VALIDASI METODE SPEKTROFLUOROMETRI UNTUK docx
VALIDASI METODE SPEKTROFLUOROMETRI UNTUK
PENENTUAN ALFA TOKOFEROL DALAM MINYAK JAGUNG
VALIDATION OF SPECTROFLUOROMETRIC METHOD
FOR DETERMINATION OF ALPHA TOCOPHEROL IN CORN OIL
Leny Irawati*
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Ujungpandang, Makassar*
(email: irawatileny@yahoo.co.id)
Abstrak
Penentuan kadar alfa tokoferol dalam minyak jagung dapat dilakukan dengan metode spektrofluorometri.
Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung secara
spektrofluorometri berdasarkan parameter linieritas, presisi, akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi.
Linieritas ditentukan dengan mengukur intensitas fluoresensi standar alfa tokoferol pada rentang
0.5-16 mg/L. Presisi ditentukan dengan menghitung koefisien variasi (%RSD) intra dan antar hari.
Akurasi ditentukan berdasarkan hasil perolehan kembali (%Recovery) menggunakan metode spike
sampel . Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ) ditentukan dengan mengukur intensitas
fluoresensi larutan blanko, dimana LOD = X+3SD dan LOQ= X+10SD. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa metode linier pada rentang konsentrasi 0,5-16 mg/L dengan koefisien korelasi 0,998, koefisien
variasi (%RSD) presisi intra dan antar hari kurang dari 5%, akurasi/recovery 99.48-102.55%, limit deteksi
0.007 mg/L, limit kuantitasi 0.17 mg/L dan konsentrasi alfa tokoferol minyak jagung 38.98 ± 0.02 mg/L.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode spektrofluorometri relatif mudah, sensitif, cepat
dan ekonomis untuk penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung.
Kata kunci: Minyak jagung, alfa tokoferol, spektrofluorometri, validasi metode
Abstract
Determination of alpha tocopherol in corn oil can be analyzed by using spectrofluorometric method. This
research aimed to validate Spectrofluorometric method for determination of alpha tocopherol in corn oil.
The method was based on linierity, precicion, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation
(LOQ). The linierity was dermine by measuring fluoroscens intensity of standar alfa tocopherols in range
0.5-16 mg/L. Precicion was determine from %RSD of intra and interday. Acuracy was determine from
recovery of sampel spike method. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) was
determine from fluorescens intensity of the blank. The result show that the method of spektrofluorometric
have a linearity with the correlation coefficient 0.998, %RSD intra and inter-day precicion less than 5%,
accuracy/recovery is 99.48-102.55%, LOD 0.007 mg/L, LOQ 0.17 mg/L, and concentration alpha
tocopherol in corn oil is 38.98 ± 0.02 mg/L. The proposed spectrofluorometric method is simple,
sensitive, fast, and economical for determining alpha tocopherol in corn oil.
Keywords: Corn oil, alpha tocopherol, spectrofluorometric and method validation
1. Pendahuluan
Validasi metode adalah suatu
proses
yang
digunakan
untuk
mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis
yang digunakan untuk suatu uji tertentu
telah sesuai peruntukannya. Hasil dari
validasi metode dapat digunakan untuk
menilai kualitas, reliabilitas dan konsistensi
hasil analisis. (Kalra, 2011).
Suatu metode analisis yang
baku
atau
standar
dapat
memberikan hasil analisis yang
berbeda jika dilakukan oleh
laboratorium yang berbeda. Hal
tersebut disebabkan karena adanya
perbedaan lingkungan kerja, waktu,
tempat,
serta
analis
yang
melaksanakannya. Oleh karena itu
diperlukan evaluasi unjuk kerja dari
metode tersebut. Metode yang
harus divalidasi di laboratorium
sebelum digunakan sebagai metode
dalam analisis rutin antara lain
adalah metode non-standar, metode
yang didisain/dikembangkan oleh
laboratorium, metode standar yang
digunakan diluar ruang lingkup
(rentang) yang ditentukan dan
metode standar yang mengalami
modifikasi (Arifin, 2013)
Parameter yang harus
dipertimbangkan dalam validasi
metode analisis antara lain adalah
spesifisitas, akurasi, presisi, limit
deteksi, limit kuantitasi, linearitas,
rentang dan ketegaran /robustness
(ICH, 2005). Dalam melakukan
validasi metode analisis, tidak
selalu harus mengerjakan semua
parameter validasi. Penentuan
parameter
didasarkan
pada
kesepakatan antara laboratorium
(jika melibatkan lebih dari satu
laboratorium), atau berdasarkan
pada penilaian yang dilakukan oleh
analis yang akan melakukan
validasi (Ajay & Rohit, 2012).
Vitamin E merupakan antioksidan
penting di dalam makanan yang terdapat
dalam delapan senyawaan: yaitu alfa (α),
beta (β), gamma (γ) dan delta (δ) tokoferol
dan α,β,γ dan δ tokotrienol. Alfa tokoferol
memiliki aktifitas vitamin E yang paling
besar, sedangkan alfa tokotrienol memiliki
aktivitas antioksidan yang sangat baik
(Cahoom et al., 2003). Sebagai penangkal
radikal bebas, vitamin E dipercaya
melindungi tubuh dari penyakit generative
khususnya penyakit kanker dan jatung
(Irakli et al., 2012), penyakit arthritis,
penyakit pada hati (liver), proses penuaan,
katarak,
alzheimer dan atherosclerosis
(Hashim et al., 2013). Minyak sayuran
(vegetable oils), kacang-kacangan , sayuran
hijau
dan serealia merupakan sumber
utama vitamin E (Cho, et al. 2007). Minyak
jagung curah mengandung alfa tokoferol
sekitar 0,12%, sedangkan minyak jagung
murni mengandung 0.08% alfa tokoferol
(Corn Revines Assosiation, 2006).
Untuk menentukan kadar alfa
tokoferol dalam makanan dan produk
pangan, beberapa metode telah dilakukan
antara
lain
metode
kolorimetri,
spektrofotometri, kromatografi lapis tipis
dan metode fluorometri (Zaman, et al.
2011).
Metode
tersebut
memiliki
kekurangan seperti memerlukan waktu
lama, perlu keterampilan dan pengalaman
serta
presisi
yang kecil.
Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan metode yang paling umum
digunakan
untuk
identifikasi
dan
kuantifikasi alfa tokoferol. Metode ini
sangat sensitif dan presisi tinggi tetapi
memerlukan biaya yang tidak sedikit
(Razagui et al., 1992).
Kemampuan alfa tokoferol untuk
berfluoresensi digunakan sebagai dasar
untuk penentuan secara kuantitatif, dan
diaplikasikan untuk menentukan alfa
tokoferol dalam sampel matriks biologi
menggunakan alat spektrofluorometer
pertama kali dilakukan oleh Duggan
(1959).
Spektrofluorometer juga telah
digunakan untuk analisis alfa tokoferol
dalam suplemen makanan (Rasagui et al.,
1991), pada minyak zaitun (Sikorska et al.,
2005) dan pada sediaan farmasi (Hossu,
et al., 2009). Keuntungan menggunakan
metode fluoresensi adalah lebih cepat,
prosedurnya lebih sederhana dan relatif
murah dibandingkan metode KCKT (Aoun
et al., 2005). Atas dasar penelitian tersebut,
penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi
metode spektrofluorometri pada penentuan
alfa tokoferol minyak jagung. Manfaat
penelitian ini adalah memperoleh metode
baru untuk analisis alfa tokoferol minyak
yang tervalidasi dan dapat digunakan dalam
analisis rutin di laboratorium.
2. Metode Penelitian
2.1 Lokasi Penelitian
Penelitian
ini
dilakukan
di
laboratorium analisis pangan Jurusan
Teknik
Kimia
Politeknik
Negeri
Ujungpandang.
2.2 Peralatan dan bahan penelitian
Penelitian
ini
menggunakan
instrumen
Spektrofluorometer Shimadzu RF
5301 PC dengan lampu Xenon
sebagai sumber cahaya, kuvet non
fluoresensi, Vorteks VM 300 dan
seperangkat alat gelas. Bahan yang
digunakan adalah standar murni
alfa tokoferol dari Sigma Aldrich
(BM 430,71 g/mol), n- Heksan dari
Merck, dan minyak jagung
komersial.
2.3.Validasi Metode
2.3.1 Pembuatan larutan standar alfa
tokoferol.
Dibuat larutan standar
alfa tokoferol dengan konsentrasi
1000 mg/L dengan pelarut nheksan yang kemudian diencerkan
menjadi 100 mg/L. Larutan standar
ini kemudian diencerkan menjadi
0.5, 1, 2, 4, 8, dan, 16 mg/L.
kemudian dilakukan pengukuran
intensitas
fluoresensi
untuk
menentukan
linearitas, presisi,
akurasi, limit deteksi, dan limit
kuantitasi .
2.3.2 Penentuan λ eksitasi dan λ emisi.
Panjang
gelombang
eksitasi dan emisi ditentukan
dengan membaca spektrum salah
satu standar.
2.3.3 Pembuatan kurva standar dan
penentuan linieritas
Kurva standar dibuat
dengan
mengukur
Intensitas
fluoresensi dari masing-masing
konsentrasi larutan standar seri
sebanyak lima kali ulangan,
kemudian
diplot
terhadap
konsentrasi. Linearitas ditentukan
dari
koefisien korelasi (R)
persamaan garis lurus kurva
standar.
2.3.4 Penentuan Presisi.
Presisi
ditentukan
dengan
mengukur
intensitas
fluoresensi larutan standar 0.5 -16
mg/L secara intra hari dan antar
hari. Untuk intra hari dilakukan
pengukuran sebanyak lima kali
ulangan pada hari yang sama,
sedangkan untuk antar hari
dilakukan lima kali pengukuran
selama lima hari berturut-turut.
Dari
hasil
yang
diperoleh
ditentukan %RSD.
2.3.5 Penentuan Akurasi.
Akurasi
ditentukan
sebagai persen recovery (R%) αtokoferol
standar (spike) yang
ditambahkan terhadap sampel .
Recovery
dilakukan
dengan
menambahkan 1 mg/L, 8 mg/L dan
16 mg/L
α-tokoferol standar
terhadap sampel minyak jagung .
R% = [ ( A – B ) / C ] x 100
A = Konsentrasi spike sampel
B = Konsentrasi sampel.
C = Konsentrasi spike.
2.3.6 Penentuan Limit deteksi dan Limit
kuantitasi.
Limit deteksi dan limit
kuantitasi dihitung berdasarkan
standar deviasi pembacaan blanko
atau standar yang paling dekat
dengan blanko.
LOD = X + 3 SD
LOQ= X + 10 SD
2.3.7 Pengukuran alfa tokoferol minyak
jagung dengan spektrofluorometer.
Sebanyak 1.0 mL sampel
minyak jagung dilarutkan dengan
n- heksan dalam labu ukur 10 mL,
divorteks
selama
5
menit,
dimasukkan ke dalam kuvet non
fluoresensi, lalu diukur intensitas
fluoresensinya sebanyak 5 kali
ulangan.
3. Hasil dan Pembahasan
Pada penelitian ini, konsentrasi alfa
tokoferol
ditentukan
menggunakan
Spektrofluorometer
pada
panjang
gelombang eksitasi 293 nm dan panjang
gelombang emisis 352 nm. Hasil validasi
metode dapat dilihat pada tabel 1 dan kurva
kalibrasi alfa tokoferol dapat dilihat pada
gambar 1.
Tabel 1. Parameter Validasi Metode Untuk
Penentuan Alfa Tokoferol Dalam Minyak
Jagung
Parameter
Linieritas Standar
R
Intersep
Slope
Range (mg/L)
Presisi (%RSD)
Intra hari
Antar hari
Akurasi/recovery
Konsentrasi bawah
Konsentrasi tengah
Konsentrasi atas
Limit Deteksi (mg/L)
Nilai
0.998
3.082
5.771
1-20
3.35
3.35
102.55
100.53
99.48
0.007
Limit Kuantitasi (mg/L)
0.17
Intensitas Fluoresensi
100
f(x) = 5.77x + 3.08
R² = 1
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Konsentrasi
Gambar 1. Kurva kalibrasi alfa tokoferol
Berdasarkan perhitungan
statistik regresi linear diperoleh
nilai koefisien korelasi untuk alfa
tokoferol yaitu 0,998 dengan
persamaan garis y=5,771x+3,082.
Hal ini menunjukkan bahwa
metode analisis alfa tokoferol
menggunakan spektrofluorometer
memiliki linieritas yang baik.
Linieritas
adalah
kemampuan
( dalam rentang penggunaan ) dari
suatu metode untuk memberikan
hasil uji secara proporsional
terhadap kepekatan yang ada.
Linieritas suatu metode harus diuji
untuk
membuktikan
adanya
hubungan yang linier antara
konsentrasi analit dan respon alat,
selain itu linieritas juga dapat
digunakan
untuk
mengetahui
kemampuan
standar
dalam
mendeteksi analit dalam contoh.
Dalam pelaksanaannya linieritas
dapat
ditetapkan
dengan
menggunakan minimal lima sampel
dengan memperhitungkan rentang
konsentrasi
yang
diberikan.
Linieritas atau kecenderungan
korelasi antara dua variabel
(konsentrasi
dan
absorbansi)
biasanya
dinyatakan
dalam
koefisien korelasi (r) yang dapat
dihitung secara statistika. Linieritas
yang baik ditunjukan dengan harga
r yang mendekati satu. Nilai
koefisien korelasi yang memenuhi
persyaratan menurut ICH (1995)
adalah lebih besar dari 0.9970.
18
Presisi adalah kedekatan
beberapa nilai pengukuran dari
sampel yang sama dan diuji secara
berurutan. Menurut metode ICH ,
presisi terbagi tiga yaitu repibilitas,
presisi
antara
(intermadiate
precision) dan reproduksibilitas.
Pada penelitian ini yang digunakan
adalah repibilitas dan salah satu
bagian dari presisi antara yaitu
perbedaan
hari.
Repibilitas
dinyatakan sebagai hasil presisi
pada perlakuan yang sama (analis
dan alat yang sama) dalam interval
waktu pemeriksaan yang singkat.
Pada penentuan presisi intra hari,
yaitu pengukuran sebanyak lima
kali ulangan pada hari yang sama
dipeoleh nilai RSD < 5, demikian
pula pada penentuan presisi antar
hari, yaitu pengukuran selama lima
hari berturut-turut juga diperoleh
nilai RSD
PENENTUAN ALFA TOKOFEROL DALAM MINYAK JAGUNG
VALIDATION OF SPECTROFLUOROMETRIC METHOD
FOR DETERMINATION OF ALPHA TOCOPHEROL IN CORN OIL
Leny Irawati*
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Ujungpandang, Makassar*
(email: irawatileny@yahoo.co.id)
Abstrak
Penentuan kadar alfa tokoferol dalam minyak jagung dapat dilakukan dengan metode spektrofluorometri.
Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung secara
spektrofluorometri berdasarkan parameter linieritas, presisi, akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi.
Linieritas ditentukan dengan mengukur intensitas fluoresensi standar alfa tokoferol pada rentang
0.5-16 mg/L. Presisi ditentukan dengan menghitung koefisien variasi (%RSD) intra dan antar hari.
Akurasi ditentukan berdasarkan hasil perolehan kembali (%Recovery) menggunakan metode spike
sampel . Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ) ditentukan dengan mengukur intensitas
fluoresensi larutan blanko, dimana LOD = X+3SD dan LOQ= X+10SD. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa metode linier pada rentang konsentrasi 0,5-16 mg/L dengan koefisien korelasi 0,998, koefisien
variasi (%RSD) presisi intra dan antar hari kurang dari 5%, akurasi/recovery 99.48-102.55%, limit deteksi
0.007 mg/L, limit kuantitasi 0.17 mg/L dan konsentrasi alfa tokoferol minyak jagung 38.98 ± 0.02 mg/L.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode spektrofluorometri relatif mudah, sensitif, cepat
dan ekonomis untuk penentuan alfa tokoferol dalam minyak jagung.
Kata kunci: Minyak jagung, alfa tokoferol, spektrofluorometri, validasi metode
Abstract
Determination of alpha tocopherol in corn oil can be analyzed by using spectrofluorometric method. This
research aimed to validate Spectrofluorometric method for determination of alpha tocopherol in corn oil.
The method was based on linierity, precicion, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation
(LOQ). The linierity was dermine by measuring fluoroscens intensity of standar alfa tocopherols in range
0.5-16 mg/L. Precicion was determine from %RSD of intra and interday. Acuracy was determine from
recovery of sampel spike method. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) was
determine from fluorescens intensity of the blank. The result show that the method of spektrofluorometric
have a linearity with the correlation coefficient 0.998, %RSD intra and inter-day precicion less than 5%,
accuracy/recovery is 99.48-102.55%, LOD 0.007 mg/L, LOQ 0.17 mg/L, and concentration alpha
tocopherol in corn oil is 38.98 ± 0.02 mg/L. The proposed spectrofluorometric method is simple,
sensitive, fast, and economical for determining alpha tocopherol in corn oil.
Keywords: Corn oil, alpha tocopherol, spectrofluorometric and method validation
1. Pendahuluan
Validasi metode adalah suatu
proses
yang
digunakan
untuk
mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis
yang digunakan untuk suatu uji tertentu
telah sesuai peruntukannya. Hasil dari
validasi metode dapat digunakan untuk
menilai kualitas, reliabilitas dan konsistensi
hasil analisis. (Kalra, 2011).
Suatu metode analisis yang
baku
atau
standar
dapat
memberikan hasil analisis yang
berbeda jika dilakukan oleh
laboratorium yang berbeda. Hal
tersebut disebabkan karena adanya
perbedaan lingkungan kerja, waktu,
tempat,
serta
analis
yang
melaksanakannya. Oleh karena itu
diperlukan evaluasi unjuk kerja dari
metode tersebut. Metode yang
harus divalidasi di laboratorium
sebelum digunakan sebagai metode
dalam analisis rutin antara lain
adalah metode non-standar, metode
yang didisain/dikembangkan oleh
laboratorium, metode standar yang
digunakan diluar ruang lingkup
(rentang) yang ditentukan dan
metode standar yang mengalami
modifikasi (Arifin, 2013)
Parameter yang harus
dipertimbangkan dalam validasi
metode analisis antara lain adalah
spesifisitas, akurasi, presisi, limit
deteksi, limit kuantitasi, linearitas,
rentang dan ketegaran /robustness
(ICH, 2005). Dalam melakukan
validasi metode analisis, tidak
selalu harus mengerjakan semua
parameter validasi. Penentuan
parameter
didasarkan
pada
kesepakatan antara laboratorium
(jika melibatkan lebih dari satu
laboratorium), atau berdasarkan
pada penilaian yang dilakukan oleh
analis yang akan melakukan
validasi (Ajay & Rohit, 2012).
Vitamin E merupakan antioksidan
penting di dalam makanan yang terdapat
dalam delapan senyawaan: yaitu alfa (α),
beta (β), gamma (γ) dan delta (δ) tokoferol
dan α,β,γ dan δ tokotrienol. Alfa tokoferol
memiliki aktifitas vitamin E yang paling
besar, sedangkan alfa tokotrienol memiliki
aktivitas antioksidan yang sangat baik
(Cahoom et al., 2003). Sebagai penangkal
radikal bebas, vitamin E dipercaya
melindungi tubuh dari penyakit generative
khususnya penyakit kanker dan jatung
(Irakli et al., 2012), penyakit arthritis,
penyakit pada hati (liver), proses penuaan,
katarak,
alzheimer dan atherosclerosis
(Hashim et al., 2013). Minyak sayuran
(vegetable oils), kacang-kacangan , sayuran
hijau
dan serealia merupakan sumber
utama vitamin E (Cho, et al. 2007). Minyak
jagung curah mengandung alfa tokoferol
sekitar 0,12%, sedangkan minyak jagung
murni mengandung 0.08% alfa tokoferol
(Corn Revines Assosiation, 2006).
Untuk menentukan kadar alfa
tokoferol dalam makanan dan produk
pangan, beberapa metode telah dilakukan
antara
lain
metode
kolorimetri,
spektrofotometri, kromatografi lapis tipis
dan metode fluorometri (Zaman, et al.
2011).
Metode
tersebut
memiliki
kekurangan seperti memerlukan waktu
lama, perlu keterampilan dan pengalaman
serta
presisi
yang kecil.
Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
merupakan metode yang paling umum
digunakan
untuk
identifikasi
dan
kuantifikasi alfa tokoferol. Metode ini
sangat sensitif dan presisi tinggi tetapi
memerlukan biaya yang tidak sedikit
(Razagui et al., 1992).
Kemampuan alfa tokoferol untuk
berfluoresensi digunakan sebagai dasar
untuk penentuan secara kuantitatif, dan
diaplikasikan untuk menentukan alfa
tokoferol dalam sampel matriks biologi
menggunakan alat spektrofluorometer
pertama kali dilakukan oleh Duggan
(1959).
Spektrofluorometer juga telah
digunakan untuk analisis alfa tokoferol
dalam suplemen makanan (Rasagui et al.,
1991), pada minyak zaitun (Sikorska et al.,
2005) dan pada sediaan farmasi (Hossu,
et al., 2009). Keuntungan menggunakan
metode fluoresensi adalah lebih cepat,
prosedurnya lebih sederhana dan relatif
murah dibandingkan metode KCKT (Aoun
et al., 2005). Atas dasar penelitian tersebut,
penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi
metode spektrofluorometri pada penentuan
alfa tokoferol minyak jagung. Manfaat
penelitian ini adalah memperoleh metode
baru untuk analisis alfa tokoferol minyak
yang tervalidasi dan dapat digunakan dalam
analisis rutin di laboratorium.
2. Metode Penelitian
2.1 Lokasi Penelitian
Penelitian
ini
dilakukan
di
laboratorium analisis pangan Jurusan
Teknik
Kimia
Politeknik
Negeri
Ujungpandang.
2.2 Peralatan dan bahan penelitian
Penelitian
ini
menggunakan
instrumen
Spektrofluorometer Shimadzu RF
5301 PC dengan lampu Xenon
sebagai sumber cahaya, kuvet non
fluoresensi, Vorteks VM 300 dan
seperangkat alat gelas. Bahan yang
digunakan adalah standar murni
alfa tokoferol dari Sigma Aldrich
(BM 430,71 g/mol), n- Heksan dari
Merck, dan minyak jagung
komersial.
2.3.Validasi Metode
2.3.1 Pembuatan larutan standar alfa
tokoferol.
Dibuat larutan standar
alfa tokoferol dengan konsentrasi
1000 mg/L dengan pelarut nheksan yang kemudian diencerkan
menjadi 100 mg/L. Larutan standar
ini kemudian diencerkan menjadi
0.5, 1, 2, 4, 8, dan, 16 mg/L.
kemudian dilakukan pengukuran
intensitas
fluoresensi
untuk
menentukan
linearitas, presisi,
akurasi, limit deteksi, dan limit
kuantitasi .
2.3.2 Penentuan λ eksitasi dan λ emisi.
Panjang
gelombang
eksitasi dan emisi ditentukan
dengan membaca spektrum salah
satu standar.
2.3.3 Pembuatan kurva standar dan
penentuan linieritas
Kurva standar dibuat
dengan
mengukur
Intensitas
fluoresensi dari masing-masing
konsentrasi larutan standar seri
sebanyak lima kali ulangan,
kemudian
diplot
terhadap
konsentrasi. Linearitas ditentukan
dari
koefisien korelasi (R)
persamaan garis lurus kurva
standar.
2.3.4 Penentuan Presisi.
Presisi
ditentukan
dengan
mengukur
intensitas
fluoresensi larutan standar 0.5 -16
mg/L secara intra hari dan antar
hari. Untuk intra hari dilakukan
pengukuran sebanyak lima kali
ulangan pada hari yang sama,
sedangkan untuk antar hari
dilakukan lima kali pengukuran
selama lima hari berturut-turut.
Dari
hasil
yang
diperoleh
ditentukan %RSD.
2.3.5 Penentuan Akurasi.
Akurasi
ditentukan
sebagai persen recovery (R%) αtokoferol
standar (spike) yang
ditambahkan terhadap sampel .
Recovery
dilakukan
dengan
menambahkan 1 mg/L, 8 mg/L dan
16 mg/L
α-tokoferol standar
terhadap sampel minyak jagung .
R% = [ ( A – B ) / C ] x 100
A = Konsentrasi spike sampel
B = Konsentrasi sampel.
C = Konsentrasi spike.
2.3.6 Penentuan Limit deteksi dan Limit
kuantitasi.
Limit deteksi dan limit
kuantitasi dihitung berdasarkan
standar deviasi pembacaan blanko
atau standar yang paling dekat
dengan blanko.
LOD = X + 3 SD
LOQ= X + 10 SD
2.3.7 Pengukuran alfa tokoferol minyak
jagung dengan spektrofluorometer.
Sebanyak 1.0 mL sampel
minyak jagung dilarutkan dengan
n- heksan dalam labu ukur 10 mL,
divorteks
selama
5
menit,
dimasukkan ke dalam kuvet non
fluoresensi, lalu diukur intensitas
fluoresensinya sebanyak 5 kali
ulangan.
3. Hasil dan Pembahasan
Pada penelitian ini, konsentrasi alfa
tokoferol
ditentukan
menggunakan
Spektrofluorometer
pada
panjang
gelombang eksitasi 293 nm dan panjang
gelombang emisis 352 nm. Hasil validasi
metode dapat dilihat pada tabel 1 dan kurva
kalibrasi alfa tokoferol dapat dilihat pada
gambar 1.
Tabel 1. Parameter Validasi Metode Untuk
Penentuan Alfa Tokoferol Dalam Minyak
Jagung
Parameter
Linieritas Standar
R
Intersep
Slope
Range (mg/L)
Presisi (%RSD)
Intra hari
Antar hari
Akurasi/recovery
Konsentrasi bawah
Konsentrasi tengah
Konsentrasi atas
Limit Deteksi (mg/L)
Nilai
0.998
3.082
5.771
1-20
3.35
3.35
102.55
100.53
99.48
0.007
Limit Kuantitasi (mg/L)
0.17
Intensitas Fluoresensi
100
f(x) = 5.77x + 3.08
R² = 1
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Konsentrasi
Gambar 1. Kurva kalibrasi alfa tokoferol
Berdasarkan perhitungan
statistik regresi linear diperoleh
nilai koefisien korelasi untuk alfa
tokoferol yaitu 0,998 dengan
persamaan garis y=5,771x+3,082.
Hal ini menunjukkan bahwa
metode analisis alfa tokoferol
menggunakan spektrofluorometer
memiliki linieritas yang baik.
Linieritas
adalah
kemampuan
( dalam rentang penggunaan ) dari
suatu metode untuk memberikan
hasil uji secara proporsional
terhadap kepekatan yang ada.
Linieritas suatu metode harus diuji
untuk
membuktikan
adanya
hubungan yang linier antara
konsentrasi analit dan respon alat,
selain itu linieritas juga dapat
digunakan
untuk
mengetahui
kemampuan
standar
dalam
mendeteksi analit dalam contoh.
Dalam pelaksanaannya linieritas
dapat
ditetapkan
dengan
menggunakan minimal lima sampel
dengan memperhitungkan rentang
konsentrasi
yang
diberikan.
Linieritas atau kecenderungan
korelasi antara dua variabel
(konsentrasi
dan
absorbansi)
biasanya
dinyatakan
dalam
koefisien korelasi (r) yang dapat
dihitung secara statistika. Linieritas
yang baik ditunjukan dengan harga
r yang mendekati satu. Nilai
koefisien korelasi yang memenuhi
persyaratan menurut ICH (1995)
adalah lebih besar dari 0.9970.
18
Presisi adalah kedekatan
beberapa nilai pengukuran dari
sampel yang sama dan diuji secara
berurutan. Menurut metode ICH ,
presisi terbagi tiga yaitu repibilitas,
presisi
antara
(intermadiate
precision) dan reproduksibilitas.
Pada penelitian ini yang digunakan
adalah repibilitas dan salah satu
bagian dari presisi antara yaitu
perbedaan
hari.
Repibilitas
dinyatakan sebagai hasil presisi
pada perlakuan yang sama (analis
dan alat yang sama) dalam interval
waktu pemeriksaan yang singkat.
Pada penentuan presisi intra hari,
yaitu pengukuran sebanyak lima
kali ulangan pada hari yang sama
dipeoleh nilai RSD < 5, demikian
pula pada penentuan presisi antar
hari, yaitu pengukuran selama lima
hari berturut-turut juga diperoleh
nilai RSD