Pengaruh ekstrak etanolik daun mimba [Azadirachta indica A.Juss] terhadap proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar - USD Repository

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Anna Karina Algustie NIM : 058114012

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Anna Karina Algustie NIM : 058114012 PERSETUJUAN PEMBIMBING Yang diajukan oleh :

  Anna Karina Algustie NIM : 058114012

  Skripsi ini telah disetujui oleh: Pembimbing (Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.)

  Pengesahan Skripsi Berjudul

  Oleh : Anna Karina Algustie

  NIM : 058114012 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

  Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 10 Januari 2009

  Mengetahui Fakultas Farmasi

  Universitas Sanata Dharma Dekan

  (Rita Suhadi, M.Si.,Apt.) Pembimbing

  (Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt.) Panitia Penguji:

  1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt. 1……………………

  2. Rm. Drs. P. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J. 2……………………

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. 3……………………

  Dalam hidup ini meminta sesuatu adalah suatu hal biasa namun memberi dan mensyukuri segala sesuatu adalah suatu hal lain yang luar biasa

  Legenda Pribadi datang menghampiri semua orang, namun hanya beberapa saja yang berani menjawab panggilannya… Aku ingin bermimpi, kemudian...berlayar!!!

  Karya ini kupersembahkan untuk Tuhan Yesus yang selalu menemani setiap lamgkah hidupku Mami, Papi, De’Donny, De’Puput, De’Sasa

  Hikoza-ku, I love you Almamaterku LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

  Nama : Anna Karina Algustie Nomor Mahasiswa : 058114012

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: !"#$ % & '$#&

  '#!()*& # ! *+,# ' $%#-#. $()*/ $# * )

• /( *' .#-# *& #!'#! #) $ * '#$ beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: 11 Januari 2009 Yang menyatakan, (Anna Karina Algustie)

  Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan berkat;Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh Ekstrak Etanolik Daun Mimba (

  A. Juss) terhadap Proliferasi Sel Limfosit pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing, yang selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama penyusunan skripsi.

  2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan masukan dan saran.

  4. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan.

  5. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma.

  6. Mas Heru, Mas Parjiman, Mas Wagiran, Mas Kayat, Mas Yuwono, Mas Andri, Mas Sigit, Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan bantuan.

  7. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Mbak Istini, dan segenap karyawan LPPT UGM yang telah banyak membantu dan menemani dalam penelitian skripsi ini.

  8. Mami, Papi, dan adik;adikku yang selalu menyemangatiku dan mendoakanku. Untuk kasih sayang yang luar biasa.

  9. Agustinus Titis Iswara atas cinta yang luar biasa dan motivasi untuk tidak pernah menyerah.

  10. Illon, Rias, Yesika, Anni atas kerjasama, diskusi, canda tawa dan keluh kesah selama penyusunan skripsi ini.

  11. Sekar, Nolen, Lina “boy”, Tami, Anni, Imelda, Mitha, teman;teman UKK “A”, teman;teman FKK ‘05 dan teman;teman kost atas dukungan, kebersamaan, dan kesediannya untuk berbagi suka dan duka selama ini.

  12. Nur’aniyah, Ratna, Cawas, Cicil atas masukan yang sangat berguna dalam penyelesaian skripsi ini.

  13. Teman;teman angkatan 2005 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas kebersamaannya.

  14. Semua pihak yang telah banyak memberikan dukungan dalam penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

  Penulis menyadari tulisan ini masih banyak kekurangan dan kesalahan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atas tulisan ini. Penulis berharap tulisan ini berguna untuk perkembangan ilmu kefarmasian.

  Penulis Saya menyatakan bahwa sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 6 November 2008 Penulis,

  Anna Karina Algustie mg : miligram ml : mililiter rpm : rotasi per menit FBS : Fetal Bovine Serum MTT : 3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;dipheniltetrazolium bromide) reagen : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N RPMI : Rosswell Park Memorial Institute SDS : Sodium Dodesil Sulfat 96 : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

  ADCC : Antibody Dependent Cytotoxic Cell CTL : Cell T Lymphocyte

  Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap suatu penyakit. Tanaman mimba adalah salah satu tanaman yang diduga dapat meningkatkan sistem imun tubuh. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa eksrak air daun dan kulit batang mimba berkhasiat meningkatkan sistem imun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit dan berapa besar persentase peningkatan proliferasi sel limfosit.

  Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menghitung kultur sel limfosit yang diambil dari limpa tikus jantan dengan metode MTT (3; (4,5;dimethylthiazol;2;yl);2,5;diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh kemudian diolah secara statistik dengan uji Kruskal Wallis.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba mempunyai aktifitas imunostimulan dengan meningkatkan proliferasi sel limfosit. Peningkatan proliferasi sel limfosit terjadi pada kelompok perlakuan dosis 35 mg/kgBB, 70 mg/kgBB dan 140 mg/kgBB dengan peningkatan proliferasi sel limfosit sebesar 56,83%; 62,30 % dan 59,18% terhadap kontrol negatif.

  Kata kunci : proliferasi sel limfosit, tikus jantan, ekstrak etanolik, daun mimba

  Immune system protects the body from many diseases. Neem is plant which is expected to increase immune system. Various researches had been done previously show that water extract of neem’s bark increased immune system. The purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf on lymphocyte proliferation and to determine the percentage of the increasing of lymphocyte proliferation.

  This research is a pure experimental research with the complete random design one way pattern. Wistar male rats were given ethanolic extract of neem’s leaf and induced by hepatitis B vaccine. Lymphocyte proliferation was measured by using MTT method (3;(4, 5;dimethylthiazol;2;yl);2,5;diphenyltetrazolium bromide). The result was analysed statistically by using Kruskal;Wallis test.

  The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf shows immunostimulant activity to lymphocyte proliferation. Immunostimulant effect is achieved at the dose of 35;70;140 mg/kgBB with the percentage of proliferation increase are 56,83%; 62,30% and 59,18%, respectively.

  Key words: lymphocyte proliferation, male rat, ethanolic extract, neem’s leaf

  Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v PRAKATA.................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ............................................. x

  INTISARI ..................................................................................................... xi .................................................................................................... xii

  DAFTAR ISI................................................................................................. xiii DAFTAR TABEL......................................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii BAB I PENGANTAR..................................................................................

  1 A. Latar Belakang .....................................................................................

  1 1. Rumusan masalah .......................................................................

  2 2. Keaslian penelitian......................................................................

  3 3. Manfaat penelitian ......................................................................

  3 B. Tujuan ..................................................................................................

  4 1. Tujuan umum…… ......................................................................

  4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................

  14 I. Hipotesis ..............................................................................................

  16 1. Alat ............................................................................................

  16 C. Alat dan Bahan .....................................................................................

  16 5. Definisi operasional ....................................................................

  15 4. Variabel pengacau tak terkendali................................................

  15 3. Variabel pengacau terkendali......................................................

  15 2. Variabel tergantung.....................................................................

  15 1. Variabel bebas.............................................................................

  15 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...................................

  15 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................

  14 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................

  13 H. Kerangka Pemikiran.............................................................................

  5 A.

  12 G. MTT .....................................................................................................

  11 F. Ekstraksi...............................................................................................

  ® ...........................................................................

  2. Hepavax;Gene

  11

  10 1. Vaksin Hepatitis..........................................................................

  9 E. Antigen.................................................................................................

  9 D. Limfosit………....................................................................................

  7 C. Imunomodulator……………...............................................................

  5 B. Sistem Imun..........................................................................................

  A. Juss ..................................................................

  16

  D. Tata Cara Penelitian .............................................................................

  18 1. Determinasi tanaman...................................................................

  18 2. Pengumpulan daun mimba..........................................................

  18 3. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba ..................................

  18 4. Perlakuan ekstrak etanolik daun mimba terhadap hewan uji......

  18 5. Induksi antigen............................................................................

  19 6. Kulturisasi sel limfosit ................................................................

  19 7. Pengukuran peningkatan proliferasi sel limfosit.........................

  20 E. Analisis Hasil.......................................................................................

  20 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................

  22 A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia........................

  22 B. Hasil Ekstraksi .....................................................................................

  23 C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji ...................................................

  24 D. Hasil Isolasi Sel Limfosit.....................................................................

  27 E. Hasil Uji Peningkatan Proliferasi Sel Limfosit.............. .....................

  28 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................

  33 A. Kesimpulan ..........................................................................................

  33 B. Saran ....................................................................................................

  33 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

  35 LAMPIRAN..................................................................................................

  38 BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................

  55

  Halaman Tabel I. Data Rata;rata Absorbansi Sel Limfosit dan Standar

  Deviasi Setelah Inkubasi selama 72 jam..................................... 29 Tabel II. Persen Besar Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit

  Kelompok Perlakuan Dibandingkan Kelompok Kontrol............ 31 Tabel III. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata;rata Mingguan

  Selama Masa Perlakuan .............................................................. 41 Tabel IV. Hasil Uji Proliferasi Kultur Sel Limfosit dengan

  Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba................................... 42

  Halaman Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh.........................

  8 Gambar 2. Skema Kerja Penelitian............................................................

  21 Gambar 3. Profil Rata;rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan .......................................................................

  25 Gambar 4. Foto Histologi Hepar................................................................

  27 Gambar 5. Kultur Sel Limfosit Hidup .......................................................

  28 Gambar 6. Reaksi Pembentukan Kristal Formazan ...................................

  29 Gambar 7. Grafik Rata;rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan..................................................................................

  30

  Halaman Lampiran 1. Perhitungan Dosis .................................................................

  39 Lampiran 2. Rata;rata Berat Badan Tikus per Minggu .............................

  41 Lampiran 3. Data Absorbansi Sel Limfosit ...............................................

  42 Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif…………………....…….

  42 Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Shapiro Wilk dan Uji Homogenitas Data.................................................................

  45 Lampiran 6. Uji Hipotesis Hasil Penelitian dengan Uji Kruskal Wallis ...

  46 Lampiran 7. Uji Kruskal Wallis Kelompok Perlakuan Daun Mimba .......

  46 Lampiran 8. Perhitungan Persentase Kenaikan Proliferasi Sel Limfosit…. 47 Lampiran 9. Tanaman Mimba ( A.Juss)……………… 48 Lampiran 10. Daun Mimba ( A.Juss) ……………........ 49 Lampiran 11. Serbuk Daun Mimba……………………….….…………… 50 Lampiran 12. Ekstrak Etanolik Daun Mimba..............................................

  50 Lampiran 13. 96; ........................................................................

  51 Lampiran 14. ELISA SLT 340 ATC ...............................................

  51 Lampiran 15. Surat Pengesahan Determinasi..............................................

  52 Lampiran 16. Hasil Histologi Hepar .............................................................

  53 Lampiran 17. Surat Keterangan Penelitian ...................................................

  54

  #'#$ )#&#!" Dewasa ini banyak penyakit baru yang berkembang dan tingkat kematian karena berbagai penyakit tersebut terus meningkat. Hal ini dapat dicegah apabila tubuh mempunyai imunitas yang baik. Imunitas merupakan resistensi (pertahanan) tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas ini bersifat alami (bawaan) atau diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Oleh karena pentingnya imunitas tubuh, menurut pusat penelitian imun ( ) maka perlu adanya pemeliharaan sistem imun untuk mengurangi resiko melemahnya sistem imun tubuh, antara lain dengan: mengurangi stress, banyak berolahraga, asupan gizi yang cukup (buah, sayur, produk rendah lemak, suplemen makanan), dan istirahat yang cukup (Anonim, 2008a). Sistem imun tubuh yang baik akan meningkatkan respon imun terhadap antigen atau agen penyebab infeksi sehingga mencegah terjadinya gejala penyakit atau dapat juga mempercepat penyembuhan penyakit, dan dengan imunitas tubuh yang baik, secara umum diharapkan adanya peningkatan kesehatan masyarakat.

  Salah satu cara peningkatan sistem imun tubuh dengan suplemen disebut sebagai imunostimulan. Kebutuhan imunostimulan di masyarakat mulai meningkat dan untuk memenuhi kebutuhan tersebut telah dikembangkan beberapa produk herbal. Adanya peningkatan kebutuhan ini mendorong pencarian tanaman obat yang mempunyai efek imunostimulan. Salah satu tanaman yang telah dikenal mempunyai banyak manfaat kesehatan adalah tanaman mimba (

  A. Juss). Hampir semua bagian dari tanaman ini mempunyai manfaat bagi keseimbangan kehidupan, antara lain: pengusir serangga, antidiabetes, antimikroba, antifertilitas, antikanker dan diduga dapat pula meningkatkan sistem imun tubuh (Biswas, 2002). Sebelumnya telah diketahui bahwa kulit batang tanaman mimba mempunyai efek sebagai imunostimulan (Biswas, 2002). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba dapat meningkatkan antibodi (Ray, 1996).

  Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun mimba dalam peningkatan proliferasi sel limfosit yang berperan sebagai sel imunitas tubuh. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji dan in vitro dengan pengkulturan sel limfosit kemudian diukur perbedaan proliferasi sel limfosit dengan metode MTT.

  Dari penelitian ini diharapkan adanya pengembangan sediaan herbal yang mampu meningkatkan sistem imun sehingga imunitas tubuh meningkat dan tubuh dalam kondisi siap dalam menghadapi penyakit.

• 1 #! +# #)#%

  a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel b. Berapa besar peningkatan proliferasi sel limfosit hewan uji dengan pemberian ekstrak etanolik daun mimba? # )*#! ! )*'*#!

  Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak etanolik daun mimba dalam meningkatkan proliferasi sel limfosit tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait dengan efek imunostimulan tanaman mimba antara lain: Efek Imunomodulator dari Minyak Mimba ( A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi respon imun humoral dan seluler oleh (Mimba) pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM;76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang Menghambat Perkembangan dan B16 (Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).

  2 #!/##' ! )*'*#! Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel limfosit ini diharapkan bermanfaat antara lain: a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem imun tubuh dengan peningkatan proliferasi sel limfosit.

  b. manfaat praktis penelitian ini adalah pemanfaatan daun mimba sebagai peningkat sistem imun atau dapat dikembangkan menjadi sediaan herbal

  3 #! 1 3 #! + + Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba ( A. Juss.) mempunyai efek imunostimulan.

  3 #! %

  a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit b. Untuk mengetahui berapa besar peningkatan proliferasi sel dengan pemberian ekstrak etanolik

• ,# 1 ' $#!"#! ,('#!*

  Pohon mimba dideskripsikan dengan nama pada awal 1830 oleh De Jussieus (Biswas, 2002). Posisi taksonomik mimba sebagai berikut:

  Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Class : Dicotyledonae Ordo : Rutales Family : Meliaceae (keluarga mahogany) Genus : Species :

  A. Juss (Hutapea, 1993) Nama daerah : imba, mimba, membha, mempheuh (Anonim, 1989).

  Deskripsi tanaman pohon dengan tinggi 10;15 m; Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, simpodial, coklat; Daun majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip; Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris; Buah buni, bulat telur, hijau ; biji bulat, diameter ±1 cm, putih; Akar tunggang, coklat (Hutapea, 1993).

  %# *#' *+,# Selama ini, mimba digunakan sebagai pupuk tanah, repelan, insektisida, lubrikan, sabun, produk hygiene mulut, dan pengobatan tradisional. Bagian yang paling banyak diteliti dari mimba adalah digunakan dalam agrikultur sebagai biopestisida. Fraksi kasar dari berbagai bagian tanaman mimba yang terisolasi telah diketahui mempunyai efek sebagai antiinflamasi, antirematik, antiartitis, antipiretik, antimalaria, antimikroba, depresi sistem saraf pusat (SSP), antiulcer, antidiabetes, antitumor, antifertilitas, imunostimulan dan efek kardiovaskuler. Kandungan mimba dapat dibagi menjadi dua kelas mayor : isoprenoid dan lainnya. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid termasuk protomeliacin, limonoid, azadirone dan derivatnya, gedunin dan derivatnya, tipe kandungan vilasinin dan C secomeliacins seperti nimbin, salanin dan azadirachtin.

  Kandungan nonisoprenoid meliputi protein (asam amino) dan karbohidrat (polisakarida), konponen sulfur, polifenolik seperti flavonoid dan glikosidanya, dihidrocalcone, kumarin dan tannin, komponen alifatik, dan lainnya. Pada kulit batang mimba mengandung catechin dan NB II Peptidoglycan yang diduga mempunyai aktivitas imunomodulator (Biswas, 2002). Kandungan senyawa pada daun mimba antara lain: karbohidrat, β; sitosterol, calsium, fiber, magnesium, nimbaflavon, nimbolide, phosphorus, protein, quercetin, rutin (Duke, 1996).

  Penelitian tanaman mimba sebagai imunomodulator sudah banyak dilakukan, antara lain: Efek imunomodulator minyak mimba pada mencit menunjukkan adanya peningkatan proliferasi limfosit (Upadhyay, 1992); Ekstrak menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator dari NIM;76, suatu fraksi volatile dari biji mimba pada tikus. Pada pemberian NIM;76 dengan dosis 120 mg/kgBB terdapat peningkatan aktivitas makrofag dan respon proliferasi limfosit tikus (Sairam, 1997); Ekstrak air dari daun mimba meningkatkan sistem imun tubuh baik dengan peningkatan humoral (antibodi) dan sistem imun tergantung sel (Biswas, 2002) ; Preparat daun mimba dapat meningkatkan aktivasi imun yang menghambat perkembangan dan B16 dengan induksi proliferasi limfosit pada mencit galur swiss dan C57BL/6 (Baral, 2004). Preparat daun mimba meningkatkan respon imun Th 1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara dengan hasil peningkatan antibodi tergantung sel sitotoksik (ADCC) dan sel T sitotoksik (CTL) (Mandal, 2007).

• ' + + ! Imunitas adalah suatu keadaan dimana tubuh resisten terhadap penyakit terutama penyakit infeksi. Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun sedangkan reaksi yang dikoordinasi sel;sel dan molekul;molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya disebut respon imun (Baratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap

sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991).

  Antigen yang masuk dalam tubuh akan mengaktifkan makrofag atau monosit. Makrofag akan mempengaruhi sel imunokompeten yaitu sel limfoid dari sistem retikuloendotelial. Antigen yang telah diaktifkan oleh plasma sel akan merangsang sel limfoid dalam proses imunologik selanjutnya. Sel limfosit terdiri dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi, sedangkan sel T ( ! " akan tersensitisasi menjadi menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel plasma dan (gambar 1) Memori imunologik dapat berada dalam bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan, 1991).

  

#+,#$ 1 !" !#)#! !'*" ! -#! .(! + ! , % !(!*+4 5,

• !(+(- )#'($ Imunomodulator dapat didefinisikan sebagai substansi biologi atau sintetis yang mampu menstimulasi, menekan, atau memodulasi komponen; komponen pada sistem imun. Fungsi utama sistem imun adalah melindungi individu dalam menghadapi agen infeksi dan potensial patogen. Hal ini menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit (Juyal, 2003).

  Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004).

  Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).

  Senyawa;senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain: rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat, asam oleanolik, asam ursolic. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan antara lain: phosphorus (Duke, 1996).

• /( *' Limfosit adalah leukosit mononukleus dan tidak bergranula yang mempunyai inti berwarna gelap yang mengandung kromatin tebal dan sitoplasma yang berwarna biru pucat, suatu sel berinti satu berdiameter 7;12 Pm yang

  (Anonim,1998). Limfosit mencakup sel T dan sel B, yang mempunyai peran utama dalam imunitas (Brooks, 1995). Peningkatan dan penurunan konsentrasi sel ini mempengaruhi kesehatan (imunitas) tubuh untuk mengenali antigen asing dan penurunan respon imun (Dhote, 2005). Untuk terjadinya respons imun efektif harus terjadi peristiwa seluler yang rumit yang berurutan. Antigen harus terikat dan bila perlu diproses oleh sel penyaji antigen yang kemudian berhubungan dan mengaktifkan sel B dan sel T. Sel T helper harus membantu sel B dan prekursor sel T sitotoksik tertentu dan diperlukan mekanisme yang mampu melipatgandakan jumlah sel efektor berpotensi dengan cara proliferasi dan berdiferensiasi, untuk menghasilkan mediator imunitas humoral dan seluler. Integrasi dari interaksi seluler yang rumit yang terjadi ! ! , yang merupakan dasar respons imun, terjadi pada jaringan limfoid perifer atau sekunder, yang arsitekturnya teratur; yaitu kelenjar getah bening, limpa (Roitt, 1994)..

  !'*" ! Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi antibodi (Baratawidjaja, 2004). Secara fungsional antigen dibagi menjadi imunogen dan hapten. Hapten adalah molekul kecil yang dapat merangsang respon imun apabila diika oleh molekul besar. Kompleks antara hapten dan molekul besar (disebut karier atau molekul pembawa) dapat berperan sebagai imunogen (Baratawidjaja, 2004). Tidak semua antigen menimbulkan respon imunogenik, namun semua imunogen adalah antigen (Janeway, 1994). Bagian daerah hipervariabel antibodi yang berkontak dengan antigen diberi istilah paratop dan bagian antigen yang berkontak dengan paratop disebut epitop (Roitt, 1994).

  Antigen eksogen adalah antigen yang masuk dari luar tubuh, misalnya dengan inhalasi, ingesti atau injeksi. Oleh endositosis atau fagositosis, antigen ini kemudian dipresentasikan pada # # (APCs) dan diproses menjadi fragmen;fragmen. APCs kemudian mempresentasikan fragmen;fragmen

• tersebut pada sel T helper (CD4 ) dengan menggunakan molekul histocompatibility kelas II pada permukaannya. Beberapa sel T spesifik terhadap peptida: komplek MHC. Mereka kemudian diaktifkan dan mulai menghasilkan sitokin. Sitokin adalah substansi yang dapat mengaktifkan limfosit T sitotoksik (CTL), antibodi dari sel B, makrofag, dan partikel lain (Anonim, 2008c). 1 #& *! .#'*'*

  Vaksin hepatitis B adalah vaksin yang dikembangkan untuk mencegah infeksi virus hepatitis B. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan rekayasa genetik galur ! yang mengandung plasmid atau gen untuk antigen HbsAg (Baratawidjaja, 2004). Setelah injeksi vaksin sebanyak 3 kali, suatu antibodi terhadap HbsAg akan mengalir di darah. Antibodi ini dikenal sebagai $%& #. Antibodi dan memori sistem imun kemudian menyediakan imunitas terhadap infeksi virus hepatitis B (Anonim, 2008d).

  ®

  .#6#78 !

  ®

  Hepavax;Gene adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B (HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan '

  % ( 1 ml vaksin mengandung 20 mcg

  ®

  HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax;Gene adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008e). Vaksin ini diproduksi oleh Berna Biotech Korea Corporation.

  & '$#& * Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut dalam cairan penyari (Anonim, 2000).

  Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan maserasi, perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi dan perkolasi (Anonim, 1979).

  Maserasi adalah salah satu cara penyarian yang sederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding rongga sel sehingga masuk dalam sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut terjadi berulang sehingga terjadi keseimbangan antara di dalam dan di luar sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air;etanol, atau pelarut lain (Anonim, 1986).

  Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena lebih selektif, sulit ditumbuhi kapang dan kuman dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, dan panas yang dibutuhkan untuk pemekatan tidak terlalu tinggi (Anonim, 1986).

  Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak, malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

  Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji proliferasi adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3;(4,5;dimetil;tiazol;2;il);2,5;difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO, isopropanol, atau pelarut yang tepat, maka produk formazan larut dan dibebaskan sehingga dapat diukur secara kolorimetri. Kemampuan enzim dehidrogenase mitokondria untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel hidup. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan

  (Castell, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur

  $#!"&# +*&*$#! Sistem imun merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap segala macam antigen yang masuk dalam tubuh. Peranannya sangat penting untuk mencegah seseorang terserang penyakit. Karena fungsinya yang sangat penting inilah, dibutuhkan sistem imun yang kuat. Peningkatan sistem imun dapat dilakukan dengan cara pemberian suplemen makanan.

  Daun mimba merupakan salah satu tanaman obat yang diduga dapat digunakan sebagai imunostimulan. Daun mimba mempunyai kandungan rutin, quercetin, polisakarida, phosphorus yang mempunyai aktivitas sebagai imunomodulator. Berbagai penelitian efek imunomodulator daun mimba telah dipublikasikan, antara lain penelitian Ekstrak air kulit batang mimba telah terbukti mempunyai efek sebagai imunomodulator (Biswas, 2002); Ekstrak air daun mimba pada 100 mg/kg setelah 3 minggu pemberian secara oral menyebabkan peningkatan IgM dan IgG disertai peningkatan titer antibody antiovalbumin pada mencit (Ray, 1996). Pemberian 120 mg/kgBB NIM;76, suatu fraksi menguap dari minyak mimba menunjukkan peningkatan aktivitas imunostimulan dengan mengaktifkan mekanisme imun yang diperantarai sel pada tikus (Sairam, 1997).

  Penelitian ini adalah penelitian awal penemuan senyawa dari tanaman yang berefek sebagai imunostimulan dengan cara peningkatan proliferasi sel limfosit.

• .(' * Ekstrak etanolik daun mimba (

  A. Juss) mempunyai

  !* -#! #!9#!"#! ! )*'*#! Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba ( A. Juss) terhadap peningkatan proliferasi sel limfosit pada tikus jantan galur wistar ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

  #$*#, ) ! )*'*#! -#! /*!* * . $# *(!#)

  1. Variabel bebas Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu: 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB tikus, 140 mg/kg BB tikus.

  2. Variabel tergantung Besar kenaikan proliferasi sel limfosit

  3. Variabel pengacau terkendali

  a. Suhu pembuatan ekstrak etanolik, dikendalikan pada suhu ruangan 25

  o

  C–

  30

  o C.

  b. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan, berat badan 150;250 g c. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640.

  d. Inkubasi sel limfosit dikendalikan dengan disimpan di inkubator dengan

  o e. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

  4. Variabel pengacau tak terkendali Kondisi fisiologis dan patologis hewan uji

  5. Definisi operasional

  a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM berumur 3 bulan.

  b. Ekstrak etanolik daun mimba adalah hasil penyarian daun mimba dengan metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 70%.

  c. Imunostimulan ialah senyawa atau yang menyebabkan peningkatan sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan proliferasi sel imun.

  d. Peningkatan proliferasi sel limfosit adalah peningkatan pertumbuhan sel yang ditandai dengan peningkatan jumlah sel kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol.

  )#' -#! #%#! ! )*'*#! 1 )#' Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat;alat gelas, timbangan analitik (Sartorius), alumunium foil, alat bedah, alat injeksi (Terumo),

  # , tabung # (Nunc), autoklaf, # # , inkubator (Memmett), mikropipet, autoklaf, lemari pendingin, , )*$

  (SLT 340 ATC), (Nebaueur)+ tissue (Nice), sarung tangan, masker.

  (Sigma), Aquabides steril 2) Buffer lisis eritrosit : tris buffer ammonium klorida : tris base 0,17 M, NH

  d) fungison 0,5%

  c) penisilin;streptomisin 1% v/v (Gibco)

  b) Fetal bovine serum (FBS) 10 % (Gibco)

  a) Medium RPMI (Sigma)

  3) Media penumbuh: Medium komplit

  4 Cl 0,16 M

  3 (Sigma), HEPES

  #%#! Bahan;bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

  Media RPMI : RPMI 1640 (Sigma), NaHCO

  e. Bahan untuk kulturisasi sel limfosit 1) Media pencuci

  d. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac;gene®)

  c. Etanol teknis 70%

  b. Hewan uji tikus jantan galur wistar berumur 3 bulan dengan berat badan 150;250 g

  a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta

  f. Bahan untuk uji proliferasi sel limfosit

  Buffer pelarut MTT : Phosphat buffered saline steril Reagen Stopper: Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N

  #'# 0#$# ! )*'*#! 1 ' $+*!# * '#!#+#! Determinasi daum mimba dilakukan di laboratorium Farmakognosi

  Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink, Jr., 1965).

  !" +. )#! -# ! +*+,# Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008.

  2 +, #'#! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,# Sepuluh bagian serbuk daun mimba dimaserasi dengan etanol teknis sebanyak 70 bagian (Anonim, 1986). Maserasi dilakukan selama 24;48 jam dengan pengadukan terus;menerus menggunakan shaker. Filtrat yang didapat kemudian disaring dan kemudian dipekatkan dengan ! ! sampai sebagian besar etanol menguap dan terpisah dari filtrat. Filtrat yang didapat dikeringkan dengan oven. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan selanjutnya digunakan sebagai senyawa uji. : $)#& #! & '$#& '#!()*& -# ! +*+,# ' $%#-#. % ;#! 3*

  Tiga kelompok hewan uji, masing;masing kelompok hewan uji diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35 mg/Kg BB, 70 mg/kg BB, 140 mg/kg BB secara peroral setiap hari selama 48 hari. Kelompok keempat diberi perlakuan aquades sebagai kontrol negatif.

  < !- & * #!'*" ! Selama proses pemberian ekstrak mimba, hewan uji divaksinasi dengan antigen untuk memicu respon imun. Proses vaksinasi dilakukan setelah proses perlakuan dengan ekstrak etanolik selama 7 hari, masing;masing kelompok uji diinduksi dengan antigen sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke 7, 21, dan 35.

  = )' $* # * ) )*+/( *' Setelah proses induksi antigen selesai, hewan uji dikorbankan dan diambil sel limfositnya dari organ limpa. Tikus diletakkan dalam posisi telentang, kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya dengan alkohol 70%. Limpa diangkat dan diletakkan dalam cawan petri diameter 50 mm yang berisi 5 ml medium RPMI. Limpa dibersihkan dengan pinset steril dari organ dan jaringan yang mengikat. Limpa dicuci dibawah , - (LAF) dengan jalan memindahkan Limpa dari satu cawan petri ke cawan petri berikutnya yang telah disiapkan (4;5 cawan petri berisi 10 ml medium tanpa serum pada masing;masing petri).

  Pada organ limpa dilakukan penyemprotan medium ke dalam organ dengan alat suntik 5 ml atau 10 ml dari berbagai posisi sampai organ tampak transparan dan didapatkan suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan dalam tabung

  o

  sentrifus 10 ml. sel disentrifus pada 1200 rpm 4 C selama 10 menit. Pellet yang didapat disuspensikan dalam 2 ml tris buffer ammonium klorida. Sel dicampur

  o selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pellet dicuci dengan RPMI 2 kali

  o dengan dara dipipet berulang;ulang dan disentrifus 1200 rpm 4 C selama 5 menit.

  Supernatan dibuang dan sel limfosit disuspensikan dengan medium komplit. Sel dihitung dengan hemositometer.

  > !" & $#! . !*!"&#'#! .$()*/ $# * ) )*+/( *' Dalam )* dimasukkan 100 Tl suspensi sel dalam media

  RPMI yang sudah disterilkan dengan filter 0.22Tl + 100Tl senyawa antigen, inkubasi 3 x 24 jam, 10Tl media kemudian diambil dari tiap;tiap sumuran lalu tambahkan 10 Tl larutan 5 mg/ml MTT dalam PBS steril, inkubasi 4 jam. Tambahkan 100Tl larutan stop (10 % SDS + HCl 0,01N dalam akuades). Inkubasi dilanjutkan 18;20 jam dan selanjutnya dibaca absorbansinya dengan menggunakan ELISA pada 550 nm.

  λ

  !#)* * # *) Untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data secara statistik. Data diuji normalitasnya, apabila distribusi data normal, uji statistik yang dilakukan adalah uji parametrik dengan ANOVA satu arah. Apabila distribusi data tidak normal, dilakukan uji non parametrik dengan Kruskal;Wallis.

  & +# ! )*'*#!

  

#+,#$ & +# $3# ! )*'*#!

  Proses Ekstraksi daun mimba Kontrol

  Aquades Isolasi Limfosit dari Organ Limpa Hewan Uji

  Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Persiapan Penelitian

  Pengumpulan Daun Mimba Induksi Antigen

  Kelompok Perlakuan

  35mg/kgBB Kelompok

  Perlakuan 70mg/kgBB

  Kelompok Perlakuan

  140mg/kgBB

  !" +. )#! # ! *+,# -#! +, #'#! *+.)* *# Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman

  A. Juss (Mimba) yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang dikumpulkan berasal dari satu pohon dan dalam sekali pemanenan. Hal ini bertujuan untuk menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun yang diambil. Umur daun yang dipilih tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda sehingga diperoleh kandungan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya dilakukan pemisahan daun dari tangkai daun, bagian tumbuhan yang lain, atau dari bahan asing yang ikut terbawa saat pemanenan daun mimba. Daun dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel.

  Daun yang sudah dibersihkan dikeringkan di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam untuk mencegah kerusakan senyawa kemudian setelah

  o

  daun cukup kering, daun dikeringkan dengan oven pada suhu 40 – 60 C selama 24 jam sampai daun mudah dihancurkan. Daun kemudian diblender, diayak

  2

  dengan ayakan yang mempunyai 154 lubang per 1 cm dan disimpan sebagai serbuk simplisia kering.