Optimasi pemisahan campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek X menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository

  

OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT

DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X”

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

  

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Henny Puspitasari

  NIM: 068114045

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  

OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT

DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X”

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

  

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Henny Puspitasari

  NIM: 068114045

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  Life is… Life is an opportunity, benefit from it Life is beauty, admire it

  Life is a dream, realize it Life is a challenge, meet it Life is a duty, complete it Life is a game, play it

  Life is a promise, fulfill it Life is a sorrow, overcome it Life is a song, sing it Life is a struggle, accept it

  Life is a tragedy, confront it Life is a adventure, dare it Life is a luck, make it Life is too precious, don’t destroy it

  Life is life, fight for it (Mother Theresa) Karya ini kupersembahkan bagi Kemuliaan Tuhan, Mama, Papa, kakak-kakakku yang luar biasa; teman-teman dan Almamaterku

KATA PENGANTAR

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang penuh kasih, hanya karena berkat dan kasih karunia-Nya maka skripsi yang berjudul “OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X” MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK” ini dapat diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikannya, maka pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktunya dalam memberikan masukan, kritik, solusi, semangat baik selama penelitian, penyusunan skripsi maupun saat perkuliahan dan telah membantu penulis dalam mendapatkan senyawa standar yang berguna dalam penelitian.

  3. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran, kritik dan semangat dalam penyusunan skripsi ini.

  4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan dan semangat baik selama penyusunan skripsi maupun dalam perkuliahan.

  5. Jeffry Julianus, M.Si. dan Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. atas saran dan diskusi yang telah diberikan dalam penyusunan skripsi.

  6. PT. Kalbe Farma, Tbk. yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang berguna dalam penelitian.

  7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga sehingga berguna dalam proses penyusunan skripsi.

  8. Happy Suryawan E.W., S.Farm. yang telah memberikan saran dan semangat dalam penyusunan skripsi.

  9. Oktavianus Tri Harjanto selaku teman seperjuangan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  10. Seluruh staf laboratorium kimia: Bimo, Kunto, Parlan, dan Kasiran yang telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

  11. Hendro, Hendri, Hendra dan Hendiwan terimakasih telah menjadi kakak- kakak yang hebat bagi penulis.

  12. Novita Dewi atas semangat dan pengertian yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  13. Lise Natalia atas pinjaman laporan yang sangat berguna selama perkuliahan, 14. Deden atas pinjaman printer warna.

  15. Marissa Winata, Vita Felicia, Handayani atas dukungan, kritik, masukan dan saran selama penelitian maupun kuliah.

  16. Yola, Adit, Nia, Lulu, Shinta, Yosephine, Lia Yumi, Ardani, Robby, Wilasto, Utami, Nika, Rico, Reni dan Linda sebagai teman yang sering satu kelompok telah memberikan pengetahuan, pengalaman berharga, dan semangat untuk ujian skripsi.

  17. Jimmy, Eka, Irene, Wiwit, Nisia, Yuvita, dan Bayu terima kasih atas pengalaman dan kebersamaanya.

  18. Teman-teman kos putri 9999 dan kos kana yang pernah menjadi teman seperjuangan di Yogyakarta.

  19. Teman-teman FST angkatan 2006 atas pengalaman dan kebersamaannya.

  20. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak tertulis di sini, terima kasih atas semua bantuannya.

  Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih banyak memiliki kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan dan perkembangan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat demi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 2 November 2009 Penulis

  

Intisari

  Krim kloramfenikol dan hidrokortison asetat merupakan obat yang memiliki fungsi sebagai obat dermatitis dan anti infeksi. Kedua zat aktif tersebut dapat terdegradasi menjadi produk yang tidak diinginkan dalam penyimpanannya. Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan sekaligus menetapkan kadar kedua zat aktif tersebut adalah metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan detektor UV.

  Sistem KCKT yang digunakan adalah kolom Kromasil-100 C 250 x 4,6

  18

  mm, 5µm, fase gerak campuran metanol-aquabides dengan menggunakan detektor UV pada 255 nm. Parameter yang dioptimasi adalah komposisi fase gerak yaitu metanol-aquabides dan flow rate. Hasil penelitian menunjukkan kondisi pemisahan yang baik dicapai pada fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) dengan flow rate 1,2 ml/menit. Semua komponen terpisah baik dalam waktu analisis kurang dari 10 menit.

  Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, linearity, spesifisitas, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ). Hasil penelitian menunjukkan metode memiliki linearity yang baik pada konsentrasi 10

• – 70 ppm untuk kloramfenikol (r = 0,9998) dan 12,5 – 87,5 ppm untuk hidrokortison asetat (r = 0,9999). Recovery dan CV untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turut dari kloramfenikol adalah 100,5 %, 1,00 % ; 100,53 %, 0,79 % ; 100,00 %, 1,47 % dan untuk hidrokortison asetat adalah 100,47%, 1,14 % ; 99,44 %, 1,34 % ; dan 99,63 %, 0,62 %. Nilai LOD dan LOQ untuk kloramfenikol 1,28 ; 4,28 ppm dan hidrokortison asetat 1,44 ; 4,81ppm. Kata kunci : hidrokortison asetat, kloramfenikol, KCKT, validasi

  

Abstract

  Chloramphenicol and hydrocortisone acetate cream are possessed of dermatitis and antiinfection functions. The both active ingredients can be degradated to unwanted product in storage. The method that can be use for separating and quantifying those two active ingredient is Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with UV detector.

  The HPLC system were Kromasil-100 C

  18 250 x 4.6 mm, 5 µm column,

  mobile phase of methanol-water and UV detector at 255 nm. Optimizing parameters were mobile phase; methanol-water composition and flow rate. The result show conditions to get a good separation were methanol : water (63 : 35 v/v) mobile phase with the flow rate 1.2 ml/menit. All the component were fully resolved in less than 10 minutes.

  Validation parameters studied included accuracy, precision, sensitivity, Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ). The research result showed that the method have good linearity in the range 10 – 70 ppm for chloramphenicol (r = 0.9998) and 12.5 – 87.5 ppm for hydrocortisone acetate (r = 0.9999). The recovery and CV of low, medium and high consentration were 100.5 %, 1.00 % ; 100.53 %, 0.79 % ; 100.00 %, 1.47 % for chloramphenicol and 100.47 %, 1.14% ; 99.44 %, 1.34 % ; 99.63, 0.62 % for hydrocortisone acetate.

  Value of LOD and LOQ were 1.28 ; 4.28 ppm for chloramphenicol dan 1.44 ; 4.81 ppm for hydrocortisone acetate.

  Keywords: hydrocortisone acetate, chloramphenicol, HPLC, validaton

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................ v KATA PENGANTAR .................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

  INTISARI ...................................................................................................... x

  

ABSTRACT .................................................................................................... xi

  DAFTAR ISI ................................................................................................. xii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xx

  1 BAB I PENGANTAR ..................................................................................

  A. Latar Belakang ..................................................................................

  1 1. Permasalahan...............................................................................

  3 2. Keaslian Penelitian ......................................................................

  4 3. Manfaat Penelitian ......................................................................

  4 B. Tujuan Penelitian ..............................................................................

  4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .........................................................

  5 A. Hidrokortison Asetat .........................................................................

  5 B. Kloramfenikol ...................................................................................

  7 1. Antibiotik ....................................................................................

  7 2. Sifat Kimia ..................................................................................

  8 C. Krim ..................................................................................................

  9 D. Spektrofotometer UV ........................................................................

  10 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................

  13 1. Kromatografi Partisi Fase Terbalik .............................................

  13 2. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi .....................................

  15 3. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif ................................

  22 F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental .........................................

  23 1. Akurasi ........................................................................................

  23 2. Presisi ..........................................................................................

  23 3. Linieritas .....................................................................................

  24 4. Spesifisitas ..................................................................................

  24 G. Landasan Teori ..................................................................................

  25 H. Hipotesis ...........................................................................................

  25 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................

  26 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................

  26 B. Variabel Penelitian ............................................................................

  26 1. Variabel Utama ...........................................................................

  26

  2. Variabel Pengacau Terkendali ....................................................

  26 C. Bahan-bahan Penelitian .....................................................................

  27 D. Alat-alat Penelitian ............................................................................

  27 E. Tata Cara Penelitian ..........................................................................

  28 1. Optimasi Metode KCKT .............................................................

  28 2. Verifikasi sistem KCKT ..............................................................

  30 3. Validasi Metode ..........................................................................

  31 F. Analisis Hasil ...................................................................................

  33 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

  34 A. Optimasi Metode ..............................................................................

  34 1. Penentuan panjang gelombang overlapping ..............................

  34

  2. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol baku .....................................................................

  36

  3. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam sampel .......................................................

  41 4. Optimasi fase gerak .....................................................................

  43 B. Verifikasi Sistem KCKT Hasil Optimasi ..........................................

  55 1. Verifikasi sistem injeksi ..............................................................

  55 2. Uji kesesuaian sistem ..................................................................

  56 3. Verifikasi pompa .........................................................................

  57 C. Pembuatan Kurva Baku.....................................................................

  58

  D. Validasi Metode Penetapan Kadar Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol ...................................................................................

  62 1. Linearity ......................................................................................

  62 2. Kecermatan (akurasi) ..................................................................

  62 3. Keseksamaan (presisi) .................................................................

  64 4. Spesifisitas .................................................................................

  64 5. Batas deteksi dan batas kuantitasi ...............................................

  65 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................

  66 A. Kesimpulan .......................................................................................

  66 B. Saran ..................................................................................................

  67 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

  68 LAMPIRAN ..................................................................................................

  72 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 126

  DAFTAR TABEL Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT ..........................

  14 Tabel II. Pemisahan yang diinginkan dalam metode KCKT ...............

  23 Tabel III. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) ................................................................

  47 Tabel IV. Hasil optimasi komposisi fase gerak pada flow rate 2 ml/menit ................................................................................

  53 Tabel V. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) ................................................................

  53 Tabel VI. Hasil uji kesesuaian sistem dan verifikasi presisi sistem injeksi KCKT .............................................................

  56 Tabel VII. Nilai persen penyimpangan flow rate pada uji akurasi pompa ....................................................................................

  58 Tabel VIII. Data kurva baku kloramfenikol .............................................

  59 Tabel IX. Data kurva baku hidrokortison asetat ....................................

  60 Tabel X. Hasil penetapan recovery dan CV hidrokortison asetat .........

  63 Tabel XI. Hasil penetapan recovery dan CV kloramfenikol..................

  63

  DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Rumus struktur hidrokortison asetat .....................................

  5 Gambar 2. Rumus struktur kloramfenikol ..............................................

  8 Gambar 3. Pemisahan dua senyawa ........................................................

  16 Gambar 4. Difusi Eddy ...........................................................................

  19 Gambar 5. Transfer massa fase diam ......................................................

  20 Gambar 6. Transfer massa fase gerak .....................................................

  20 Gambar 7. Penentuan peak asymmetry dan peak tailing factor .............

  21 Gambar 8. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam ..................

  21 Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom kloramfenikol dan hidrokortison asetat ...............................................................

  34 Gambar 10. Spektra panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat dan kloramfenikol .......................................................

  35 Gambar 11. Ikatan hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak metanol : aquabides ...............................................................

  37 Gambar 12. Ikatan hidrogen antara hidrokortison asetat dengan fase gerak metanol : aquabides .....................................................

  37 Gambar 13. Gugus nonpolar kloramfenikol .............................................

  38 Gambar 14. Gugus nonpolar hidrokortison asetat ...................................

  38 Gambar 15. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol baku dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi .................................

  39

  Gambar 16. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol dan hidrokortison asetat dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi ........................................................................

  40 Gambar 17. Kromatogram sampel ditambah baku kloramfenikol ............

  41 Gambar 18. Kromatogram waktu retensi sampel dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi ..................................................

  43 Gambar 19. Sturktur hidrokortison dan hidrokortison asetat ....................

  45 Gambar 20. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap kedua ........

  46 Gambar 21. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap ketiga .......

  48 Gambar 22. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap keempat ....

  49 Gambar 23. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,8 ml/menit ...........................................................

  50 Gambar 24. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,6 ml/menit ...........................................................

  50 Gambar 25. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,4 ml/menit ...........................................................

  51 Gambar 26. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,2 ml/menit ...........................................................

  51 Gambar 27. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,0 ml/menit ...........................................................

  52 Gambar 28. Kurva flow rate vs HETP dengan fase gerak metanol : aquabides (65 :35) .................................................................

  54 Gambar 29. Kurva teori Van Deemter ......................................................

  54

  Gambar 30. Hubungan antara konsentrasi kloramfenikol dengan AUC / 10000 (replikasi I) .....................................................

  60 Gambar 31. Hubungan antara konsentrasi hidrokortison asetat dengan AUC / 15000 (replikasi I) .........................................

  61

  DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Sertifikat analisis hidrokortison asetat ...............................

  73 Lampiran 2. Sertifikat analisis kloramfenikol ........................................

  74 Lampiran 3. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol .....................................................................

  75 Lampiran 4. Kromatogram baku kloramfenikol .....................................

  76 Lampiran 5. Contoh perhitungan N, HETP dan Rs ................................

  77 Lampiran 6. Kromatogram hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40 v/v) .......................................

  78 Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) .......................................

  81 Lampiran 8. Kromatogram dan hasil penetapan presisi injeksi ..............

  90 Lampiran 9. Kromatogram kurva baku hidrokortison asetat dan kloramfenikol replikasi I .................................................... 101 Lampiran 10. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku .................................................................................... 108 Lampiran 11. Kromatogram hasil validasi metode................................... 110 Lampiran 12. Data penimbangan dan contoh perhitungan penetapan recovery............................................................. 119 Lampiran 13. Contoh perhitungan LOD dan LOQ ................................... 123

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Hidrokortison asetat merupakan obat dermatitis dengan tingkat potensi

  lemah yang sering digunakan masyarakat. Jika pada dermatitis tersebut ditemukan adanya infeksi bakteri, maka dapat diberikan antibiotik (Anonim, 2006).

  Kombinasi obat dermatitis dan antibiotik akan memberikan penyembuhan yang sukses tanpa menyebabkan komplikasi (Orosz et al., 2007). Salah satu antibiotik yang digunakan bersamaan dengan obat dermatitis adalah kloramfenikol.

  Pada penyimpanan lama hidrokortison asetat akan terurai menjadi senyawa turunannya yaitu hidrokortison dan kortison asetat (Hajkova et al., 2003). Chauhan dan Conway (2005) menyatakan bahwa produk degradasi hidrokortison alkohol juga dapat terjadi dalam sediaan farmasi.

  Kloramfenikol merupakan antimikroba spektrum luas yang efektif terhadap bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Mekanisme kerjanya adalah menghambat sintesis protein sel mikroba (Anonim, 2009b). Kloramfenikol dalam penyimpanannya dapat terdegradasi membentuk produk-produk yang tidak diinginkan. Produk degradasi kloramfenikol pada berbagai pH (1-14) yang paling banyak dijumpai adalah produk oksidasi: p-nitrobenzaldehid, produk reduksi: arilamin (Shih, 1979) dan produk hidrolisis: 2-amino-1-(4-nitrophenyl)-propane- 1,3-diol (Khalil et al, 1993). Penetapan kadar hidrokortison dan kloramfenikol dalam sediaan tetes telinga dengan metode KCKT fase terbalik pernah dilakukan oleh Li X (1998). Fase diam yang digunakan adalah kolom YWG-C

  18 150 x 5 mm, 5 µm dan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40).

  Hal yang membedakan penelitian ini dengan penelitian Li X (1998) antara lain: dalam penelitian ini akan ditetapkan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol sedangkan Li X hidrokortison dan kloramfenikol, sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah krim sedangkan Li X tetes telinga, merek kolom yang digunakan dalam penelitian ini adalah Kromasil dengan panjang 25 cm sedangkan Li X menggunakan kolom YWG dengan panjang 15 cm. Adanya perbedaan tersebut menyebabkan metode Li X tidak dapat digunakan untuk penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim karena kondisi optimal pada penelitian Li X belum tentu memberikan kondisi optimal pada penelitian ini. Hal tersebut menjadi dasar dilakukannya penelitian optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut dengan dengan fase gerak campuran metanol dan aquabides untuk mendapatkan kondisi optimal dan metode tervalidasi yang dapat menetapkan kadar kedua komponen tersebut secara simultan.

  Validasi metode merupakan proses yang dilakukan melalui penelitian laboratorium untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode itu memenuhi persyaratan aplikasi analitik yang dimaksudkan. Jenis karakteristik kinerja metode yang perlu dipertimbangkan dalam validasi meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, limit deteksi, limit kuantitasi, linearity, range dan robustness (Anonim, 2007). Metode KCKT fase terbalik dipilih karena dengan metode ini diharapkan dapat dilakukan untuk pemisahan kloramfenikol dan hidrokortison asetat sekaligus penetapan kadar tiap zat aktif tersebut dalam campuran.

  1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan sebagai berikut: a. Apakah terdapat kondisi yang optimal untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan dengan metode KCKT fase terbalik menggunakan kolom C

  18 dan fase gerak

  campuran metanol-aquabides?

  b. Apakah metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan memiliki validitas yang baik?

  2. Keaslian Penelitian

  Metode analisis multikomponen dari campuran hidrokortison dan kloramfenikol dalam tetes telinga pernah dilakukan oleh Li X dengan metode KCKT dengan menggunakan kolom YWG-C column (5µm, 5 mm x 150 mm)

  18 o

  pada suhu 30 C dan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40). Namun optimasi penetapan kadar campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim dengan metode KCKT menggunakan kolom Kromasil-C

  18 100 250 x 4,6 mm i.d., 5 µm dan fase gerak campuran aquabides dan metanol belum pernah dilakukan.

3. Manfaat Penelitian

  a. Manfaat metodologis. Dapat menghasilkan sumbangan ilmiah mengenai metode pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol secara simultan.

  b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode untuk analisis campuran multikomponen hidrokortison asetat dan kloramfenikol.

B. Tujuan Penelitian

  1. Mengetahui kondisi yang optimal untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” menggunakan fase gerak campuran metanol-aquabides secara simultan dengan metode KCKT.

  2. Mengetahui validitas metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan.

  

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Hidrokortison Asetat

Hidrokortison asetat (Gambar 1) adalah suatu senyawa antiradang dari

  golongan kortikosteroid yang sangat efektif untuk pengobatan pada kulit. Pada penyakit kulit yang disebabkan oleh alergi, krim hidrokortison asetat akan segera memberi efek berkurangnya: radang, rasa gatal dan sakit (Anonim, 2009a). _{HO O HO O O O}

_{H H}

H

  Gambar 1. Rumus struktur hidrokortison asetat

  Hidrokortison asetat mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 102,0% C

23 H

  32 O 6 , dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Serbuk

  hablur putih hingga praktis putih, tidak berbau. Hidrokortison asetat dalam metanol memberikan serapan maksimum pada λ 242 nm (Anonim, 1995). Satu mg hidrokortison asetat dapat larut dalam 100 ml air dan 3,9 mg dapat larut dalam 1 ml metanol (Anonim, 1989). Hidrokortison asetat dapat diekstraksi dari larutan netral dengan menggunakan etil asetat yang baru didistilasi (Clarke, 1986).

  Hidrokortison asetat dalam sediaan farmasi akan terdegradasi menjadi hidrokortison alkohol. Metode KCKT telah dilakukan untuk mengukur kadar hidrokortison asetat, hidrokortison alkohol, metil paraben dan propil paraben memiliki selektivitas dan spesifisitas adalah Zorbax SB-Phenyl. Analisis dilakukan dalam waktu kurang dari 15 menit dengan fase gerak campuran aquabides dan metanol (40 : 60 v/v) menggunakan detektor UV pada 254 nm (Chauhan dan Conway, 2005).

  Penetapan kadar hidrokortison asetat dan turunannya pernah dilakukan oleh Kamata et al (1982) menggunakan sitem KCKT fase normal dengan fase diam Zorbak SIL Column dan fase gerak etanol : kloroform : heksan (1 : 2 : 7).

  

Linearity metode ditunjukkan pada range kadar 0,01-0,1 µg dan nilai recovery

(dengan metode standar adisi) sebesar 91,0-98,2 %.

  Analisis hidrokortison asetat dalam sediaan farmasi menggunakan metode spektrofotometri kinetik dengan partial least-squares regression pernah dilakukan oleh Blanco et al. (1999). Metode ini memiliki akurasi dan presisi yang baik, namun metode ini tidak praktis dan memerlukan waktu yang cukup lama.

  Metode kolorimetri juga dapat digunakan untuk menetapkan kadar hidrokortison asetat, yaitu melalui reaksi dengan fenilhidrazin dalam suasana asam selama 20 menit pada suhu 60

  C. Senyawa berwarna yang terbentuk diukur pada 410 nm (Bartos dan Pesez, 1979).

  Penetapan kadar hidrokortison asetat, produk degradasinya yaitu hidrokortison dan kortison asetat serta metil paraben dan propil paraben dalam krim topikal dengan menggunakan dexametason sebagai internal standar telah dilakukan dengan menggunakan metode KCKT. Sistem KCKT yang digunakan adalah kolom 5 µm SUPELCO Discovery C 125 x 4 mm i.d. dan fase gerak

  18 campuran metanol, asetonitril, dan aquabides (15 : 27 : 58 v/v) dengan waktu analisis kurang dari 13 menit (Hajkova et al., 2003).

  Penetapan kadar kortikosteroid pernah dilakukan oleh Singh dan Verma (2008) dengan metode spektrofotometri visibel. Metode ini menggunakan Fe (III) sebagai agen pengoksidasi kortikosteroid sehingga akan dihasilkan Fe (II) yang kemudian akan dikompleksasi dengan potassium heksasianoferat membentuk warna biru hijau yang akan diukur absorbansinya pada 780 nm. Nilai standar deviasi dari metode ini berkisar antara 0,03-1,06 %. Metode ini dikatakan memiliki akurasi dan presisi yang baik serta waktu analisis yang cepat.

B. Kloramfenikol

1. Antibiotik

  Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba terutama fungi, yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotik yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Sifat antibiotik dapat berbeda satu dengan yang lain (Ian, 1995). Kloramfenikol merupakan antibiotik yang pertama kali ditemukan dan bersifat bakteriostatik (Anonim, 2009c).

  Kloramfenikol aktif baik terhadap bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Ian, 1995), Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia, dan Chlamydophila spp (Anonim, 2009c).

2. Sifat kimia

  Kloramfenikol (Gambar 2) adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan cara menghambat sintesis protein mikroba (Anonim, 2009b). _{OH OH Cl Cl} O NH O _{O N}

  Gambar 2. Rumus struktur kloramfenikol

  Kloramfenikol berbentuk serbuk hablur halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang, putih hingga putih kelabu atau putih kekuningan, stabil dalam larutan netral atau larutan sedikit asam (Anonim, 1995). Serapan 1cm tebal larutan dengan konsentrasi 0,002 % b/v dalam air pada 278 nm adalah 0,58 sampai 0,61 (Anonim, 1979). Kloramfenikol sangat larut dalam metanol dan setiap 2,5 mg kloramfenikol larut dalam 1 ml air (Anonim, 1989). Kloramfenikol memiliki berat molekul 323,1; pKa 5,5; kelarutan dalam alkohol 1 : 2-5; dalam air 1 : 400; koefisien partisinya 12, memiliki pH antara 4,5-7,5. Larutan kloramfenikol stabil bila tidak terkena cahaya. Kloramfenikol dalam etanol mempunyai λmaks pada 271 nm (E 1%,1cm = 178) (Clarke, 1986).

  Proses degradasi kloramfenikol yang sering terjadi adalah hidrolisis, terdegradasi oleh cahaya dan oksidasi (Boer dan Pijnenburg, 1983). Penetapan kadar kloramfenikol dan produk hidrolisisnya pernah dilakukan oleh Khalil et al. dengan menggunakan KCKT fase terbalik. Metode tersebut dikatakan lebih baik dari pada metode yang disarankan oleh British Pharmacepoeia karena memiliki

  Penetapan kadar deksametason, deksametason sodium fosfat dan kloramfenikol telah dilakukan dengan metode KCKT menggunakan kolom Shim- Pack CLC-ODS (6,0 x 150 mm) dan fase gerak terdiri dari campuran larutan bufer natrium dihidrogen fosfat, asetonitril dan metanol dengan perbandingan 1,73 : 1,16 : 1 (Iqbal et al., 2006).

  Analisis kloramfenikol dalam berbagai bentuk sediaan obat pernah dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri. Titanium (III) klorida digunakan untuk mereduksi kloramfenikol kemudian senyawa hasil reduksi tersebut dikopling menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid dan diukur pada panjang gelombang 440 nm (Eboka et al., 2003).

C. Krim

  Krim adalah bentuk sediaan setengah padat mengandung satu atau lebih bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar. Istilah ini secara tradisional telah digunakan untuk sediaan setengah padat yang mempunyai konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air dalam minyak atau minyak dalam air.

  Sekarang ini batasan tersebut lebih diarahkan untuk produk yang terdiri dari emulsi minyak dalam air atau disperse mikrokristal asam-asam lemak atau alkohol berantai panjang dalam air, yang dapat dicuci dengan air dan lebih ditujukan untuk penggunaan kosmetik dan estetika (Anonim, 1995).

  Stabilitas krim rusak, jika terganggu sistem campurannya terutama disebabkan oleh perubahan suhu dan perubahan komposisi yang disebabkan penambahan salah satu fase krim secara berlebihan atau pencampuran dua tipe krim yang zat pengemulsinya tidak saling campur satu dengan yang lainnya. Zat pengemulsi yang digunakan disesuaikan dengan jenis dan sifat krim yang dikehendaki. Zat pengemulsi yang dapat digunakan antara lain: emulgid, Lemak Bulu Domba, setaseum, setilalkohol, stearialkohol, trietanolamin stearat dan golongan sorbitan, polisorbat, polietilenglikol, sabun. Zat pengawet yang sering digunakan antara lain: metil paraben dan propil paraben (Anonim, 1979).

  Untuk membuat krim digunakan zat pengemulsi, umumnya berupa surfaktan-surfaktan anionik (eter alcohol sulfat, alkil sulfat, dan sulfosuccinates), kationik (quarternary ammonium compounds) dan ninionik (lanolin , polysorbate, sorbitan ester, polyoxyethilated (POE) alkyl phenols, dan sebagainya) (Anief, 2003).

D. Spektrofotometer UV

  Spektroskopi adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (REM). Spektrofotometri ultraviolet adalah salah satu teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektra dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan yang diabsorbsi (Khopkar, 1990).

  Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi yang terjadi antara radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul. Adanya interaksi tadi menyebabkan terjadinya perpindahan energi dari sinar radiasi ke molekul yang disebut absorbsi. Akibat absorbsi radiasi elektromagnetik oleh molekul tersebut maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron antibonding. Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin

  terjadi yaitu , n , n )

  σ→σ →σ →π , dan π →π . Eksitasi elektron (σ →σ memberikan energi yang terbesar dan terjadi pada daerah ultraviolet jauh yang ) diberikan oleh ikatan tunggal, misalnya alkana. Eksitasi elektron (π →π

• diberikan oleh ikatan rangkap dua dan tiga, juga terjadi pada daerah ultraviolet jauh. Eksitasi elektron (n ) terjadi juga pada gugus karbonil (dimetil keton dan
• asetaldehid) yang terjadi pada daerah ultraviolet jauh (Mulya dan Suharman, 1995).

  →σ

  →π

• Transisi elektronik yang berguna dalam penelitian adalah transisi n karena memberikan spektra pada 200-700 nm. Kedua transisi ini dan π→π
• membutuhkan adanya kromofor dalam struktur molekulnya, yaitu suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital

  π yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog, 1985).

  Selain kromofor, dikenal juga istilah auksokrom yaitu merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor (Sastrohamidjojo, 2001). Gugus auksokrom paling sedikit memiliki sepasang elektron bebas yang dapat berinteraksi dengan elektron π, misalnya -OH, -NH (Skoog, 1985).

2 Spektrofotometer ultraviolet melibatkan energi elektronik yang cukup

  besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer ultraviolet lebih banyak untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Analisis kuantitatif selalu melibatkan pembacaan serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul yang dikenal dengan absorban (A) tanpa satuan atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan yang dikenal dengan transmitan dengan satuan persen (% T). Bouger, Lambert, dan Beer membuat formula secara matematik hubungan antara transmitan atau absorban terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi sebagai :

  I _t

−Є C b

  T = = 10 (1)

  I

1 A = log = (2)

  ε. C. b

  T Dimana T = persen transmitan I = intensitas radiasi yang datang

  I = intensitas radiasi yang diteruskan _{t -1 -1} cm ) ε = daya serap molar (L mol _-1 C = konsentrasi (mol L ) b = tebal larutan (cm) A = serapan/absorbansi

  (Mulya dan Suharman, 1995).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan secara cepat dengan bantuan tekanan, dan hasilnya dideteksi dengan instrumen (Willard et al., 1988). Pada akhir tahun 1970, perkembangan instrumen ini dapat menghasilkan pemisahan yang baik atau menghasilkan penampilan peak yang baik sehingga sistem ini lebih dikenal dengan KCKT (Kromidas, 2000).

  KCKT merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan dalam analisis farmasi untuk pemisahan, identifikasi dan determinasi dalam campuran yang kompleks (Skoog et al., 1998).

1. Kromatografi partisi fase terbalik

  Menurut Gritter et al. (1991), konsep pada pengembangan kromatografi cair partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat. Jika solut ditambahkan ke dalam kondisi yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan kondisi dibiarkan seimbang, solut akan tersebar antara kedua fase itu menurut persamaan:

  

Cs

  K = (3)

  

Cm

  K adalah koefesien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Skoog et al., 1998).

  Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi partisi fase balik adalah: a. Kolom. Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini adalah kemasan fase terikat. Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase balik adalah oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil (C8) (Munson, 1991).

  b. Fase gerak.

  Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT

  Fase gerak pada KCKT sangat berpengaruh pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase terbalik, kandungan utama fase geraknya adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak. Karakteristik beberapa pelarut yang sering digunakan pada KCKT disajikan pada tabel I.

  Pelarut Indek polaritas Nilai eluentropik UV Cut-off (nm) Alumina C18 Silika Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195 Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200

  Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284 Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212 Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256 Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330

  Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205 Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268 Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

  Air 10,2 - - - 190

  (Snyder et al., 1997)

  c. Detektor. Detektor yang baik hendaknya memiliki kepekaan tinggi, rentang respon liniernya lebar, tidak dipengaruhi perubahan suhu dan aliran, memberikan hasil dengan keterulangan yang baik, dan tidak banyak noise. Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu: 1) Bulk property detectors, merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase gerak dan solut. Detektor tipe ini cenderung relatif tidak sensitif dan menghendaki suhu yang terkendali. Contoh detektor jenis ini yaitu detektor indeks bias.

  2) Solut property detectors,

  merupakan detektor yang hanya mengukur sifat fisik solut. Detektor tipe ini 1000 kali lebih sensitif dan mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi. Contoh detektor jenis ini yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan (UV-Vis), dan detektor elektrokimia (Munson, 1991).

2. Pemisahan puncak dalam kromatografi

  Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Kolom yang efisien mencegah pelebaran puncak atau menghasilkan puncak yang sangat sempit (Johnson dan Stevenson, 1978).

  Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak. Daya pisah (R), dapat diukur dengan persamaan: R =

  (t R 2 −t ^{R 1 )} � ¹ ₂ �(w ¹

  =

  2 Δt w ₁ +w ₂

  (4) Nilai t

• w

₂

)

  R2

  dan t

  R1

  adalah waktu retensi senyawa, diukur pada titik maksimum puncak dan Δt adalah selisih antara t

  R2 dan t R1. Nilai w 2 dan w 1 adalah lebar alas puncak. Pemisahan dua senyawa dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 3):

  

Gambar 3. Pemisahan dua senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978)

  Nilai R >1,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama. Dalam praktiknya, pemisahan dengan nilai R= 1,0 (kedua puncak berhimpit lebih kurang 2%) dianggap memadai (Pescok et al., 1976).