DEOXYRIBO NUCLEIC ACID BAKTERI DARI ORGAN IKAN NILA (

  Metode isolasi Deoxyribo Nucleic Acid bakteri dari ..... (Lila Gardenia) METODE ISOLASI DEOXYRIBO NUCLEIC ACID BAKTERI DARI ORGAN IKAN NILA ( Oreochromis niloticus) Streptococcociasis UNTUK DIAGNOSA DENGAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION

  

Lila Gar denia dan Ist i Koeshar yani

  Pusat Penelit ian dan Pengem bangan Perik anan Budidaya Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakart a Selat an 12540

  E- m ail: lila_abimanyu@yahoo.com (Naskah diterima: 9 Agustus 2011; Disetujui publikasi: 3 November 2011)

ABST RAK

  Streptococcus sp. m enyebabkan wabah penyakit dan m enim bulkan kem atian m assal

  pada beberapa jenis ikan di seluruh dunia dengan angka kerugian yang ditim bulkannya berk isar 150 j ut a US$ per t ahun. Streptococcus agalactiae m erupak an salah sat u bak t eri penyebab Streptococcocis pada ik an nila (Oreochromis niloticus). Saat ini diagnosa agen penyebab penyakit bakt eri t ersebut dapat dilakukan dengan t eknik PCR (Polymerase Chain Reaction) m enggunakan pasangan prim er spesifik (Sdi252- Sdi61), nam un pada um um nya ekstraksi dilakukan m elalui proses m engisolasi bakteri dari organ terinfeksi, m enum buhkan pada m edia agar, pem urnian isolat dan terakhir isolasi DNA. Sedangkan isolasi DNA bakteri langsung dari organ yang terinfeksi dapat m em persingkat waktu diagnosa agen penyakit tersebut. Tujuan penelitian ini adalah unt uk m em peroleh m et ode ek st rak si yang dapat m engisolasi DNA bak t eri secara langsung dari organ ikan yang terinfeksi (otak, hati, lim fa, dan ginjal). Metode yang digunakan adalah pem anasan, ekstraksi DNA secara kim iawi dengan DNAzol reagent dan dengan mini column QIAam p DNA Mini Kit . Dari hasil penelit ian m enunjukkan bahwa m etode pem anasan, DNAzol reagent dan QIAam p DNA Mini Kit m asing- m asing m enghasilkan band positif sebesar 82%, 64%, dan 100%. Lim fa dapat digunakan untuk m engisolasi DNA Streptococcus agalactiae secara langsung dengan m enggunakan ketiga m acam m etode ekstraksi, nam un QIAam p DNA Mini Kit m enghasilkan DNA yang leb ih b er sih d engan t ingk at k em ur nian yang t inggi. Isolasi langsung d ar i or gan m em percepat proses ident ifikasi bakt eri.

  KATA KUNCI: St r ept ococcus agalact iae, ek st r ak si D NA, bak t er i, PCR ABST RACT : M et hod s of b act er ial D eoxyr ib o Nucleic Acid isolat ion f r om t i ssu e o r g a n s o f n i l e t i l a p i a ( Oreochromis niloticus) f o r Polym erase Chain Reaction diagnosis of Streptococcociasis. By: Lila Gar d enia and I st i Koeshar yani Streptococcus sp. have caused numerous outbreaks of disease and caused mass mortality of several cultured fish species throughout the world resulting in severe economic losses of $150 million annually. Streptococcus agalactiae is one of the bacteria that cause St r ep t ococcocis in nile tilapia (Or eochr om is nilot icus). Currently, the detection of the causative agents of the bacterial diseases can be carried out by PCR (Polymerase Chain Reaction) using specific primer pairs (Sdi252- Sdi61). However, the extraction of bacteria is done through several isolation processes

  

which are isolating the bacteria from infected organs tissue, growing on agar plates,

isolation and purification of the bacterial isolates before proceeding to the DNA

extraction. An approach of isolating the bacterial DNA directly from the infected

tissues can greatly reduce the lenght of detection process. The aim of this study was

to obtain the extraction method that can isolate bacterial DNA directly from organ

tissues of infected fish (brain, liver, spleen and kidney). The methods used were heating,

chemical DNA extraction with DNAzol reagent and mini-column based DNA extraction

with QIAamp DNA Mini Kit. The results showed that heating, DNAzol reagent and

mini-column based DNA Mini Kit methods, can produced a positive band of 82%, 64%

and 100% respectively. Spleen as the target organ in Streptococcus agalactiae

infection can be used in direct isolation of bacterial DNA using all of the extraction

methods used in this research. DNA isolated from QIAamp DNA Mini Kit methods is

cleaner and has higher level of purification. Isolation of DNA directly from infected

organ can shorten the lenght of the bacterial identification process.

  Streptococcus agalactiae m er u p ak an

  Pr oses ek t r ak si p ad a d asar nya ad alah untuk m em bebaskan DNA dari m assa sel dan k o m p o n en - k o m p o n en l ai n d i d al am sel . Um um nya ekst raksi unt uk m engisolasi DNA

  akurat dibandingkan m et ode konvensional sep er t i u j i k ar ak t er i st i k b i o k i m i a. Uj i karakt erisasi f isiologi sering m enim bulkan k esu l i t an d al am m en g i d en t i f i k asi k ar en a hasilnya dapat berbeda- beda tergantung pada ukuran inokulum , suhu dan lam a inkubasi, k o m p o si si m ed i a, p er b an d i n g an vo l u m e terhadap permukaan media, dan kriteria yang digunakan untuk mendefinisikan reaksi positif dan negatif (Holt et al., 1994).

  cus agalactiae. Teknik ini lebih cepat dan

  mendiagnosa penyakit ini telah dikembangkan oleh Berridge et al. (2001), Mata et al. (2004), dan Kawam ura et al. (2005). Mereka m eng- h asi l k an p r i m er sp esi es sp esi f i k d en g an target 16S- 23S rDNA intergenic spacer region dan 23S rDNA yang spesifik untuk Streptococ-

  Streptococcus agalactiae. Tek n i k u n t u k

  Saat ini Polymerase Chain Reaction (PCR) t elah m enjadi m et ode alt ernat if yang t elah banyak digunak an unt uk m engident if ik asi

  bet a- hem olysin dari Staphylococcus aureus sehingga m enghasilk an d aer ah lisis yang nyata dan luas pada media agar darah domba.

  S. agalactiae berdifusi dan bereaksi dengan

  bakteri gram positif berbentuk coccus dengan sif at ant ara lain kat alase negat if , oksidase negat if , hippurate hydrolisis negat if , d an CAMP (Christ ie, At kins and Munch- Pet ersen) posit if dim ana senyawa ek st r aselular dar i

  Austin & Austin, 1999).

  KEYWORD S: Streptococcus agalactiae, D NA ext ract ion, bact eria, PCR PENDAHULUAN Streptococcus spp. m enyebabkan wabah

  yang paling signif ikan dari penyakit ini pada ikan adalah septikemia dan meningoencepha- litis. Bakteri ini menyerang organ target seperti lim f a, hat i, dan ot ak, kem udian m enyebar ke ginjal, usus dan jant ung (Aust in & Aust in, 1999). Limfa tampak membesar dan rusak, hati t erlihat pucat dan m engalam i nekrosis. Usus m en g an d u n g cai r an d an p en d ar ah an d i beberapa t em pat , sert a kadang- kadang di- j u m p ai o t ak b er w ar n a k ek u n i n g an d an m engandung banyak bakt eri (Kit ao, 1993;

  et al., 2002). Menurut Eldar et al. (1995), gejala

  m enyerang m at a, hat i dan lim fa. Gejala klinis yang ditimbulkannya antara lain unilateral atau bilateral ex opthalmia, pendarahan pada mata, t ubuh kehit am an, berenang t idak berat uran, dan pembengkakan pada limfa (Rasheed et al., 1985). Ikan sakit akibat infeksi bakteri tersebut dapat pula memperlihatkan gejala klinis seperti berenang berputar pada permukaan air, bentuk t ubuh m elengk ung (berbent uk huruf “C”), k el ai n an p ad a m at a sep er t i m at a k er u h , pendarahan intraocular dan periorbital (Evans

  cus umumnya mengalami infeksi sistemik yang

  Ikan yang t erinf eksi bakt eri Streptococ-

  banyak kerugian yang disebabkan t ingginya t ingk at k em at ian ak ib at ser angan b ak t er i tersebut hingga 30%- 50% (Eldar et al., 1995).

  Vagococcus sp. Penyakit ini m enyim bulkan

  k it bak t erial yang disebabk an oleh inf ek si bakteri Streptococcus sp., Lactococcus sp., dan

  al., 2000). Streptococcocis merupakan penya-

  penyakit dan m enim bulkan kem at ian m assal pada beberapa jenis ikan di seluruh dunia dengan angka kerugian yang ditim bulkannya m encapai 150 jut a US$ per t ahun (Klesius et

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 469-477

  C sam pai digunak an. DNA k em udian disim pan pada

  o

  Metode isolasi Deoxyribo Nucleic Acid bakteri dari ..... (Lila Gardenia)

  o

  bakt eri dilakukan m elalui beberapa t ahapan sepert i m engisolasi bakt eri dari organ t er- i nf ek si , m enum b uhk an p ad a m ed i a ag ar , pemurnian isolat dan terakhir dilakukan isolasi DNA. Proses t ersebut m enyebabkan ident i- f ikasi agen penyakit t ersebut m em but uhkan waktu 2- 3 hari sebelum dilakukan proses PCR. Sedangkan isolasi DNA bakt eri langsung dari organ yang t erinf eksi dapat m em persingkat wak t u d i ag n o sa ag en p en yak i t t er seb u t . Namun diperlukan metode isolasi DNA bakteri yang baik dan t epat , karena sensit ivit as PCR sangat dipengaruhi m et ode ekst raksi DNA (Sjobring et al.,1990). Tujuan penelit ian ini adalah unt uk m em peroleh m et ode ekst raksi yang dapat mengisolasi DNA bakteri langsung dari organ yang t erinfeksi.

  o

  C selam a 10 m enit diat as thermomixer sam bil sesekali dikocok m en g g u n ak an minimixer. Deb r i s sel d i - p i sah k an d ar i DNA b ak t er i d en g an car a sentrifugasi pada 8.000 x g selam a 10 m enit. Cairan bening (supernatant) diambil sebanyak 300 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan disim pan pada suhu - 20

• 20

  limfa dan ginjal dari setiap ikan sampel, masing- masing disimpan dalam tabung mikro 1.5 mL berisi 750 µL alkohol 95%. Masing- m asing sampel jaringan (kurang lebih 75 g) diambil dan dihancurkan dengan m enggunakan gunt ing. Jaringan kem udian dibagi ke dalam 3 t abung mikro yang diberi label sesuai dengan jaringan, nom or ikan dan m et ode ekst raksi yang akan digunakan. DNA bakt eri dari isolat m aupun jaringan ikan yang digunakan dalam uji PCR ini diekst raksi dengan m enggunakan 3 m acam m et ode yait u dengan pem anasan, DNAzol reagent dan QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).

  o

  Sam pel ikan nila (Oreochromis niloticus) berasal dari kasus kematian dengan mortalitas lebih dari 50% pada tambak bersalinitas rendah d i Kar awan g , Jawa Bar at . Ik an n i l a sak i t mengalami gejala Streptococcocis dengan ciri- ciri berenang berput ar dan t idak berat uran, mata menonjol, dan tubuh berwarna kehitaman. Ikan sebanyak 3 ekor dibawa dalam keadaan hidup ke Laboratorium Riset Kesehatan Ikan- Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya, Jakarta dan dilakukan isolasi bakteri dari otak masing- masing ikan (sebagai kontrol). Isolat dit um buhkan pada m edia BHIA (Brain

  C selam a 1 0 m en i t . Tab u n g d i ” spindown” sel am a beberapa det ik, kem udian dit am bahkan 200 µL Et hanol 100%, diaduk dan dikocok m eng- gunakan minimixer kem bali selam a 15 det ik. Tabung kembali di ”spindown” selama beberapa

  o

  C selam a 1- 3 jam / overnight sam pai lisis, kemudian di ”spindown” selama beberapa detik. Sebanyak 200 µL larutan AL (Lysis Buffer) d im asuk k an k e d alam t ab ung m ik r o, lalu dikocok m enggunakan minimixer selam a 15 det ik dan diinkubasi pada suhu 70

  o

  Ke dalam tabung m ikro 1,5 m L yang telah berisi sam pel jaringan (25 m g), dit am bahkan 180 µL larutan ATL (Tissue Lysis Buffer) dan 20 µL Prot einase- K. Tabung m ikro lalu dikocok menggunakan minimixer dan diinkubasi pada suhu 56

  Ekstraksi dengan QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)

  C sam pai akan digunakan dalam proses amplifikasi.

  Ke dalam tabung m ikro 1,5 m L yang telah berisi sam pel jaringan (25 m g), dit am bahkan 5 0 0 µ L DNAz ol l al u d i hancur k an d eng an m enggunakan penggerus. Suspensi kem u- dian disent rif ugasi pada 12.000 rpm selam a 10 m enit . Supernat an yang diperoleh lalu dipindahkan ke t abung m ikro 1,5 m L baru yang t elah berisi 100% Et hanol sebanyak 500 µ L. Ag ar h om og en l ar u t an d i b ol ak - b al i k sebanyak 5 kali, kem udian diinkubasi pada suhu ruang selam a 1- 3 m enit . Sent rif ugasi dilakukan kem bali pada 8.000 rpm selam a 2- 3 m enit dan supernat an yang dihasilkan dibuang. Pellet DNA lalu dit am bahkan 95% Et hanol sebanyak 500 µL, dibolak- balik dan selanjut nya disent rif ugasi pada 8.000 rpm selama 2- 3 menit. Supernatan kembali dibuang, kemudian segera ditambahkan TE (Tris- EDTA) b u f f er seb an yak 1 0 0 µ L. DNA k em u d i an disimpan pada - 20

  Ekstraksi dengan Pemanasan

  Ekstraksi dengan DNAz ol Reagent (Invit r ogen)

  C sam pai akan digunakan dalam proses amplifikasi.

BAHAN DAN METODE

  Heart Infusion Agar) dan ditumbuhkan di dalam

  inkubator pada suhu 28

  o C selama 24- 48 jam.

  Set el ah d i m u r n i k an b eb er ap a k al i , i sol at bakteri (10- 20 koloni) diam bil m enggunakan ose st eril dan disim pan dalam 400 µL RNAse

  free water. Sampel jaringan seperti otak, hati,

  Ekst raksi DNA bakt eri dari jaringan ikan yang t erinf eksi dilakukan RNAse free water sebanyak 300 µL. Tabung m ikro kem udian dipanaskan pada suhu 98

  Elek t rof oresis

  260 sebesar 50 ug/ m L.

  Hasil amplifikasi dideteksi dengan meng- elek t r op hor esis m asing- m asing am p lik on sebanyak 10 µL pada 1,5% gel agarose di dalam buffer 1x Tris- acet at e- EDTA (220 V selam a 25 m enit ). Pewarnaan DNA dilakukan d en g an p er en d am an g el d al am l ar u t an

  ethidium bromide (0,5 µg per 100 m L TAE buffer) selam a 15 m enit dan hasilnya di-

  dokumentasikan dengan kamera polaroid.

  Penghitungan Konsentrasi DNA dengan NanoDrop

  DNA d i h i t u n g k on sen t r asi n ya d en g an m enet esk an 1 µL set iap sam pel DNA dari m asing- m asing m et ode ekst raksi pada alat Nan o d r o p (Thermo Scientific) yan g d i - h u b u n g k an l an g su n g d en g an k o m p u t er .

  Software yang t elah t ersedia akan m em baca

  konsent rasi asam nukleat nya dengan sat uan ng/ µL. Absorbansi dibaca pada t iga panjang gelom bang yait u 230 nm , 260 nm , dan 280 nm. Konsentrasi DNA diperoleh dari perkalian nilai absorbansi 260 nm, faktor pengenceran, dan konversi OD

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 469-477

  det ik. Cairan put ih bening akan t erbent uk set el ah p en am b ah an et h an o l , k em u d i an sem ua cairan dipindahkan secara hat i- hat i ke dalam 2 mL minispin-column dan collection

  Pasangan prim er oligonuk leot ida yang d i g u n ak an u n t u k m en d et ek s i b ak t er i p at hogen Streptococcus difficilis (Mat a et

  Primer dan Amplifikasi PCR

  C sam pai akan digunakan dalam proses amplifikasi.

  o

  k em ud ian d isent r if ug asi p ad a 8 .0 0 0 r p m selama 1 menit. DNA kemudian disimpan pada

  water. Set elah didiam kan selam a 1- 3 m enit

  dan disent rif ugasi pada 6.000 g (8.000 rpm ) selam a 1 m enit . Collection tube yang berisi cairan dibuang, kem udian minispin-column dit em pat kan pada collection tube baru, lalu ditambahkan 500 µL larutan AW- 1 (column wash buffer- 1) dan disent rifugasi pada 8.000 rpm selam a 1 m enit . Collection tube yang berisi cairan dibuang. Minispin column kem udian dit em pat kan pada collection tube baru, lalu ditambahkan 500 µL larutan AW- 2 (column wash buffer- 2) dan disentrifugasi pada 14.000 rpm selam a 3 m enit . Collection tube yang berisi cai r an d i b uang k em b al i . Minispin column dipindahkan pada 1,5 m L m ikrot ube bersih/ baru lalu ditambahkan secara hati- hati 200 µL Bu f f er AE (Elution Buffer) at au Destilated

  tube yang t ersedia, lalu dit ut up dengan baik

• 20

HASIL DAN BAHASAN

  o C selam a 9 0 det ik .

  AGGAAACCTGCCATTTGCG- 3’ Sdi 252 : 5’ - CAATCTATTTCTAGATCGTGG- 3’ dengan target gen 16S intergenic spacer dengan panjang 192 bp. Prim er yang digunakan dalam proses PCR ini disint esa oleh Alpha DNA (Mont real, Queb ec).

  al., 2 0 0 4 ) seb ag ai b er i k u t : Sd i 6 1 : 5 ’ -

  kit dapat diam at i pada Gam bar 2 dan 3. Dari hasil dokum entasi tersebut teram ati otak dan hat i sering m engalam i hasil false negat if dan juga m enghasilkan pit a posit if yang sangat tipis.

  DNAzol reagent dan metode mini-column DNA

  Hasil uji PCR sam pel jaringan yang di- ek st r ak si d en g an m en g g u n ak an m et o d e

  transiluminator.

  Uji PCR dari DNA hasil ekst raksi m eng- g u n ak an m et od e p em an asan (Gam b ar 1 ) m em perlihat kan pit a posit if pada sebagian besar organ. Walaupun terdapat beberapa pita posit if yang sangat t ipis, nam un m asih dapat t eram at i dengan cuk up baik di bawah UV

  akan m enghasilkan pit a posit if pada berat m olekul t arget (192 bp) pada jaringan yang terinfeksi bakteri.

  intergenic spacer. Hasil am plifikasi t ersebut

  Di ag n o sa PCR m en g g u n ak an p r i m er spesifik untuk Streptococcus agalactiae yait u Sdi252 dan Sdi62 (Mat a et al., 2004) yang m en g am p l i f i k asi k an g en 1 6 S- 2 3 S RNA

  Proses amplifikasi PCR dilakukan di dalam cam puran reaksi dengan volum e 25 m l per s am p el s eb ag ai b er i k u t : master mix

  C selam a 1 m enit , dan elongasi pada 7 2

  GoTaq®Green (Prom ega, Madison WI USA)

  seb an yak 1 2 , 5 µ L, nuclease free water sebanyak 8,5 µL, primer (reverse dan forward) m asing- m asing sebanyak 1 µL dan t em plat e DNA sebanyak 2 µL. Am plif ikasi dilakukan m enggunakan thermal cycler MJ. Research dengan program siklus am plif ikasi sebagai berikut : set elah t ahap denat urasi awal pada suhu 94

  o

  C selama 2 menit, kemudian lakukan 25 kali siklus denat urasi pada 92

  o

  C selam a 1 m enit , annealing pada 55

  o

  C selam a 5 m enit . Sebagai negat if kont rol (no template DNA) digunak an RNAse free water.

  o

  72

  Terakhir dilakukan proses elongasi akhir pada

  Metode isolasi Deoxyribo Nucleic Acid bakteri dari ..... (Lila Gardenia)

  192 bp Gambar 1. Hasil deteksi PCR S. agalactiae dari jaringan ikan nila menggunakan metode pemanasan.

  M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No. 1- 3, jaringan ikan nila- 1 (otak, hati, dan limfa). No. 4- 7, jaringan ikan nila- 2 (otak, hati, limfa dan ginjal). No. 8- 11, jaringan ikan nila- 3 (otak, limfa, ginjal, dan hati). P. Positif kontrol dan N. Negatif kontrol Figure 1.

  The result of PCR detection of S. agalactiae from tilapia organ tissue using heating method. M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No. 1-3, organs of fish-1 (brain, liver, and spleen). No. 4-7, organs of fish-2 (brain, liver, spleen and kidneys). No. 8-11, organs of fish-3 (brain, spleen, kidney, and liver). P. Positive control and N. Negative control

  192 bp Gambar 2. Hasil deteksi PCR S. agalactiae dari jaringan ikan nila dengan m et ode DNAzol

  reagent. M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No. 1- 3, jaringan ikan nila- 1 (otak,

  hati dan lim fa). No. 4- 7, jaringan ikan nila- 2 (otak, hati, lim fa dan ginjal). No. 8- 11, jaringan ikan nila- 3 (otak, hati, ginjal, dan limfa). P. Positif kontrol dan N. Negatif kontrol

  Figure 2.

  The result of PCR detection of S. agalactiae from tilapia organ tissues using DNAzol reagent method. M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No. 1-3, organ tissues of fish-1 (brain, liver and spleen). No. 4-7, organ tissues of fish-2 (brain, liver, spleen, and kidneys). No. 8-11, organ tissue of fish-3 (brain, liver, kidney, and spleen). P. Positive control and N. Negative control

  Perbandingan hasil PCR dari beberapa tersebut merupakan metode isolasi DNA yang m et od e ek st r ak si yan g d i g u n ak an d al am menggunakan spin column dan membran silika penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Mini- gel yang akan menghasilkan DNA yang bersih dari kontaminan dan inhibitor. DNA berikatan

  column DNA kit m enghasilkan hasil uji yang

  1 0 0 % p o si t i f , sed an g k an k ed u a m et o d e dengan silika gel pada m em bran, sedangkan lainnya m asing- m asing hanya m enghasilkan kont am inan lainnya t erbuang m elewat i pori- pit a posit if sebesar 82% dan 64%. Met ode pori m em bran. Hal ini m enyebabkan proses Gambar 3. Hasil deteksi PCR S. agalactiae dari jaringan ikan nila dengan mini-column QIAam p DNA mini kit . M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No. 1- 3, jaringan ikan nila- 1 (otak, hati, dan limfa). No. 4- 7, jaringan ikan nila- 2 (otak, hati, limfa, dan ginjal). No. 8- 11, jaringan ikan nila- 3 (otak, limfa, ginjal, dan hati). P. Positif kontrol dan N. Negatif kontrol

  

Figure 3. The result of PCR detection of S. agalactiae from tilapia organ tissues using mini-

column QIAamp DNA minikit method. M. Marker 100 bp ladder plus (Fermentas), No.

  1-3, organ tissues of fish-1 (brain, liver, and spleen). No. 4-7, organ tissues of fish-2 (brain, liver, spleen, and kidneys). No. 8-11, organ tissues of fish-3 (brain, spleen, kidney, and liver). P. Positive control and N. Negative control

  Tabel 1. Hasil uji PCR DNA Streptococcus agalactiae dari organ ikan nila m enggunakan beberapa metode ekstraksi

  Table 1.

  PCR test of Streptococcus agalactiae DNA from nile tilapia organ tissues by using several extraction methods Org an T issue M et o d e 1 Pemanasan Hea t in g m et h od M et o d e 2 DNAzo l DNAzol m et h od M et o d e 3 QIAamp M ini kit QIAm p m in i kit m et h od Ikan-1 Otak (Brain ) - - +

  Fish-1 Hati (Liver ) + + + Limfa (Spleen ) + + +

  Ikan-2 Otak (Brain ) + - +

  Fish-2 Hati (Liver ) - + + Ginjal (Kidney ) + + + Limfa (Spleen ) + + +

  Ikan-3 Otak (Brain ) + - +

  Fish-3 Hati (Liver ) + - + Ginjal (Kidney) + + + Limfa (Spleen ) + + +

  9/ 11 = 82% 7/ 11 = 64% 11/ 11 = 100% Persent ase Per cen t a g e

  ekst raksi pada m et ode ini lebih opt im al dan DNA yan g d i h asi l k an l eb i h b er si h d ar i kont am inan dan inhibit or yang dapat m eng- hambat proses amplifikasi.

  DNAzol reagent m erupakan m etode yang cepat dan m udah dalam m engisolasi DNA. Met ode ini m enggunakan bahan kim ia siap pakai yang dapat digunakan untuk mengisolasi

  192 bp

  J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 469-477 genom DNA dari sam pel padat dan cairan (t an am an m au p u n h ewan ). Nam u n u n t u k m engisolasi DNA bakt eri (khususnya gram p o si t i f ) d ar i j ar i n g an y an g t er i n f ek si , m em erlukan m odif ikasi at au pre-treatment dengan pemanasan atau bahan kimia lain untuk m em ecahk an at au m elisisk an d ind ing sel bakt eri. Hal ini m enyebabkan kurang ef ek- t if nya reagent t ersebut dalam m engisolasi DNA bakt eri langsung dari jaringan sehingga hanya 64% sam pel yang posit if . Sedangkan m et o d e d en g an p em an asan m er u p ak an m et o d e yan g san g at sed er h an a, d en g an m enggunakan suhu t inggi hingga sel pecah. Metode ini mudah, murah, dan biasa digunakan untuk ekstraksi isolat bakteri dari kultur yang t elah m urni. Met ode ini cukup baik dalam m engisolasi DNA bakt eri dalam jaringan sel yang terinfeksi sehingga terdapat 82% sampel yang m enghasilkan pit a posit if . Nam un DNA yang dihasilkan m asih m engandung banyak k ont am inan d an inhib it or , t er ut am a p ad a jaringan yang m engandung banyak prot ein seperti otak dan hati.

  Streptococcus agalactiae m en yer an g

  organ t arget sepert i lim f a, hat i, dan ot ak , kemudian menyebar ke ginjal, usus dan jantung (Aust in & Aust in, 1999). Pada penelit ian ini isolasi DNA dilakukan dari otak, hati, limfa, dan ginjal. Organ- organ tersebut merupakan organ t arget Streptococcus agalactiae yang dapat digunakan untuk mendeteksi bakteri tersebut secara langsung, nam un hanya lim f a yang m em perlihatkan hasil yang konsisten dengan menggunakan ketiga macam metode ekstraksi.

  Hasil penguk uran DNA dengan m eng- gunakan Nanodrop (Thermo Scientific), terlihat ek st rak si dengan m et ode DNAzol reagent cenderung m em iliki konsent rasi DNA yang ham pir sam a atau lebih rendah dibandingkan d en g an p en g u k u r an d en g an mini-column DNA kit (Tabel 2). Tetapi hasil pengukuran DNA yang diekt raksi dengan m et ode pem anasan jauh lebih tinggi. Hal ini dapat disebabkan pada m et ode pam anasan hanya dilakukan proses pem ecahan dinding sel unt uk m em bebaskan isi sel d an sent r if ug asi unt uk p em isahan eksudat . Tidak ada proses degradasi prot ein dan RNA m enggunakan prot ease dan RNAse m enyebabk an DNA yang dihasilk an m asih t ercam pur. Kelem ahan inst rum en spekt ro- fot om et er UV unt uk pengukuran DNA adalah bahwa RNA dan garam - garam yang m eng- kont am inasi akan t erukur juga absorbansi- n y a b er s am a d en g an D N A s eh i n g g a m enyebabkan hasil yang t erukur jauh lebih t inggi pada m et ode ini dibandingkan kedua m et ode lainnya. Keakurat an pem bacaan alat spektrofotom eter terhadap konsentrasi asam nukleat t ergant ung pada t ingkat pem urnian hasil ekstraksi tersebut pada saat pengukuran.

  Dalam penelitian ini konsentrasi DNA hasil ek st r ak si d ar i k et i g a m et o d e t er seb u t d i l ak u k an d en g an car a sp ek t o f o t o m et r i . Nukleot ida, ssDNA, dan dsDNA diukur akan m enunjukkan absorbansi t ot al pada 260 nm . Rasio pada 260 nm dan 280 nm digunakan unt uk m enilai kem urnian DNA. Sam pel DNA dapat dikat akan m urni apabila berada dalam skala 1,8- 2,0. Pada ketiga macam metode, nilai r asi o d ar i asam nuk l eat yang d i ek st r ak si dengan m et ode pem anasan t erdapat lebih dari 50% berada di bawah skala kem urnian, sedangkan m et ode DNAzol reagent kurang lebih 50% m em iliki kem urnian di at as skala rasio yang dit ent ukan. Hanya m et ode mini-

  column DNA k it yang m enghasilk an asam nukleat yang berada dalam skala kem urnian.

  Terdapat beberapa faktor yang menyebabkan rasio tersebut berubah/ bervariasi, antara lain perubahan pH pada sam pel (Wilf inger et al., 1997) dan komposisi dari lima jenis nukleotida yang terdapat di dalam nya (Leninger, 1975).

  Rasio pada 260 nm dan 230 nm j uga dapat digunakan sebagai pengukuran tingkat kem urnian asam nukleat . Nilai rasio t ersebut lebih tinggi dibandingkan nilai rasio pada 260 nm dan 280 nm . Nilai rasio pada 260 nm dan 230 nm dikatakan murni apabila berada dalam skala 2,0- 2,2. Nilai rasio pada hasil ekst raksi menggunakan metode pemanasan dan metode DNAzol reagent berada di bawah skala murni, hal ini m enunj uk k an ad anya k ont am inasi protein, fenol, garam atau kontaminan lainnya yang diabsorbsi pada 230 nm (Anonim, 2008). Metode DNAzol reagent m engandung larutan

  guanidine detergent sebagai bahan pelisis

  yang menghidrolisis RNA dan mempresipitasi DNA. Larut an t ersebut ikut t erabsorbsi pada 2 3 0 n m seh i n g g a n i l ai r asi on ya m en j ad i rendah. Selain itu nilai rasio yang rendah dapat disebabkan oleh adanya zat EDTA, karbohidrat, dan fenol.

  Limfa dapat digunakan untuk mengisolasi D N A Streptococcus agalactiae s ec ar a langsung dengan menggunakan ketiga macam metode ekstraksi, namun QIAamp DNA Mini Kit

  Metode isolasi Deoxyribo Nucleic Acid bakteri dari ..... (Lila Gardenia)

KESIMPULAN DAN SARAN

  4 J. Ris. Akuakultur Vol.6 No.3 Tahun 2011: 469-477

  7

  6 Tabel 2. Konsentrasi asam nukleat (ng/ µL) dari jaringan ikan nila (Oreochromis niloticus) yang terinfeksi bakteri dengan menggunakan beberapa metoda ekstraksi

  Table 2. Nucleic acid concentrations (ng/ μL) of infected organ tissues from nile tilapia (Oreochromis niloticus) by using several methods of extraction

  Ko nsent rasi Ko nsent rasi Ko nsent rasi asam nukleat asam nukleat asam nukleat Rat io Rat io Nucleic a cid Nucleic a cid Nucleic a cid Kemurnian kemurnian con cen t r a t ion con cen t r a t ion con cen t r a t ion Org an Ra t io Ra t io T issue M et o d e-1 M et o d e-2 M et o d e-3 of Pur in it y of pur in it y Pemanasan DNAzo l QIAamp mini kit Hea t in g m et h od DNAzol m et h od QIAa m p m in i kit m et h ( ng / µL) 260/ 280 260/ 230 ( ng / µL) 260/ 280 260/ 230 ( ng / µL) Nila 1 / T ila pia 1 Otak (Brain ) 768.2

  1.64 0.64 113.8

  2.10

  1.14

  90.4 Hati (Liver ) 1855.2 1.81 1.01 192.9

  2.09 1.05 383.1 Limfa (Spleen ) 1009.0 1.80 1.17 125.2

  2.00 0.68 255.6 Nila 2 / T ila pia 2 Otak (Brain ) 490.0

  1.62

  1.11

  26.2

  1.92

  0.09

  72.5 Hati (Liver ) 1463.4

  1.91 1.11 360.4

  2.10 1.65 397.2 Ginjal (Kidney) 749.7

  1.67 0.86 183.1

  1.99 0.80 172.2 Limfa (Spleen ) 1210.8

  1.76

  1.05

  68.7

  2.00 0.40 349.3 Nila 3 / T ila pia 3 Otak (Brain ) 1222.7

  1.89

  1.08

  27.2

  2.10 0.09 245.7 Hati (Liver ) 1916.9

  1.71 0.77 170.2

  2.00 1.06 368.7 Ginjal (Kidney) 300.1

  1.68

  1.00

  54.8

  2.01 0.38 119.2 Limfa (Spleen ) 1008.5 1.95 1.27 143.3

  2.13 0.48 432.4 m enghasilkan DNA yang lebih bersih dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Isolasi langsung dari organ m em percepat proses ident if ikasi bakt eri ini. Selanjut nya perlu dilakukan uji sen si t i vi t as d en g an m en cam p u r o r g an t erinf eksi dengan organ ikan sehat dengan p er b and ingan t er t ent u unt uk m enget ahui ef ekt ivit as m et ode ekst raksi yang dilakukan langsung pada jaringan dengan tingkat infeksi ringan dan sangat ringan.

  DAFTAR ACUAN Anonim. 2008. 260/ 280 and 260/ 230 Ratios.

  Streptococcus difficilis: S. difficilis Eldar et al.,1995 is a later synonym of S. agalactiae

  Chomczynski. 1997. Effect of pH and Ionic St r en g t h o n t h e Sp ect r o p h o t o m et r i c Assessm en t o f Nu cl ei c Aci d Pu r i t y: BioTechniques, 22: 474- 481.

  & Miorner, H. 1990. Polym erase chain re- action for detection of Mycobacterium tu- berculosis. J. Clin Microbiol., 28: 2200- 2204. William , Wilf inger, W., Mack ey, K., & Piot r

  Histopathology Responsible Subject Edi- tor: T: P F! Evelyn, Nanaimo, B.C., Canada of bullm innows, Fundulus grandis Baird and Girard, inf ect ed wit h a non- haem olyt ic group B Streptococcus sp., J. Fish Dis., 8: 65- 74. Sjobring, J.H., Mecklenburg, M., Andersen, A.B.,

  Rasheed, V., Lim suwan, C., & Plum b, J. 1985.

  plied and Environmental Microbiology, 70: 3183- 3187.

  M., Domínguez, L., & Fernández- Garayzábal, J.F. 2004. Multiplex PCR assay for detec- tion of bacterial pathogens associated with warm - water streptococcosis in fish. Ap-

  Mata, A.I., Gibello, A., Casamayor, A., Blanco, M.

  national, Rio de Janeiro, Brazil, p. 558- 564. Leninger, A.L. 1975. Biochem istry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, p. 859- 890.

  In J. Carvalho, editor. Fifth International Symposium on Tilapia Aquaculture. Inter-

  Vaccination: A health management practice for preventing diseases caused by strep- tococcus in tilapia and other cultured fish.

  Kitao, T. 1993. Streptococcal intections. In: Inglis V, Roberts RJ, Bromage NR (eds) Bac- terial disease of fish. Blackwell Scientific Publications, Oxford, p. 196- 210. Klesius, P.H., Shoemaker, C.A., & Evans, J.J. 2000.

  tematic Evololutionary Microbioliology, 55: 961- 965.

  Lehm ann and Neum ann 1896 (Approved Lists 1980). International Journal of Sys-

  Kawamura, Y., Itoh, Y., Mishima, N., Ohkusu, K., Kasai, H., & Ezaki, T. 2005. High genetic sim ilarity of Streptococcus agalactiae and

  [terhubung berkala] www.nanodrop.com [21 Maret 2011]. Austin, B. & Austin, D.A. 1999. Bacterial Fish Pathogens: Disease in Farmed and Wild Fish.

  Determinative Bacteriology. Ed ke- 9. Balti- more: William & Wilkins, p. 3- 6.

  & William s, S.T. 1994. Bergey’s Manual of

  auratus L. and wild mullet, Liza klunzingeri (Day) in Kuwait. J. Fish Dis., 25: 505- 513. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, I.T.,

  agalactiae in cultured seabream , Sparus

  B- h aem o l yt i c g r o u p B Streptococcus

  Evans, J., Klesius, P., Gilbert, P., Shoemaker, C., & Al- Sarawi, M. 2002. Characterization of

  Bacteriol., 45: 840–842.

  ing septicem ic infection in fish, is a junior synonym of Streptococcus iniae. Int. J. Syst

  coccus shiloi, the name for an agent caus-

  Eldar, A., Frelier, P.F., Assenta, L., Varner, P.W., Lawhon, S., & Bercovier, H. 1995. Strepto-

  Veterinary Microbiology, 78(2): 165- 173.

  hom ogeneit y and species- specific PCR.

  tococcus agalactiae and Streptococcus difficile 16S–23S intergenic rDNA: genetic

  In: Bact erial Fish Pat hogens: Disease in Farmed and Wild Fish. Ellis Honwood Ltd, p. 13- 15. Brian, R., Berridge, H.B., & Paul, F.F. 2001. Strep-

  Metode isolasi Deoxyribo Nucleic Acid bakteri dari ..... (Lila Gardenia)