Optimasi metode bioanalisis kafein dalam sampel darah orang Jawa dengan metode kromatogafi cair kinerja tinggi fase terbalik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

OPTIMASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH
ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Jonathan Ronny Kurniawan
NIM : 138114126

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

OPTIMASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH
ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Jonathan Ronny Kurniawan
NIM : 138114126

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan karya ini untuk
Tuhan Yesus Kristus yang selalu memberikan hal yang terbaik
untukku,
Orang tua ku yang telah mengasihi aku dan membesarkan
aku dari aku kecil dengan penuh kasih sayang,

Sahabat-sahabatku yang selalu mendukungku,
dan untuk almamaterku universitas sanata dharma tercinta.

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi saya yang berjudul
“Optimasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah Orang Jawa dengan
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” tidak memuat karya atau
bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar
pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini,
maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan
yang berlaku.

Yogyakarta, 9 Januari 2017
Penulis

Jonathan Ronny Kurniawan

v

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama

: Jonathan Ronny Kurniawan

Nomor Mahasiswa

: 138114126

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“OPTIMASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH

ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI FASE TERBALIK”
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan
dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 9 Januari 2017

Yang menyatakan

(Jonathan Ronny Kurniawan)

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat,
cinta kasih dan penyertaan-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penyusunan naskah skripsi yang berjudul “Optimasi Metode Bioanalisis Kafein
dalam Sampel Darah Orang Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Fase Terbalik”. Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
Penulis menyadari bahwasannya dalam penyusunan naskah ini tidak lepas dari
bantuan dan dukungan berbagai pihak, oleh karena itu pada kesempatan ini penulis
hendak menyampaikan terimakasih kepada :
1.

Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi,
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2.

Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing utama atas
kesabaran, bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama penelitian hingga
penyusunan naskah skripsi ini.

3.

Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing
pendamping atas kesabaran, bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama
penelitian hingga penyusunan naskah skripsi ini.

4.

Bapak Maywan Hariono, M.Si., Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang telah
memberikan kritik dan saran yang membangun hingga skripsi ini tersusun.

5.

Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt., selaku dosen penguji yang telah
memberikan kritik dan saran yang membangun hingga skripsi ini tersusun.

6.

Ibu Dita Maria Virginia, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing
Akademik atas bimbingan selama ini.

7.

Pak Kayat dan Pak Bimo, selaku laboran yang telah membantu selama penelitian.

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

8.

Keluarga tersayang Bapak Sugiono, Ibu Veronica Setyawati, Kakak Jessica
Novia Fransisca dan Linda Evelina Larisa, atas segala kasih, cinta, nasehat,
saran, dukungan, dan doa yang selalu mengiringi langkah penulis.

9.

Teman skripi bioanalisis kafein, Suryatmoko Agung, terimakasih untuk
dukungan dan bantuannya selama ini.

10. Sahabat-sahabat penulis, Kadek Ida Krisnadewi, Ivana Tunggal, RR Kirana
Andranilla, Yohanes Medika, Lia Elisa, Cindy dan Regina Eva Angelista,
terimakasih untuk kebersamaan yang terjalin, semangat dan dukungan selama ini.
11. Teman-teman “Kos Wiratha” atas kebersamaannya selama ini.
12. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan
naskah skripsi ini, namun tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa tidak ada manusia yang sempurna, demikian juga
untuk skripsi ini yang masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu penulis
mengharapkan adanya kritik dan saran yang membangun, sehingga skripsi ini
dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan serta bagi para pembaca.

Yogyakarta, Desember 2016

Jonathan Ronny Kurniawan

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Metabolisme kafein pada orang jawa terjadi secara lambat sehingga berpotensi
menyebabkan toksisitas, oleh karena itu penting untuk dilakukan Therapeutic Drug
Monitoring (TDM). TDM dilakukan untuk menentukan dosis obat yang efektif dalam
darah sehingga dapat memonitor terjadinya toksisitas. TDM perlu pengembangan
metode baru untuk analisis kafein pada orang jawa sehingga dapat digunakan untuk
analisis rutin. Tujuan dari penelitian ini untuk mengembangkan metode baru untuk
analisis kafein dalam sampel darah jawa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) fase terbalik. Standar internal (SI) yang digunakan dalam penelitian
ini adalah asetanilida. Pengembangan metode yang dilakukan dalam penelitian ini
adalah optimasi komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak. Optimasi
komposisi fase gerak menggunakan aqua bidestilata :metanol dengan perbandingan
40:60; 50:50; dan 60:40 serta kecepatan alir 0,5 mL/menit dan 1,0 mL/menit. Fase
diam yang digunakan adalah Phenomenex® C18 kolom (dimensi 250 x 4,6 mm,
ukuran partikel 5 µm). Deteksi UV dilakukan setelah pemisahan kromatografi pada 
255 nm. Parameter yang digunakan pada penelitian ini adalah nilai faktor tailing,

resolusi, waktu retensi, HETP dan koefisien variansi (CV) dari nilai faktor tailing,
waktu retensi dan HETP. Hasil penelitian menunjukkan komposisi fase gerak yang
optimal adalah aquabidestilata: metanol (50:50) dan laju alir optimum fase gerak
adalah 1,0 mL / menit.
Kata Kunci : Bioanalisis, Kafein, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, orang jawa

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
A slow metabolism of caffeine in Javanese increases its potential of toxicity,
therefore it is important to do Therapeutic Drug Monitoring (TDM). TDM is aimed to
determine drug level in the blood, so it can control toxicity. TDM needs a
development of new methods for the analysis of caffeine in the Javanese, so it can be
applied for routine analysis. The aim of this study was developing new method for
analysis of caffeine in javanese blood sample using reverse phase High Performance
Liquid Chromatography (HPLC). Internal standard (IS) used in this research was
acetanilide. The method development performed in this research were optimization of
mobile phase composition and its flow rate. The optimization of mobile phase
composition using re-distiled water : methanol in the ratio of 40:60; 50:50; and 60:40
then a flow rate 0.5 mL/minute and 1,0 mL/minute. The stationary phase being used
was Phenomenex® C18 column (dimensions 250x4.6 mm, particle size 5m). The UV
detection was performed after chromatographic separation at 255 nm. The Parameter
being used in this study are value of tailing factor, resolution, retention time, HETP
and the coefficient of variance (CV) of those individual parameters. The results
indicated that the optimum mobile phase composition was re-destiled water :
methanol (50:50) with optimum flow rate of mobile phase is 1.0 mL/minute.
Key Words : Bioanalysis, Caffeine, High Pressure Liquid Chromatography, javanese

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL........................................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................................. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................................v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................................. vi

PRAKATA .......................................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ....................................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................................... xvi
INTISARI............................................................................................................................ xvii
ABSTRACT .......................................................................................................................... xviii

PENDAHULUAN .............................................................................................................. 1
METODE PENELITIAN .................................................................................................... 2
Metode................................................................................................................................. 3
Pembuatan larutan baku kafein .................................................................................... 3
Pembuatan larutan standar internal (SI) ....................................................................... 3
Penentuan panjang gelombang pengamatan kafein dan SI .......................................... 3
Optimasi sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ...................................... 4
Uji Kesesuaian Sistem ................................................................................................. 5
HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................................... 6
KESIMPULAN ................................................................................................................... 13
SARAN……………………………………………………………………………………13
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 14
LAMPIRAN ........................................................................................................................ 15
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................................ 59

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL
Tabel I. Nilai tailing factor dan waktu retensi dari kafein dan kandidat SI (asetanilida,
nikotinamida, papaverin) pada optimasi………………..………..………....8
Tabel II. Nilai tf dan tR kafein dan SI pada berbagai tingkat…...………..………...12
Tabel III. Data nilai tailing factor kafein dan SI (asetanilida), nilai waktu retensi
kafein dan SI (asetanilida), nilai resousi kafein dan SI (asetanilida), dan nilai
HETP kafein dan SI (asetanilida) pada uji kesesuaian sistem……...……...13

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Kromatogram tumpang tindih antara blanko plasma dengan senyawa
kafein dan beberapa kandidat SI (asetanilida, nikotinamida dan papaverin)
menggunakan sistem KCKT yang optimum (fase diam kolom C18: 250 x
4,6 mm, 5µm; fase gerak campuran aquabidestilata : metanol dengan
perbandingan 60:40; kecepatan alir 1,0 mL/menit…………………………7
Gambar 2. Tumpang tindih spektrum senyawa kafein dan asetanilida. Pembacaan
absorbansi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang
200nm - 400nm………………………………….…………………………8
Gambar 3. Kromatogram senyawa: Kafein dan SI Asetanilida dalam sampel plasma
menggunakan sistem KCKT yang optimum (fase diam C18: 250 x 4,6 mm,
5µm; fase gerak campuran aquabidestilata : metanol dengan perbandingan
50:50; kecepatan alir 1,0 mL/menit; detektor UV 255 nm……………......9
Gambar 4.

Interaksi

senyawa kafein

dan SI

asetanilida dengan fase

diam…...……..……………..……………..……………..……………..…10
Gambar 5. Senyawa kafein dan SI asetanilida dengan gugus polarnya serta
interaksinya dengan fase gerak aquabidestilata (H2O) dan metanol
(CH3OH) …………..……………..……………………..……………..…11

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat ijin penelitian skripsi oleh dinas perizinan kota Yogyakarta …...15
Lampiran 2. Hasil pembacaan absorbansi senyawa kafein dan SI asetanilida
menggunakan spektrofotometer UV.…… …………………....………16
Lampiran 3. Hasil pembacaan absorbansi senyawa kafein dan SI papaverin
menggunakan spektrofotometer UV………...……………..……….…17
Lampiran 4. Hasil pembacaan absorbansi senyawa kafein dan SI nikotinamida
menggunakan spektrofotometer UV……….…………………….……18
Lampiran 5. Sertifikat analisis working standar kafein………………………...……19
Lampiran 6. Surat permohonan ijin penelitian dan pengambilan data…...…….……20
Lampiran 7. Surat permohonan bahan penelitian dari PMI kota Yogyakarta…….…21
Lampiran 8. Kuisioner donor darah ………..…………..……………………………22
Lampiran 9. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (40:60) kecepatan alir 0,5 mL/menit ...……..26

Lampiran 10. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 0,5 mL/menit ..…...…27

Lampiran 11. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (60:40) kecepatan alir 0,5 mL/menit .………28

Lampiran 12. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (40:60) kecepatan alir 1,0 mL/menit .………29

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 13. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit………..30

Lampiran 14. Campuran kafein dan nikotinamida mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (60:40) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…31

Lampiran 15. Kromatogram papaverin 4 g/mL mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit ...…..…32

Lampiran 16. Kromatogram papaverin 4 g/mL mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (60:40) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…33

Lampiran 17. Kromatogram asetanilida 8 g/mL mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…34

Lampiran 18. Kromatogram asetanilida 8 g/mL mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (60:40) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…35

Lampiran 19. Kromatogram blanko plasma A mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…36

Lampiran 20. Kromatogram blanko plasma B mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…37

Lampiran 21. Kromatogram blanko plasma C mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…38

Lampiran 22. Kromatogram blanko plasma D mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…39

xv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 23. Kromatogram blanko plasma E mengunakan fase gerak
aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit …….…40

Lampiran 24. Seri 1 (kafein 1,6 g/mL dan asetanilida 4 g/mL) replikasi 1
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit ...….………..…….…….…….…….…….…….…….…41
Lampiran 25. Seri 1 (kafein 1,6 g/mL dan asetanilida 4 g/mL) replikasi 2
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit ...….………..…….…….…….…….…….…….…….…42
Lampiran 26. Seri 1 (kafein 1,6 g/mL dan asetanilida 4 g/mL) replikasi 3
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit ...….………..…….…….…….…….…….…….…….…43
Lampiran 27. Seri 2 (kafein 8 g/mL dan asetanilida 8 g/mL) replikasi 1
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…44
Lampiran 28. Seri 2 (kafein 8 g/mL dan asetanilida 8 g/mL) replikasi 2
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…45
Lampiran 29. Seri 2 (kafein 8 g/mL dan asetanilida 8 g/mL) replikasi 3
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…46

xvi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 30. Seri 3 (kafein 18 g/mL dan asetanilida 12 g/mL) replikasi 1
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…47
Lampiran 31. Seri 3 (kafein 18 g/mL dan asetanilida 12 g/mL) replikasi 2
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…48
Lampiran 32. Seri 3 (kafein 18 g/mL dan asetanilida 12 g/mL) replikasi 3
mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol (50:50) kecepatan alir
1,0 mL/menit .….………....…….…….…….…….…….…….…….…49
Lampiran 33. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 1 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…50
Lampiran 34. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 2 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…51
Lampiran 35. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 3 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…52
Lampiran 36. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 4 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…53

xvii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 37. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 5 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…54
Lampiran 38. Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 6 (kafein 12 g/mL dan

asetanilida 8 g/mL) mengunakan fase gerak aquabidestilata :metanol

(50:50) kecepatan alir 1,0 mL/menit .….………....…….… ……….…55
Lampiran 39. Perhitungan konsentrasi larutan seri pada tahap optimasi pemisahan
kafein dan SI asetanilida dalam plasma .….………....…….……….….56
Lampiran 40. Perhitungan konsentrasi larutan seri pada tahap uji kesesuaian sistem
………………………………………………………………………....57
Lampiran 41. Contoh perhitungan konsentrasi kafein dan asetanilida dari
penimbangan, perhitungan konsentrasi larutan stok dan perhitungan
konsentrasi larutan intermediet…………………………………..…....58

xviii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Kafein merupakan zat psikoaktif dan juga berperan sebagai stimulan sistem saraf
pusat (Joewana, 2005). Konsumsi kafein yang berlebihan menyebabkan peningkatan
hormon stress, peningkatan tekanan darah, cemas, pusing, kelelahan dan gangguan tidur
(Pedak, 2009). Waktu paruh dari kafein adalah 3,5 jam, tetapi metabolisme kafein pada
orang yang memiliki penyakit liver atau ibu hamil lebih lambat sehingga waktu paruhnya
lebih lama (Key dan Hayes, 1996). Kecepatan metabolisme obat dipengaruhi oleh
beberapa faktor, yaitu induksi enzim, inhibisi enzim, usia, penyakit, dan faktor genetik
(Neal, 2006). Kecepatan metabolisme obat dipengaruhi oleh faktor genetik, salah satunya
adalah perbedaan komposisi enzim pada ras/suku yang berbeda sehingga menyebabkan
perbedaan kemampuan metabolisme obat.
Enzim Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan enzim yang bertanggung jawab
terhadap metabolisme beberapa obat seperti kafein, efavirenz, letrozole, nikotin,
pilocarpine dan tegafur. CYP2A6*4 adalah salah satu alel dari enzim CYP2A6 yang
merupakan alel non aktif sehingga menyebabkan penurunan kecepatan metabolisme kafein
(Anonim, 2012). Polimorfisme genetis enzim CYP2A6 dengan frekuensi alel CYP2A6*4
yang tinggi secara signifikan menurunkan kemampuan metabolisme kafein sehingga
kemampuan metabolisme kafein menjadi lambat. Berdasarkan penelitian Patramurti, dkk
(2015) dikatakan adanya polimorfisme genetik dimana frekuensi alel CYP2A6*4 pada
orang jawa tinggi jumlahnya sehingga kemampuan memetabolisme kafein pada orang jawa
menjadi lambat. Metabolisme kafein yang lambat pada orang jawa berpotensi terjadinya
toksisitas, sehingga dapat dikatakan pentingnya dilakukan Therapeutic Drug Monitoring
(TDM). TDM sangat penting dalam bidang farmasi untuk mengukur kadar obat dalam
aliran darah selama interval waktu tertentu. TDM penting dilakukan untuk menentukan
dosis obat yang efektif dalam darah, sehingga dapat mencegah terjadinya keadaan toksik
atau keracunan obat di dalam tubuh. TDM melibatkan pengukuran konsentrasi obat pada
berbagai sampel biologis seperti darah (Kang dan Lee, 2009). Metode yang spesifik untuk
aplikasi TDM senyawa kafein pada orang jawa diperlukan untuk menghasilkan data yang
representatif, efektif, efisien, akurat dan presisi. Perlu dilakukan pengembangan metode
baru untuk analisis kafein pada orang jawa sehingga dapat digunakan untuk analisis rutin.
Metode analisis kafein yang sudah pernah dilakukan oleh peneliti terdahulu dapat
dijadikan acuan untuk penemuan metode baru.

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Pada penelitian jurnal oleh Alvi dan Hammami (2011) dilakukan analisis kafein
dalam plasma sintetik menggunakan fase gerak kalium fosfat dan asetonitril dengan
perbandingan 83:17. Panjang gelombang pada penelitian tersebut diatur sebesar 274 nm.
Waktu retensi senyawa kafein yang dihasilkan < 10 menit, namun resolusi antara puncak
senyawa kafein dengan puncak senyawa lain yang berdekatan sehingga belum memenuhi
persyaratan analisis. Plasma sintetik yang digunakan pada penelitian tersebut kurang
representatif jika digunakan untuk aplikasi TDM pada orang jawa karena sampel plasma
sintetik memiliki komposisi yang berbeda dengan sampel darah orang jawa. Hasil analisis
akan lebih representatif jika menggunakan sampel darah orang jawa.
Pada penelitian skripsi oleh Irmanto (2008) dilakukan analisis kafein menggunakan
instrumen KCKT fase terbalik dengan fase gerak aquabidestilata dan metanol. Penelitian
tersebut diawali dengan tahap optimasi. Fase gerak aquabidestilata dan metanol pada
penelitian tersebut dijadikan acuan sebagai fase gerak pada penelitian ini.
Berdasarkan review artikel oleh Patil (2012), disebutkan beberapa penelitian tentang
analisis kafein menggunakan berbagai sampel seperti minuman kopi, plasma sintetik,
campuran obat dan teh. Berdasarkan review tersebut, analisis senyawa kafein dapat
dilakukan dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik, metode KCKT elusi gradien
dan metode UHPLC. Pada penelitian ini juga digunakan metode KCKT fase terbalik.
Pengembangan metode diperlukan untuk kepentingan analisis kafein. Pengembangan
metode ini dilakukan melalui dua tahapan yaitu optimasi metode dan validasi metode.
Sebelum dilakukan validasi metode perlu dilakukan tahapan optimasi terlebih dahulu.
Penelitian yang dilakukan yaitu optimasi pada sistem KCKT untuk mendapatkan parameter
optimasi yang optimal. Parameter optimasi tersebut meliputi nilai resolusi senyawa kafein
dan SI asetanilida dengan senyawa lain yang puncaknya berdekatan, tailing factor (kafein
dan SI asetanilida) , waktu retensi (kafein dan SI asetanilida), nilai HETP (kafein dan SI
asetanilida), dan nilai koefisien variansi (CV) dari tailing factor , waktu retensi dan HETP
untuk kafein dan SI asetanilida.
METODE PENELITIAN
Bahan
Sampel plasma darah orang jawa dari PMI kota Yogyakarta, metanol (p.a grade) (E
Merck),

aquabidestilata ,

baku

kafein

(sertifikat

analisis

working

standard,

no.002/WS/RD/I/2012, MA USP 34), baku asetanilida, baku nikotinamida dan baku
papaverin.
2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Alat
KCKT Shimadzu LC-2010C dengan detektor sinar UV, kolom C18 merek
Phenomenex® (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5µm), seperangkat komputer (merek Dell

B6RDZIS Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet
1000 J110a), Spektrofotometer UV Shimadzu UV-1800, milipore, ultrasonikator Retsch
tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr, C-066/83, HF-frequ:35 kHz), timbangan analitik
SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g; d = 0,01/0,1 mg), penyaring Whatman 0,45 µm,
alat vakum GAST, sentrifugator Thermo scientific Heraeus Pico 17/21 dan peralatanperalatan gelas.
Metode
Optimasi pemisahan senyawa kafein dan SI pada sistem KCKT fase terbalik
dilakukan dengan berbagai komposisi fase gerak yang terdiri dari campuran
aquabidestilata : metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40. Selain

perbandingan komposisi fase gerak, dilakukan juga optimasi kecepatan alir fase gerak pada
0,5 dan 1,0 mL/menit. Volume injeksi sejumlah 20 L. Plasma darah yang didapatkan dari
PMI kota Yogyakarta disimpan pada pendingin dengan temperatur -70 oC.
Pembuatan Larutan Stok dan Intermediet Kafein
Sejumlah kafein ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 20 mg dan dilarutkan
pada pelarut metanol 50% dalam labu takar volume 5 mL sehingga didapat larutan stok
kafein dengan konsentrasi 4 mg/mL. Dari larutan stok kafein, dibuat larutan intermediet
kafein dengan konsentrasi 800 g/mL. Larutan stok dan intermediet kafein selalu dibuat
baru.
Pembuatan Larutan Standar Internal (SI)
Pada penelitian ini dilakukan optimasi pemilihan SI, adapun SI yang digunakan
adalah nikotinamida, papaverin dan asetanilida. Masing-masing SI tersebut ditimbang
seksama lebih kurang sebanyak 20 mg dan dan dilarutkan pada pelarut metanol 50% dalam
labu takar volume 5 mL sehingga didapat konsentrasi 4 mg/mL. Untuk memudahkan
pengenceran di tahap selanjutnya maka dibuat larutan intermediet SI dengan konsentrasi
320 g/mL. Larutan stok dan intermediet masing-masing kandidat SI selalu dibuat baru.

Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kafein dan SI dengan Spektrofotometer
UV
Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengencerkan larutan intermediet kafein 800

g/mL menggunakan pelarut metanol 50% sehingga didapatkan konsentrasi 5, 10 dan 15
3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

µg/mL. Masing-masing larutan seri kafein tersebut dibaca absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang antara 200-400 nm.

Larutan seri SI dibuat dengan cara mengencerkan larutan intermediet SI 320 g/mL
menggunakan pelarut metanol 50% sehingga didapatkan konsentrasi 4, 8, dan 12 µg/mL
untuk SI asetanilida; 10, 15, dan 20 µg/mL untuk SI nikotinamida; dan 2, 4, dan 6 µg/mL
untuk SI papaverin. Masing-masing larutan seri SI tersebut dibaca absorbansinya
menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang antara 200-400 nm.
Spektrum yang dihasilkan ditumpang tindihkan, lalu dipilih panjang gelombang
pengamatan yang akan digunakan untuk deteksi pada sistem KCKT baik pada kafein
maupun SI.
Optimasi Sistem KCKT
Optimasi pemilihan standar internal. Larutan kerja kafein dibuat dengan mengencerkan
larutan intermediet kafein 800 g/mL menggunakan pelarut metanol 50 % sehingga
didapatkan konsentrasi larutan kafein 10 µg/mL. Larutan disaring menggunakan milipore
lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator sehingga larutan kerja kafein siap
diinjeksikan ke sistem KCKT.

Larutan kerja SI dibuat dengan mengencerkan larutan intermediet SI 320 g/mL

menggunakan pelarut metanol 50 % sehingga didapatkan konsentrasi larutan SI 8 µg/mL
untuk SI asetanilida; 10 g/mL untuk SI nikotinamida dan 4 g/mL untuk SI papaverin.
Larutan di saring menggunakan milipore lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator
sehingga larutan kerja SI siap diinjeksikan ke sistem KCKT.
Larutan blanko plasma dibuat dengan mengambil plasma darah sebanyak 600 µL,
kemudian dipindahkan ke dalam tube, lalu ditambahkan 400 µL pelarut metanol 50 %,
divortex selama 30 detik. Dari tube tersebut, larutan diambil sebanyak 500 µL lalu
ditambahkan metanol sebanyak 1500 µL dalam tabung sentrifugasi. Sehingga didapatkan
volume total 2000 µL. Lalu tabung sentrifugasi divortex selama 30 detik dan disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Cairan supernatan dipisahkan, kemudian
disaring

dengan

millipore.

Selanjutnya

dilakukan

diawaudarakan

menggunakan

ultrasonikator selama 5 menit sehingga supernatan siap di injeksikan ke sistem KCKT.

Sejumlah 20,0 L masing-masing larutan tersebut (larutan kerja kafein, larutan kerja SI
dan larutan blanko plasma) diinjeksikan ke sistem KCKT secara terpisah dengan berbagai
komposisi fase gerak dan kecepatan alir. Tumpang tindih dari kromatogram larutan kerja
kafein, larutan kerja SI dan blanko plasma yang dihasilkan diamati pemisahan puncaknya.
4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SI yang menghasilkan tailing factor dan pemisahan puncak terbaik dari senyawa lain yang
berdekatan dipilih untuk dijadikan SI pada penelitian ini.
Optimasi komposisi fase gerak dan kecepatan alir dalam pelarut. Kromatogram
larutan kerja kafein dan larutan kerja SI yang didapat pada tahap optimasi pemilihan
standar internal ditumpang tindih, lalu diamati waktu retensi, tailing factor dan pemisahan
puncaknya. Komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang menghasilkan waktu retensi,
tailing factor dan pemisahan puncak terbaik dipilih untuk digunakan pada penelitian ini.

Optimasi pemisahan kafein dan SI Asetanilida dalam plasma. Diambil plasma darah
sebanyak 600 µL, kemudian dipindahkan ke dalam tube, lalu ditambahkan 200 µL larutan
seri SI asetanilida, dan 200 µL larutan seri kafein. dan divortex selama 30 detik. Adapun
konsentrasi larutan seri kafein dan larutan seri SI asetanilida yang ditambahkan yaitu
larutan seri kafein 32 µg/mL dengan larutan seri SI asetanilida 80 µg/mL; larutan seri
kafein 160 µg/mL dengan larutan seri SI asetanilida 160 µg/mL; dan larutan seri kafein
360 µg/mL dengan seri SI asetanilida 240 µg/mL. Dari tube tersebut, larutan diambil
sebanyak 500 µL lalu ditambahkan metanol sebanyak 1500 µL dalam tabung sentrifugasi
sehingga didapatkan volume total 2000 µL. Lalu tabung sentrifugasi divortex selama 30
detik dan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Cairan supernatan
dipisahkan, kemudian disaring dengan millipore. Selanjutnya dilakukan diawaudarakan
menggunakan ultrasonikator selama 5 menit sehingga supernatan siap di injeksikan ke
sistem KCKT.

Sejumlah 20,0 L masing-masing supernatan yang telah disiapkan, diinjeksikan pada
sistem KCKT dengan komposisi fase gerak dan kecepatan alir optimum. Kromatogram
yang dihasilkan lalu diamati bentuk puncak nya dengan melihat nilai waktu retensi, tailing
factor (tf) serta nilai Rs dari kafein maupun SI dengan senyawa lain yang berdekatan.

Kondisi sistem KCKT dikatakan optimum jika kromatogram yang dihasilkan mempunyai
nilai tf 2,0 serta tR < 10 menit. SI yang menghasilkan parameter optimum terbaik
dipilih untuk dijadikan SI pada penelitian ini.
Uji Kesesuaian Sistem KCKT
Diambil plasma darah sebanyak 600 µL, kemudian dipindahkan ke dalam tube, lalu
ditambahkan 200 µL larutan seri SI asetanilida, dan 200 µL larutan seri kafein. Adapun
konsentrasi larutan seri kafein dan larutan seri SI asetanilida yang ditambahkan yaitu; seri
kafein 240 µg/mL dan seri SI asetanilida 160 µg/mL. Selanjutnya divortex selama 30 detik.
Dari tube tersebut, larutan diambil sebanyak 500 µL lalu ditambahkan metanol sebanyak
5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

1500 µL dalam tabung sentrifugasi. Sehingga didapatkan volume total 2000 µL. Lalu
tabung sentrifugasi divortex selama 30 detik dan disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 10000 rpm. Cairan supernatan dipisahkan, kemudian di millipore. Selanjutnya
diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Supernatan siap di injeksikan
ke sistem KCKT.

Sejumlah 20,0 L masing-masing supernatan yang telah disiapkan tersebut,

diinjeksikan pada sistem KCKT sebanyak 6 kali replikasi dengan komposisi fase gerak dan
kecepatan alir optimum.
Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang pengamatan kemudian diamati
kromatogram kafein hasil pemisahan dan dilihat nilai waktu retensi (kafein dan SI
asetanilida), nilai tf (kafein dan SI asetanilida), Rs kafein dengan puncak senyawa lain
yang terdekat, Rs SI asetanilida dengan puncak senyawa lain yang terdekat, nilai CV dari
waktu retensi (kafein dan SI asetanilida) dan nilai CV dari tf (kafein dan SI asetanilida).
Kondisi sistem KCKT dikatakan optimum jika kromatogram yang dihasilkan
mempunyai nilai tf 2,0 serta tR < 10 menit.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel biologis yang dianalisis pada penelitian ini berupa sampel plasma darah dari
subjek keturunan suku jawa. Penggunaan sampel plasma darah orang keturunan suku jawa
penting sehingga metode analisis menjadi lebih spesifik.
Preparasi merupakan langkah yang sangat penting pada analisis sebelum larutan
sampel dianalisis menggunakan metode KCKT. Teknik preparasi sampel plasma darah
pada penelitian ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Alvi dan Hammami
(2011). Sampel plasma pertama kali dispike dengan senyawa kafein dan SI karena subjek
uji tidak diberi perlakuan untuk mengkonsumsi kafein. Protein pada plasma diendapkan
dengan bantuan penambahan metanol dan sentrifugasi. Sampel plasma harus disaring
menggunakan microsyringe untuk menghilangkan kontaminasi zat yang mungkin ada
dalam sampel sebelum diinjeksikan pada KCKT. Ultrasonikasi dilakukan untuk
menghilangkan gelembung udara pada sampel yang dapat mengacaukan pembacaan
absorbansi. Larutan yang akan dianalisis menggunakan KCKT harus jernih dan bebas dari
kontaminasi zat atau gelembung udara karena jika masih terdapat kontaminasi zat atau
gelembung udara pada sampel bisa mengakibatkan kerusakan kolom.

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Optimasi pemilihan standar internal dilakukan sebelum optimasi sistem KCKT.
Optimasi sistem KCKT pada penelitian ini dilakukan dengan optimasi berbagai
perbandingan komposisi fase gerak aquabidestilata : metanol dan optimasi kecepatan alir
fase gerak campuran aquabidestilata : metanol. Kandidat standar internal yang dioptimasi
adalah asetanilida, nikotinamida dan papaverin. Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan
pada Gambar 1, senyawa nikotinamida tidak dapat dijadikan standar internal karena
memiliki puncak yang bertabrakan dengan puncak senyawa dalam blanko plasma. Puncak
senyawa asetanilida dan papaverin terpisah dari puncak noise dalam blanko plasma.
Puncak senyawa papaverin yang dihasilkan memiliki waktu retensi yang dekat dengan
puncak senyawa kafein, sedangkan puncak senyawa asetanilida memiliki waktu retensi
yang cukup jauh dengan senyawa kafein sehingga senyawa asetanilida dipilih sebagai SI
pada penelitian ini.

Gambar 1. Kromatogram tumpang tindih antara blanko plasma dengan senyawa kafein dan
beberapa kandidat SI (asetanilida, nikotinamida dan papaverin) menggunakan sistem KCKT
yang optimum (fase diam kolom C18: 250 x 4,6 mm, 5µm; fase gerak campuran aquabidestilata :
metanol dengan perbandingan 60:40; kecepatan alir 1,0 mL/menit

Berdasarkan spektrum yang dihasilkan oleh spektrofotometer UV pada pembacaan
absorbansi senyawa kafein dan asetanilida, dipilih panjang gelombang pengamatan untuk
senyawa kafein dan SI asetanilida yaitu 255 nm. Spektrum hasil pembacaan oleh
spektrofotometer UV dapat dilihat pada gambar 2.

7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Gambar 2. Tumpang tindih spektrum senyawa kafein dan asetanilida. Pembacaan absorbansi
menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200nm - 400nm

Kondisi optimum sistem KCKT yang dapat memisahkan kafein, SI dan matriks
sampel plasma dioptimasi pada berbagai perbandingan komposisi fase gerak dan kecepatan
alir. Kecepatan alir yang dioptimasi pada sistem KCKT menggunakan kecepatan alir 0,5
mL/menit dan 1,0 ml/menit menggunakan fase gerak aquabidestilata :metanol dengan
perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40. Pada kecepatan alir 0,5 mL/menit, waktu retensi
yang dihasilkan lebih lama dibandingkan pada kecepatan alir 1,0 mL/menit. Selain itu pada
kecepatan alir 0,5 ml/menit dihasilkan puncak yang melebar. Sedangkan pada kecepatan
alir 1,0 ml/menit dihasilkan puncak yang lebih sempit dan waktu retensi yang lebih cepat,
sehingga kecepatan alir 1,0 ml/menit dipilih sebagai kecepatan alir optimum pada
penelitian ini. Data tailing factor dan waktu retensi dari kafein dan kandidat SI
(asetanilida, nikotinamida, papaverin) pada optimasi fase gerak dan kecepatan alir dapat
dilihat pada tabel I.
Tabel I. Nilai tailing factor dan waktu retensi dari kafein dan kandidat SI (asetanilida,
nikotinamida, papaverin) pada optimasi
Komposisi
fase gerak
(aquabidesti
lata :
metanol)
40 : 60
50 : 50
60 : 40

Kecepa
tan alir
(ml
/menit)

tf
kafein

tf
asetanili
da

tf
nikotina
mida

tf
papaver
in

tR
kafein

tR
asetanili
da

tR
nikotina
mida

tR
papaver
in

0,5
1,0
0,5
1,0
0,5
1,0

1,408
1,411
1,342
1,349
1,218
1,247

1,192
1,100

1,500
1,535
1,442
1,481
1,378
1,414

1,318
1,227

6,895
3,462
7,941
3,990
10,298
5,233

6,151
9,292

5,755
2,882
5,964
2,988
6,386
3,202

3,207
6,314

8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Komposisi fase gerak yang dioptimasi pada sistem KCKT yaitu perbandingan
komposisi fase gerak aquabidestilata :metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan
60:40

dengan

kecepatan

alir

1,0

ml/menit.

Untuk

komposisi

fase

gerak

aquabidestilata :metanol dengan perbandingan 60:40 dihasilkan puncak dengan pemisahan

paling baik dibandingkan pada komposisi fase gerak dengan perbandingan 50:50 dan
40:60. Namun pada perbandingan komposisi fase gerak 60:40 waktu retensi dari standar
internal asetanilida terlalu lama yaitu mendekati 10 menit. Waktu retensi dikatakan efektif
jika

kurang

dari

10

menit.

Untuk

perbandingan

komposisi

fase

gerak

aquabidestilata :metanol dengan perbandingan 50:50 menghasilkan pemisahan yang lebih

baik dibandingkan pada perbandingan komposisi fase gerak 40:60. Selain itu pada
perbandingan komposisi fase gerak 50:50 dihasilkan waktu retensi dari standar internal
dibawah 7 menit (cukup cepat). Sehingga komposisi fase gerak aquabidestilata :metanol
dengan perbandingan 50:50 dipilih sebagai komposisi fase gerak optimum.

Gambar 3. Kromatogram senyawa: Kafein dan SI Asetanilida dalam sampel plasma
menggunakan sistem KCKT yang optimum (fase diam kolom C18: 250 x 4,6 mm, 5µm; fase
gerak campuran aquabidestilata : metanol dengan perbandingan 50:50; kecepatan alir 1,0
mL/menit; detektor UV 255 nm
Keterangan : Data 1 (blanko plasma)
Data 2 (seri 1) : kafein 1,6 µg/mL; asetanilida 4 µg/mL
Data 3 (seri 2) : kafein 8 µg/mL; asetanilida 8 µg/mL
Data 4 (seri 3) : kafein 18 µg/mL; asetanilida 12 µg/mL

Puncak senyawa kafein dan SI asetanilida dalam kromatogram mempunyai nilai tf
kurang dari 2, hal ini menunjukkan bahwa kafein dan SI asetanilida tidak cukup kuat
tertahan dalam kolom dan dapat keluar serentak dari kolom (Snyder dkk., 2010). Nilai tR
kafein dan SI asetanilida pada Gambar 3 adalah kurang dari 10 menit. Hal ini
menunjukkan bahwa kedua senyawa tersebut dapat keluar dengan cepat dari kolom. Nilai
tR senyawa kafein lebih cepat dibandingkan senyawa SI asetanilida, hal ini disebabkan
karena waktu retensi suatu senyawa sangat dipengaruhi oleh interaksinya dengan fase diam
9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

dan fase gerak yang digunakan. Pada penelitian ini digunakan metode KCKT fase terbalik,
sehingga semakin polar suatu senyawa maka interaksi dengan fase geraknya semakin kuat
dan dapat dikatakan waktu retensinya semakin cepat.
Gambar 4 menunjukkan interaksi kafein atau SI asetanilida dengan fase diam.
Interaksi kafein dengan fase diam lebih sedikit dibandingkan interaksi SI asetanilida
dengan fase diam.

Gambar 4. Interaksi senyawa Kafein (A) dan SI asetanilida (B) dengan fase diam
Keterangan :
Interaksi hidrofobik antara senyawa kafein/SI dengan fase diam

Gambar 5 menunjukkan gugus polar yang dimiliki kafein dan SI asetanilida dan
interaksinya dengan fase gerak. Ditinjau dari strukturnya, gugus polar pada senyawa kafein
lebih banyak dibandingkan gugus polar pada SI asetanilida sehingga interaksi kafein
dengan fase gerak lebih besar dibandingkan interaksi SI asetanilida dengan fase gerak.
Interaksi kafein dengan fase diam yang lebih sedikit dibandingkan interaksi SI asetanilida
dengan fase diam serta interaksi kafein dengan fase gerak yang lebih besar dibandingkan
interaksi SI asetanilida dengan fase gerak menyebabkan waktu retensi kafein lebih cepat
dibandingkan waktu retensi SI asetanilida.

10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Gambar 5. Senyawa Kafein (A) dan SI Asetanilida (B) dengan gugus polarnya (
serta interaksinya dengan fase gerak aquabidestilata (H2O) dan metanol (CH3OH)
Keterangan :
Interaksi kafein/SI dengan pelarut aquabidestilata
Interaksi kafein/SI dengan pelarut metanol

)

Hasil kromatogram untuk senyawa kafein dan SI asetanilida menunjukkan
pemisahan puncak yang sempurna dengan puncak senyawa lain yang berdekatan. Hal ini
ditunjukkan dengan nilai Rs > 2,0 mengidentifikasikan bahwa puncak senyawa dapat
terpisah dengan baik dengan senyawa lain yang puncaknya berdekatan (Snyder dkk.,
2010).
Pada tahap optimasi pemisahan kafein dan SI asetanilida dalam sampel plasma,
digunakan 3 seri konsentrasi kafein maupun SI asetanilida menggunakan fase gerak
aquabidestilata dan metanol dengan perbandingan 40:60; 50:50 dan 60:40 serta kecepatan

alir 0,5mL/menit dan 1,0 mL/menit. Penggunaan 3 seri konsentrasi bertujuan untuk
membandingkan tinggi puncak kromatogram sebagai acuan seberapa besar kadar yang
akan digunakan pada tahap validasi metode. Nilai tailing factor dan waktu retensi yang
didapatkan dari sistem KCKT fase terbalik dengan fase gerak perbandingan
aquabidestilata :metanol dengan perbandingan 50:50 dan kecepatan alir 1,0 ml/menit telah

memenuhi persyaratan analisis baik untuk kafein maupun SI (asetanilida), data disajikan
pada Tabel II.

11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel II. Nilai tf dan tR kafein dan SI pada berbagai tingkat
Seri

Senyawa

Kadar

tf

CV

tR (menit)

CV

(g/ml)

(rata-rata ±SD)

(%)

(rata-rata ±SD)

(%)

Kafein

1,6

1,349 ± 0,010

0,741

3,975 ± 0,011

0,266

SI asetanilida

4

1,181 ± 0,012

0,988

6,135 ± 0,030

0,489

Kafein

8

1,329 ± 0,003

0,199

3,973 ± 0,011

0,276

SI asetanilida

8

1,182 ± 0,001

0,049

6,137 ± 0,032

0,524

Kafein

18

1,330 ± 0,003

0,189

3,976 ± 0,011

0,269

SI asetanilida

12

1,192 ± 0,003

0,256

6,142 ± 0,032

0,521

konsentrasi
rendah

tengah

tinggi

Keterangan : masing-masing senyawa dalam setiap kadar direplikasi sebanyak 3 kali.

Berdasarkan uji kesesuaian sistem didapatkan rata-rata nilai tailing factor kafein
yaitu 1,332; rata-rata waktu retensi kafein adalah 4,005 menit, rata-rata resolusi kafein
dengan senyawa lain yang puncaknya terdekat yaitu 2,029, rata-rata nilai tailing factor SI
(asetanilida) yaitu 1,197, rata-rata waktu retensi SI (asetanilida) adalah 6,251, rata-rata
resolusi SI (asetanilida) dengan senyawa lain yang puncaknya terdekat untuk replikasi 1, 2
dan 3 yaitu 8,468 sedangkan rata-rata resolusi SI dengan senyawa lain yang puncaknya
terdekat untuk replikasi 4, 5 dan 6 yaitu 5,723. Nilai resolusi SI (asetanilida) pada replikasi
1, 2 dan 3 jauh berbeda dengan nilai resolusi SI (asetanilida) pada replikasi 4, 5 dan 6
karena puncak terdekat dari SI asetanilida pada replikasi 1, 2 dan 3 merupakan puncak
senyawa kafein yang memiliki waktu retensi sekitar 4,0 menit, sedangkan puncak terdekat
dari SI asetanilida pada replikasi 4, 5 dan 6 terdapat puncak senyawa lain pada waktu
retensi sekitar 4,4 menit. Pada replikasi 4, 5 dan 6 terbaca puncak noise blanko plasma
pada waktu retensi sekitar 4,4 menit, sedangkan pada replikasi 1, 2 dan 3 tidak terbaca
puncak noise pada waktu retensi sekitar 4,4 menit. Hal tersebut menyebabkan resolusi pada
uji kesesuaian sistem untuk SI pada replikasi 1, 2 dan 3 memiliki nilai resolusi yang lebih
tinggi dibandingkan resolusi uji kesesuaian sistem pada replikasi 4, 5 dan 6. Berdasarkan
penjelasan tersebut dapat dikatakan bahwa metode ini telah memenuhi kriteria tailing
factor yang baik yaitu dibawah 2,0; waktu retensi yang efektif yaitu dibawah 10 menit dan

resolusi yang baik yaitu diatas 2,0. Dari uji kesesuaian sistem tersebut didapatkan CV
untuk parameter tailing factor , waktu retensi dan Height Equivalent of a Theoretical Plate
(HETP) baik untuk kafein maupun SI menunjukkan CV < 2% sehingga dapat dikatakan
memenuhi kriteria batasan koefisien variansi untuk uji kesesuaian sistem. Data
selengkapnya disajikan pada tabel III.

12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel III. Data nilai tailing factor kafein dan SI (asetanilida), nilai waktu retensi kafein dan SI
(asetanilida), nilai resousi kafein dan SI (asetanilida), dan nilai HETP kafein dan SI (asetanilida) pada
uji kesesuaian sistem

1
2
3
4
5
6
Rata
-rata
CV
(%)

Tailing
factor
(Kafein)
1,338
1,322
1,326
1,333
1,340
1,334

Waktu
retensi
(Kafein)
4,005
4,006
4,004
4,006
4,005
4,006

Resolusi
(Kafein)

HETP
(Kafein)

Tailing
factor (SI)

Resolusi
(SI)

1,198
1,197
1,196
1,199
1,198
1,195

Waktu
retensi
(SI)
6,250
6,253
6,250
6,251
6,251
6,253

2,072
2,076
2,047
2,019
1,970
1,990

35,247
36,401
35,771
36,357
35,629
35,214

1,332

4,005

2,029

0,5210

0,0204

2,146

Resolusi
(SI)

HETP
(SI)

5,562
5,899
5,709

18,866
19,487
19,253
19,361
19,132
19,013

35,770

1,197

6,251

8,468

5,723

19,185

1,450

0,1230

0,0219

0,7799

2,9521

1,191

8,535
8,403
8,465

KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa kondisi optimum sistem
KCKT fase terbalik menggunakan kolom C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) yang dapat
memisahkan senyawa kafein dan SI asetanilida dari matriks sampel plasma adalah fase
gerak campuran aquabidestiata : metanol dengan perbandingan (50:50) pada kecepatan 1,0
mL/menit; menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 255 nm; serta volume
injeksi sejumlah 20 L.
SARAN
Perlu dilakukan tahap validasi metode setelah tahap optimasi dan jika metode ini
valid dapat dikembangkan untuk kepentingan Therapeutic Drug Monitoring (TDM).

13

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA
Alvi, S.N., dan Hammami, M., M, 2011. Validated HPLC Method for Determination of
Caffeine Level in Human Plasma using Synthetic Plasma: Application to
Bioavailability Studies, Journal of Chromatographic Science. (49), 292-296.
Anonim, 2012. CYP2A6, https://www.pharmgkb.org/gene/PA121?tabType=tabVip,
diakses pada 11 November 2016.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Penerbit Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, 242-246, 326-327, 379-381, 385-386, 388.
Irmanto, A.R., 2008, Validasi Penetapan Kadar Campuran Parasetamol, Propifenazon
dan Kafein dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.
Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, 33-70.
Joewana, S., 2005. Gangguan Mental dan Perilaku Akibat Penggunaan Zat Psikoaktif.
Edisi 2, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 71.
Kang, J.S., dan Lee, M.H., 2009. Overview of Therapy Drug Monitoring, The Korean
Journal of Internal Medicine. (24), 1-10.
Kee, J.L., dan Hayes, E.L., 1996. Fa