PERCOBAAN INISIASI KALUS DARI BEBERAPA DIOSCOREA SP. Repository - UNAIR REPOSITORY

  PERCOBAAN INISIASI KALUS DARI BEBERAPA DIOSCOREA SP. SKRIPSI DIBUAT UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR MENCAPAI GELAR SARJANA FARMASI PADA FAKULTAS FARMASI

  ^ r

  UNIVERSITAS AIRLANGGA /, oleh Retno Sari 058210491

  Disetujui oleh Pembimbing M I L I t

  '

  I T BR P U S T AE AA* _{1-W N IT E R S 1 T A S / l K L A N O « A ’}

  , S U R A H A V A Gunawan^ntirayanto Drs* Charoad Ahmad Sahid

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  Penelitian. ini dikerjakan atas kerja sama Sub Balai Pene­ litian Hortikultura Malang dengan Laboratorium Bioteknolo- gi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  KATA PENGANTAR Penelitian dengan judul " PERCOBAAN INISIASI KALUS

  DARI BEBSRAPA DIOSCOREA SP. " setelah waktu yang cukup panjang, akhirnya dapat diselesaikan. Meskipun hasil yang dicapai belum cukup memadai, diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi perkerabangan dan kemajuan penelitian di bi dang bioteknologi terutama teknik kultur jaringan tanaman obat.

  Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, kami persembahkan apa yang telah dicapai bagi kemaduan ilmu pengetahuan.

  Ucapan terima kasih yang setulusnya kami sampaikan kepada : Bapak Dr, Gunawan Indrayanto dan Bapak Drs. Charaad

  Ahmad Sahid selaku dosen pembimbing,- yang telah banyak mera- berikan bimbingan dan saran serta dorongan moril.

  Bapak Ir. F. Kasijadi KS selaku Kepala Sub Balai Pe­ nelitian Hortikultura Malang yang telah memberikan kesem- patan dan fasilitas untuk melaukan penelitian di laborato­ ry um Fisiologi.

  Kepala Kebun /?aya Purv/odadi -Pasuruan beserta staf yang telah banyak membantu dalam mendapatkan bahan peneli­ tian.

  Para dosen Fakultas Farraasi Universitas Airiangga yang telah memberikan saran dan dorongan moril iii

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  Para staf Laboratorium Fisiologi Sub Balai Peneliti- an Hortikultura Malang yang banyak memberikan bantuan se- lama penelitian.

  Tak lupa terima kasih yang sebesarnya kepada kedua orang tua dan saudara-saudara kami yang banyak memberikan bantuan moril materiil.

  Surabaya, Desember 1987 iv

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  DAFTAR ISI Halaraan

  KATA PENGANTAR iii

  DAFTAR ISI . . . - . . . . . . . . . . . . . . v DAFTAR TABEL. .......................... - . viii DAFTAR GAMBAR .................... . . . x DAFTAR L A M P I R A N .......................... xii- DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN .............. xiii- BAB

  I. PENDAHULUAN 1 . Latar belakang ................. ..... 1

  2. Tujuan Penelitian . . . . . . . k

  II. TINJAUAN PUSTAKA 1. Kultur jaringan . . . . . . . . .

  5

  2. Media kultur jaringan .................7 3. Kondisi lingkungan kultur jaringan.

  11 4. Kultur kalus dan karakteristiknya .

  12

  5. Kultur jaringan sebagai sumber

  15 metabolit sekunder . . . . . . 6 . Produksi diosgenin dari kultur jaring­ an Dioscorea sp..................

  18 7. Tinjauan uraum tanaman Dioscorea sp.

  19 7.-1 Sistematika tanaman Dioscorea sp.

  19 7.2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea sp.

  20 7.3 Kandungan Dioscorea sp. . . .

  21 III. METODOLOGI PENELITIAN 1. B a h a n .............. ..

  23

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Halaman III..

  

1*1 Eksplan . . . . . . . . . . . .

  23 1..2 Bahan kimia. ............... .

  23

• 1.3 Agar .. . . . . . . . .

  23 1. if M e d i a . .............. 23 2.. Alat ......................... 2 if

  Zk 3* Cara kerja . ............... . .

  3*1 Sterilisasi alat . . . . . . 2if

  3.1.1 Alat gelas, alat logam dan alu­ minium foil 2if

  3.1.2 Air s u l i n g ................. .... 25 3*2 Pembuatan media

  23 3*3 Penanaman eksplan. .. * . ...

  23 3.4 Pemindahan kultur kalus. .- » ..

  26 3.5 Pengamatan hasil .. .. . . . ...

  26 3.-5.1 Pemeriksaan makroskopis kalus .

  26 3*5.2 Pengamatan pertumbuhan kalus .

  26 3-5.3 Pengolahan data . . . . . . . .

  27 IV- HASIL PENELITIAN

  $Q

  1. Sterilisasi •

  2. Pembentukan kalus • .................31 3. Pemeriksaan makroskopis kalus .

  32 if. Hasil perhitungan............- .

  36

  6 V.. P E M E A H A S A N .......................... .... if

  VI. KESIMPULAN .................. . . . .-

  50

  vi

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  Halajoan

  VII. SARAN ..................................... 52 RINGKASAN.................................. .... 53. DAFTAR PUSTAKA . . . . . . . . . ..........

  54 LAMP

  I R A N .......................... .. . - 5? vii

• *■

  » ». - *.

  32

  38 viii No. Teks Halaman

  10. Contoh perhitungan persamaan regresi dari data Indeks Pertumbuhan rata-rata dan v/aktu (kalus Dioscorea pentaph.ylla L. pada media KD^) . ............

  36

  9. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea •pentaphylla L. . .. .. . ..

  3k

  33 8 . Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea batatas Decne.

  7. Pemeriksaan makroskopis kalus Dioscorea pentaphylla L. • . .. ..

  32 6 . Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea batatas Decne. . . . . . .

  DAFTAR TABEL 1.. Komposisi kimiawi media Murashige -

  5. Waktu tumbuh kalus dari eksplan Dioscorea pentaphvlla L. . . . . . . . .

  3 1

  30 if. Pembentukan kalus dari eksplan Dioscorea sp. pada media MS dengan pe- nambahan zat pengatur tumbuh .. .. .. «.

  29 3* Cara sterilisasi yang digunakan terha- dap eksplan Dioscorea sp. . . . . . . .

  2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus Dioscorea sp. .

  28

  Skoog ••

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  11. Indeks Pertumbuhan (IP) kalus Dioscorea batatas Decne.............. /+1

  12. Waktu duplikasi (td) kalus Dioscorea pentaphylla L. . . . .

  45 13* Waktu duplikasi (t^) kalus Dioscorea batatas Decne. . . . . . . .

  45 No. Teks Halaman ix

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  DAFTAR GAMBAR

  Pertumbuhaa rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L* pada media (A) KD^ (B) kd7 . . . . . . . . .

  No. Teks Halaman

  (A) KDej (B) KDrj Zj-3 x

  8 a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media

  1+2.

  7.. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea bat at as Decne.. .. .. .. .. *.

  Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. pada media (C) KDg (D) . * . ■ » • .- .• • z^o

  39 6b. Persamaan regresi dari grafik log Indeks

  37 6a. Persamaan regresi dari grafik log Indeks

  1. Kurva pertumbuhan kalus .. «. .. - » l*f 2 .

  5. Grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu (hari) dari kalus Dioscorea pentaphvlla L. . . . . . .

  35

  ( pembesaran 50 X -

  33 if. Sel-sel kalus Dioscorea pentaphvlla L..

  3. Kalus Dioscorea batatas Decne yang di- tanam pada media (A) KD^; (B) KD^ pada minggu X V . . ........... .. .

  3 k

  Terjadinya organogenesis pada kalus ^ Dioscorea pentaphvlla L.. pada media (A) KD1# (B) KD3 . ...............

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  No, Teks Halaman 8b.

  Persamaan regresi dari grafik log Indeks Pertumbuhan rata-rata terhadap waktu dari kalus Dioscorea batatas Decne pada media

  (C) KDg (D) k d x0. . . . . . . * . , xi

  DAFTAR LAMPI RAN DISKRIPSI TAKSONOMI 1. Dioscorea hispida Dennst . . . . . . . .

  57 2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk . .. .. ..

  57 3* Dioscorea pentaphvlla L. .. . . . . 4- Dioscorea batatas Decne . . . . . . . .

  59 Gambar

  1. Dioscorea h i Dennst .. .. .. .. ., £0 2. Dioscorea esculenta (Lour) Burk. . . . .

  61 3* Dioscorea pentaphvlla L.- . . . . . .

  62 4* Dioscorea batatas Decne. •• .. .. - .. .•

  63 Tabel Hasil penimbangan bobot basah. kalus Dioscorea pentaphvlla L. dalsun gram . .

  64 Hasil penimbangan bobot basah kalus Dioscorea batatas Decne dalam gram .

  65 No. Teks Halaman.

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN BA benzylaminopurine; BAP

  2,4 D 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid Eksplan potongan jaringan; organ yang diguna- kan untuk memulai kultur jaringan Friable rapuh

  IP Indeks Pertumbuhan

  IAA indole-3-acetic acid Kalus suatu massa meristematik yang tak ter deferensisi dari sel tanaman yang ter bentuk pada kondisi in vitro

  MS Murashige and Skoog NAA -naphthaleneacetic acid Subkultur pemindahan aseptik dari bagian suatu kultur pada media t, waktu duplikasi xiii

  DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN BA 2,if D

  Eksplan Friable

  IP

  IAA Kalus

  MS NAA Subkultur b enzylaminopurine; BAP

  2 ,if - dichlorophenoxyacetic acid potongan jaringan; organ yang diguna- kan untuk memulai kultur jaringan rapuh

  Indeks Pertumbuhan indole-3-a.cetic acid suatu massa meristematik yang tak ter deferensisi dari sel tanaman yang ter bentuk pada kondisi in vitro

  Murashige and Skoog

  ck -naphthaleneacetic acid

  pemindahan aseptik dari bagian suatu kultur pada media waktu duplikasi xiii

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  1 BAB I

  PENDAHULUAN

  1.1 Latar belakang Situasi kependudukan di Indonesia yang kurang menguntungkan. merupakan sebab dilaksanakannya Program

  Keluarga Berencana Nasional. Salah satu sasaran. Pro­ gram Keluarga Berencana yakni sasaran langsung merupa- kan usaha menurunkan tingkat kelahiran melalui pema- kaian kontrasepsi. Hasil yang dicapai pada pelaksana- an Program Keluarga Berencana cenderung mengalami pe- ningkatan (1). Pencapaian peserta Keluarga Berencana aktif secara nasional hingga tahun 1985/1986 sebesar 5 0 ,4

  % dari jumlah pasangan usia subur dengan. penggu-

  naan obat kontrasepsi mencapai lebih dari 60 % (2)* Obat kontrasepsi banyak digunakan karena. pemakaiannya mudah, praktis, efektif dan aman. untuk jangka lama.

  Obat kontrasepsi yang digunakan merupakan hormon steroid. Sebagai bahan baku hormon steroid yang se- ring digunakan adalah diosgenin, stigma sterol, hek- sogenin, asam empedu dan jenis alkaloid steroid yang diperoleh dari tanaman. Kebutuhan akan hormon steroid makin meningkat sejalan dengan bertambahnya jumlah penduduk disamping sejalan dengan kemajuan teknik ca- ra sintesa hormon steroid. Dengan makin meningkatnya kebutuhan akan hormon steroid maka dalam beberapa ta-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  2

  hun kemungkinan. akan kekurangan bahan untuk sumber bahan baku hormon steroid, Oleh karenanya perlu di- kembangkan metode untuk mendapatkan bahan .-baku hor- mon steroid disamping pemanfaatan. dan pengembangan sumber daya alam (3 )..

  Dari hasil pertemuan ilmiah di Meksiko tahun 1975 diketahui sebagai sumber bahan baku steroid yang; pa­ ling banyak diproduksi adalah diosgenin (3 )* Dios- genin merupakan metabolit sekunder yang diteraukan pada jenis tanaman Dioscorea. Tanaman Dioscorea di Indonesia terdapat lebih dari 1+0 jenis, baik yang sengaja ditanam majipun yang tumbuh liar.

  Untuk mendapatkan senyawa/metabolit sekunder dari tanaman pada umumnya dapat dilakukan dengan bu- didaya tanaman. Kesulitan dalam produksi metabolit sekunder disebabkan oleh semakin berkurangnya sumber bahan alam yang tersedia, biaya produksi yang mahal, kesulitan ekonomis dan teknis penanaman ( k) * Kemaju- an bidang bioteknologi membuka kemungkinan-kemung- kinan baru dalam produksi metabolit sekunder yaitt dengan teknik kultur jaringan. Dengan t-eknik kultur jaringan diperoleh keuntungan antara lain: senyawa berguna diproduksi pada kondisi terkontrol, bebas dari pengaruh mikroba dan insekta, tidak tergantung iklim dan letak geografis (5).

  Hasil penelitian yang dilakukan oleh 'Rokem et, al.

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  3

  menunjukkan produksi diosgenin mencapai 7 ,8 % dari kultur jaringan Dioscorea deltoidea. Sejumlah jenis lain dari Dioscorea seperti Dioscorea composita. Dioscorea floribunda. Dioscorea glandulosa telah di- teliti kemampuannya untuk memproduksi diosgenin jika ditanara pada kultur suspensi sel (6 )* Dari peneliti­ an yang dilakukan Tjondronegoro dkk., beberapa jenis Dioscorea yaitu Dioscorea bulbifera. Dioscorea hispida. Dioscorea esculenta diketahui ke­ mampuannya memproduksi diosgenin jika ditanam pada media kultur jaringan (?)•

  Dengan dasar penelitian yang telah dilakukan ma- ka dapat dikembangkan produksi diosgenin dengan tek- nik kultur jaringan guna mencukupi kebutuhan bahan baku pembuatan hormon steroid. Dengan teknik kultur jaringan tahap awal yang harus -dilakukan adalah pena- naman eksplan (potongan jaringan) pada media yang sesuai dimana akan dihasilkan suatu massa yang tak terdeferensiasi disebut kalus* Kultur kalus diketa­ hui mampu memproduksi metabolit sekunder. Untuk men- dapatkan hasil yang optimal dalam produksi metabolit sekunder menurut Keinstein diperlukan cara induksi kalus dari tanaman antara lain dengan pembuatan kul­ tur dari tanaman, optimasi media untuk pertumbuhan kultur yang haik, tanpa memperhatikan kemampuannya dan lain-lain (8 ).

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

_k

  Dari kultur kalus, kalus yang terbentuk dapat di- subkulturkan dengan memindahkan ke.'dalam media;, baru atau untuk produksi dalam jumlah besar dipindahkan ke- dalam kultur suspensi atau kultur fermentor* Kultur kalus untuk produksi dalam jumlah besar kurang meng- untungkan karena tumbuhnya relatif lambat. Tetapi, se- bagai tahap awal untuk mencapai kultur suspensi atau kultur fermentor, harus diketahui terlebih dahulu ke- mampuan pembentukan kalus dari suatu tanaman dan media yang sesuai untuk pertumbuhan kalus sebagaimana dike- mukakan Heinstein (5,9>10), Dengan demikian dapat di- lakukan penelitian lebih lanjut mengenai kandungannya dan keuntungannya untuk dikembangkan dengan teknik kultur jaringan.

  1.2 Tujuan penelitian Penelitian yang dilakukan bertujuan: s p .

  1. Menumbuhkan kalus dari tanaman Dioscorea pada media buatan Murashige - Skoog dengan penam- bahan zat pengatur tumbuh tertentu.

  s p «-

  2. Mengetahui gambaran pertumbuhan kalus Dioscorea dalam bentuk grafik log Indeks Pertumbuhan rata- rata terhadap waktu, pada beberapa kombinasi kon- sentrasi zat pengatur tumbuh*

  s p .

  3. Mengetahui waktu duplikasi kalus Dioscorea pada beberapa kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh.

  5 TINJAUAN PUSTAKA

  11*1 Kultur jaringan Kultur jaringan dapat didefinisikan sebagi ba- gian atau jaringan yang telah dipindahkan dari tanam- an. asalnya dan ditumbuhkan dalam keadaan steril pada suatu media buatan, dan sel-selnya mampu tumbuh dan mengadakan pembelahan (5 ).

  Kultur jaringan didasari oleh teori sel Schwann dan Schleiden yang menyatakan bahwa sel hewan dan sel tumbuhan merupakan satuan biologis terkecil yang mampu melakukan aktivitas hidup seperti metabolisme, reproduksi dan tumbuh. T.H. Morgan mengemukakan sifat totipotensi dari suatu sel dimana sel mampu berkem**. bang menjadi organisme. Pendapat tersebut menjadi salah satu dasar berkembangnya teknik kultur jaring­ an (8,9). Teknologi kultur jaringan tanaman dapat di- bagi dalam lima kelas berdasarkan bahan yang diguna- kan (9 ) :

  a. Kultur kalus

  b. Kultur sel

  c. Kultur organ

  d. Kultur meristem dan morfogenesis

  e. Kultur protoplast Sel-sel tanaman dari semua jenis dapat dikul-

  BAB II ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  6

  turkan secara aseptik pada media nutrisi. Kultur dimulai dengan penanaman eksplan yang telah diste- rilkan pada media agar.. Dalam dua sampai empat ming- gu, tergantung dari jenis tanaman, suatu massa sel tak terorganisasi terbentuk yang disebut kalus. Kalus dapat disubkulturkan tak terbatas dengan me- mindahkan ke dalam media baru. Waktu yang diperlu- kan untuk mendapatkan jaringan kalus sangat berva- riasi tergantung jenis tanaman, asal eksplan dan komposisi nutrisi media (9).

  Keuntungan teknik kultur jaringan dibandingkan teknik konvensional antara lain (6,9) :

  1. Kondisi dapat dikontrol, sehingga dapat dihasil- kan produksi tertentu yang diinginkan. 2.. Bebas pengaruh mikroba dan insekta. 3- Dapat ditanam dimana saja, 'tidak tergantung pada letak geografis dan iklim,.

  Dengan keuntungan teknik kultur jaringan, maka dapat dikeaibangkan imtuk-tiijuan. (4*5')‘ 1- Produksi senyawa-senyawa tertentu yang berguna dalam bidang farmasi/medis.

  2. Eiotransforaasi senyav/a-senyav/a tertentu menja- di senyav;a yang dapat digunakan dalam bidang f annasi/me di s. 3.. Produksi senyawa-senyawa spesifik. if. Seleksi starin-strain tanaman unggul untuk dip

  a-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

7 kai pada bidang pertanian dan hortikultura.

  5. Multiplikasi tanaman secara cepat dan seragam.

  XI*2 Media kultur jaringan Komposisi dari media kultur memegang peranan penting dalam keberhasilan kultur jaringan. Ada be­ berapa macam media kultur jaringan antara lain : me­ dia Murashige - Skoog, B^, White, Heller, Gamborg et. al., Gautheret, Hildebrandt et. al. yang pada dasar- nya sama, dengan modifikasi pada komposisi dan jum­ lah komponennya dimafta disesuaikan dengan tujuan penelitian (1 1 )*.

  Media standar kultur jaringan terdiri dari komposisi yang seimbang antara makroelemen dan mi- kroelemen, vitamin, sumber karbon dan energi, se- nyawa organik, sumber nitrogen dan zat pengatur tumbuh* Penambahan bahan organik seperti air kela* pa, sari buah (tomat, semangka, jeruk), ekstrak tanaman (ekstrak ragi dan gandum) dan protein hi- drolisat dapat merangsang terjadinya pembelahan sel (9,11,12)..

  Komponen media kultur jaringan pada dasarnya terdiri dari:

  1. Sumber karbon seperti sukrosa, glukosa, frukto- sa, laktosa. Dari percobaan beberapa macam kar- bohidrat, sukrosa merupakan karbohidrat terbaik untuk sel tanaman, airaana hampir semua kultur

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  8

  menunjukkan pertumbuhan optimal*. Sukrosa biasa ditambahkan pada konsentrasi 20.000 - 45.000 mg/1 (5,12,13). 2* Makroelemen anorganik

  Nutrisi makroelemen anorganik yang terutama di- butuhkan untuk pertumbuhan meliputi : 'IT, P, Mg, S, K, Ca, Cl*. Nitrogen dibutuhkan dalam jumlah besar, diberikan dalam bentuk ion nitrat dan atau amonium,. Magnesium dan Sulfur diberikan da­ lam bentuk MgSỘ 7 1^0.. Kalium dibutuhkan dalam jumlah besar pula, diberikan dalam bentuk KC1,

  KNÔ, atau KH^PỘ. Penambahan CaCl^,. 2 H^O dan Ca(N0^)2^ 4 ^ 0 atau bentuk garam lainnya untuk memenuhi kebutuhan kalsium. Sedangkan klorida berada dalam bentuk KC1 atau CaC^. Fosfor ber- ada dalam bentuk Nal^PỘ H20 atau KI^PÔ (9).

  3.- Mikroelemen Dibutuhkan oleh sel tanaman dalam jumlah kecil.

  Nutrisi mikroelemen yang diperlukan sel tanaman tihggi adalah Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, dan Mo. Bebe­ rapa media juga mengandung Co dan I (9)*'

  4- Vitamin Vitamin diperlukan dalam jumlah kecil. Mempunyai fungsi mengkatalisa sistem ensim. Tiamin r.ierupa- kan vitamin esensial yang diperlukan hampir se- mua kultur jaringan tanaman. Asam nikotinat dan

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  9

  piridoksin merangsang pertumbuhan, Mio - inositol ditambahkan pada beberapa media dengan konsentra- si 10 0 mg/1 , dimaksudkan sebagai faktor pertum­ buhan. Vitamin lain yang biasa digunakan adalah asam para aminobensoat, asam askorbat, biotin, kholin, sianokobalamin, as§m folat dan riboflavin

  (9,13).

  5. Zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh yang digunakan untuk kebanyak- an kultur jaringan terutama kultur kalus adalah auksin dan sitokinin. Auksin mempunyai peranan antara lain terhadap pengembangan sel, penbentuk- an kalus dan pertumbuhan akar. Sitokinin mempunyai peranan dalam proses pembelahan sel (14). Termasuk dalam kelompok auksin yang sering digunakan untuk keperluan kultur jaringan adalah IAA, 2,/+ D, NAA, sedangkan sitokinin adalah kinetin, BA dan zea- tin.

  V/eier et. al. meneliti pertumbuhan tobacco pith tissue culture dengan menggunakan auksin dan sitokinin dalam berbagai perbandingan. Pada kon- sentrasi sitokinin lebih besar dari auksin memper- lihatkan stimulasi pertumbuhan tunas dan daun. Sebalikr.ya jika konsentrasi sitokinin lebih kecil dari auksin mengakibatkan stimulasi pertumbuhan akar. Pada keadaan dimana konsentrasi kedua -

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  10

  nya berimbang maka pertumbuhan tunas, daun dan akar berimbang juga. Pada konsen.trasi sitokinin sedang (intermediet) dan auksin rendah akan ter- bentuk kalus (14)« 2,4 D lebih potensial daripa- da IAA dan NAA. Kalus dapat terbentuk dari bebe- rapa eksplan pada konsentrasi 2,4 D kurang dari 0 , 1 mg/1 ., meski beberapa jaringan membutuhkan 5 - 1 0 mg/1 untuk merangsang pembelahan sel. Un­ tuk pembentukan kalus penambahan 2,4 D 0,2 - 2 mg/ 1 cukup eSektif untuk semua jaringan. tanaman. Sitokinin ditambahkan dengan konsentrasi 0,5 - 2 mg/ 1 (9 ). 6 . Asam amino dan bahan organik konrpleks

  Asam amino jarang ditambahkan dalam media kultur jaringan kecuali glisin* Jika diperlukan media diperkaya dengan kasein hidrolisat atau asam ca- samino* Penggunaan ekstrak alam seperti ekstrak ragi, ekstrak gandum dan sari buah dapat memban- tu. Sebagai contoh pertumbuhan in vitro dari eksplan beberapa jenis Citrus sangat dirangsang dengan penambahan sari jeruk pada media (9 )-

  Pemilihan media tergantung pada jenis tanaman, jaringan atau organ yang ditanam serta tujuan pene­ litian. Jika telah dilakukan penelitian yang berha- sil dari suatu tanaman, cara terbaik adalah dengan mempergunakan metode yang digunakan pada penelitian

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  11

  tersebut. Beberapa penelitian terhadap kultur ja* ringan Dioscorea sn. menggunakan media dasar Mura- shige - Skoog (6,,..7,9).

  II.3 Kondisi lingkungan kultur jaringan (13 ) 1.- Temperatur

  Menuru'UDe Capite, temperatur optimum beberapa kultur jaringan lebih tinggi dibandingkan tanam­ an. asalnya tetapi menurut Riker dan Hildebrandt sama dengan tanaman. asalnya. Secara umum kultur jaringan tanaman akan tumbuh baik pada tempera­ tur 20 - 28°C dengan temperatur optimal 26 - 27°C. Tetapi beberapa kultur jaringan. tanaman tidak mengalami kerusakan pada temperatur 5 -

  10°C.

  2. Cahaya Kultur suspensi tanaman umumnya tumbuh dengan pencahayaan. redup, meskipun Torrey dan Reinert melaporkan bahwa kecepatan tumbuh dalam keadaan gelap maupun terang untuk jaringan tanaman ada- lah sama. Blakerly dan Stewart melaporkan penca­ hayaan pada kultur jaringan Haplopannus gravilis menghasilkan kultur yang kompak dan kultur yang tumbuh dalam gelap bersifat rapuh. Untuk merang- sang pertumbuhan kalus yang optimum, kultur seba- iknya diletakkan di tempat gelap#

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  12

  3- pH Pada umumnya pH yang menguntungkan untuk pertum­ buhan kultur jaringan antara 5>0 - 6,5. White menyatakan. pH optimal adalah Beberapa media kultur ditambah dengan buffer phosphat karena selama sterilisasi dan selama waktu pertumbuhan pH dapat berubah. Namun penambahannya sangat ter- batas karena pada konsentrasi tinggi akan meng- hambat pertumbuhan. kultur.

  4 . Aerasi dan agitasi Aerasi merupakan faktor penting untuk kekuatan pertumbuhan dari kebanyakan kultur suspensi ta­ naman. Aerasi dan agitasi yang memuaskan dicapai pada kultur yang tumbuh dalam carboys dengan me- lewatkan udara melalui fritted tube atau open ended glass tubing* Pengaduk magnjetik digunakan untuk menambah agitasi pada banyak tipe wadah kultur.

  II.4 Kultur kalus dan karakteristiknya Kultur jaringan tanaman yang paling umum adalah kultur kalus, dimana merupakan suatu massa yang tak terdeferensiasi dari sel tanaman (13). Pada mulanya kalus diketahui terbentuk akibat adanya luka pada jaringan tanaman dimana pada kondisi menguntungkan akan menutup luka dan mencegah infeksi mikroorganis- me. Penelitian yang dilakukan oleh White kemudian

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  13 Gautheret dan Nobecourt di tahun 1930' an membukti-

  kan bahwa kalus dapat terbentuk dari jaringan ta­ naman yang diisolasi.. Kalus dapat dihasilkan dari semua bagian tanaman (15). Cara yang umum' adalah dengan menanam bagian tanaman yang steril pada me-.., dia kultur yang sesuai. Pemberian zat pengatur turn- buh pada konsentrasi tertentu akan merangsang pem- bentukan kalus. Kultur kalus dapat ditumbuhkan pada media padat dan media cair (13 )*

  Kalus dari jenis tanaman yarig berbeda bervari- asi dalam tekstur, kerapuhan dan warna.. Kultur ja­ ringan batang Citrus grandis mempunyai kalus berv/ar- na putih, kompak dan bernodul dengan pertumbuhan yang lambat, sedang kalus yang rapuh pertumbuhannya cepat. Pada kultur jaringan batang Plumbago, Heble et. al. mengamati adanya pemisahan dari beberapa lini sel yang mempunyai perbedaan kemampuan tumbuh, morfologi dan pigmentasi. Kalus berpigmen hijau tum- buh lebih baik dibawah cahaya daripada pada keadaan gelap. Pigmentasi dipengaruhi konsentrasi gula, ada­ nya amiliuiii terlarut, defisiensi nitrogen, temperatur, cahaya dan auksin eksogen (1 1 )*

  Kalus yang terdiri dari sel-sel parenkim yang seragam sangat jarang, kecuali pada Agave dan Bp_s_a. Tergantung dari sumber/asal kalus, nutrisi media, dan interval waktu subkultur. Sel-sel kalus terdiri

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  14

  dari tipe sel yang berv.ariasi ukuran danbentuk, isi sel dan ketebalan dinding selnya (1 1 ).

  Kalus tumbuh selama periode waktu tertentu, bi- asanya selama dua minggu sampai kira-kira tiga bulan. Pada akhirnya akan dicapai ukuran optimum dan per­ tumbuhan akan menurun, Hal tersebut disebabkan makin

  j*

  berkurangnya nutrisi atau dehidrasi media, terben- ttiknya metabolit beracun, habisnya oksigen sel inti jaringan (12). Kurva pertumbuhan kalus selalu meng- hasilkan bentuk n S Kecepatan pertumbuhan menca- pai maksimal setelah fase linier dan menjadi konstan pada fase stationer (Gambar 1) (9,16).

  Gambar 1, Kurva pertumbuhan kalus

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  15 Produksi metabolit sekunder dalam kultur sel berkait-

  an erat dengan kurva pertumbuhan kalus, karena (17) :

  1. Pembentukan metabolit paralel dengan pertumbuhan sel.

  2* Pembentukan metabolit diperlambat sampai pertum­ buhan berhenti. 3* Pembentukan metabolit terjadi setelah lag phase.

  II.5 Kultur jaringan sebagai sumber metabolit sekunder Dengan keberhasilan pertumbuhan in vitro dari jaringan tanaman pada tahun 19 30 an maka studi ter­ hadap kultur jaringan berkembang pesat. Teknik kul­ tur jaringan tanaman membuka kemungkinan baru dalam usaha menemukan produk-produk berguna dari tanaman obat untuk keperluan industri (18,19)»

  Produk yang telah diidentifikasi terdapat pada kultur jaringan tanaman. antara lain steroid, terpe­ noid, sapogenin, alkaloid, karbohidrat, ensim, fla- vonoid, tanin, asam amino, glikosida, zat pengatur tumbuh, pigmen, senyawa fenol dan asam organik (19 )* Adanya aktivitas mikroba fjuga telah diteliti (18).. Kultur jaringan mungkin memproduksi senyawa-senyawa yang sama/identik dengan tanaman induknya dan atau senyawa-senyawa yang lain sama sekali (5). Bahkan mungkin tidak mampu memproduksi senyawa spesifi* da-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  16

  ri tanaman asalnya. Beberapa kegagalan pembentukan senyawa tersebut dikarenakan (2 0 ) :

  1. Kurang atau tidak adanya prekursor yang diperlu­ kan*

  2. Tidak adanya ensim yang terlibat dalam lintasan biokomia yang diperlukan* 3.- Pembentukan struktur sel tertentu.

  4- Perubahan lokalisasi substrat dan ensim.

  Dengan adanya perbedaan kondisi dan lingkungan denganrtanaman asalnya maka ada kemungkinan kultur jaringan mempunyai profil metabolit sekunder yang berbeda sekali dengan tanaman asalnya baik kuanti- tatif maupun kualitatif. Beberapa kultur suspensi yang mempunyai kandungan senyawa alam lebih tinggi dibandingkan tanaman asalnya adalah Coleus blumei

  ( 12 % asam rosmarinat ), Catharanthus roseus ( 0,8 % serpentin ), Dioscorea deltoidea ( 7,8 % di- osgenin ), Solanum aviculare ( 3 % asam betulinat ).

  Senyawa-senyawa yang diproduksi pada kultur jaringan tetapi tidak pada tanaman asalnya atau sedikit seka­ li antara lain : eduline dari Ruta graveolens. luci- dine dari Morinda citrifolia, paniculidis dari Andrographis paniculata* 3-metilpurpurin dari

  Digitalis lanata. Shikonin, suatu zat yang dipakai sebagai obat luka telah berhasil diproduksi secara industri dengan teknik kultur jaringan dari tanaman

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  17 Lithospermum erythrorhlson, Demikian juga ubikinon-

  10 yang diisolasi dari kultur jaringan tambakau

  ( 5 , 21 ) .

  Cara untuk meningkatkan produksi metabolit se­ kunder adalah dengan optimasi media kultur jaringan, optimasi kondisi dari bioreaktor/fermentor, penam- bahan prekursor atau elisitor pada media, biotrans- formasi dan seleksi strain.yang berproduktivi'tas tinggi. Untuk mencari strain-strain yang mampu mem­ produksi metabolit sekunder tertentu dalam jumlah besar dilakukan seleksi strain. Cara seleksi yang dikemukakan Heinstein merupakan perbaikan cara-cara terdahulu, Secara ringkas cara Heinstein antara la­ in (2 2 ) : 1. Pembuatan kultur tanaman. 2* Optimasi media untuk pertumbuhan kultur yang ba- ik tanpa memperhatikan kemaunpuannya.

  3. Mengembangkan metoda untuk menginduksi pemben­ tukan metabolit sekunder.

  Dalam hal mendapatkan metabolit sekunder dengan teknik kultur jaringan agar mempunyai nilai ekonomis, maka diperlukan beberapa kriteria yang harus dipe- nuhi (2 1) :

  1. Konsentrasi produk harus lebih besar dari tanam- asalnya.

  2. Bahan dasar tanaman utuh untuk isolasi sangat su-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

18 kar diperoleh.

  3* Produk biotransformasi dari bahan dasar yang mu- rah dan proses biotransformasi tidak dapat lewat cara kimia atau mikroorganisme. 4* Untuk produksi senyawa kimia yang sukar sekali diperoleh pada tanaman asalnya seperti interme- diet biosintesa, ensim-ensim tertentu.

  II. 6 Produksi diosgenin dari kultur jaringan Dioscorea Pada umumnya tanaman jenis Dioscorea mengandung diosgenin 4 - 3 % bo bothering (22). Kaul dan Staba pada tahun 1968 pertama kali mengisolasi diosgenin dari kultur kalus Dioscorea deltoidea. Dihasilkan

  % bobot ke-

  diosgenin dengan konsentrasi mendekati 1 ring. Dari penelitian lebih lanjut, kultur secara normal tumbuh dalam kultur suspensi dengan adanya 2,4 D 1 mg/1. Sedang tanpa 2,4 D setelah 11 minggu kandungan diosgenin berkurang sampai sepertiga jum- lah normal* Dengan penambahan kolesterol produksi diosgenin meningkat menjadi 2 ,3 % bobot kering (18,

  19). Dari hasil penelitian Rokem et. el. mengenai kultur jaringan Dioscorea deltoidea dicapai kadar diosgenin 7,8 % bobot kering (6 ). Kultur jaringan

  % bobot

  Dioscorea s.ylvatica mengandung diosgenin 1,2 kering (11), Diosgenin juga telah diisolasi dari kul­ tur jaringan D.composita. D. floribunda, D. tokoro

  D. sniculiflora (18)*

  19 Dari kultur jaringan D. deltoidea dilaporkan

  biosintesa diosgenin berlabel jika jaringan diberi

  4 C1^ dan 26 kolesterol. Juga telah diisolasi diosgenin radioaktif, yonogenin dan tokorogenin da­ ri kultur kalus D. tokoro dengan pemberian sikloar- tenol radioaktif, kolest-5-en,3 £,16 ,2 6 triol dan kolest-5-en,3 J5,16 ,2 2 ,2 6 tetrol (18)..

  Penelitian yang dilakukan Tjondronegoro dkk. terhadap beberapa jenis Dioscorea. menunjukkan adanya diosgenin dari ekstrak kalus D. bulbifera.

  D. hispida dan D. esculenta. Analisa kuantitatif dari ekstrak kalus D. bulbifera pada media dengan penambahan NAA dan BAP mempunyai kandungan diosgenin lebih tinggi (0 ,4 %) daripada dengan 2 ,4 D (0 ,2.%)

  (7). Tal dan Golberg melaporkan bahwa amonium dan sitrat dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pembentukan diosgenin. Produksi diosgenin maksimum pada N yang tinggi. Pada konsentrasi NH^NO-^ 2,2 g/1 diperoleh 12,7 g. sel kering/liter. Jenis dan konsentrasi gula juga menentukan kandungan diosgenin. Dengan penambah­ an sukrosa 15 g/ 1 diperoleh 3 ,8 % diosgenin sesudah 21 hari dalam batch culture. Galaktosa pada konsen­ trasi 10 mg/ 1 menghasilkan diosgenin yang lebih tinggi dari penggunaan 30 rog/ 1 sukrosa (23)*

  II.7 Tinjauan umun tanaman Dioscorea sp.

  II.7*1 Sistematika tanaman Dioscorea sp. (24,25)

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  20 Divisi : Spermatophyta

  Anak divisi : Angiospermae K e 1 a s : Monocotyledoneae Bangsa : Idliales S u k u : Dioscoreaceae M a. c g a : Dioscorea

  s p J e a i s : Dioscorea ..

  Suku Dioscoreaceae dikenal sebagai jenis ubi-ubian. Terdiri dari 10 marga yang terdi­ ri dari lebih kurang 650 jenis, Tersebar lu- as di daerah tropik dan subtropik. Tanaman

  Dioscorea di Indonesia terdapat lebih dari 40 jenis, baik yang sengaja ditanam atau tumbuh liar*

  ,2 Sifat-sifat tanaman Dioscorea (24»25j26,27)

  II.7 Habitus : herba tahunan, tumbuh menjalar atau membelit. Didalam tanah mem- bentuk tubera, satu atau banyak, adakalanya tumbuh tubera di ke- tiak. Batang : tumbuh dari tubera, membelit, kadang bersayap atau berduri. D a u n : tunggal kadang-kadang majemuk, berhadapan, berseling atau ter­ sebar. Pada umumnya berbentuk jantung.

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  21 Bunga : beraturan* selalu berkelamin

  satu, berumah satu. Daun +.-■ tenda bunga 6 , dalam lingkar- an masing-masing 3 pada pang- kal kerapkali melekat. Bunga jantan: benang sari 6 , semua fertil atau berkurang 3 men- jadi staminodia* Bunga beti- na: bakal buah tenggelam, kerapkali beruang 3 > bakal biji 2 per ruang, tangkai pu- tik 1 bercabang 3 *

  B a a h : buah kotak atau buah buni de­ ngan 3 lobus, bersayap, mem- buka pada waktu masak, biji 1 samjxai 2 tiap sel datar pa­ da bagian atas atau meling- kar, beralbumin. 11.7*3 Kandungan Dioscorea sp.

  Kandungan tanaman Dioscorea sp. sangat ber- variasi tergantung jenisnya. Tubera terutama

  %, disamping karbohi-

  mengandung air 60 - 80 drat 23 protein 2 %, sejumlah kecil vita­ min B, C, dan karoten. Selain itu tubera mengandung senyawa glikosida saponin, sterol, tanin, trigliserida dan komponen-komponen

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  22

  asam fenolat. Diosgenin pada umumnya terda- pat pada tan am an Dioscorea. Kandungan dios­ genin berbeda pada tiap organ tanaman. Pa- iLittg-'banyak terdapat pada umbi, menyusul ba-

  j

  gian dekat umbi dan*'terns berkurang mender kati pucuk batang (7,24*26).

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  23 BAB III

  METODOLOGI PENELITIAN 111,1 Bahan

  III..1..1 Eksplan Eksplan berasal dari daun Dioscorea hispida Dennst., Dioscorea esculenta (Lour) Burk., Dioscorea batatas Decne yang diperoleh dari Kebun Raya Purwodadi dan telah diketahui identitasnya, dan Dioscorea pentaphvlla L.. yang diperoleh dari daerah Surabaya, yang determinasinya telah dilakukan sesuai dengan buku Flora of Java (25).-

  111.1.2 Bahan kimia Bahan kimia yang digunakan adalah produksi

  E. Merck Darmstadt dengan derajat " pro analisa M kecuali disebutkan lain. Bahan pen- steril yang digunakan adalah Regular Klorox mengandung 5*25 % Natrium hipoklorit, pro­ duksi The Clorox Company, Oakland.. 111.1.3 Agar

  Agar yang digunakan adalah agar batangan me- rek " AA " yang diperoleh dari pasar Klojen, Malang. 111.1.4 Media

  Media yang digunakan adalah media standar

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  24 Murashige-Skoog (Tabel 1) dengan penambah­ an zat pengatur tumbuh pada berbagai kom- binasi konsentrasi (Tabel 2),

  III-2 Alat Alat yang digunakan pada penelitian :

• Laminar air flow cabinet Pharmeq Lab..''
• Otoklaf 25 liter (American Portable Autoclave WAF Co Inc.)
• pH meter Fisher - Monopan balance
• Gelas beker
• Cawan petri
• Erlenmeyer - Gelas >Pipet volum
• Pinset - Pisau sca
• Lampu spiritus
• Botol bermulut lebar (diameter 3*5 cm, tinggi 7 cm. )

  III.3 Cara kerja

  III.3-1 Sterilisasi alat

  III.3.1.1 Alat gelas, alat logam dan alumi­ nium foil.

  Dimasukkan ke dalam bungkus alumi-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

25 nium f o i l ke m u d i a n d i s t e r i l i s a s i

  di dalam oven 160°C selama empat jam (9).. 111.3,1,2 Air suling

  Sterilisasi dilakukan di dalam otoklaf 121°c selama 15 menit.

  Pembuatan media dilakukan sesuai dengan meto- de Kurashige , Masing-masing komponen media dibuat larutan stok dan dengan mencampur la- rutan-larutan stok diperoleh larutan MS. pH media diatur + 5>7 dengan penambahan la­ rutan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N. Setelah di- tambah 1 % agar, larutan dituqng ke dalam botol bermulut lebar sebanyak 25 ml. Botol ditutup rapat dengan aluminium foil dan di- sterilkan dalam otoklaf 121°C, tekanan 20 psi selama 15 menit.

  III.3-3 Penanaman eksplan Daun Dioscorea sp. dicuci bersih dengan air suling. Direndam dalam alkohol 90 % selama 2 menit, kemudian disterilkan dalam larutan Klorox 30 % (mengandung Natrium hipoklorit 1*575 %) selama 10 menit. Setelah dibilas tiga kali dengan air suling steril bebas mi­ neral, eksplan dipotong pada bagian tangkai

  26

  dekat pangkal helai daun + 5 mm, kemudian ditanam pada media. Semua pekerjaan dilakukan dalam laminar air flow cabinet.

  III.3.4 Pemindahan kultur kalus Botol kultur yang berisi kalus dibuka tutup- nya kemudian mulut botol dibakar. Dengan meng- gunakan scalpel steril, kalus dipindahkan ke dalam media baru. Mulut botol dan tutup alu­ minium masing-masing dibakar, kemudian botol ditutup rapat.

  III.3*5 Pengamatan hasil

  III.-3*-3*l Pemeriksaan makroskopis kalus Pemeriksaan makroskopis kalus me- liputi :

• warna
• tekstur
• organogenesis 111.3.5.2 Pengamatan pertumbuhan kalus

  Parameter pertumbuhan kalus dihya^- takan dengan Indeks Pertumbuhan (IP). Indeks Pertumbuhan didefini- sikan sebagai :

  Bobot basah kalus akhir

  IP = ---------------------- x 100 Bobot basah kalus awal

  Bobot basah kalus akhir ditentukan tiap minggu dengan cara kalus di-

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

  27

  keluarkan dari botol kultur kemudi- an ditimbang. Bobot awal kalus di­ peroleh dengan cara: B ~ B — B av/ ” media + kalus “ media

  111.3.5*3 Pengolahan data Dari data yang diperoleh d^'buat gra­ fik log IP rata-rata terhadap waktu.

  Dengan menghitung persamaan regresi yang dilakukan pada minggu I sampai dengan minggu II, dapat diketahui waktu duplikasi (t^) dari kalus ya-

  . itu dengan menggunakan (28): Persamaan regresi y = bx + a dimana: y = log IP rata-rata x = waktu b = slope _{= —} I * . S > n— n a = y - bx

  2,303 = specific growth rate

  0,693

  t , = ------

  a H

  28 Tabel i. Komposisi kimiawi media Murashige & Skoog

  0,25 CuSỘ 5 h2o 0,025 C o C12. 6 H20

  30000

  Agar 10000 Sukrosa

  2 Thiamin KC1 0,10

  Glisin

  0,50 Piridoksin HC1 0,50

  0,025 FeSỘ. 7 H20 27 ,,80 Na2EDTA. 2 H20 37,30 Mio-inositol 100 Asam nikotinat

  8,60 Na2MoO^# 2 H20

  Komponen Jumlah (mg/1) NH.NO, 4 3

  22,30 ZnSO^* 7 H20

  6,20 MnSỘ 4 H20

  0,83 H,BO, 3 3

  KH2P0if 170 KI

  Mgsộ 7 h2o" 370

  CaCl2. 2 H20 440

  1650 KNO^ 190 0

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Tab.el 2. Rancangan kombinasi zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus Dioscorea

  sp

  Ket: ZPT= Zat pengatur tumbuh ; KM= Kode media * Konsentrasi dalam ppm.

  

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

• D. hispida Daun Klorox 10

  Daun - idem - ^-

  Klorox 40 % 10 menit

  D. pentapnvlla Daun

  Klorox 40 % 10 menit ⁺

  D. batatas Daun

  Daun Klorox 40 % 4 menit ^-

  D. hispida Daun

  Daun HgCl2 10 ppm 10 menit ^-

  D. hispida Daun

  % 20 menit -

  3 D. esculenta Daun Klorox 20

  D. esculenta Daun Klorox 20 % + Tween 2 10 menit

  D. pentaphvlla Daun

  kemudian Klorox 1 % 10 menit

  % 10 menit

  D. pentaphylla Daun Klorox 40 % 4 menit

  Klorox 40 % 4 menit ^-

  D. esculenta Daun

  ► ^-

  D. hispida Daun Klorox 40 % 4 menit

  Cara sterilisasi {eberhasilan

  Jenis Eksplan

  s p .

  IV.1 Sterilisasi Tabel 3* Cara sterilisasi yang digunakan terhadap eksplan Dioscorea

  HASIL PENELITIAN

  30 BAB IV

D. esculenta

• D. esculenta Daun Klorox 20 % 10 menit ^-
• idem -