Penetapan Kadar Zat Aktif Betametason Valerat pada Produk Ruahan Krim Betametason 0,1% menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Betametason
Menurut Neal (2006), Betametason berada di dalam tubuh manusia, dimana
korteks adrenal melepaskan beberapa hormon steroid ke dalam sirkulasi. Hormon
tersebut dibagi berdasarkan kerjanya menjadi dua kelas yaitu:
a) Mineralokortikoid, terutama aldosteron pada manusia, mempunyai
aktivitas menahan garam dan disintesis dalam sel-sel zona glomerulosa.
Termasuk
hormon
dari
mineralokortikoid adalah
aldosteron
dan
fludrokortison.
b) Glukokortikoid,
terutama
kortisol
(hidrokotison)
pada
manusia,
mempengaruhi metabolisme karbohidrat dan protein, tetapi juga
mempunyai aktivitas mineralokortikoid yang bermakna. Hormon ini
disintesis dalam sel-sel zona fasikulata dan zona retikularis. Termasuk
hormon pada glukokortikoid adalah hidrokortison (kortisol) sedangkan
hormon yang disintesis yaitu prednisolon, betametason, dan deksametason.
Secara topikal betametason tidak terlalu aktif, tetapi dengan mengikat 5
rantai atom karbon valerat pada posisi hidroksil-17 menghasilkan suatu senyawa
yang 300 kali lebih aktif dibandingkan dengan hidrokortison untuk pemakaian
topikal (Katzung, 2004).
Kortikosteroid dermal merupakan obat manjur paling ampuh dalam
pengobatan gangguan kulit dan digunakan secara luas. Sebab efek antiradang dan
antimitosisnya zat-zat ini dapat menyembuhkan dengan efektif bermacam-macam
bentuk ekzem dan dermatitis, penyakit sisik (psoriasis) dan bintil-tintil gatal
Universitas Sumatera Utara
(prugio). Tidak jarang gangguan ekzem segera kambuh lagi, terutama bila
digunakan fluorkortikoida dengan khasiat kuat (Tjay dan Rahadja, 2007).
2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia
Betametason adalah stereoisomer dari deksametason, dimana gugus-metil
pada C16 berada pada posisi-beta. Struktur betametason valerat dapat dilihat pada
gambar dibawah ini:
Gambar 2.1 Struktur betametason valerat
Rumus Molekul
: C22H37FO6
Berat Molekul
: 476,58
Nama Kimia
: 9-Fluoro-11β,17,21-trihidroksi-16β-metilpregna-1,4 diena3,20-dion 17-valerat.
Pemerian
: Serbuk, putih sampai praktis putih, tidak berbau. Melebur
pada suhu lebih kurang 190o disertai penguraian.
Kelarutan
: Mudah larut dalam aseton dan dalam kloroform, larut dalam
etanol, sukar larut dalam benzene dan dalam eter, praktis
tidak larut dalam air (Ditjen POM, 2014).
Universitas Sumatera Utara
2.1.2 Farmakologi Betametason
Mekanisme kerja
:
Kortikosteroid bekerja dengan mempengaruhi kecepatan sintesis protein.
Molekul hormon memasuki sel melewati membran plasma secara difusi pasif.
Reseptor protein yang spesifik dalam sitoplasma sel hanya bereaksi di jaringan
target hormon ini dan membentuk kompleks reseptor-steroid. Kompleks ini
mengalami perubahan konformasi, lalu bergerak menuju nukleus dan berikatan
dengan kromatin. Ikatan ini menstimulasi transkripsi asam ribonukleat
(ribonucleic acid, RNA) dan sintesis protein spesifik. Induksi sintesis protein ini
yang menghasilkan efek fisiologi steroid (Suherman dan Ascobat, 2007).
Farmakokinetik
: Betametason secara topikal dapat diabsorpsi melalui kulit.
Penggunaan jangka panjang atau pada daerah kulit yang
luas dapat menyebabkan efek sistemik, antara lain
mempunyai kemampuan untuk supresi (menekan) korteks
adrenal (Suherman dan Ascobat, 2007).
Indikasi
: alergi dan peradangan lokal
Kontraindikasi
: Infeksi bakteri, fungi, dan penyakit kulit yang disebabkan
oleh virus. Selain itu, penderita acne rosacea, dan perioral
dermatitis (Sartono, 1996)
Efek samping
: Atropi lokal, gatal-gatal, hipopigmentasi, perioral dan
alergi dermatitis, serta infeksi sekunder (Sartono, 1996).
2.2 Krim
Krim adalah bentuk sediaan setengah padat mengandung satu atau lebih
bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar yang sesuai. Istilah ini
Universitas Sumatera Utara
secara tradisisonal telah digunakan untuk sediaan setengah padat yang mempunyai
konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air dalam minyak atau minyak
dalam air. Sekarang ini batas tersebut lebih diarahkan untuk produk yang terdiri
dari emulsi minyak dalam air atau dispersi mikrokristal asam-asam lemak atau
alkohol berantai panjang dalam air, yang dapat dicuci dengan air dan lebih
ditujukan untuk penggunaan kosmetika dan estetika. Krim dapat digunakan untuk
pemberian obat melalui vaginal (Ditjen POM, 2014).
Sebagai obat luar, krim harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
a) Stabil
selama masih dipakai untuk pengobatan, krim harus bebas dari
inkompatibilitas, stabil pada suhu kamar, dan kelembaban yang ada di dalam
suhu kamar.
b) Lunak, semua zat dalam keadaan halus dan seluruh produk menjadi lunak
serta homogen.
c) Mudah dipakai, krim tipe emulsi adalah yang paling mudah dipakai dan
dihilangkan dari kulit.
d) Terdistribusi secara merata, obat harus terdispersi merata melalui dasar krim
padat atau cair pada penggunaan (Widodo, 2013).
2.2.1 Penggolongan Krim
Tipe krim ada dua yaitu: krim tipe air minyak (a/m) dan krim tipe minyak air
(m/a). Untuk membuat krim digunakan zat pengemulsi umumnya berupa
surfaktan-surfaktan anionik, kationik dan nonionik. Untuk krim tipe m/a
digunakan: sabun polivalen, span, adeps lanae, kolestrol, cera. Untuk krim tipe
m/a digunakan: sabun monovalen, tween, natrium lauryl sulfat, kuning telur,
gelatinium, karboksi metil selulosa (carboxy methyl cellulose, CMC), peclinum.
Universitas Sumatera Utara
Untuk penstabilan krim ditambah zat antioksidan dan zat pengawet. Zat pengawet
yang sering digunakan ialah nipagin 0,12% - 0,18%, nipasol 0,02% - 0,05%
(Anief, 2000).
2.3 Uji Kualitatif dan Kuantitatif Betametason
2.3.1 Uji Kualitatif Betametason
a) Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Menurut Farmakope Indonesia edisi V (2010), uji kualitatif betametason
menggunakan metode kromatografi lapis tipis dilakukan dengan ditotolkan
masing-masing 10 µL larutan etanol mutlak yang mengandung (1) zat uji
0,5 mg per mL dan (2) Betametason BPFI 0,5 mg per mL pada jarak yang
sama, 2,5 cm dari tepi lempeng kromatografi silika gel setebal 0,25 mm.
masukkan lempeng ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan
dengan fase gerak campuran kloroform-dietilamina (2:1) dan dibiarkan
fase gerak merambat hingga lebih kurang tiga per empat tinggi lempeng.
Angkat lempeng, biarkan fase gerak menguap, semprot lempeng dengan
larutan asam sulfat (1 dalam 2) dan panaskan di atas lempeng pemanas
atau di bawah lampu hingga bercak tampak.
b) Identifikasi dengan reaksi Porter-Silber
Menurut Schunack et. al. (1990), Pemeriksaan identitas betametason dan
deksametason juga dapat diterapkan reaksi Porter-Silber. Untuk ini larutan
senyawa dalam etanol direaksikan dengan fenilhidrazin-asam sulfat. Hasil
reaksi yang berwarna kuning menunjukkan serapan maksimum pada
sekitar 420-450 nm.
Universitas Sumatera Utara
2.3.2 Uji Kuantitatif Betametason
Uji kuantitatif betametason dapat dilakukan dengan menggunakan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pemeriksaan betametason valerat
secara kromatografi cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 254 nm,
menggunakan fase diam: kolom 4 mm x 30 cm bahan pengisi L1, fase gerak:
asetonitril - air (3:2), dan pelarut: asam asetat glacial - metanol (1:1000) (Ditjen
POM, 1995).
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan
detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair
menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.
Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (Ditjen POM, 1995).
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam
bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding
kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan (Rohman, 2009).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan suatu metoda pemisahan
canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji
kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak
bisa dianalisis dengan kromatografi gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis,
dengan kromatografi cair kinerja tinggi mulai dari senyawa ion anorganik sampai
Universitas Sumatera Utara
senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat / bahan obat
campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale
Trenphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif (Putra, 2004).
Kromatografi
cair
kinerja
tinggi
(High
Performance
Liquid
Chromatography, HPLC) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, kromatografi cair kinerja tinggi merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam produk
ruahan atau dalam sediaan farmasetik, serta obat dalam cairan biologis (Rohman,
2009).
2.4.1
Keuntungan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai banyak keuntungan jika
dibandingan dengan kromatografi cair (KC) tradisional yaitu: cepat, daya
pisahnya baik, peka, detektor unik, kolom dapat dipakai kembali, ideal untuk
molekul besar dan ion dan mudah memperoleh kembali cuplikan (Johnson dan
Robert, 1991).
2.4.2
Kerugian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kerugian dari kromatografi cair kinerja tinggi adalah mahal, sampel yang
digunakan hanya sedikit dan perlu tenaga ahli untuk mengoperasikannya.
2.4.3 Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumen kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya terdiri atas: wadah
fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (alat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer sebagai perekam
(integrator) yang dapat dilihat pada gambar 2.2:
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.2 Komponen kromatografi cair kinerja tinggi
1. Wadah Fase Gerak pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan penghilangan gas (degassing) yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Rohman, 2009).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara
3. Pompa
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 Psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin
proses
penghantaran
fase
gerak
berlangsung
secara
tepat,
reproduksibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal (Gandjar dan Rohman,
2007).
5. Kolom
Kolom merupakan bagian kromatografi cair kinerja tinggi yang mana
terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute / analit. Ada
dua jenis kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi yaitu kolom konvensional
dan kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama
dibandingkan dengan kolom konvensional.
a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10-100 µL/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektometer massa.
Universitas Sumatera Utara
c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih peka, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis ( Gandjar dan Rohman, 2007).
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada kromatografi cair kinerja tinggi berupa silica
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimerpolimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit
asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai
untuk solute yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi (Rohman, 2009).
7. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam
efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak
banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis
senyawa (Johnson dan Robert, 1991).
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Putra, 2004).
Universitas Sumatera Utara
Detektor pada kromatografi cair kinerja tinggi dikelompokkan menjadi dua
golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,
tidak spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa; dan golongan yang spesifik yang hanya akan mendeteksi
analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor ultraviolet sinar tampak,
detektor flouresensi, dan detektor elektrokimia (Gandjar dan Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Betametason
Menurut Neal (2006), Betametason berada di dalam tubuh manusia, dimana
korteks adrenal melepaskan beberapa hormon steroid ke dalam sirkulasi. Hormon
tersebut dibagi berdasarkan kerjanya menjadi dua kelas yaitu:
a) Mineralokortikoid, terutama aldosteron pada manusia, mempunyai
aktivitas menahan garam dan disintesis dalam sel-sel zona glomerulosa.
Termasuk
hormon
dari
mineralokortikoid adalah
aldosteron
dan
fludrokortison.
b) Glukokortikoid,
terutama
kortisol
(hidrokotison)
pada
manusia,
mempengaruhi metabolisme karbohidrat dan protein, tetapi juga
mempunyai aktivitas mineralokortikoid yang bermakna. Hormon ini
disintesis dalam sel-sel zona fasikulata dan zona retikularis. Termasuk
hormon pada glukokortikoid adalah hidrokortison (kortisol) sedangkan
hormon yang disintesis yaitu prednisolon, betametason, dan deksametason.
Secara topikal betametason tidak terlalu aktif, tetapi dengan mengikat 5
rantai atom karbon valerat pada posisi hidroksil-17 menghasilkan suatu senyawa
yang 300 kali lebih aktif dibandingkan dengan hidrokortison untuk pemakaian
topikal (Katzung, 2004).
Kortikosteroid dermal merupakan obat manjur paling ampuh dalam
pengobatan gangguan kulit dan digunakan secara luas. Sebab efek antiradang dan
antimitosisnya zat-zat ini dapat menyembuhkan dengan efektif bermacam-macam
bentuk ekzem dan dermatitis, penyakit sisik (psoriasis) dan bintil-tintil gatal
Universitas Sumatera Utara
(prugio). Tidak jarang gangguan ekzem segera kambuh lagi, terutama bila
digunakan fluorkortikoida dengan khasiat kuat (Tjay dan Rahadja, 2007).
2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia
Betametason adalah stereoisomer dari deksametason, dimana gugus-metil
pada C16 berada pada posisi-beta. Struktur betametason valerat dapat dilihat pada
gambar dibawah ini:
Gambar 2.1 Struktur betametason valerat
Rumus Molekul
: C22H37FO6
Berat Molekul
: 476,58
Nama Kimia
: 9-Fluoro-11β,17,21-trihidroksi-16β-metilpregna-1,4 diena3,20-dion 17-valerat.
Pemerian
: Serbuk, putih sampai praktis putih, tidak berbau. Melebur
pada suhu lebih kurang 190o disertai penguraian.
Kelarutan
: Mudah larut dalam aseton dan dalam kloroform, larut dalam
etanol, sukar larut dalam benzene dan dalam eter, praktis
tidak larut dalam air (Ditjen POM, 2014).
Universitas Sumatera Utara
2.1.2 Farmakologi Betametason
Mekanisme kerja
:
Kortikosteroid bekerja dengan mempengaruhi kecepatan sintesis protein.
Molekul hormon memasuki sel melewati membran plasma secara difusi pasif.
Reseptor protein yang spesifik dalam sitoplasma sel hanya bereaksi di jaringan
target hormon ini dan membentuk kompleks reseptor-steroid. Kompleks ini
mengalami perubahan konformasi, lalu bergerak menuju nukleus dan berikatan
dengan kromatin. Ikatan ini menstimulasi transkripsi asam ribonukleat
(ribonucleic acid, RNA) dan sintesis protein spesifik. Induksi sintesis protein ini
yang menghasilkan efek fisiologi steroid (Suherman dan Ascobat, 2007).
Farmakokinetik
: Betametason secara topikal dapat diabsorpsi melalui kulit.
Penggunaan jangka panjang atau pada daerah kulit yang
luas dapat menyebabkan efek sistemik, antara lain
mempunyai kemampuan untuk supresi (menekan) korteks
adrenal (Suherman dan Ascobat, 2007).
Indikasi
: alergi dan peradangan lokal
Kontraindikasi
: Infeksi bakteri, fungi, dan penyakit kulit yang disebabkan
oleh virus. Selain itu, penderita acne rosacea, dan perioral
dermatitis (Sartono, 1996)
Efek samping
: Atropi lokal, gatal-gatal, hipopigmentasi, perioral dan
alergi dermatitis, serta infeksi sekunder (Sartono, 1996).
2.2 Krim
Krim adalah bentuk sediaan setengah padat mengandung satu atau lebih
bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar yang sesuai. Istilah ini
Universitas Sumatera Utara
secara tradisisonal telah digunakan untuk sediaan setengah padat yang mempunyai
konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air dalam minyak atau minyak
dalam air. Sekarang ini batas tersebut lebih diarahkan untuk produk yang terdiri
dari emulsi minyak dalam air atau dispersi mikrokristal asam-asam lemak atau
alkohol berantai panjang dalam air, yang dapat dicuci dengan air dan lebih
ditujukan untuk penggunaan kosmetika dan estetika. Krim dapat digunakan untuk
pemberian obat melalui vaginal (Ditjen POM, 2014).
Sebagai obat luar, krim harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
a) Stabil
selama masih dipakai untuk pengobatan, krim harus bebas dari
inkompatibilitas, stabil pada suhu kamar, dan kelembaban yang ada di dalam
suhu kamar.
b) Lunak, semua zat dalam keadaan halus dan seluruh produk menjadi lunak
serta homogen.
c) Mudah dipakai, krim tipe emulsi adalah yang paling mudah dipakai dan
dihilangkan dari kulit.
d) Terdistribusi secara merata, obat harus terdispersi merata melalui dasar krim
padat atau cair pada penggunaan (Widodo, 2013).
2.2.1 Penggolongan Krim
Tipe krim ada dua yaitu: krim tipe air minyak (a/m) dan krim tipe minyak air
(m/a). Untuk membuat krim digunakan zat pengemulsi umumnya berupa
surfaktan-surfaktan anionik, kationik dan nonionik. Untuk krim tipe m/a
digunakan: sabun polivalen, span, adeps lanae, kolestrol, cera. Untuk krim tipe
m/a digunakan: sabun monovalen, tween, natrium lauryl sulfat, kuning telur,
gelatinium, karboksi metil selulosa (carboxy methyl cellulose, CMC), peclinum.
Universitas Sumatera Utara
Untuk penstabilan krim ditambah zat antioksidan dan zat pengawet. Zat pengawet
yang sering digunakan ialah nipagin 0,12% - 0,18%, nipasol 0,02% - 0,05%
(Anief, 2000).
2.3 Uji Kualitatif dan Kuantitatif Betametason
2.3.1 Uji Kualitatif Betametason
a) Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Menurut Farmakope Indonesia edisi V (2010), uji kualitatif betametason
menggunakan metode kromatografi lapis tipis dilakukan dengan ditotolkan
masing-masing 10 µL larutan etanol mutlak yang mengandung (1) zat uji
0,5 mg per mL dan (2) Betametason BPFI 0,5 mg per mL pada jarak yang
sama, 2,5 cm dari tepi lempeng kromatografi silika gel setebal 0,25 mm.
masukkan lempeng ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan
dengan fase gerak campuran kloroform-dietilamina (2:1) dan dibiarkan
fase gerak merambat hingga lebih kurang tiga per empat tinggi lempeng.
Angkat lempeng, biarkan fase gerak menguap, semprot lempeng dengan
larutan asam sulfat (1 dalam 2) dan panaskan di atas lempeng pemanas
atau di bawah lampu hingga bercak tampak.
b) Identifikasi dengan reaksi Porter-Silber
Menurut Schunack et. al. (1990), Pemeriksaan identitas betametason dan
deksametason juga dapat diterapkan reaksi Porter-Silber. Untuk ini larutan
senyawa dalam etanol direaksikan dengan fenilhidrazin-asam sulfat. Hasil
reaksi yang berwarna kuning menunjukkan serapan maksimum pada
sekitar 420-450 nm.
Universitas Sumatera Utara
2.3.2 Uji Kuantitatif Betametason
Uji kuantitatif betametason dapat dilakukan dengan menggunakan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pemeriksaan betametason valerat
secara kromatografi cair kinerja tinggi dilengkapi dengan detektor 254 nm,
menggunakan fase diam: kolom 4 mm x 30 cm bahan pengisi L1, fase gerak:
asetonitril - air (3:2), dan pelarut: asam asetat glacial - metanol (1:1000) (Ditjen
POM, 1995).
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan
detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair
menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi.
Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (Ditjen POM, 1995).
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit
dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam
bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding
kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan (Rohman, 2009).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan suatu metoda pemisahan
canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji
kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak
bisa dianalisis dengan kromatografi gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis,
dengan kromatografi cair kinerja tinggi mulai dari senyawa ion anorganik sampai
Universitas Sumatera Utara
senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat / bahan obat
campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale
Trenphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif (Putra, 2004).
Kromatografi
cair
kinerja
tinggi
(High
Performance
Liquid
Chromatography, HPLC) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, kromatografi cair kinerja tinggi merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam produk
ruahan atau dalam sediaan farmasetik, serta obat dalam cairan biologis (Rohman,
2009).
2.4.1
Keuntungan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai banyak keuntungan jika
dibandingan dengan kromatografi cair (KC) tradisional yaitu: cepat, daya
pisahnya baik, peka, detektor unik, kolom dapat dipakai kembali, ideal untuk
molekul besar dan ion dan mudah memperoleh kembali cuplikan (Johnson dan
Robert, 1991).
2.4.2
Kerugian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kerugian dari kromatografi cair kinerja tinggi adalah mahal, sampel yang
digunakan hanya sedikit dan perlu tenaga ahli untuk mengoperasikannya.
2.4.3 Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumen kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya terdiri atas: wadah
fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (alat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer sebagai perekam
(integrator) yang dapat dilihat pada gambar 2.2:
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.2 Komponen kromatografi cair kinerja tinggi
1. Wadah Fase Gerak pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan penghilangan gas (degassing) yang ada pada
fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Rohman, 2009).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara
3. Pompa
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 Psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin
proses
penghantaran
fase
gerak
berlangsung
secara
tepat,
reproduksibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal (Gandjar dan Rohman,
2007).
5. Kolom
Kolom merupakan bagian kromatografi cair kinerja tinggi yang mana
terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solute / analit. Ada
dua jenis kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi yaitu kolom konvensional
dan kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama
dibandingkan dengan kolom konvensional.
a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10-100 µL/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektometer massa.
Universitas Sumatera Utara
c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih peka, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis ( Gandjar dan Rohman, 2007).
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada kromatografi cair kinerja tinggi berupa silica
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimerpolimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit
asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai
untuk solute yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih
cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi (Rohman, 2009).
7. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam
efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak
banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis
senyawa (Johnson dan Robert, 1991).
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Putra, 2004).
Universitas Sumatera Utara
Detektor pada kromatografi cair kinerja tinggi dikelompokkan menjadi dua
golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,
tidak spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa; dan golongan yang spesifik yang hanya akan mendeteksi
analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor ultraviolet sinar tampak,
detektor flouresensi, dan detektor elektrokimia (Gandjar dan Rohman, 2007).
Universitas Sumatera Utara