Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun (Plectranthus amboinicus L.) Terhadap Kadar Superoxide Dismutase (SOD) Pada Tikus Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengujian aktivitas
antioksidan EEDBB (Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun) terhadap kadar enzim
SOD (SuperOxide Dismutase) melalui metode spektrofotometri pada serum dan
pemeriksaan histologi jaringan hati tikus. Tahap penelitian meliputi pengumpulan
bahan uji, pembuatan simplisia dan ekstrak, karakterisasi pada simplisia dan
ekstrak, skrining fitokimia simplisia dan ekstrak, uji aktivitas antioksidan secara
in vivo, dan histologi jaringan hati tikus.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari lemari pengering, oven, tanur, rotary
evaporator, water bath, seperangkat alat penetapan kadar air, desikator, neraca
hewan, neraca listrik, blender, mikroskop, objek kaca, tissue, spatula, alat-alat
gelas laboratorium, aluminium foil, kertas saring, oral sonde, pipet tetes, spuit,
selang, alat sentrifuge, alat vortex, dan spektrofotometerUV-Visible.
3.1.2 Bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun BangunBangun (Plectranthus amboinicus L.). Bahan kimia yang digunakan kecuali
dinyatakan lain berkualitas pro analisis adalah etanol 96%, pereaksi Bouchardat,
Dragendorff, Mayer, besi (III) klorida, Molisch, timbal (II) asetat, asam sulfat,
asam klorida, methanol, kloroform-isopropanol, Liebermann-Burchard, n-
Universitas Sumatera Utara
heksan,toluen, kloroform, serbuk magnesium, serbuk seng, Doxorubicin,
EnzyChrom™SuperOxide Dismutase Assay Kit (ESOD-100), Na-CMC (natrium
carboxy methyl cellulose), dan akuades.
3.1.3 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih
(Rattus norvegicus) galur Wistar, jenis kelamin betina, berusia 2-3 bulan dengan
berat badan150-200 g.
3.2 Prosedur Pembuatan Simplisia
3.2.1 Pengambilan Bahan
Pengambilan
bahan
tumbuhan
dilakukan
secara
purposif
tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Tumbuhan
diambil dari daerah Kecamatan Pancur Batu, Kabupaten Deli Serdang, Sumatera
Utara.
3.2.2 Determinasi Tumbuhan
Determinasi bahan tumbuhan bangun-bangun (Plectranthus amboinicus
L.) dilakukan di Herbarium Medanense, Fakultas MIPA, Universitas Sumatera
Utara, Medan.
3.2.3 Pembuatan Simplisia
Tumbuhan bangun-bangun (Plectranthus amboinicus L.) dikumpulkan,
dipisahkan akar, batang, dan bagian tumbuhan lainnya,dipetik daun-daunnya
dengan tangan satu-persatu (Depkes RI, 1985), kemudian daun-daunnya disortasi
basah, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan, dan ditimbang beratnya.
Daun bangun-bangun (Plectranthus amboinicus L.) selanjutnya dikeringkan di
Universitas Sumatera Utara
lemari pengering hingga kering, sortasi kering, kemudian ditimbang beratnya, dan
disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
3.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
3.3.1Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik dilakukan dengan mengamati
bentuk, bau dan rasa dari daun bangun-bangun, serbuk simplisia daun bangunbangun.
3.3.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun bangun-bangun segar
dan serbuk simplisia daun bangun-bangun. Serbuk simplisia daun bangun-bangun
diletakkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan
ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.3.3 Penetapan Kadar Air Simplisia
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi
toluena). Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin,
tabung penyambung, dan tabung penerima.
Cara kerja:
Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu destilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30
menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5g serbuk simplisia yang telah
ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena
mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian
Universitas Sumatera Utara
besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1992).
3.3.4. Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam
dengan 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter)
menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, 20 ml filtrat dipipet, diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada
suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam
persen (Depkes RI, 2008).
3.3.5. Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam
dengan 100 ml etanol 95% menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, 20 ml filtrat
dipipet, diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata
(Depkes RI, 2008).
3.3.6. Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama
dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
Universitas Sumatera Utara
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan
pada suhu 600oC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai
diperoleh bobot tetap. Kadar abu total dihitung dalam persen (Depkes RI, 1995).
3.3.7. Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25
ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci denganair
panas dalam kurs porselen. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 60oC
sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut
dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara (Depkes RI,
1995).
3.4 Skrining Fitokimia Simplisia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun bangun-bangun (Plectranthus
amboinicus L.) meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid,
saponin, tannin, glikosida, dan steroid/triterpenoid.
3.4.1 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan selama 5
menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrate ditambahkan 0,1
g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 1 ml amil alkohol, dikocok
dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah kekuningan
atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml
asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji
alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi :
a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan di atas (Depkes RI, 1995).
3.4.3 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak
kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.4.4 Pemeriksaan Tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 2 menit
dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 12 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau
kehitaman menunjukkan adanya tannin (Farnsworth, 1966).
Universitas Sumatera Utara
3.4.5 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 2 g, lalu disari dengan 20 ml
campuran etanol 95% dengan air (7:2) dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml
air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform (2:2),
dilakukan berulang kali sebanyak 2 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 500C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml methanol.
Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan
dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Kemudian secara perlahanlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya
cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida (Depkes
RI, 1995).
3.4.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam,
disaring, lalu filtrate diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi LiebermanBourchard), diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk
warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1987).
Universitas Sumatera Utara
3.5 Proses Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun (EEDBB)
Proses pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan
pelarut etanol.Sebanyak 500g serbuk kering simplisia dengan derajat halus yang
cocok
dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan etanol 96%
sebanyak 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya
sambil diaduk sekali-kali setiap hari. Setelah 5 hari, kemudian disaring, ampas
diperas. Ampas dicuci dengan pelarut secukupnya, diaduk dan disaring hingga
diperoleh 100 bagian. Tampung maserat ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di
tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian dienaptuangkan.
Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator, kemudian ekstrak
dikeringkan dengan penangas air(Depkes RI, 1979).
3.6 Karakterisasi dan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun BangunBangun (EEDBB)
Prosedur karakterisasi dan pemeriksaan golongan senyawa kimia ekstrak
etanol daun bangun-bangun dilakukan sama seperti prosedur untuk karakterisasi
dan pemeriksaan skrining fitokimia serbuk simplisia.
3.7 Penyiapan Pereaksi dan Bahan Uji
3.7.1 Pembuatan Suspensi CMC Na 1% b/v
Sebanyak 1 g CMC Na ditaburkan dalam lumpang yang berisi air suling
panas. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang
transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling,
dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya
dengan air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Pembuatan Suspensi Rutin
Ditimbang rutin sebanyak 100 mg, ditambahkan suspensi CMC Na 1%
sedikit demi sedikit sambil digerus homogen, lalu diencerkan dengan suspensi
CMC Na 1% hingga 20 ml.
3.7.3 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun (EEDBB)
Dalam pengujian akan digunakan 3 variasi dosis, yakni dosis 250 mg/kg
BB, dosis 500 mg/kg BB, dan dosis 750 mg/kg BB. EEDBB dimasukkan
sebanyak 1,5 g ke dalam lumpang ditambahkan suspensi Na-CMC 1% b/v sedikit
demi sedikit sambil digerus sampai homogen, lalu cukupkan sesuai total volume
EEDBB yang dibutuhkan yaitu 20 ml.
3.7.4 Induksi Stres Pada Tikus
Penginduksian stres pada tikus dilakukan pada hari ke-8 dan ke-9
pengujian. Penginduksian dilakukan dengan memberikan doksorubisin HCl dosis
20 mg/kg bb secara intraperitonial (Thandavarayan, dkk., 2015 ; Ihab, dkk.,
2009).
3.7.5 Pembuatan larutan buffer formalin 10%
Larutan buffer formalin 10 % dibuat dengan penambahan 4 g NaH2PO4 dn
6,5 g Na2HPO4 ke dalam formalin 10 % (100 mL larutan formaldehid 40%
ditambah akuades 900 mL) kemudian dicukupkan dengan akuades sampai 1000
mL.
3.8 Uji Aktivitas Antioksidan EEDBB (Ekstrak Etanol Daun BangunBangun) dengan Metode Spektrofotometri UV-Visible terhadap Kadar
SOD.
Prosedur uji aktivitas antioksidan merujuk kepada modifikasi Sihotang
(2015); Ragavendran, dkk., (2012); Hassanen, dkk., (2015).
Universitas Sumatera Utara
3.8.1 Penyiapan Hewan Percobaan
Sebelum dijadikan subjek percobaan, semua tikus diadaptasikan dengan
lingkungannya selama 7 hari dan diberikan perlakuan normal (aklimatisasi).
Masing-masing kandang diberikan bedding (sekam) dan diberi makan secara
teratur.
Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 6 kelompok. Masing-masing
terdiri dari 5 ekor tikus.
Kelompok 1
: diberikan suspensi CMC Na 1% secara per oral selama 9 hari
(Normal).
Kelompok 2
: diberikan doksorubisin HCl dosis 20 mg/kg bb secara
intraperitonial pada hari ke-8 dan ke-9 (Kontrol Negatif).
Kelompok 3
: diberikan suspensi EEDBB dosis 250 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl 20
mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 4
: diberikan suspensi EEDBB dosis 500 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl 20
mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 5
: diberikan suspensi EEDBB dosis 750 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan pada hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl
20 mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 6
: diberikan Rutin dosis 50 mg/kg bb secara oral selama 7 hari
sebelum pemberian doksorubisin HCl dan dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama
dengan pemberian doksorubisin HCl dosis 20 mg/kg bb secara intraperitonial
(Kontrol Positif).
Universitas Sumatera Utara
Tikus dipuasakan selama 12 jam setelah perlakuan terakhir dan pada hari
ke-10 semua hewan percobaan dianestesi dengan ketamin 70 mg/kg bb secara
intraperitonial. Selanjutnyadengan segera diambil cuplikan darah dari jantung
tikus untuk dilakukan pengukuran aktivitas SOD pada serumnya dan hati tikus
untuk dilakukan histologi.
3.8.2 Pengambilan Serum Darah Tikus
Pengambilan serum darah tikus diawali dengan pengambilan sejumlah
volume darah dari jantung dengan menusukkan syringe langsung dan disedot
secara perlahan, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Selanjutnya sentrifuge
dengan kecepatan 1500-3000 rpm selama 10-15 menit dan diambil supernatan
pada bagian atas berupa cairan bening agak kekuningan (Frandson, 1981).
3.8.3 Pengukuran Kadar SOD pada Serum Darah Tikus
Pengukuran kadar SOD dilakukan dengan metode Spektrofotometri UVVisible berdasarkan prosedur EnzyChrom™ SuperOxide Dismutase Assay Kit
(ESOD-100) pada panjang gelombang 440 nm. Prosedur dapat dilihat pada
lampiran 15 halaman 88.
Prosedur :
a. Sampel :
Disiapkan 30 sampel serum darah tikus. Kemudian sampel didilusikan
menggunakan Diluent dengan perbandingan 1 : 5.
b. Standard :
Dicampurkan 8 μl SOD Enzyme dengan 392 μl Diluent agar mencapai 3 U/ml
SOD standard. Kemudian dilusikan beberapa standard sesuai tabel berikut.
Universitas Sumatera Utara
No
3U/ml SOD + Diluent
Standard (U/ml)
1
80 μl + 20 μl
2.4
2
40 μl + 60 μl
1.2
3
8 μl + 92 μl
0.24
4
4 μl + 96 μl
0.12
5
0 μl + 100 μl
0
Dipindahkan 20 μl masing-masing SOD Standard ke dalam plate 96-well alas
datar. Kemudian pindahkan juga masing-masing sampel ke dalam well secara
terpisah.
c. Disiapkan Working Reagent. Untuk setiap well, dicampurkan 160 μl Assay
Buffer, 5 μl Xanthine dan 5 μl WST-1. Pindahkan 160 μl Working Reagent
tersebut ke masing-masing well yang sudah terisi standard dan sampel,
selanjutnya plate di goyangkan dengan pelan dan hati-hati agar saling
tercampur.
d. Didilusikan dengan cepat XO Enzyme 1:20 dalam Diluent. Kemudian ke dalam
setiap well pengujian ditambahkan 20 μl XO Enzyme yang terdilusi tersebut
dengan multi-channel pipettor. Plate digoyangkan dengan pelan dan hati-hati
agar saling tercampur.
e. Diukur absorbansinya segera dengan Spektofotometri, panjang gelombang 440
nm (OD0). Selanjutnya diinkubasikan selama 60 menit dalam temperatur
ruangan (250C) dan keadaan gelap. Kemudian ukur kembali absorbansi dengan
panjang gelombang 440 nm (OD60).
Universitas Sumatera Utara
f. Dikalkulasikan hasil absorbansinya dengan mendapatkan nilai∆OD = OD
60
–
OD0; ∆∆OD = ∆OD std 8 - ∆OD dari setiap standard dan sampel dimana ∆OD
std 8 adalah standard yang tidak mempunyai aktivitas SOD dan nilai
absorbansinya yang paling tertinggi. Selanjutnya dibuat plot kurva standard
∆∆OD vs[SOD](U/ml).
3.9 Pemeriksaan Histopatologi Jaringan Organ Hati Tikus dengan
Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE)
3.9.1 Pembuatan Preparat Blok Parafin
Langkah-langkah pembuatan blok parafin adalah sebagai berikut:
a. sampel hati yang direndam dalam larutan formalin 10% selanjutnya dilakukan
proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat yaitu diawali dengan alkohol 70%,
kemudian berturut-turut alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut. Pada
masing-masing proses dilakukan selama 30 menit sampai 1 jam.
b. tahap selanjutnya adalah pencucian dengan menggunakan larutan xylol yaitu
xylol 1, xylol 2, dan xylol 3 masing-masing selama 1-2 jam.
c. proses penanaman. Caranya: sampel direndam dalam campuran xylol dan
parafin cair pada suhu 60–70oC, dengan perbandingan xylol : parafin berturutturut 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 2 jam.
d. dilakukan pencetakan dan dibiarkan membeku, kemudian blok parafin dipotong
dengan menggunakan alat mikrotom dengan ketebalan irisan 5-7 μm.
3.9.2 Pewarnaan Hematoxylin Eosin
Pemeriksaan histologi hati dilakukan pada seluruh sampel hati tikus.
Pewarnaan
HE
dimulai
dengan
melakukan
deparafinisasi
dengan
memasukkanpreparat ke dalam seri larutan xylol I, II, III. Tahapan selanjutnya
Universitas Sumatera Utara
adalah fiksasi dengan memasukkan preparat ke dalam larutan alkohol 96%.
Kemudian dicuci dengan air mengalir dan direndam dalam akuades. Preparat
direndam dalam hematoxylin selama 5 menit lalu dicuci dengan air mengalir
selama 3 menit. Kemudian preparat dicelup ke dalam larutan acid alcohol 1%
sebanyak 1-2 celupan dan dicuci kembali dengan air mengalir selama 3 menit.
Setelah itu preparat diwarnai menggunakan eosin 1% dan dicuci lagi dengan air
mengalir selama 3 menit. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol
bertingkat (alkohol 80%, 95% dan alkohol absolut) selama 3 menit serta
penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Sediaan dilakukan mounting
dan ditutup dengan cover glass. Preparat diamati dibawah mikroskop cahaya
untuk melihat morfologi sel atau jaringan termasuk kerusakannya.
3.10 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS versi
17.0. Data dianalisis dengan menggunakan metode Kolmogorov Smirnov untuk
menentukan
homogenitas
dan
normalitasnya.
Kemudian
dilanjutkan
menggunakan metode One Way ANOVA untuk menentukan perbedaan rata-rata
di antara kelompok. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji
Post Hoc Tukey HSD untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanese, Universitas
Sumatera Utara. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa sampel termasuk famili
Lamiaceace , jenis Coleus amboinicus Lour. Hasil identifikasi tumbuhan dapat
dilihat pada lampiran 2 halaman 60.
4.2 Hasil Karakteristik Daun Bangun-Bangun dan Simplisia
4.2.1 Pemeriksaan Makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik daun bangun-bangun segar menunjukkan
daun berwarna hijau, helaian daun berbentuk bundar telur, kadang-kadang agak
membundar, panjang helaian daun 3,5 cm sampai 7 cm, lebar 4 cm sampai 7 cm,
pinggir daun agak bergerigi atau berombak. Pada keadaan segar helaian daun
tebal, sangat berdaging dan berair, tulang daun bercabang-cabang, permukaan atas
dan bawah berambut halus berwarna putih, bila dimakan berasa getir. Pada
keadaan kering helaian daun tipis dan sangat berkerut, permukaan atas kasar,
warna coklat sampai coklat tua, permukaan bawah berwarna lebih muda dari
permukaan atas, pada kedua permukaan terdapat rambut halus berwarna putih.
4.2.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia daun bangun-bangun
terlihat fragmen rambut penutup, rambut kelenjar, pembuluh kayu, epidermis,
kristal kalsium oksalat berbentuk prisma.
Universitas Sumatera Utara
4.2.3 Karakterisasi Simplisia dan EEDBB
Hasil pemeriksaan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol,
kadar abu total dan kadar abu yang tidak larut asam dapat dilihat pada Tabel 4.1
Tabel 4.1 Hasil Karakteristik Simplisia dan EEDBB
No.
Pemeriksaan
Simplisia
1 Kadar air
7,55
2 Kadar sari larut air
32
3 Kadar sari larut etanol
6,89
4 Kadar abu total
14,90
5 Kadar abu tidak larut
0,45
Keterangan : MMI = Materia Medika Indonesia
Hasil (%)
EEDBB
8,91
32,23
5,47
3,47
0,24
MMI Simplisia
< 10
> 29
>5
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengujian aktivitas
antioksidan EEDBB (Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun) terhadap kadar enzim
SOD (SuperOxide Dismutase) melalui metode spektrofotometri pada serum dan
pemeriksaan histologi jaringan hati tikus. Tahap penelitian meliputi pengumpulan
bahan uji, pembuatan simplisia dan ekstrak, karakterisasi pada simplisia dan
ekstrak, skrining fitokimia simplisia dan ekstrak, uji aktivitas antioksidan secara
in vivo, dan histologi jaringan hati tikus.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari lemari pengering, oven, tanur, rotary
evaporator, water bath, seperangkat alat penetapan kadar air, desikator, neraca
hewan, neraca listrik, blender, mikroskop, objek kaca, tissue, spatula, alat-alat
gelas laboratorium, aluminium foil, kertas saring, oral sonde, pipet tetes, spuit,
selang, alat sentrifuge, alat vortex, dan spektrofotometerUV-Visible.
3.1.2 Bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun BangunBangun (Plectranthus amboinicus L.). Bahan kimia yang digunakan kecuali
dinyatakan lain berkualitas pro analisis adalah etanol 96%, pereaksi Bouchardat,
Dragendorff, Mayer, besi (III) klorida, Molisch, timbal (II) asetat, asam sulfat,
asam klorida, methanol, kloroform-isopropanol, Liebermann-Burchard, n-
Universitas Sumatera Utara
heksan,toluen, kloroform, serbuk magnesium, serbuk seng, Doxorubicin,
EnzyChrom™SuperOxide Dismutase Assay Kit (ESOD-100), Na-CMC (natrium
carboxy methyl cellulose), dan akuades.
3.1.3 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih
(Rattus norvegicus) galur Wistar, jenis kelamin betina, berusia 2-3 bulan dengan
berat badan150-200 g.
3.2 Prosedur Pembuatan Simplisia
3.2.1 Pengambilan Bahan
Pengambilan
bahan
tumbuhan
dilakukan
secara
purposif
tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Tumbuhan
diambil dari daerah Kecamatan Pancur Batu, Kabupaten Deli Serdang, Sumatera
Utara.
3.2.2 Determinasi Tumbuhan
Determinasi bahan tumbuhan bangun-bangun (Plectranthus amboinicus
L.) dilakukan di Herbarium Medanense, Fakultas MIPA, Universitas Sumatera
Utara, Medan.
3.2.3 Pembuatan Simplisia
Tumbuhan bangun-bangun (Plectranthus amboinicus L.) dikumpulkan,
dipisahkan akar, batang, dan bagian tumbuhan lainnya,dipetik daun-daunnya
dengan tangan satu-persatu (Depkes RI, 1985), kemudian daun-daunnya disortasi
basah, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan, dan ditimbang beratnya.
Daun bangun-bangun (Plectranthus amboinicus L.) selanjutnya dikeringkan di
Universitas Sumatera Utara
lemari pengering hingga kering, sortasi kering, kemudian ditimbang beratnya, dan
disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
3.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
3.3.1Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik dilakukan dengan mengamati
bentuk, bau dan rasa dari daun bangun-bangun, serbuk simplisia daun bangunbangun.
3.3.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun bangun-bangun segar
dan serbuk simplisia daun bangun-bangun. Serbuk simplisia daun bangun-bangun
diletakkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan
ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.3.3 Penetapan Kadar Air Simplisia
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi
toluena). Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin,
tabung penyambung, dan tabung penerima.
Cara kerja:
Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat,
lalu destilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30
menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5g serbuk simplisia yang telah
ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena
mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian
Universitas Sumatera Utara
besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1992).
3.3.4. Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam
dengan 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter)
menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, 20 ml filtrat dipipet, diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada
suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam
persen (Depkes RI, 2008).
3.3.5. Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam
dengan 100 ml etanol 95% menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, 20 ml filtrat
dipipet, diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata
(Depkes RI, 2008).
3.3.6. Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama
dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
Universitas Sumatera Utara
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan
pada suhu 600oC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai
diperoleh bobot tetap. Kadar abu total dihitung dalam persen (Depkes RI, 1995).
3.3.7. Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25
ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu kemudian dicuci denganair
panas dalam kurs porselen. Residu dan kertas saring dipijarkan pada suhu 60oC
sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut
dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara (Depkes RI,
1995).
3.4 Skrining Fitokimia Simplisia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun bangun-bangun (Plectranthus
amboinicus L.) meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid,
saponin, tannin, glikosida, dan steroid/triterpenoid.
3.4.1 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan selama 5
menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrate ditambahkan 0,1
g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 1 ml amil alkohol, dikocok
dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah kekuningan
atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml
asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji
alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi :
a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan di atas (Depkes RI, 1995).
3.4.3 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak
kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.4.4 Pemeriksaan Tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 2 menit
dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 12 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau
kehitaman menunjukkan adanya tannin (Farnsworth, 1966).
Universitas Sumatera Utara
3.4.5 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 2 g, lalu disari dengan 20 ml
campuran etanol 95% dengan air (7:2) dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks
selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml
air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform (2:2),
dilakukan berulang kali sebanyak 2 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada
temperatur tidak lebih dari 500C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml methanol.
Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan
dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch. Kemudian secara perlahanlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya
cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida (Depkes
RI, 1995).
3.4.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam,
disaring, lalu filtrate diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi LiebermanBourchard), diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk
warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1987).
Universitas Sumatera Utara
3.5 Proses Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun (EEDBB)
Proses pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan
pelarut etanol.Sebanyak 500g serbuk kering simplisia dengan derajat halus yang
cocok
dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan etanol 96%
sebanyak 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya
sambil diaduk sekali-kali setiap hari. Setelah 5 hari, kemudian disaring, ampas
diperas. Ampas dicuci dengan pelarut secukupnya, diaduk dan disaring hingga
diperoleh 100 bagian. Tampung maserat ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di
tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian dienaptuangkan.
Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator, kemudian ekstrak
dikeringkan dengan penangas air(Depkes RI, 1979).
3.6 Karakterisasi dan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun BangunBangun (EEDBB)
Prosedur karakterisasi dan pemeriksaan golongan senyawa kimia ekstrak
etanol daun bangun-bangun dilakukan sama seperti prosedur untuk karakterisasi
dan pemeriksaan skrining fitokimia serbuk simplisia.
3.7 Penyiapan Pereaksi dan Bahan Uji
3.7.1 Pembuatan Suspensi CMC Na 1% b/v
Sebanyak 1 g CMC Na ditaburkan dalam lumpang yang berisi air suling
panas. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang
transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling,
dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya
dengan air suling hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Pembuatan Suspensi Rutin
Ditimbang rutin sebanyak 100 mg, ditambahkan suspensi CMC Na 1%
sedikit demi sedikit sambil digerus homogen, lalu diencerkan dengan suspensi
CMC Na 1% hingga 20 ml.
3.7.3 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Bangun-Bangun (EEDBB)
Dalam pengujian akan digunakan 3 variasi dosis, yakni dosis 250 mg/kg
BB, dosis 500 mg/kg BB, dan dosis 750 mg/kg BB. EEDBB dimasukkan
sebanyak 1,5 g ke dalam lumpang ditambahkan suspensi Na-CMC 1% b/v sedikit
demi sedikit sambil digerus sampai homogen, lalu cukupkan sesuai total volume
EEDBB yang dibutuhkan yaitu 20 ml.
3.7.4 Induksi Stres Pada Tikus
Penginduksian stres pada tikus dilakukan pada hari ke-8 dan ke-9
pengujian. Penginduksian dilakukan dengan memberikan doksorubisin HCl dosis
20 mg/kg bb secara intraperitonial (Thandavarayan, dkk., 2015 ; Ihab, dkk.,
2009).
3.7.5 Pembuatan larutan buffer formalin 10%
Larutan buffer formalin 10 % dibuat dengan penambahan 4 g NaH2PO4 dn
6,5 g Na2HPO4 ke dalam formalin 10 % (100 mL larutan formaldehid 40%
ditambah akuades 900 mL) kemudian dicukupkan dengan akuades sampai 1000
mL.
3.8 Uji Aktivitas Antioksidan EEDBB (Ekstrak Etanol Daun BangunBangun) dengan Metode Spektrofotometri UV-Visible terhadap Kadar
SOD.
Prosedur uji aktivitas antioksidan merujuk kepada modifikasi Sihotang
(2015); Ragavendran, dkk., (2012); Hassanen, dkk., (2015).
Universitas Sumatera Utara
3.8.1 Penyiapan Hewan Percobaan
Sebelum dijadikan subjek percobaan, semua tikus diadaptasikan dengan
lingkungannya selama 7 hari dan diberikan perlakuan normal (aklimatisasi).
Masing-masing kandang diberikan bedding (sekam) dan diberi makan secara
teratur.
Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 6 kelompok. Masing-masing
terdiri dari 5 ekor tikus.
Kelompok 1
: diberikan suspensi CMC Na 1% secara per oral selama 9 hari
(Normal).
Kelompok 2
: diberikan doksorubisin HCl dosis 20 mg/kg bb secara
intraperitonial pada hari ke-8 dan ke-9 (Kontrol Negatif).
Kelompok 3
: diberikan suspensi EEDBB dosis 250 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl 20
mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 4
: diberikan suspensi EEDBB dosis 500 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl 20
mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 5
: diberikan suspensi EEDBB dosis 750 mg/kg bb selama 7 hari,
dilanjutkan pada hari ke-8 dan ke-9 bersama dengan pemberian doksorubisin HCl
20 mg/kg bb secara intraperitonial.
Kelompok 6
: diberikan Rutin dosis 50 mg/kg bb secara oral selama 7 hari
sebelum pemberian doksorubisin HCl dan dilanjutkan hari ke-8 dan ke-9 bersama
dengan pemberian doksorubisin HCl dosis 20 mg/kg bb secara intraperitonial
(Kontrol Positif).
Universitas Sumatera Utara
Tikus dipuasakan selama 12 jam setelah perlakuan terakhir dan pada hari
ke-10 semua hewan percobaan dianestesi dengan ketamin 70 mg/kg bb secara
intraperitonial. Selanjutnyadengan segera diambil cuplikan darah dari jantung
tikus untuk dilakukan pengukuran aktivitas SOD pada serumnya dan hati tikus
untuk dilakukan histologi.
3.8.2 Pengambilan Serum Darah Tikus
Pengambilan serum darah tikus diawali dengan pengambilan sejumlah
volume darah dari jantung dengan menusukkan syringe langsung dan disedot
secara perlahan, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Selanjutnya sentrifuge
dengan kecepatan 1500-3000 rpm selama 10-15 menit dan diambil supernatan
pada bagian atas berupa cairan bening agak kekuningan (Frandson, 1981).
3.8.3 Pengukuran Kadar SOD pada Serum Darah Tikus
Pengukuran kadar SOD dilakukan dengan metode Spektrofotometri UVVisible berdasarkan prosedur EnzyChrom™ SuperOxide Dismutase Assay Kit
(ESOD-100) pada panjang gelombang 440 nm. Prosedur dapat dilihat pada
lampiran 15 halaman 88.
Prosedur :
a. Sampel :
Disiapkan 30 sampel serum darah tikus. Kemudian sampel didilusikan
menggunakan Diluent dengan perbandingan 1 : 5.
b. Standard :
Dicampurkan 8 μl SOD Enzyme dengan 392 μl Diluent agar mencapai 3 U/ml
SOD standard. Kemudian dilusikan beberapa standard sesuai tabel berikut.
Universitas Sumatera Utara
No
3U/ml SOD + Diluent
Standard (U/ml)
1
80 μl + 20 μl
2.4
2
40 μl + 60 μl
1.2
3
8 μl + 92 μl
0.24
4
4 μl + 96 μl
0.12
5
0 μl + 100 μl
0
Dipindahkan 20 μl masing-masing SOD Standard ke dalam plate 96-well alas
datar. Kemudian pindahkan juga masing-masing sampel ke dalam well secara
terpisah.
c. Disiapkan Working Reagent. Untuk setiap well, dicampurkan 160 μl Assay
Buffer, 5 μl Xanthine dan 5 μl WST-1. Pindahkan 160 μl Working Reagent
tersebut ke masing-masing well yang sudah terisi standard dan sampel,
selanjutnya plate di goyangkan dengan pelan dan hati-hati agar saling
tercampur.
d. Didilusikan dengan cepat XO Enzyme 1:20 dalam Diluent. Kemudian ke dalam
setiap well pengujian ditambahkan 20 μl XO Enzyme yang terdilusi tersebut
dengan multi-channel pipettor. Plate digoyangkan dengan pelan dan hati-hati
agar saling tercampur.
e. Diukur absorbansinya segera dengan Spektofotometri, panjang gelombang 440
nm (OD0). Selanjutnya diinkubasikan selama 60 menit dalam temperatur
ruangan (250C) dan keadaan gelap. Kemudian ukur kembali absorbansi dengan
panjang gelombang 440 nm (OD60).
Universitas Sumatera Utara
f. Dikalkulasikan hasil absorbansinya dengan mendapatkan nilai∆OD = OD
60
–
OD0; ∆∆OD = ∆OD std 8 - ∆OD dari setiap standard dan sampel dimana ∆OD
std 8 adalah standard yang tidak mempunyai aktivitas SOD dan nilai
absorbansinya yang paling tertinggi. Selanjutnya dibuat plot kurva standard
∆∆OD vs[SOD](U/ml).
3.9 Pemeriksaan Histopatologi Jaringan Organ Hati Tikus dengan
Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE)
3.9.1 Pembuatan Preparat Blok Parafin
Langkah-langkah pembuatan blok parafin adalah sebagai berikut:
a. sampel hati yang direndam dalam larutan formalin 10% selanjutnya dilakukan
proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat yaitu diawali dengan alkohol 70%,
kemudian berturut-turut alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut. Pada
masing-masing proses dilakukan selama 30 menit sampai 1 jam.
b. tahap selanjutnya adalah pencucian dengan menggunakan larutan xylol yaitu
xylol 1, xylol 2, dan xylol 3 masing-masing selama 1-2 jam.
c. proses penanaman. Caranya: sampel direndam dalam campuran xylol dan
parafin cair pada suhu 60–70oC, dengan perbandingan xylol : parafin berturutturut 3:1, 1:1, dan 1:3 masing-masing selama 2 jam.
d. dilakukan pencetakan dan dibiarkan membeku, kemudian blok parafin dipotong
dengan menggunakan alat mikrotom dengan ketebalan irisan 5-7 μm.
3.9.2 Pewarnaan Hematoxylin Eosin
Pemeriksaan histologi hati dilakukan pada seluruh sampel hati tikus.
Pewarnaan
HE
dimulai
dengan
melakukan
deparafinisasi
dengan
memasukkanpreparat ke dalam seri larutan xylol I, II, III. Tahapan selanjutnya
Universitas Sumatera Utara
adalah fiksasi dengan memasukkan preparat ke dalam larutan alkohol 96%.
Kemudian dicuci dengan air mengalir dan direndam dalam akuades. Preparat
direndam dalam hematoxylin selama 5 menit lalu dicuci dengan air mengalir
selama 3 menit. Kemudian preparat dicelup ke dalam larutan acid alcohol 1%
sebanyak 1-2 celupan dan dicuci kembali dengan air mengalir selama 3 menit.
Setelah itu preparat diwarnai menggunakan eosin 1% dan dicuci lagi dengan air
mengalir selama 3 menit. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol
bertingkat (alkohol 80%, 95% dan alkohol absolut) selama 3 menit serta
penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Sediaan dilakukan mounting
dan ditutup dengan cover glass. Preparat diamati dibawah mikroskop cahaya
untuk melihat morfologi sel atau jaringan termasuk kerusakannya.
3.10 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS versi
17.0. Data dianalisis dengan menggunakan metode Kolmogorov Smirnov untuk
menentukan
homogenitas
dan
normalitasnya.
Kemudian
dilanjutkan
menggunakan metode One Way ANOVA untuk menentukan perbedaan rata-rata
di antara kelompok. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji
Post Hoc Tukey HSD untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanese, Universitas
Sumatera Utara. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa sampel termasuk famili
Lamiaceace , jenis Coleus amboinicus Lour. Hasil identifikasi tumbuhan dapat
dilihat pada lampiran 2 halaman 60.
4.2 Hasil Karakteristik Daun Bangun-Bangun dan Simplisia
4.2.1 Pemeriksaan Makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik daun bangun-bangun segar menunjukkan
daun berwarna hijau, helaian daun berbentuk bundar telur, kadang-kadang agak
membundar, panjang helaian daun 3,5 cm sampai 7 cm, lebar 4 cm sampai 7 cm,
pinggir daun agak bergerigi atau berombak. Pada keadaan segar helaian daun
tebal, sangat berdaging dan berair, tulang daun bercabang-cabang, permukaan atas
dan bawah berambut halus berwarna putih, bila dimakan berasa getir. Pada
keadaan kering helaian daun tipis dan sangat berkerut, permukaan atas kasar,
warna coklat sampai coklat tua, permukaan bawah berwarna lebih muda dari
permukaan atas, pada kedua permukaan terdapat rambut halus berwarna putih.
4.2.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia daun bangun-bangun
terlihat fragmen rambut penutup, rambut kelenjar, pembuluh kayu, epidermis,
kristal kalsium oksalat berbentuk prisma.
Universitas Sumatera Utara
4.2.3 Karakterisasi Simplisia dan EEDBB
Hasil pemeriksaan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol,
kadar abu total dan kadar abu yang tidak larut asam dapat dilihat pada Tabel 4.1
Tabel 4.1 Hasil Karakteristik Simplisia dan EEDBB
No.
Pemeriksaan
Simplisia
1 Kadar air
7,55
2 Kadar sari larut air
32
3 Kadar sari larut etanol
6,89
4 Kadar abu total
14,90
5 Kadar abu tidak larut
0,45
Keterangan : MMI = Materia Medika Indonesia
Hasil (%)
EEDBB
8,91
32,23
5,47
3,47
0,24
MMI Simplisia
< 10
> 29
>5