Analisis Keragaman Genetik Beberapa Origin Tanaman Kelapa Sawit (Elaeisguineensis Jacq.) Menggunakan Primer Spesifik Ily-2 dan Primer SSR Chapter III VI
23
BAHAN DAN METODE
Waktu Dan Tempat Penelitian
Peneitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Medan dan Laboratorium Bio
Molekuler PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar Desa Martebing
Kecamatan Dolok Masihul Kabupaten Serdang Bedagai Sumatera Utara.
Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2017 sampai bulan Agustus 2017.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel daun
muda kelapa sawit origin sebanyak 36 sampel yang berasal dari plasma nutfah
Pusat Seleksi Bangun Bandar PT. SOCFINDO, Desa Martebing, Kecamatan
Dolok Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara, Primer ILY-2 dan
Primer
SSR
FR-1753
dan
adalahPolyvinylpolypyrolidone
FR-3300.Bahan
kimia
(PVPP),nitrogen
yang
digunakan
cair,
buffer
ekstraksicetyltrimethylammonium bromide (CTAB), buffer ekstraksi CTAB (2 gr
Nacl, 5 gr CTAB, 100 ml aquades), Buffer TAE, buffer TE, KIAA (24ml
klorofom : 1ml isoamil-alkohol) Hcl p.a, NaOH, Na-EDTA, isopropanol dingin,
ethylenediamine tetraacetic (EDTA), β-mercaptoethanol 2%, etanol 70%, etanol
absolute, DNA marker 100bp Ladder, Go taq Green Master Mix, loading dye,
aquades, aquabidest, agarose, kertas tissue, sarung tangan karet, alumunium foil.
Alat yang digunakan dalam penelitan ini adalah mortar, alu, mikropipet
ukuran 1-10 µl, 20-100µl, 100-1000µl, tip pipet (warna kristal, kuning dan biru)
rak tube, autoklaf, waterbath, magnetik stirer, centrifuge, freezeer, komputer,
timbangan elektrik, vortex, cetakan agarose, tabung eppendorf 2ml dan 1,5 ml,
Universitas Sumatera Utara
24
chambell well(bak elekroforesis), power supplay, PCR (Therma Cycler)UV
Transilluminator, Gel-Doc (UV Cambridge), pH meter, alat-alat gelas (beaker
gelas, erlenmeyer, dll), alat tulis, pengaduk , kamera, gunting, pinset, spatula,
timbangan digital.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode marka molekuler
dengan menggunakan primer spesifik ILY-2 dan 2 primer SSR berdasarkan PCR
(Polymerase Chain Reaction) yang mengamplifikasikan sekuen DNA Spesifik,
dan data diolah dengan softwareDARwin 6.
Universitas Sumatera Utara
25
PELAKSANAAN PENELITIAN
Pengambilan sampel
Semua alat disiapkan seperti pisau dan plastik sampel, lalu diambil sampel
daun muda di lapangan dari masing-masing populasi. Daun dibersihkan dengan
air bersih kemudian dibuang tulang daunnya dan daun dipotong kecil-kecil.
Dimasukkan potongan daun ke alumunium foil lalu simpan ke dalam kulkas.
Isolasi DNA dan Pemurnian DNA
Pada penelitian ini, stok DNA origin kelapa sawit yang digunakan untuk
analisis diperoleh dari penelitian Putri, et al (2016). Sehingga untuk penelitian ini
tidak dilakukan lagi kegiatan pengambilan sampel dan isolasi DNA.
Namun secara umum isolasi DNA meliputi tahapan berikut : Daun kelapa
sawit muda yang sudah dicuci dan bersih ditambahkan ke dalam mortar dingin
sebanyak 0,1 gr. Kemudian ditambahkan ± 0,1 gr Polyvinyl-Polypyrolidone dan
nitrogen cair, gerus hingga halus. Serbuk halus yang dihasilkan kemudian
dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml yang berisi 1 ml buffer ekstraksi yang telah
dipanaskan dan diberi 2 μl β-merkaptoethanol 1%. Campuran tersebut kemudian
dikocok menggunakan stirer, lalu dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65 C di
waterbath. Larutan dibiarkan dingin pada suhu kamar lalu, ditambahkan
chloroform : isoamil alkohol 1 Volume. Larutan tersebut disentrifuge selama 10
menit dengan kecepatan 11.000 rpm.
Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tube 2 ml yang baru.
Kemudian ditambahkan 1 volumeChloroform : Isoamil alkohol, tube tersebut
dikocok bolak balik, kemudian tube tersebut disentrifuge selama 10 menit dengan
kecepatan 11.000 rpm, cairan bagian atas didalam tube kemudian dipipet dan
Universitas Sumatera Utara
26
dimasukkan kedalam tube baru kemudian ditambahkan isopropanol dingin
sebanyak 1 volume. Dikocok perlahan hingga homogen kemudian simpan dalam
kulkas 1 - 4 jam, kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan
11.000 rpm. Cairan dan pellet DNA dibuang dan dikeringkan dengan cara
membalikkan tabung.
Pellet DNA dilarutkan dalam 0,1 ml buffer TE, kemudian ditambahkan
CH3COONa 3 M pH 5.2 sebanyak 1/10 volume dan ethanol absolute sebanyak
2,5 volume. Larutan tersebut dikocok hingga homogen dan disimpan dalam
freezeer selama 30 menit atau semalam. Kemudian larutan tersebut disentrifuge
selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, cairan tersebut kemudian dibuang
dan pellet DNA diambil kemudian dicuci dengan ethanol 70% lalu dikeringkan.
Pellet DNA yang sudah kering dilarutkan dalam 50 μl buffer TE atau nuclease
free water, ditambahkan RNA-se 25 μl, kemudian simpan dalam freezer. Kualitas
DNA kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarose 2% dan konsentrasinya
diukur dengan nanospec pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm.
Uji Kuantitas DNA
Sebanyak 2 μlstok DNA diukur menggunakan Nanospektrometer sinar
UV. Absorban diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian
DNA ditemukan dari nilai perbandingan A260/A280.
Konsentrasi DNA = Faktor konversi x faktor pengenceran x A260
Tingkat kemurnian DNA ditetapkan dengan membandingkan nilai absorbansi
pada A260 nm terhadap A280 nm. Bila rasio perbandingan menunjukkan nilai
1,8-2,0 maka tingkat konsentrasi DNA dinyatakan memenuhi syarat untuk
dianalisis selanjutnya.
Universitas Sumatera Utara
27
Uji Kualitas DNA
Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan
cara memasukkan 2 μlstok DNA ditambah μlloading dye kedalam sumur gel
agarose 0,8 %.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8%
(h/v). Agarose ditimbang 1,04 g kemudian dilarutkan kedlam 130 ml buffer TAE
1X atau buffer TBE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer
kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik sehingga larutan
menjadi bening kemudian didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada
air yang mengalir. Setelah larutan agak dingin
(suhu 60oC), ditambahkan 1
μletidium bromida, diaduk sambil dipanaskan kembali selama 2 menit
dan
didinginkan ampai 600C kemudian larutan dimasukkan kedalam cetakan agar
yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama 40
menit. Gel yang telah memadat dimasukkan kedalam elektroforesis dan diberi
larutan TAE 1x atau larutan TBE 1x sebanyak 670 ml (hingga terendam) DNA
yang telah disiapkan dimasukkan kedalam summur gel. Setelah semua lubang
sumur gel berisi selanjutnya di elektroforesis. Running elektroforesisdilakukan
pada kondisi 75 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah
dielektroforesis dilakukan dengan UV Transluminator dan didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik hasil elektroforesis menunjukkan pola pita
yang terang yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid,
utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
28
Amplifikasi dan Genotiping
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer spesifik ILY-2 dan
Primer SSR FR-1753 dan FR-3300. Sebelum running PCR dilakukan
pengenceran DNA dengan mengambil 9 μl stok DNA dan ditambah 15μl ddH2O
sehingga diperoleh 24μl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer
yaitu tube primer di sentrifuge selama 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O
sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 μl stok
primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR
yaitu paket PCR produksi promegadalam kotak berisi pecahan es. untuk
mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan
digunakan maka larutan master terdiri dari : ddH2O 3,5 μl X 5 = 17,5 μ, Go Tag
7,5μl x5 = 37,5 μ, aliquot primer 1μl x 5 = 5 μl. Dari tube diambil 15 μl ketube
yang lain sehingga diperoleh 5 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing
DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA
dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel dimesin PCR dengan
annealing540C. Reaksi amplifikasi thermocycler didesain waktu, suhu, dan
jumlah siklus termal 30-35 kali yang telah digunakan pada tanaman kelapa sawit.
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu
200C bila sedang tidak digunakan. Dapat dilihat proses amplifikasi mesin
Polymerase chain Reaction (PCR) pada Tabel 1.
Tabel 1. Proses amplifikasi PCR
Tahapan
Suhu (oC)
Waktu
Jumlah siklus
Universitas Sumatera Utara
29
Pre Denaturasi
Denaturasi
Annealing
Ekstensi
Ekstensi Akhir
Cooling
94
94
54
72
72
4
2 menit
2 menit
1 menit
1 menit
10 menit
Unlimited
1
30-35
30-35
30-35
1
1
Elektroforesis
Bak elektroforesis disiapkan dan diisi dengan TBE 0,5x sebanyak 300 ml.
Kemudian cetakan gel yang sudah kering dimasukkan ke dalam bak, cetakan gel
dipastikan terendam dalam buffer. Kemudian loading buffer disiapkan dalam
parafilm dan dicampurkan dengan sampel. Dimasukkan sampel ke dalam sumursumur
elektroforesis
lalu
dijalankan
alat
elektroforesis
dengan
menghubungkannya dengan power supply.
Analisis Data
Penentuan Ukuran Pita Hasil PCR
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan UVITEC Cambridge FireReader , fragmen DNA yang
digunakan sebagai standart ukuran yaitu 1 kb + (Invitrogen) DNA ladder, data
gambar hasil elektroforesis yang dimasukkan kedalam program akan dideteksi
muncul tidaknya band dan dinilai berdasarkan marker valueyang telah
dimasukkan.
Analisis Hubungan Genetik
Untuk penentuan kekerabatan genetik, produk PCR diskoring berdasarkan
muncul tidaknya pita. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel,
keragaman alel ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel dari masingmasing sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan
Universitas Sumatera Utara
30
kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada)
(Ferreira dan Grattapaglia, 1998).
Data
skooring
kemudian
diolah
dengan
menggunakan
software
DARwin 6.0.13 (Perrier dan Jacquemoud, 2009) dimana matriks jarak atau
ketidaksamaan genetik genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat
dilakukan dengan
Coordinates
ketidaksamaan
dua analisis deskriptif dari keragaman; (i) Principal
Analysis(PCoA),
untuk
suatu
jenis
mendapatkan
analisi
group
faktorial
origin
pada
tabel
utama
dan
(ii) Neighbor joining Tree(NJTRee) untuk memperoleh gambaran dari
kekerabatan antara individu.
Universitas Sumatera Utara
31
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Identitas sampel yang digunakan sebanyak 36 sampel Origin Kelapa Sawit
terdapat pada Tabel 2.
Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka molekuler terkait
karakter karakter asam oleat pada tanaman kelapa sawit
(primer ILY-2)
menunjukkan pola pita (amplikon) yang dengan persentasi polimorfisme yang
67% dan pada primer SSR FR-3300 dan FR-1753 dengan polimorfisme sebesar
100% . terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang
sama tapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini
diperoleh fragmen pita polimorfik dengan ukuran berkisar 127 bp-1324bp.
Berdasarkan hasil PCoA dapat diketahui bahwa keragaman dari 36 sampel
DNA stok tanaman kelapa sawit
sangat yaitu sebesar36.65%
dan analisis
dendogram menunjukkan 36 sampel DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi 3
kelompok utama.
Universitas Sumatera Utara
32
Tabel 2. Identitas sampel yang digunakan
Kode
Sampel
1D
2D
2B
3D
3B
4D
4B
5D
5B
6D
7D
8D
8B
9D
10D
10B
11D
11B
12D
12B
13D
13B
14D
14B
20D
20B
22D
22B
24D
24B
26D
26B
27D
27B
29D
29B
Origin
Jenis Buah
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
WA
WA
WA
WA
WA
WA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Virescens
Virescens
Nigrescens
Nigrescens
Virescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Tahun
Tanam
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2005
2005
2005
2005
2005
2005
2012
2012
2012
2012
2012
2012
Bentuk Sampel
yang diisolasi
Daun
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Daun
Daun
Buah
Daun
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Universitas Sumatera Utara
33
Visualisasi Hasil Amplifikasi
Sebanyak 36 stok sampel DNA tanaman kelapa sawit di amplifikasi
dengan mesin PCR menggunakan Primer Spesifik ILY-2 dan 2 primer SSR yaitu
FR-1753 dan FR-3300 kemudian dielektroforesis dengan menggunakan agarose
sebanyak 1,3% untuk primer Spesifik ILY-2 dan agarose sebanyak 3% untuk
primer SSR yang divisualisasi dengan menggunakan UV Translumilator. Untuk
bebebrapa sampel yang tidak berhasil diamplifikasi telah dilakukan pengulangan
prosedur PCR –SSR, sedangkan pada primer spesifik ILY-2 semua sampel dapat
teramplifikasi. Hasil akhir menunjukkan bahwa ada Sampel yang tidak
teramplifikasi pada primer FR-3300 sebanyak 3 sampel dan pada primer FR-1753
yang tidak teramplifikasi sebanyak 6 sampel(Tabel 3).
Tabel 3. Hasil Amplifikasi Primer ILY-2 dan SSR
Nomor Nama
Jumlah
Jumlah Aksesi
Primer
Aksesi
yang Tidak
Teramplifika Terampifikasi
si
1
ILY-2
36
0
No Aksesi
-
2
FR33
3
7D,20D,27B
3300
3
FR30
6
7D,8D,10D,8B,10B,12
1753
B
Amplifikasi 36 aksesi origin kelapa sawit primer Spesifik ILY-2 dan 2
Primer SSR menunjukkan polimorfisme yang tinggi.Hasil pengamatan jumlah
fragmen DNA dan persentase polimorfik setiap primer dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Persentase polimorfik
No.
Nama
Ukuran
.
Primer
Pita (bp)
1.
ILY-2
472-1324
2.
FR 3300
186-410
3.
FR 1753
127-177
Total
Rata-Rata
Σ
Pita
3
6
4
13
4,3
Σ Pita
Polimorfik
2
6
4
12
4
Σ Pita
Monomorfik
1
0
0
1
0,3
%
Polimorfik
67%
100%
100%
267%
89%
Universitas Sumatera Utara
34
Pada Tabel 4 dapat terlihat bahwa pola pita yang dihasilkan oleh 3 primer
yang digunakan menghasilkan pola pita yang bervariasi. Ukuran pita-pita yang
dihasilkan bervariasi antara 127 bp- 1324bp. Total pola pita dari ketiga primer
sebanyak 13 dengan rata-rata 4,3 pita per primer. Pita polimorfik yang dihasilkan
sebanyak 12 pita dan total pita monomorfik sebanyak 1 pita.
Persentase pita polimorfik berkisar antara 67% sampai 100% dengan ratarata 89% untuk semua primer. Jumlah pita tertinggi dan ukuran pasangan basa
tertinggi yaitu 4 pita dengan ukuran sebesar 1324 bp terdapat pada primer ILY-2
sedangkan jumlah pola pita terendah dan ukuran pasang basa terendah terdapat
pada primer FR 1753dengan ukuran 127 bp.
Primer ILY-2 mampu menunjukkan amplifikasi pada 36 DNA origin
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 3 dan
ukuran pita sekitar 472 bp, 752 bp dan 1324 bp. Visualisasi primer ILY-2 dapat
dilihat pada Gambar 1. Persentase pita polimorfis sebesar 67% dan persentase pita
momorfis sebesar 33%.
Primer FR 3300 mampu menunjukkan amplifikasi pada 33 DNA klon
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 6 dan
ukuran pita sekitar 186 bp,213bp, 233 bp, 248 bp, 383 bp
dan 410 bp.
Persentasepolimorfis sebesar 100%. Visualisasi primer FR 3300dapat dilihat pada
Gambar 2.
Primer FR 1753 mampu menunjukkan amplifikasi pada 30 DNA origin
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 4 dan
ukuran pita sekitar 127 bp, 155 bp, 166 bp dan 177 bp. Persentase pita
Universitas Sumatera Utara
35
polimorfisme sebesar 100% dan persentase pita monomorfis sebesar 0%.
Visualisasi primer FR 1753 dapat dilihat pada Gambar 3.
M
1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D13D14D20D
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M
22D 24D 26D 27D 29D 2B 3B 4B 5B 8B 10B 11B 12B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
M 13B 14B 20B 22B 24B 26B 27B 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
Gambar 1. Profil elektroforegram produk PCR Primer ILY-2 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb +(Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
Universitas Sumatera Utara
36
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
M
1D2D3D 4D 5D 3B 5B 8D 12D 10D11D D13D 20D 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M 3D 6D 7D 9D 12D 14D 22D 24D 26D 27D 29D 3B 4B 5B 8B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M10B 11B 12B 13B 14B 20B 22B 24B 26B 27B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 2. Profil elektroforegram produk PCR Primer FR-3300 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb + (Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
Universitas Sumatera Utara
37
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M
1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D13D14D20D
M 22D 24D 26D 27D 29D 2B 3B 4B 5B 8B 10B 11B 12B 13B 14B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M 20B 22B 24B 26B 27B 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 3. Profil elektroforegram produk PCR Primer FR-1753 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb +(Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
Universitas Sumatera Utara
38
Analisis hubungan genetik
Gambar menunjukkan persentase keragaman genetik berdasarkan analisis
faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis). Melalui software DARwin
6.0.13 keragaman molekuler dari hasil analisis faktorial menunjukkan bahwa total
keragaman molekuler pada aksis 1 sebesar 21,37% dan aksis 2 sebesar 15,28%
dengan total 36,65%, sebaran genetik sampel-sampel terdapat pada semua bidang
yang terbentuk dari aksis 1 dan aksis 2.
.35
4B
.3
26D
24D
22D
6D
.25
3D
3B
.2
.15
5D
24B
27B
29D
.1
13B
.05
-.45
-.4
-.35
-.3
2B
-.25
-.2
-.15
-.1
-.05
.05
.1
26B
22B
20B
12D
10D
-.5
27D
14D
9D
10B
.15
.2
-.05
.25
14B
.3
.35
11D
29B
-.1
20D
1D
-.15
7D
2D
-.2
8D
8B -.25
4D
5B
11B
-.3
-.35
-.4
12B
-.45
13D
Gambar 4. Analisis faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis) Aksis 1
(Horizontal) dan Aksis 2 (Vertical) berdasarkan matrix dissimilarity
simple matching dengan menggunakan ILY 2dan FR 3300,FR 1753
Universitas Sumatera Utara
39
Hasil analisis pengelompokan dengan metode Matrix Dissimilarity
SimpleMatching untuk 36 sampel stok DNA kelapa sawit dengan marka primer
ILY-2, SSR FR-3300 dan FR-1753 menghasilkan dendogram yang menunjukkan
bahwa semua sampel dapat dibedakan dengan jelas antara satu dengan yang lain
(Gambar 4).
4D
34
12
0
0
57
0
2D
12B
45
8B
44
8D
24D
53
22D
26D
35 54
55
61
69
24
70
2B
60
48
0
14
56
81
68
0
66
5
0
50
16
49
65
67
30
53
22
63
67
0
26B
37
22B
14B
20B
29D
10B
62
17
46
51
52
64
11
6D
3D
34
5
1
10D
5D
48
8
7D
4B
58
49
2
1D
59
13
1
38
43
3B
14D
40
61
41
27D
5B
11D
11B
38
39
47
20D
13B
42
9D
24B
29B
27B
2
12D
13D
3
0.1
Gambar 5. Profil Filogenik dendogram Neigbor-Joining dari 36 sampel DNA stok
kelapa sawit berdasarkan matrix dissimilarity simple matching dengan
menggunakan Spesifik
Dari Gambar 5dapat diketahui bahwa 36 sampel DNA stok kelapa sawit
terbagi menjadi 3 kelompok utama (cluster). Kelompok pertama (15 sampel)
yangterdiri dari originLame (6 sampel),origin Kamerun(5 sampel), origin WA
Universitas Sumatera Utara
40
(2 sampel), origin Angola(1 sampel) dan origin Yangambi (1sampel). Kelompok
kedua (19 sampel) yang terdiri dari origin Lame (1 sampel), origin Kamerun (4
sampel), origin Yangambi (7sampel), origin WA (4 sampel), origin Angola (3
sampel). Kelompok ketiga (2 sampel) yang berasal dari origin Angola (2 sampel).
Hasil analisis Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dapat dilihat pada Gambar
5.
Pembahasan
Informasi keragaman genetik merupakan informasi mengenai variasi atau
perbedaan karakteristik akibat keanekaragaman genetik yang ada dalam suatu
spesies. Hal ini dapat terjadi akibat evolusi maupun reproduksi seksual. Penilaian
keragaman genetik tanaman dapat menggunakan penanda morfologi, biokimia dan
molekuler. Hal ini sesuai dengan pernyataan Zulfahmi (2013) bahwa keragaman
tingkat genetik merupakan tingkat keragaman yang paling rendah dalam
organisasi biologi. Informasi keragaman genetik tanaman pada tingkat individu,
spesies maupun populasi perlu diketahui, sebagai dasar pertimbangan dalam
menyusun
strategi
konservasi,
pemuliaan,
pengelolaan
dan
pemanfaatansumberdaya genetik tanaman secara berkelanjutan. Penilaian
keragaman genetik tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan penanda
morfologi, biokimia dan molekuler DNA.
Marka SSR (Simple Sequence Repeat) merupakan penanda molekuler
yang dapat digunakan untuk mengevaluasi struktur keragaman genetik genus
Elaeis. Kelebihan marka ini bersifat kodominan, mudah dan ekonomis dalam
pengaplikasiannya serta memiliki tingkat polimorfisme tinggi. Tingkat keragaman
molekuler berdasarkan 2 marka SSR yang diuji adalah sebesar 100%. Artinya
Universitas Sumatera Utara
41
bahwa primer SSR yang diuji dapat menunjukkan adanya perbedaan antara origin
yaitu sebesar 100%.
Pada Tabel. 4 dapat terlihat dari empat primer yang digunakan 2 primer
memiliki persentase polimorfisme sebesar 100% yaitu primer FR 3300 dan FR
1753sedangkan primer lain memiliki pita polimorfis yang 67% yaitu pada primer
ILY-2 sesuai dengan pernyataan Putri (2010) menyatakan bahwa keunggulan dari
marka DNA yaitu dapat menunjukkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah
banyak, konsistensi, dan tidak dipengaruhi lingkungan yang mampu menetapkan
variabilitas genetik populasi.
Hasil penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa primer FR-3300,
FR-1753, bersifat heterozigot.Primer heterozigot merupakan primer yang mampu
menunjukkan alel yang berbeda, alel seperti ini juga dikatakan dengan alel
kodominan.Hal ini membuktikkan bahwa SSR mampu mengidentifikasi
keberadaan alel kodominan.Hal ini sesuai dengan pernyataan Arumsari (2013)
yang menyatakan bahwa SSR bersifat kodominan, dan memiliki tingkat
polimorfisme yang tinggi.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diketahui bahwa individu nomor 4B
memiliki perbedaan alel dengan 35 sampel lainnya yang teridentifikasi oleh
primer FR-3300 dan FR1-753.Hal ini membuktikan bahwa individu nomor 4B
tersebut memiliki perbedaan genetik dengan sampel lainnya sehingga primer
FR-3300 dan primer FR-1753 dapat mendeteksi keragaman alel.Hal ini sesuai
dengan pernyataan Sayekti, et al (2015) yang menyatakan bahwa primer SSR
dapat mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi dan variatif.
Universitas Sumatera Utara
42
Hasil penelitian selanjutnya telah dapat diketahui bahwa ada pita yang
tidak teramplifikasi pada nomor sampel 7D,20D,27B. Pada primer FR-3300 dan
nomor sampel pada 7D,8D,10D,8B,10B,12 B pada primer FR-1753 . Sampel yang
tidak menunjukkan adanya amplifikasi berarti basa nukleotida tidak menempel
pada sekuen target. Hal ini sesuai dengan Ariani (2014) yang menyatakan bahwa
basa nukleotida hanya akan menempel pada sekuen target.
Pada Gambar 1 yang menunjukkan profil amplikon menggunakan primer
ILY-2 didapati pada semua sampel yang teramplifikasi oleh mesin PCR. Hal ini
menunjukkan bahwa semua sampel origin mengandung asam oleat didalamnya
baik yang di sintesis melalui daun maupun yang diisolasi melalui buah.
Pada primer ILY-2 perbedaan bagian tanaman yang diisolasi DNAnya dari
satu individu yang sama juga memperlihatkan pola pita yang berbeda. Perbedaan
ini terdapat pada bagian daun dengan buah, salah satu contoh sampel yang
menunjukkan perbedaan pola pita yang sangat nyata adalah sampel 13D, 14D,
22D, 26D,27D,29D. Pada sampel 13D membentuk satu amplikon dengan ukuran
472 bp dan pada sampel 14D, 22D, 26D,27D,29Dterbentuk dua amplikon dengan
ukuran 472 bp -752bp. Sedangkan pada sampel 13B, 14B, 22B, 26B,27B,29B
pada tiap masing-masingnya Tiga amplikon dengan ukuran472 bp -1324 bp. Ini
menunjukkan bahwa asam oleat lebih banyak terkandung pada buah dibandingkan
pada daun.
Pada primer ILY-2 Perbedaan bagian tanaman yang diisolasi DNAnya dari
satu individu yang sama juga memperlihatkan pola pita yang berbeda. Perbedaan
ini terdapat pada bagian daun dengan buah, salah satu contoh sampel yang
menunjukkan perbedaan pola pita yang sangat nyata adalah sampel 13D, 14D,
Universitas Sumatera Utara
43
22D, 26D,27D,29D. Pada sampel 13D membentuk satu amplikon dengan ukuran
472 bp dan pada sampel 14D, 22D, 26D,27D,29Dterbentuk dua amplikon dengan
ukuran
472
bp
-752bp.
Sedangkan
pada
sampel
13B,
14B,
22B,
26B,27B,29Bpada tiap masing-masingnya Tiga amplikon dengan ukuran472 bp 1324 bp. Seperti yang telah diduga pada paragraf sebelumnya, hal ini disebabkan
oleh tiap-tiap bagian tanaman membentuk biosintesis asam oleat yang berbeda.
Perbedaan tingkat kandungan metabolit sekunder yang diproduksi pada tiap
bagian tanaman diduga menjadi salah satu penyebab terjadinya perbedaan
amplikon yang dihasilkan. Sebab diketahui bahwa kandungan metabolit sekunder
pada tanaman dapat mengganggu proses amplifikasi pada saat PCR.
Pita yang ada pada ukuran 483 bp dapat teramplifikasi pada 36 sampel
menunjukkan semua individu tanaman kelapa sawit secara konsisten memiliki gen
yang menyandikan asam oleat pada ukuran pasangan basa tertentu. Dengan kata
lain, primer ILY-2 yang telah didesain oleh Putri (2016) dapat dijadikan sebagai
acuan marka molekuler genetik terhadap karakter asam oleat untuk tanaman
kelapa sawit.
Amplikon-amplikon DNA dari primer ILY-2 dan SSR diterjemahkan atau
lebih umum disebut diskoring, ke dalam bentuk data binari yaitu dengan
menuliskan angka 1 bila terdapat amplikon dan angka 0 bila tidak terdapat pita.
Data binari dari pita yang telah diskoring kemudian dianalisis dengan
menggunakan software DARwin 6.0.13 sehingga didapatkan hasil yaitu
dendogram. Dendogram adalah pohon filogenetik yang menggambarkan
pengelompokkan sampel dengan Operational Taxonomic Unit (OTU) yang
berderet rata secara vertikal pada satu sisi yang berbentuk pohon. Setiap cabang
Universitas Sumatera Utara
44
pada dendogram dilakukan analisis kepercayaan cabang dengan metode bootstrap
yang dilakukan sampai 1000 kali. Pada penelitian ini diketahui bahwa 36 sampel
DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi tiga kelompok utama yang masing-masing
memiliki sub kelompok.Kelompok pertama (15 sampel) yang terdiri dari origin
Lame (6 sampel),origin Kamerun (5 sampel), origin WA (2 sampel), origin
Angola(1 sampel) dan origin Yangambi (1 sampel). Kelompok kedua (19 sampel)
yang terdiri dari origin Lame (1 sampel), origin Kamerun (4 sampel), origin
Yangambi (7 sampel), origin WA (4 sampel), origin Angola (3 sampel).
Kelompok ketiga (2 sampel) yang berasal dari origin Angola 2 (sampel). Hasil
analisis faktorial untuk PCoA juga menunjukkan bahwa keragaman secara
molekuler menggunakan primer ILY2, Primer SSR FR-3300 dan FR-1753 adalah
sebesar 36,65%. Hal ini menunjukkan bahwa adanya variasi genetik di antara
sampel yang satu dengan sampel lainnya menyebabkan perbedaan yang dapat
dibedakan atau dikelompokkan dengan jelas. Keragaman genetik yang tinggi
membuka peluang yang besar untuk mendapatkan kultivar unggul.
Universitas Sumatera Utara
45
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1.
Hasil amplifikasi DNA dengan primer ILY-2 pada origin kelapa sawit
menunjukkan pola pita (amplikon) yang beragam sebanyak 3 amplikon
dengan persentase polimorfis 67%. Adanya Perbedaan pola pita pada
sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber
bagian tanaman yang diisolasi. Diperoleh Fragmen Pita ± 472bp- 1324bp.
Keragaman molekuler dari 36origin kelapa sawit yaitu sebesar
36,65 % dengan analisis dendogram menunjukkan terbagi menjadi 3
kelompok utama.
2. Primer polimorfis ditunjukkan oleh FR 3300 dan FR1753yang
ditunjukkan oleh FR 3300 pada 127bp, 154 bp, 166 bp dan 177 bp serta
FR 1753 pada 186 bp, 213bp,233bp,248bp,383bp dan 410 bp. Primer FR
3300 dapat menunjukkan perbedaan pola pita DNA pada sampel nomor
4B.
Saran
Sebaiknya dilakukan penambahan primer SSR dan analisis Sequencing
untuk menambah informasi molekuler yang lebi akurat.
Universitas Sumatera Utara
BAHAN DAN METODE
Waktu Dan Tempat Penelitian
Peneitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman
Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Medan dan Laboratorium Bio
Molekuler PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar Desa Martebing
Kecamatan Dolok Masihul Kabupaten Serdang Bedagai Sumatera Utara.
Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2017 sampai bulan Agustus 2017.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel daun
muda kelapa sawit origin sebanyak 36 sampel yang berasal dari plasma nutfah
Pusat Seleksi Bangun Bandar PT. SOCFINDO, Desa Martebing, Kecamatan
Dolok Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara, Primer ILY-2 dan
Primer
SSR
FR-1753
dan
adalahPolyvinylpolypyrolidone
FR-3300.Bahan
kimia
(PVPP),nitrogen
yang
digunakan
cair,
buffer
ekstraksicetyltrimethylammonium bromide (CTAB), buffer ekstraksi CTAB (2 gr
Nacl, 5 gr CTAB, 100 ml aquades), Buffer TAE, buffer TE, KIAA (24ml
klorofom : 1ml isoamil-alkohol) Hcl p.a, NaOH, Na-EDTA, isopropanol dingin,
ethylenediamine tetraacetic (EDTA), β-mercaptoethanol 2%, etanol 70%, etanol
absolute, DNA marker 100bp Ladder, Go taq Green Master Mix, loading dye,
aquades, aquabidest, agarose, kertas tissue, sarung tangan karet, alumunium foil.
Alat yang digunakan dalam penelitan ini adalah mortar, alu, mikropipet
ukuran 1-10 µl, 20-100µl, 100-1000µl, tip pipet (warna kristal, kuning dan biru)
rak tube, autoklaf, waterbath, magnetik stirer, centrifuge, freezeer, komputer,
timbangan elektrik, vortex, cetakan agarose, tabung eppendorf 2ml dan 1,5 ml,
Universitas Sumatera Utara
24
chambell well(bak elekroforesis), power supplay, PCR (Therma Cycler)UV
Transilluminator, Gel-Doc (UV Cambridge), pH meter, alat-alat gelas (beaker
gelas, erlenmeyer, dll), alat tulis, pengaduk , kamera, gunting, pinset, spatula,
timbangan digital.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah metode marka molekuler
dengan menggunakan primer spesifik ILY-2 dan 2 primer SSR berdasarkan PCR
(Polymerase Chain Reaction) yang mengamplifikasikan sekuen DNA Spesifik,
dan data diolah dengan softwareDARwin 6.
Universitas Sumatera Utara
25
PELAKSANAAN PENELITIAN
Pengambilan sampel
Semua alat disiapkan seperti pisau dan plastik sampel, lalu diambil sampel
daun muda di lapangan dari masing-masing populasi. Daun dibersihkan dengan
air bersih kemudian dibuang tulang daunnya dan daun dipotong kecil-kecil.
Dimasukkan potongan daun ke alumunium foil lalu simpan ke dalam kulkas.
Isolasi DNA dan Pemurnian DNA
Pada penelitian ini, stok DNA origin kelapa sawit yang digunakan untuk
analisis diperoleh dari penelitian Putri, et al (2016). Sehingga untuk penelitian ini
tidak dilakukan lagi kegiatan pengambilan sampel dan isolasi DNA.
Namun secara umum isolasi DNA meliputi tahapan berikut : Daun kelapa
sawit muda yang sudah dicuci dan bersih ditambahkan ke dalam mortar dingin
sebanyak 0,1 gr. Kemudian ditambahkan ± 0,1 gr Polyvinyl-Polypyrolidone dan
nitrogen cair, gerus hingga halus. Serbuk halus yang dihasilkan kemudian
dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml yang berisi 1 ml buffer ekstraksi yang telah
dipanaskan dan diberi 2 μl β-merkaptoethanol 1%. Campuran tersebut kemudian
dikocok menggunakan stirer, lalu dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65 C di
waterbath. Larutan dibiarkan dingin pada suhu kamar lalu, ditambahkan
chloroform : isoamil alkohol 1 Volume. Larutan tersebut disentrifuge selama 10
menit dengan kecepatan 11.000 rpm.
Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tube 2 ml yang baru.
Kemudian ditambahkan 1 volumeChloroform : Isoamil alkohol, tube tersebut
dikocok bolak balik, kemudian tube tersebut disentrifuge selama 10 menit dengan
kecepatan 11.000 rpm, cairan bagian atas didalam tube kemudian dipipet dan
Universitas Sumatera Utara
26
dimasukkan kedalam tube baru kemudian ditambahkan isopropanol dingin
sebanyak 1 volume. Dikocok perlahan hingga homogen kemudian simpan dalam
kulkas 1 - 4 jam, kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan
11.000 rpm. Cairan dan pellet DNA dibuang dan dikeringkan dengan cara
membalikkan tabung.
Pellet DNA dilarutkan dalam 0,1 ml buffer TE, kemudian ditambahkan
CH3COONa 3 M pH 5.2 sebanyak 1/10 volume dan ethanol absolute sebanyak
2,5 volume. Larutan tersebut dikocok hingga homogen dan disimpan dalam
freezeer selama 30 menit atau semalam. Kemudian larutan tersebut disentrifuge
selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, cairan tersebut kemudian dibuang
dan pellet DNA diambil kemudian dicuci dengan ethanol 70% lalu dikeringkan.
Pellet DNA yang sudah kering dilarutkan dalam 50 μl buffer TE atau nuclease
free water, ditambahkan RNA-se 25 μl, kemudian simpan dalam freezer. Kualitas
DNA kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarose 2% dan konsentrasinya
diukur dengan nanospec pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm.
Uji Kuantitas DNA
Sebanyak 2 μlstok DNA diukur menggunakan Nanospektrometer sinar
UV. Absorban diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian
DNA ditemukan dari nilai perbandingan A260/A280.
Konsentrasi DNA = Faktor konversi x faktor pengenceran x A260
Tingkat kemurnian DNA ditetapkan dengan membandingkan nilai absorbansi
pada A260 nm terhadap A280 nm. Bila rasio perbandingan menunjukkan nilai
1,8-2,0 maka tingkat konsentrasi DNA dinyatakan memenuhi syarat untuk
dianalisis selanjutnya.
Universitas Sumatera Utara
27
Uji Kualitas DNA
Uji Kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan
cara memasukkan 2 μlstok DNA ditambah μlloading dye kedalam sumur gel
agarose 0,8 %.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8%
(h/v). Agarose ditimbang 1,04 g kemudian dilarutkan kedlam 130 ml buffer TAE
1X atau buffer TBE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer
kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik sehingga larutan
menjadi bening kemudian didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada
air yang mengalir. Setelah larutan agak dingin
(suhu 60oC), ditambahkan 1
μletidium bromida, diaduk sambil dipanaskan kembali selama 2 menit
dan
didinginkan ampai 600C kemudian larutan dimasukkan kedalam cetakan agar
yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama 40
menit. Gel yang telah memadat dimasukkan kedalam elektroforesis dan diberi
larutan TAE 1x atau larutan TBE 1x sebanyak 670 ml (hingga terendam) DNA
yang telah disiapkan dimasukkan kedalam summur gel. Setelah semua lubang
sumur gel berisi selanjutnya di elektroforesis. Running elektroforesisdilakukan
pada kondisi 75 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah
dielektroforesis dilakukan dengan UV Transluminator dan didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik hasil elektroforesis menunjukkan pola pita
yang terang yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid,
utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
28
Amplifikasi dan Genotiping
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer spesifik ILY-2 dan
Primer SSR FR-1753 dan FR-3300. Sebelum running PCR dilakukan
pengenceran DNA dengan mengambil 9 μl stok DNA dan ditambah 15μl ddH2O
sehingga diperoleh 24μl aliquot DNA. Kemudian dilakukan pengenceran primer
yaitu tube primer di sentrifuge selama 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O
sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 μl stok
primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR
yaitu paket PCR produksi promegadalam kotak berisi pecahan es. untuk
mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan
digunakan maka larutan master terdiri dari : ddH2O 3,5 μl X 5 = 17,5 μ, Go Tag
7,5μl x5 = 37,5 μ, aliquot primer 1μl x 5 = 5 μl. Dari tube diambil 15 μl ketube
yang lain sehingga diperoleh 5 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing
DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA
dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel dimesin PCR dengan
annealing540C. Reaksi amplifikasi thermocycler didesain waktu, suhu, dan
jumlah siklus termal 30-35 kali yang telah digunakan pada tanaman kelapa sawit.
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu
200C bila sedang tidak digunakan. Dapat dilihat proses amplifikasi mesin
Polymerase chain Reaction (PCR) pada Tabel 1.
Tabel 1. Proses amplifikasi PCR
Tahapan
Suhu (oC)
Waktu
Jumlah siklus
Universitas Sumatera Utara
29
Pre Denaturasi
Denaturasi
Annealing
Ekstensi
Ekstensi Akhir
Cooling
94
94
54
72
72
4
2 menit
2 menit
1 menit
1 menit
10 menit
Unlimited
1
30-35
30-35
30-35
1
1
Elektroforesis
Bak elektroforesis disiapkan dan diisi dengan TBE 0,5x sebanyak 300 ml.
Kemudian cetakan gel yang sudah kering dimasukkan ke dalam bak, cetakan gel
dipastikan terendam dalam buffer. Kemudian loading buffer disiapkan dalam
parafilm dan dicampurkan dengan sampel. Dimasukkan sampel ke dalam sumursumur
elektroforesis
lalu
dijalankan
alat
elektroforesis
dengan
menghubungkannya dengan power supply.
Analisis Data
Penentuan Ukuran Pita Hasil PCR
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan UVITEC Cambridge FireReader , fragmen DNA yang
digunakan sebagai standart ukuran yaitu 1 kb + (Invitrogen) DNA ladder, data
gambar hasil elektroforesis yang dimasukkan kedalam program akan dideteksi
muncul tidaknya band dan dinilai berdasarkan marker valueyang telah
dimasukkan.
Analisis Hubungan Genetik
Untuk penentuan kekerabatan genetik, produk PCR diskoring berdasarkan
muncul tidaknya pita. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel,
keragaman alel ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel dari masingmasing sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan
Universitas Sumatera Utara
30
kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada)
(Ferreira dan Grattapaglia, 1998).
Data
skooring
kemudian
diolah
dengan
menggunakan
software
DARwin 6.0.13 (Perrier dan Jacquemoud, 2009) dimana matriks jarak atau
ketidaksamaan genetik genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat
dilakukan dengan
Coordinates
ketidaksamaan
dua analisis deskriptif dari keragaman; (i) Principal
Analysis(PCoA),
untuk
suatu
jenis
mendapatkan
analisi
group
faktorial
origin
pada
tabel
utama
dan
(ii) Neighbor joining Tree(NJTRee) untuk memperoleh gambaran dari
kekerabatan antara individu.
Universitas Sumatera Utara
31
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Identitas sampel yang digunakan sebanyak 36 sampel Origin Kelapa Sawit
terdapat pada Tabel 2.
Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka molekuler terkait
karakter karakter asam oleat pada tanaman kelapa sawit
(primer ILY-2)
menunjukkan pola pita (amplikon) yang dengan persentasi polimorfisme yang
67% dan pada primer SSR FR-3300 dan FR-1753 dengan polimorfisme sebesar
100% . terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang
sama tapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini
diperoleh fragmen pita polimorfik dengan ukuran berkisar 127 bp-1324bp.
Berdasarkan hasil PCoA dapat diketahui bahwa keragaman dari 36 sampel
DNA stok tanaman kelapa sawit
sangat yaitu sebesar36.65%
dan analisis
dendogram menunjukkan 36 sampel DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi 3
kelompok utama.
Universitas Sumatera Utara
32
Tabel 2. Identitas sampel yang digunakan
Kode
Sampel
1D
2D
2B
3D
3B
4D
4B
5D
5B
6D
7D
8D
8B
9D
10D
10B
11D
11B
12D
12B
13D
13B
14D
14B
20D
20B
22D
22B
24D
24B
26D
26B
27D
27B
29D
29B
Origin
Jenis Buah
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
LAME
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
KAMERUN
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
YANGAMBI
WA
WA
WA
WA
WA
WA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
ANGOLA
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Virescens
Virescens
Nigrescens
Nigrescens
Virescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Nigrescens
Tahun
Tanam
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2006
2005
2005
2005
2005
2005
2005
2012
2012
2012
2012
2012
2012
Bentuk Sampel
yang diisolasi
Daun
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Daun
Daun
Buah
Daun
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Daun
Buah
Universitas Sumatera Utara
33
Visualisasi Hasil Amplifikasi
Sebanyak 36 stok sampel DNA tanaman kelapa sawit di amplifikasi
dengan mesin PCR menggunakan Primer Spesifik ILY-2 dan 2 primer SSR yaitu
FR-1753 dan FR-3300 kemudian dielektroforesis dengan menggunakan agarose
sebanyak 1,3% untuk primer Spesifik ILY-2 dan agarose sebanyak 3% untuk
primer SSR yang divisualisasi dengan menggunakan UV Translumilator. Untuk
bebebrapa sampel yang tidak berhasil diamplifikasi telah dilakukan pengulangan
prosedur PCR –SSR, sedangkan pada primer spesifik ILY-2 semua sampel dapat
teramplifikasi. Hasil akhir menunjukkan bahwa ada Sampel yang tidak
teramplifikasi pada primer FR-3300 sebanyak 3 sampel dan pada primer FR-1753
yang tidak teramplifikasi sebanyak 6 sampel(Tabel 3).
Tabel 3. Hasil Amplifikasi Primer ILY-2 dan SSR
Nomor Nama
Jumlah
Jumlah Aksesi
Primer
Aksesi
yang Tidak
Teramplifika Terampifikasi
si
1
ILY-2
36
0
No Aksesi
-
2
FR33
3
7D,20D,27B
3300
3
FR30
6
7D,8D,10D,8B,10B,12
1753
B
Amplifikasi 36 aksesi origin kelapa sawit primer Spesifik ILY-2 dan 2
Primer SSR menunjukkan polimorfisme yang tinggi.Hasil pengamatan jumlah
fragmen DNA dan persentase polimorfik setiap primer dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Persentase polimorfik
No.
Nama
Ukuran
.
Primer
Pita (bp)
1.
ILY-2
472-1324
2.
FR 3300
186-410
3.
FR 1753
127-177
Total
Rata-Rata
Σ
Pita
3
6
4
13
4,3
Σ Pita
Polimorfik
2
6
4
12
4
Σ Pita
Monomorfik
1
0
0
1
0,3
%
Polimorfik
67%
100%
100%
267%
89%
Universitas Sumatera Utara
34
Pada Tabel 4 dapat terlihat bahwa pola pita yang dihasilkan oleh 3 primer
yang digunakan menghasilkan pola pita yang bervariasi. Ukuran pita-pita yang
dihasilkan bervariasi antara 127 bp- 1324bp. Total pola pita dari ketiga primer
sebanyak 13 dengan rata-rata 4,3 pita per primer. Pita polimorfik yang dihasilkan
sebanyak 12 pita dan total pita monomorfik sebanyak 1 pita.
Persentase pita polimorfik berkisar antara 67% sampai 100% dengan ratarata 89% untuk semua primer. Jumlah pita tertinggi dan ukuran pasangan basa
tertinggi yaitu 4 pita dengan ukuran sebesar 1324 bp terdapat pada primer ILY-2
sedangkan jumlah pola pita terendah dan ukuran pasang basa terendah terdapat
pada primer FR 1753dengan ukuran 127 bp.
Primer ILY-2 mampu menunjukkan amplifikasi pada 36 DNA origin
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 3 dan
ukuran pita sekitar 472 bp, 752 bp dan 1324 bp. Visualisasi primer ILY-2 dapat
dilihat pada Gambar 1. Persentase pita polimorfis sebesar 67% dan persentase pita
momorfis sebesar 33%.
Primer FR 3300 mampu menunjukkan amplifikasi pada 33 DNA klon
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 6 dan
ukuran pita sekitar 186 bp,213bp, 233 bp, 248 bp, 383 bp
dan 410 bp.
Persentasepolimorfis sebesar 100%. Visualisasi primer FR 3300dapat dilihat pada
Gambar 2.
Primer FR 1753 mampu menunjukkan amplifikasi pada 30 DNA origin
kelapa sawit yang diuji. Pola pita bersifat heterozigot, jumlah pita sebanyak 4 dan
ukuran pita sekitar 127 bp, 155 bp, 166 bp dan 177 bp. Persentase pita
Universitas Sumatera Utara
35
polimorfisme sebesar 100% dan persentase pita monomorfis sebesar 0%.
Visualisasi primer FR 1753 dapat dilihat pada Gambar 3.
M
1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D13D14D20D
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M
22D 24D 26D 27D 29D 2B 3B 4B 5B 8B 10B 11B 12B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
M 13B 14B 20B 22B 24B 26B 27B 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
Gambar 1. Profil elektroforegram produk PCR Primer ILY-2 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb +(Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
Universitas Sumatera Utara
36
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
M
1D2D3D 4D 5D 3B 5B 8D 12D 10D11D D13D 20D 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M 3D 6D 7D 9D 12D 14D 22D 24D 26D 27D 29D 3B 4B 5B 8B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M10B 11B 12B 13B 14B 20B 22B 24B 26B 27B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 2. Profil elektroforegram produk PCR Primer FR-3300 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb + (Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
Universitas Sumatera Utara
37
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M
1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 12D13D14D20D
M 22D 24D 26D 27D 29D 2B 3B 4B 5B 8B 10B 11B 12B 13B 14B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
M 20B 22B 24B 26B 27B 29B
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 3. Profil elektroforegram produk PCR Primer FR-1753 pada beberapa
sampel kelapa sawit
Keterangan:
M = DNA ladder 1 kb +(Invitrogen)
D = Isolasi DNA berasal dari bagian Daun
B = Isolasi DNA berasal dari bagian Buah
Universitas Sumatera Utara
38
Analisis hubungan genetik
Gambar menunjukkan persentase keragaman genetik berdasarkan analisis
faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis). Melalui software DARwin
6.0.13 keragaman molekuler dari hasil analisis faktorial menunjukkan bahwa total
keragaman molekuler pada aksis 1 sebesar 21,37% dan aksis 2 sebesar 15,28%
dengan total 36,65%, sebaran genetik sampel-sampel terdapat pada semua bidang
yang terbentuk dari aksis 1 dan aksis 2.
.35
4B
.3
26D
24D
22D
6D
.25
3D
3B
.2
.15
5D
24B
27B
29D
.1
13B
.05
-.45
-.4
-.35
-.3
2B
-.25
-.2
-.15
-.1
-.05
.05
.1
26B
22B
20B
12D
10D
-.5
27D
14D
9D
10B
.15
.2
-.05
.25
14B
.3
.35
11D
29B
-.1
20D
1D
-.15
7D
2D
-.2
8D
8B -.25
4D
5B
11B
-.3
-.35
-.4
12B
-.45
13D
Gambar 4. Analisis faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis) Aksis 1
(Horizontal) dan Aksis 2 (Vertical) berdasarkan matrix dissimilarity
simple matching dengan menggunakan ILY 2dan FR 3300,FR 1753
Universitas Sumatera Utara
39
Hasil analisis pengelompokan dengan metode Matrix Dissimilarity
SimpleMatching untuk 36 sampel stok DNA kelapa sawit dengan marka primer
ILY-2, SSR FR-3300 dan FR-1753 menghasilkan dendogram yang menunjukkan
bahwa semua sampel dapat dibedakan dengan jelas antara satu dengan yang lain
(Gambar 4).
4D
34
12
0
0
57
0
2D
12B
45
8B
44
8D
24D
53
22D
26D
35 54
55
61
69
24
70
2B
60
48
0
14
56
81
68
0
66
5
0
50
16
49
65
67
30
53
22
63
67
0
26B
37
22B
14B
20B
29D
10B
62
17
46
51
52
64
11
6D
3D
34
5
1
10D
5D
48
8
7D
4B
58
49
2
1D
59
13
1
38
43
3B
14D
40
61
41
27D
5B
11D
11B
38
39
47
20D
13B
42
9D
24B
29B
27B
2
12D
13D
3
0.1
Gambar 5. Profil Filogenik dendogram Neigbor-Joining dari 36 sampel DNA stok
kelapa sawit berdasarkan matrix dissimilarity simple matching dengan
menggunakan Spesifik
Dari Gambar 5dapat diketahui bahwa 36 sampel DNA stok kelapa sawit
terbagi menjadi 3 kelompok utama (cluster). Kelompok pertama (15 sampel)
yangterdiri dari originLame (6 sampel),origin Kamerun(5 sampel), origin WA
Universitas Sumatera Utara
40
(2 sampel), origin Angola(1 sampel) dan origin Yangambi (1sampel). Kelompok
kedua (19 sampel) yang terdiri dari origin Lame (1 sampel), origin Kamerun (4
sampel), origin Yangambi (7sampel), origin WA (4 sampel), origin Angola (3
sampel). Kelompok ketiga (2 sampel) yang berasal dari origin Angola (2 sampel).
Hasil analisis Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dapat dilihat pada Gambar
5.
Pembahasan
Informasi keragaman genetik merupakan informasi mengenai variasi atau
perbedaan karakteristik akibat keanekaragaman genetik yang ada dalam suatu
spesies. Hal ini dapat terjadi akibat evolusi maupun reproduksi seksual. Penilaian
keragaman genetik tanaman dapat menggunakan penanda morfologi, biokimia dan
molekuler. Hal ini sesuai dengan pernyataan Zulfahmi (2013) bahwa keragaman
tingkat genetik merupakan tingkat keragaman yang paling rendah dalam
organisasi biologi. Informasi keragaman genetik tanaman pada tingkat individu,
spesies maupun populasi perlu diketahui, sebagai dasar pertimbangan dalam
menyusun
strategi
konservasi,
pemuliaan,
pengelolaan
dan
pemanfaatansumberdaya genetik tanaman secara berkelanjutan. Penilaian
keragaman genetik tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan penanda
morfologi, biokimia dan molekuler DNA.
Marka SSR (Simple Sequence Repeat) merupakan penanda molekuler
yang dapat digunakan untuk mengevaluasi struktur keragaman genetik genus
Elaeis. Kelebihan marka ini bersifat kodominan, mudah dan ekonomis dalam
pengaplikasiannya serta memiliki tingkat polimorfisme tinggi. Tingkat keragaman
molekuler berdasarkan 2 marka SSR yang diuji adalah sebesar 100%. Artinya
Universitas Sumatera Utara
41
bahwa primer SSR yang diuji dapat menunjukkan adanya perbedaan antara origin
yaitu sebesar 100%.
Pada Tabel. 4 dapat terlihat dari empat primer yang digunakan 2 primer
memiliki persentase polimorfisme sebesar 100% yaitu primer FR 3300 dan FR
1753sedangkan primer lain memiliki pita polimorfis yang 67% yaitu pada primer
ILY-2 sesuai dengan pernyataan Putri (2010) menyatakan bahwa keunggulan dari
marka DNA yaitu dapat menunjukkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah
banyak, konsistensi, dan tidak dipengaruhi lingkungan yang mampu menetapkan
variabilitas genetik populasi.
Hasil penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa primer FR-3300,
FR-1753, bersifat heterozigot.Primer heterozigot merupakan primer yang mampu
menunjukkan alel yang berbeda, alel seperti ini juga dikatakan dengan alel
kodominan.Hal ini membuktikkan bahwa SSR mampu mengidentifikasi
keberadaan alel kodominan.Hal ini sesuai dengan pernyataan Arumsari (2013)
yang menyatakan bahwa SSR bersifat kodominan, dan memiliki tingkat
polimorfisme yang tinggi.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diketahui bahwa individu nomor 4B
memiliki perbedaan alel dengan 35 sampel lainnya yang teridentifikasi oleh
primer FR-3300 dan FR1-753.Hal ini membuktikan bahwa individu nomor 4B
tersebut memiliki perbedaan genetik dengan sampel lainnya sehingga primer
FR-3300 dan primer FR-1753 dapat mendeteksi keragaman alel.Hal ini sesuai
dengan pernyataan Sayekti, et al (2015) yang menyatakan bahwa primer SSR
dapat mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi dan variatif.
Universitas Sumatera Utara
42
Hasil penelitian selanjutnya telah dapat diketahui bahwa ada pita yang
tidak teramplifikasi pada nomor sampel 7D,20D,27B. Pada primer FR-3300 dan
nomor sampel pada 7D,8D,10D,8B,10B,12 B pada primer FR-1753 . Sampel yang
tidak menunjukkan adanya amplifikasi berarti basa nukleotida tidak menempel
pada sekuen target. Hal ini sesuai dengan Ariani (2014) yang menyatakan bahwa
basa nukleotida hanya akan menempel pada sekuen target.
Pada Gambar 1 yang menunjukkan profil amplikon menggunakan primer
ILY-2 didapati pada semua sampel yang teramplifikasi oleh mesin PCR. Hal ini
menunjukkan bahwa semua sampel origin mengandung asam oleat didalamnya
baik yang di sintesis melalui daun maupun yang diisolasi melalui buah.
Pada primer ILY-2 perbedaan bagian tanaman yang diisolasi DNAnya dari
satu individu yang sama juga memperlihatkan pola pita yang berbeda. Perbedaan
ini terdapat pada bagian daun dengan buah, salah satu contoh sampel yang
menunjukkan perbedaan pola pita yang sangat nyata adalah sampel 13D, 14D,
22D, 26D,27D,29D. Pada sampel 13D membentuk satu amplikon dengan ukuran
472 bp dan pada sampel 14D, 22D, 26D,27D,29Dterbentuk dua amplikon dengan
ukuran 472 bp -752bp. Sedangkan pada sampel 13B, 14B, 22B, 26B,27B,29B
pada tiap masing-masingnya Tiga amplikon dengan ukuran472 bp -1324 bp. Ini
menunjukkan bahwa asam oleat lebih banyak terkandung pada buah dibandingkan
pada daun.
Pada primer ILY-2 Perbedaan bagian tanaman yang diisolasi DNAnya dari
satu individu yang sama juga memperlihatkan pola pita yang berbeda. Perbedaan
ini terdapat pada bagian daun dengan buah, salah satu contoh sampel yang
menunjukkan perbedaan pola pita yang sangat nyata adalah sampel 13D, 14D,
Universitas Sumatera Utara
43
22D, 26D,27D,29D. Pada sampel 13D membentuk satu amplikon dengan ukuran
472 bp dan pada sampel 14D, 22D, 26D,27D,29Dterbentuk dua amplikon dengan
ukuran
472
bp
-752bp.
Sedangkan
pada
sampel
13B,
14B,
22B,
26B,27B,29Bpada tiap masing-masingnya Tiga amplikon dengan ukuran472 bp 1324 bp. Seperti yang telah diduga pada paragraf sebelumnya, hal ini disebabkan
oleh tiap-tiap bagian tanaman membentuk biosintesis asam oleat yang berbeda.
Perbedaan tingkat kandungan metabolit sekunder yang diproduksi pada tiap
bagian tanaman diduga menjadi salah satu penyebab terjadinya perbedaan
amplikon yang dihasilkan. Sebab diketahui bahwa kandungan metabolit sekunder
pada tanaman dapat mengganggu proses amplifikasi pada saat PCR.
Pita yang ada pada ukuran 483 bp dapat teramplifikasi pada 36 sampel
menunjukkan semua individu tanaman kelapa sawit secara konsisten memiliki gen
yang menyandikan asam oleat pada ukuran pasangan basa tertentu. Dengan kata
lain, primer ILY-2 yang telah didesain oleh Putri (2016) dapat dijadikan sebagai
acuan marka molekuler genetik terhadap karakter asam oleat untuk tanaman
kelapa sawit.
Amplikon-amplikon DNA dari primer ILY-2 dan SSR diterjemahkan atau
lebih umum disebut diskoring, ke dalam bentuk data binari yaitu dengan
menuliskan angka 1 bila terdapat amplikon dan angka 0 bila tidak terdapat pita.
Data binari dari pita yang telah diskoring kemudian dianalisis dengan
menggunakan software DARwin 6.0.13 sehingga didapatkan hasil yaitu
dendogram. Dendogram adalah pohon filogenetik yang menggambarkan
pengelompokkan sampel dengan Operational Taxonomic Unit (OTU) yang
berderet rata secara vertikal pada satu sisi yang berbentuk pohon. Setiap cabang
Universitas Sumatera Utara
44
pada dendogram dilakukan analisis kepercayaan cabang dengan metode bootstrap
yang dilakukan sampai 1000 kali. Pada penelitian ini diketahui bahwa 36 sampel
DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi tiga kelompok utama yang masing-masing
memiliki sub kelompok.Kelompok pertama (15 sampel) yang terdiri dari origin
Lame (6 sampel),origin Kamerun (5 sampel), origin WA (2 sampel), origin
Angola(1 sampel) dan origin Yangambi (1 sampel). Kelompok kedua (19 sampel)
yang terdiri dari origin Lame (1 sampel), origin Kamerun (4 sampel), origin
Yangambi (7 sampel), origin WA (4 sampel), origin Angola (3 sampel).
Kelompok ketiga (2 sampel) yang berasal dari origin Angola 2 (sampel). Hasil
analisis faktorial untuk PCoA juga menunjukkan bahwa keragaman secara
molekuler menggunakan primer ILY2, Primer SSR FR-3300 dan FR-1753 adalah
sebesar 36,65%. Hal ini menunjukkan bahwa adanya variasi genetik di antara
sampel yang satu dengan sampel lainnya menyebabkan perbedaan yang dapat
dibedakan atau dikelompokkan dengan jelas. Keragaman genetik yang tinggi
membuka peluang yang besar untuk mendapatkan kultivar unggul.
Universitas Sumatera Utara
45
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1.
Hasil amplifikasi DNA dengan primer ILY-2 pada origin kelapa sawit
menunjukkan pola pita (amplikon) yang beragam sebanyak 3 amplikon
dengan persentase polimorfis 67%. Adanya Perbedaan pola pita pada
sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber
bagian tanaman yang diisolasi. Diperoleh Fragmen Pita ± 472bp- 1324bp.
Keragaman molekuler dari 36origin kelapa sawit yaitu sebesar
36,65 % dengan analisis dendogram menunjukkan terbagi menjadi 3
kelompok utama.
2. Primer polimorfis ditunjukkan oleh FR 3300 dan FR1753yang
ditunjukkan oleh FR 3300 pada 127bp, 154 bp, 166 bp dan 177 bp serta
FR 1753 pada 186 bp, 213bp,233bp,248bp,383bp dan 410 bp. Primer FR
3300 dapat menunjukkan perbedaan pola pita DNA pada sampel nomor
4B.
Saran
Sebaiknya dilakukan penambahan primer SSR dan analisis Sequencing
untuk menambah informasi molekuler yang lebi akurat.
Universitas Sumatera Utara