. Jumlah volume etanol 96% dan suhu untuk 30 gram serbuk .. 34 Tabel IV. Volume akhir perkolat setiap perbandingan Akuades:Etanol 96%

  .................................................................................................. 35 Tabel V. Nilai Rf untuk masing-masing bercak dengan fase gerak kloroform : metanol : aquades (10 : 15 : 2) dan fase diam

  Silika gel GF jarak elusi 15 cm, deteksi KI dan

  254,

  Vanilin-Asam Sulfat P ............................................................. 38 Tabel VI. Kadar steviosida baku yang ditotolkan (µg) dengan luas area dibawah kurva (AUC) steviosida baku ..................... 40 Tabel VII. Kadar steviosida pada sampel dengan masing-masing kondisi

  .................................................................................................. 43 Tabel VIII. Kadar rata-rata steviosida pada sampel dengan masing-

  Masing koefisien ...................................................................... 44 Tabel IX. Efek suhu, etanol 96%, dan interaksi dalam menentukan

  Kadar steviosida ....................................................................... 45 Tabel X Hasil Perhitungan Yate’s Treatment pada respon kadar steviosida

  (%b/b) ...................................................................................... 47

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1 Stevia rebaudiana Bertonii....................................................... 5 Gambar 2. Struktur Glikosida Steviol ........................................................ 7 Gambar 3. Struktur Steviosida ................................................................... 8 Gambar 4 Skema Tata Cara Penelitian ..................................................... 24 Gambar 5 Hasil KLT Ekstrak Daun Stevia dan Baku Steviosida dengan jarak pengembangan 15 cm ......................................... 37 Gambar 6 Grafik Kurva Baku antara kadar steviosida (mg) dengan area dibawah kurva (AUC) ...................................................... 41 Gambar 7 Alur penggunaan program Image-J untuk memperoleh nilai AUC ................................................................................. 42 Gambar 8 Gambar a. grafik hubungan antara etanol 96% (ml) dengan respon kadar steviosida (%b/b); Gambar b. grafik hubungan antara suhu (Celcius) dengan respon kadar steviosida (%b/b) ...................................................................... 45

  Gambar 9 Counter plot kadar steviosida ekstrak daun stevia ................... 47

  

DAFTAR LAMPIRAN

  lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi................................................ 54 lampiran 2. Kurva Baku Steviosida........................................................... 56 lampiran 3. Penetapan Kadar Steviosida Dalam Stevia rebaudiana

  Bertonii................................................................................... 58 lampiran 4 Perhitungan Yate

  ’ s Treatment ................................................. 63

  lampiran 5 Dokumentasi........................................................................... 68

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Pada makanan banyak ditambahkan pemanis terutama pemanis buatan. Pemanis buatan yang banyak terdapat dipasaran diantaranya siklamat dan sakarin

  (Achyar, 2005). Penggunaan pemanis buatan dapat menimbulkan efek berbahaya dan rasa tidak nyaman. Penggunaan siklamat dapat merangsang timbulnya kanker (Mudjajanto, 2005), sedangkan penggunaan sakarin dapat menimbulkan rasa pahit (Achyar, 2005).

  Adanya dampak negatif akibat penggunaan pemanis buatan menyebabkan dibutuhkannya suatu pemanis baru yang lebih aman dan nyaman dalam penggunaan. Salah satu yang sedang dikembangkan adalah pemanis alami yang berasal dari stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) yang merupakan tanaman asli Brazil dan Paraguay. Stevia mengandung steviosida yang kemanisannya 150-300 kali lebih manis daripada sukrosa (Hawke, 2002).

  Penggunaan gula alami tersebut meminimalkan dampak negatif karena steviosida tidak menimbulkan efek teratogenik, mutagenik, dan karsinogenik terhadap penggunanya. Gula alami yang berasal dari tanaman stevia juga mulai banyak dikonsumsi oleh para penderita diabetes karena faktor keamanan dan kandungan kalori pada stevia yang lebih rendah dibandingkan pemanis sintetis baik sakarin maupun siklamat (Ognean, 2003).

  Sebenarnya untuk penderita diabetes, sudah ada pemanis buatan berkalori rendah yang dapat dikonsumsi dalam kehidupan sehari-hari, yakni sakarin dan siklamat. Namun, setelah diujikan secara praklinis terhadap tikus, ditemukan bahwa kedua pemanis sintetis tersebut dapat menimbulkan tumor hingga kanker pada kantung kemih. Penggunaan sakarin dan siklamat dianggap berbahaya dan perlu diganti dengan pemanis yang lebih aman namun tetap rendah kalori (Mudjajanto, 2005).

  Telah dilakukan uji terhadap kemanfaatan steviosida terhadap penyakit diabetes. Penelitian dilakukan terhadap tikus 2 cara pemberian yakni secara inravena dan oral. Berdasarkan penelitian tersebut dapat dinyatakan bahwa steviosida yang terkandung pada tanaman stevia memberikan efek positif menurunkan kadar gula darah dan mempertahankan sekresi insulin pada penderita diabetes tipe 2 (Gregersen, 2004).

  Martono (2007) telah melakukan penelitian mengenai jumlah kristal steviosida yang dapat dihasilkan dengan metode ekstraksi secara sokletasi. Namun, ada kekurangan dari metode sokletasi yakni suhu yang tidak bisa dikontrol, selain itu untuk senyawa yang peka seperti glikosida, penggunaan pemanasan dalam jangka waktu yang lama akan menyebabkan glikosida mudah terdegradasi sehingga dapat mengurangi kadar senyawa aktif dalam ekstrak (Voigt, 1994).

  Perlu dilakukannya penelitian dengan menggunakan perkolasi, untuk mengetahui kemampuan ekstraksi secara perkolasi dalam mengekstraksi steviosida yang jumlahnya pada tanaman stevia cukup kecil yakni 3%-8% dari daun kering (Melis, 1992). Kemampuan etanol 96% untuk melarutkan steviosida menyebabkan steviosida lebih cepat untuk tersari. Sedangkan penggunaan suhu akan membantu meningkatkan kelarutan steviosida dalam etanol 96% sehingga steviosida akan lebih mudah untuk berdifusi. Berdasarkan hal tersebut, peneliti merasa perlu dilakukannya suatu optimasi terhadap volume penyari etanol 96% dan suhu untuk memperoleh kadar steviosida terbesar secara perkolasi.

  1. Perumusan Masalah

  a. Manakah yang dominan berpengaruh antara volume etanol 96%, suhu, atau interaksi keduanya dalam menentukan kadar steviosida dari hasil perkolasi daun stevia?

  b. Berapakah volume etanol 96% dan suhu yang optimum untuk memperoleh perkolat dengan kadar steviosida terbesar ?

  2. Keaslian Penelitian

  Sejauh penelusuran yang dilakukan oleh penulis, penelitian mengenai optimasi volume penyari etanol 96% dan suhu dalam proses perkolasi terhadap kadar steviosida dalam ekstrak stevia dengan metode desain faktorial belum pernah dilakukan sebelumnya.

  3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat teoritis

  Penelitian ini diharapkan menambah khasanah pengetahuan bidang farmasi Sains Teknologi khususnya mengenai optimasi volume penyari etanol 96% dan suhu dalam proses perkolasi daun stevia dengan metode desain faktorial.

b. Manfaat praktis

  Hasil penelitian ini dapat digunakan untuk mengetahui faktor yang dominan berpengaruh antara etanol 96%, suhu, dan interaksi keduanya dalam menentukan kadar steviosida. Mengetahui volume penyari etanol 96% dan suhu yang paling optimum untuk memperoleh perkolat dengan kadar steviosida yang optimal.

B. Tujuan Penelitian

  1. Tujuan Umum

  Mengetahui proses perkolasi yang optimum untuk memperoleh kadar steviosida terbesar.

  2. Tujuan Khusus

  a. Mengetahui dominasi faktor-faktor yang berpengaruh antara etanol 96%, suhu, atau interaksi keduanya dalam menentukan kadar steviosida dari hasil perkolasi daun stevia.

  b. Mengetahui penggunaan volume etanol 96% dan suhu yang optimum untuk memperoleh perkolat dengan kadar steviosida terbesar.

  

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A.

Stevia

Gambar 1. Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii.

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) termasuk dalam familia Asteracea dan

  merupakan tanaman asli dari Brazil dan Paraguay. Stevia sudah ditanam dan dikembangkan di Jepang, Korea, Taiwan, Cina, dan beberapa negara lainnya (Bakal, 1986).

  Kegunaan utama dari stevia adalah sebagai pemanis dengan kadar kemanisan 150 sampai 300 kali lebih besar dibandingkan dengan gula. Stevia juga dimanfaatkan sebagai obat atau makanan kecil (Hawke, 2002).

  Pemanis yang berasal dari daun dari Stevia rebaudiana Bertonii direkomendasikan untuk dikonsumsi oleh para penderita diabetes karena kalori yang dimiliki relatif rendah. Selain itu, sudah diujikan pada hewan dan digunakan oleh manusia tanpa menimbulkan efek samping (Megeji, 2005).

  1. Deskripsi

  Habitus: semak, semusim, tinggi 30-90 cm. Batang: bulat, berbulu, beruas, bercabang, hijau. Daun: tunggal, bulat telur, ujung tumpul, pangkal runcing, tepi rata, panjang 2-4 cm, lebar 1-3 cm, pertulangan menyirip, berbulu, tangkai pendek, hijau, bunga: majemuk, bentuk malai, di ujung dan di ketiak daun, bentuk cawan, kelopak bentuk tabung, berbulu, berbagi lima, hijau, tangkai benang sari dan tangkai putik pendek, kepala sari kuning, putik bentuk silindris, putih. Buah: kotak, berambut, cokelat. Biji: bentuk jarum, putih kotor. Akar: tunggang, putih kotor (Backer, 1968).

  2. Ekologi dan Penyebaran

  Stevia adalah tanaman herba dengan tangkai dan akar yang berukuran kecil dan rapuh. Stevia akan tumbuh dengan baik pada tanah dengan kondisi lembab yang teratur dan perairan yang memadai. Selain di Paraguay, Stevia tumbuh pada daerah subtropis termasuk beberapa negara dari Amerika Serikat (Goettemoeller and Ching, 1999). Stevia juga tumbuh di Brazil, Korea, Meksiko, Indonesia, Tanzania, dan Kanada. Tanah yang baik untuk pertumbuhan stevia adalah tanah dengan kandungan karbon yang rendah (0,2%), kandungan nitrogen total yang tinggi (0,15%), dan pH sebesar 5,6 (Megeji et.al, 2005).

  3. Kandungan Kimia

  Pada kondisi daun yang kering, komponen yang larut air sebesar 42% dari berat daun (Bakal and Nabors, 1986). Steviosida merupakan komponen pemanis terbesar yang terdapat pada daun Stevia rebaudiana Bertonii. Komponen lain yang ditemukan dalam jumlah kecil antara lain: steviolbiosida, rebaudiosida A, B, C,D, E, F, dulkosida A (Starrat, Kirby, Brandle, 2002), dan rubusosida (Kuznesof, 2007). Steviosida dan rebaudiosida A merupakan komponen glikosida steviol yang paling menarik perhatian karena khasiatnya sebagai pemanis (Kuznesof, 2007).

  Impurities yang terdapat pada ekstrak daun stevia merupakan ciri khas dari

  material tanaman, seperti pigmen dan sakarida. Senyawa-senyawa nonfraksi glikosida dari ekstrak daun stevia terdiri dari : spathulenol; asam dekanoat; 8,11,14- asam ecosatrienoic; 2-metiloktadekan; pentacosane; octacosane; stigmasterol; b- sitosterol; a- dan b- amyrin; lupeol; b-amyrin asetat; dan pentasiklik triterpen.

  Senyawa-senyawa tersebut merupakan substansi non polar mewakili 56% dari total ekstrak non glikosida, 44% lainnya masih belum teridentifikasi (Kuznesof, 2007).

B. GLIKOSIDA STEVIOL

  

Gambar 2. Struktur Glikosida Steviol (Geuns, 2003)

  Pada tanaman stevia, minimal terdapat 95% dari total tujuh golongan glikosida steviol. Steviosida dan rebaudiosida A adalah golongan glikosida steviol yang paling dikenal karena kegunaannya sebagai pemanis (Kuznesof, 2007).

  Glikosida steviol merupakan serbuk berwarna putih sampai kuning terang, larut dalam air dan etanol, relatif tidak memiliki bau, dan cukup stabil terhadap suhu dan kelembaban. kadar kemanisan dari glikosida steviol 200 sampai 300 kali lebih tinggi daripada sukrosa (Kuznesof, 2007).

  Glikosida steviol stabil terhadap suhu dan hidrolisis baik pada kondisi produksi ataupun penyimpanan sehingga aman digunakan sebagai pemanis untuk minuman berbasis susu, makanan pencuci mulut, kue, yoghurts, permen, dan manisan (Kuznesof, 2007).

C. STEVIOSIDA

  

Gambar 3. Struktur Steviosida (Srimaroeng, 2005)

  Steviosida(13-[(2-O- β–D-glucopyranosyl-β–D-glucopyranosyl)oxy]kaur-

  16-en-18-oic acid β-D-glucopyranosyl ester) merupakan glikosida steviol yang diekstraksi dari daun Stevia rebaudiana Bertonii. Organoleptis dari steviosida adalah tampak seperti mentol, adanya after taste yang dapat dikurangi dengan meningkatkan kemurnian steviosida. Larutan steviosida pada rentang pH 3-9 dengan suhu 100 C selama 1 jam tidak menunjukkan penurunan kadar yang signifikan. Steviosida dipertimbangkan mengalami dekomposisi pada pH 10.

  Penelitian lain menunjukkan steviosida sangat stabil dalam larutan asam dan dengan adanya garam. Selain itu juga tidak terfermentasi sehingga tidak karsiogenik (Bakal and Nabors, 1986).

  Telah dilakukan uji mutagenik terhadap steviosida dan hasilnya negatif. Dari hasil uji tersebut, dapat dinyatakan bahwa steviosida tidak memiliki efek mutagenik yang signifikan atau aktivitas genetoksik. Steviosida juga dinyatakan memiliki efek hipoglikemik (Bakal and Nabors, 1986). Steviosida memiliki toksisitas akut yang rendah, dan dalam penggunaannya tidak memberikan efek reaksi alergi (Kroger, Meister, Kava, 2006).

D. SOKLETASI

  Pada sokletasi, alat yang digunakan dinamakan soklet. Mekanisme kerjanya adalah cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih. Uap penyari akan naik ke atas melalui serbuk simplisia. Uap penyari mengembun karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu (Anonim, 1986).

  Keuntungan metode sokletasi antara lain: cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung diperoleh hasil yang lebih pekat; serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak; dan penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan tanpa menambah volume cairan penyari. Kekurangan metode sokletasi antara lain: larutan dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan peralatan untuk mengurangi tekanan udara; dan cairan penyari dididihkan terus menerus sehingga cairan penyari yang baik harus murni atau campuran azeotrop (Anonim, 1986).

E. ETANOL

  Etanol mutlak mengandung tidak kurang dari 99,2% b/b setara dengan

  o

  tidak kurang dari 99,5% v/v C H OH pada suhu 15,56

  C. Pemerian: cairan mudah

  2

  5

  menguap, jernih, tidak berwarna. Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada

  o

  lidah. Mudah menguap walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78 C. mudah terbakar (Anonim, 1995).

  Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar, dan klorofil, lemak, malam, tannin, dan saponin hanya sedikit larut. Untuk meningkatkan penyarian biasanya digunakan campuran antara etanol dan air, perbandingannya tergantung pada bahan yang akan disari. Keuntungan dari pengunaan etanol sebagai penyari adalah lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorpsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas yang diperlukan lebih sedikit. Kerugian dari penggunaan etanol sebagai penyari adalah harganya yang relatif mahal (Anonim, 1986).

F. PENYARIAN

  Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang disari mengandung zat aktif yang dapat larut dan zat yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain (Anonim, 1986). Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi: Pembuatan serbuk, Pembasahan, Penyarian dan Pemekatan (Anonim, 1986).

  Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas. Tetapi dalam pelaksanaannya tidak selalu demikian, karena penyarian masih tergantung juga pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan (Anonim, 1986).

  Pembasahan serbuk sebelum dilakukan penyarian dimaksudkan memberikan kesempatan sebesar-besarnya kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori dalam simplisia sehingga mempermudah penyarian selanjutnya (Anonim, 1986).

  Dengan mengalirnya bahan pelarut ke dalam ruang sel juga mengakibatkan protoplasma membengkak, dan bahan kandungan sel akan terlarut sesuai dengan kelarutannya. Gaya yang bekerja adalah adanya perbedaan konsentrasi antara larutan didalam sel dengan cairan ekstraksi yang mula-mula masih tanpa bahan aktif yang mengelilinginya. Bahan kandungan sel akan mencapai ke dalam cairan di sebelah luar selama difusi melintasi melintasi membran sampai terbentuknya suatu keseimbangan konsentrasi antara larutan di sebelah dalam dan di sebelah luar sel (Voight, 1994).

  Penyarian dipengaruhi oleh :

  a. Derajat kehalusan serbuk

  b. Perbedaan konsentrasi yang terdapat mulai dari pusat serbuk simplisia sampai ke permukaannya, maupun pada perbedaan konsentrasi yang terdapat pada lapisan batas, sehingga suatu titik akan dicapai, oleh zat-zat yang tersari jika ada daya dorong yang cukup untuk melanjutkan perpindahan massa (Anonim,1986).

G. PERKOLASI

  Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut: serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh gaya beratnya sendiri dan cairan diatasnya dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan (Anonim, 1986).

  Cara perkolasi lebih baik daripada dengan maserasi karena aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang konsentrasinya lebih rendah sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. Ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).

  Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari. Larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukan penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).

  Cairan penyari yang digunakan harus memenuhi syarat kefarmasian atau dalam perdagangan dikenal dengan kelompok spesifikasi “ Pharmaceutical grade” sampai saat ini berlaku aturan bahwa pelarut yang diperbolehkan adalah air dan alkohol (etanol) serta campurannya. Jenis pelarut lain seperti methanol, heksana

  (hidrokarbon alifatik), toluene (hidrokarbon aromatik), kloroform (dan segolongannya), aseton, umumnya digunakan sebagai pelarut untuk separasi dan tahap pemurnian (Anonim, 1995).

  Serbuk simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan ke dalam bejana perkolator, tetapi dibasahi atau dimaserasi terlebih dahulu dengan cairan penyari. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup. Maserasi penting terutama pada serbuk simplisia yang mengandung bahan yang mudah mengembang bila terkena air. Bila serbuk tersebut langsung dialiri dengan cairan penyari maka cairan penyari tidak dapat menembus keselurahan sel dengan sempurna (Anonim, 1986).

  Setelah maserasi, massa dimasukkan ke dalam perkolator. Pemindahan dilakukan sedikit-demi sedikit untuk mengatur kecepatan pengaliran cairan penyari. Bila ada kekhawatiran bahwa aliran cairan penyari terlalu cepat, hingga zat aktif tidak tersari sempurna maka penekanan dapat dilakukan dengan agak kuat. Sebaiknya bila perkolat tidak menetes, berarti massa terlalu padat atau serbuk simplisia terlalu halus. Bila hal ini terjadi, isi perkolator harus dibongkar, dan kemudian dimasukkan kembali dengan penekanan yang agak longgar (Anonim, 1986). Untuk menentukan akhir perkolasi dapat dilakukan dengan pemeriksaan zat aktif secara kualitatif pada perkolat terakhir (Anonim, 1986).

  Cairan penyari dituangkan perlahan-lahan hingga di atas permukaan massa masih tergenang dengan cairan penyari. Cairan penyari harus ditambahkan sehingga terjaga adanya lapisan cairan penyari di atas permukaan massa. Untuk memudahkan penambahan cairan penyari diatas perkolator dipasang botol cairan penyari. Karena penetes cairan penyari diatur sehingga kecepatan menetes cairan penyari sama dengan kecepatan menetes sari (Anonim, 1986).

H. EKSTRAK

  Ekstrak adalah sediaan kering, kental, atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut metode yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari langsung. Cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol-air. Penyarian dengan campuran etanol-air dilakukan dengan cara maserasi, perkolasi, atau penyeduhan dengan air mendidih (Anonim, 1995).

  Pembuatan sediaan ekstrak dimaksudkan agar zat berkhasiat yang terdapat di simplisia terdapat dalam bentuk yang mempunyai kadar tinggi dalam hal ini memudahkan zat berkhasiat diatur dosisnya. Dalam sediaan ekstrak dapat distandarisasikan kadar zat berkhasiat sedangkan kadar zat berkhasiat dalam simplisia sukar didapat yang sama (Anief, 1998).

I. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

  Kromatografi Lapis Tipis merupakan suatu cara yang sederhana dan dapat dipercaya untuk mengidentifikasi suatu tanaman obat asli atau dalam bentuk ekstraknya (List dan Schmidt, 1989).

  Kromatografi Lapis Tipis adalah cara pemisahan dengan adsorbsi pada lapisan tipis adsorben. Kromatografi Lapis Tipis digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa organik, komplek senyawa organik dengan anorganik dan senyawa organik alam maupun sintetik (Sastrohamidjodjo, 1991).

  Kromatografi Lapis Tipis ialah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga yang berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).

  Metode pemisahan didasarkan atas pembagian campuran senyawa dalam dua fase dimana fase gerak bergerak terhadap fase diam pada bidang datar. Fase diam ditempatkan pada penyangga berupa pelat kaca yang cocok. Campuran senyawa yang akan dipisahkan ditotolkan pada larutan, kromatogram dikembangkan dalam bejana tertutup rapat berisi fase gerak. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler, selanjutnya berwarna harus ditampakkan atau dideteksi (Stahl, 1985).

  Fase diam dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan tersebut 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab atau bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985).

  Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Yang digunakan hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada kromatografi jerap, pelarut pengembang dapat dikelompokkan ke dalam deret eluotropik berdasarkan sifat elusinya. Misalnya, heksana nonpolar mempunyai efek elusi lemah, kloroform cukup kuat, dan metanol yang polar efek elusinya kuat. Tetapan dielektrik memberi informasi mengenai kepolaran suatu senyawa. Laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut dan tentu juga kepada struktur lapisan (misalnya butiran penjerap) (Stahl, 1985).

  Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut. Silika gel merupakan fase diam yang paling banyak digunakan dalam KLT.

  Material ini dapat langsung digunakan atau dicampur dengan pengikat misalnya kalsium sulfat untuk membuat lapisan yang lebih kohesif. Bila digunakan pengikat CaSO maka pada namanya diberi tanda G, misalnya silika gel G, dan bila dicampur

  4 dengan indikator fluoresensi diberi tanda F, misalnya silika gel GF (Stahl,1985).

  Identifikasi senyawa pada kromatogram dibawah lampu ultra violet pada daerah 254 nm dan 366 nm, ditandai dengan ada atau tidaknya warna atau fluoresensi. Untuk menampakkan bercak senyawa dengan intensitas lemah dapat digunakan reaksi semprot sesuai. Untuk identifikasi suatu senyawa menggunakan harga Rf, dimana harga Rf ini diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak elusi pelarut dari titik awal (Stahl, 1985).

  jarak yang ditempuh oleh zat Rf = jarak yang ditempuh oleh pelarut

  Angka Rf berkisar antara 0,00–1,00 dan hanya dapat ditentukan dengan dua desimal (Stahl, 1985).

J. PENETAPAN KADAR STEVIOSIDA

  Image J adalah program analisis gambar yang sangat kuat dan dibuat oleh

National Institutes of Health . Image J dapat digunakan oleh masyarakat umum,

  merupakan program dengan system pengoperasian yang beraneka ragam dan dapat diperbaharui secara setiap waktu (Reinking, 2007).

  Image J adalah program yang dapat digunakan masyarakat umum untuk

  mengolah dan menganalisa suatu gambar. Image J dapat mengukur luas area dan nilai piksel gambar, jarak dan sudut, membuat densitas histogram, dan plot kurva Keuntungan dari penggunaan program ini adalah hasil yang diperoleh akan akurat dan reprodusibel (Girish and Vijayalakshmi, 2004).

K. METODE DESAIN FAKTORIAL

  Desain faktorial merupakan aplikasi persamaan regresi yaitu teknik untuk memberikan model hubungan antara variabel respon dengan satu atau lebih variabel bebas (Bolton, 1997). Desain faktorial merupakan desain yang digunakan untuk mengevaluasi efek dari faktor yang dipelajari secara simultan dan efek yang relatif penting dapat dinilai (Armstrong and James, 1996).

  Desain faktorial 2 level berarti ada 2 faktor (misal A dan B) yang masing- masing faktor diuji pada dua level yang berbeda, yaitu level rendah dan level tinggi.

  Dengan desain faktorial dapat didesain suatu percobaan untuk mengetahui faktor yang dominan berpengaruh secara significan terhadap respon. Juga memungkinkan mengetahui interaksi diantara faktor-faktor tersebut (Bolton, 1997). n

  Desain faktorial dua level dan dua faktor diperlukan empat percobaan (2 = 4, 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah faktor). Rancangan percobaan desain faktorial dengan 2 faktor dan 2 level seperti tabel berikut:

  

Tabel I. Rancangan percobaan desan faktorial

dengan dua faktor dan dua level:

Formula Faktor A Faktor B Interaksi

1 - - + a + - - b - + -

  ab

  Keterangan :

• : level rendah

  : level tinggi + Formula 1 : Faktor A pada level rendah, faktor B pada level rendah Formula a : Faktor A pada level tinggi, faktor B pada level rendah Formula b : Faktor A pada level rendah, faktor B pada level tinggi Formula ab : Faktor A pada level tinggi, faktor B pada level tinggi

  Rumus yang berlaku : Y = b + b (X ) + b (X ) + b

  X X ……………………………………….(1)

  1 A

  2 B

  12 A B

  Dengan: Y = respon hasil atau sifat yang diamati

  X X = level faktor A, level faktor B

A, B

  b , b , b , b = koefisien, dapat dihitung dari hasil percobaaan

  o

  1

  2

12 Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki

  efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam menentukan respon. Metode ini ekonomis, dapat mengurangi jumlah penelitian jika dibandingkan dengan meneliti dua efek faktor secara terpisah (Bolton, 1997).

  Keuntungan utama desain faktorial adalah bahwa metode ini memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor, maupun efek interaksi antar faktor. (Muth, 1999).

  L. Landasan Teori

  Steviosida merupakan salah satu dari golongan glikosida steviol yang terdapat pada ekstrak daun stevia. Steviosida merupakan komponen terbesar dan komponen yang berperan sebagai pemanis selain Rebaudiosida A.