Analisis Keragaman Genetik Klon Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Plasma Nutfah PT. Socfindo Menggunakan Marka RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Chapter III VI
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas
Pertanian Universitas Sumatera. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Maret 2017 sampai bulan Juni 2017.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah stok DNA yang
diisolasi dari daun klon kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) koleksi Pusat
Seleksi Bangun Bandar PT. SOCFINDO, Desa Martebing, Kecamatan Dolok
Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara. Alkohol 70 %, aquadest,
agarose LE Analytical Grade, Go Tag Green Master Mix, primer oligonukleotida
OPD-13, OPD-20, OPM-01, 100 bp DNA ladder, kertas tissue, sarung tangan.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital, hot
plate, freezer, tabung eppendorf 2,0 ml dan 1.5 ml, tabung PCR 0,2 ml,
mikropipet ukuran 10μl, 200μl dan 1000μl, sarung tangan karet, tip pipet (warna
kristal, kuning dan biru), autoklaf, kamera, pengaduk magnetik, alat-alat gelas
(baker glass, erlenmeyer, dll), UV-transilluminator, alat elektroforesis horizontal,
PCR (Therma Cycler), Gel-Doc, power supply, alat tulis.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak, dan data diolah dengan software
DARwin 6.0
Universitas Sumatera Utara
13
PELAKSANAAN PENELITIAN
Pengambilan Sampel Daun
Daun yang digunakan adalah daun klon kelapa sawit BTC 60, dipilih daun
tombak yang masih muda/lembut berwarna hijau cerah, kemudian disterilisasi
menggunakan alkohol dan dilap pakai tissue. Kemudian dimasukkan ke dalam
amplop/plastik yang telah diberi label.
Isolasi dan Pemurnian DNA
Pada penelitian ini, stok DNA klon kelapa sawit BTC 60 yang digunakan
untuk analisis merupajkan koleksi DNA dari penelitian Putri et al. (2017).
Sehingga untuk penelitian ini tidak dilakukan lagi kegiatan pengambilan sampel
dan isolasi DNA.
Namun secara umum, isolasi DNA meliputi tahapan berikut, yaitu : daun
kelapa sawit ditimbang masing-masing 0,1 gr sampai dengan 0,3 gr. Dan dipotong
halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam
mortar untuk digerus dan ditambahkan nitrogen cair sampai tergenang. Daun
digerus sampai halus melawan arah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g
PVPP sebagai antioksidan, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat.
Hasil gerusan dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer
ekstraksi CTAB dan 10μl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata.
Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan.
Tabung tersebut diinkubasi ke dalam pemanas air bersuhu 65º C selama 30 menit,
setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai
dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung
Universitas Sumatera Utara
14
dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm.
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat
jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan
ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan
adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih
sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4ºC selama 30 menit. Setelah 30 menit
cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung
ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan
100μl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan
buffer TE (Orozco-Castillo, et al., 1994)
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol
100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4ºC selama
30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000
rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah
100 μl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang
diperoleh disimpan pada suhu ± - 20ºC bila tidak digunakan.
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan
cara memasukkan 5μl stok DNA ditambah 2μl loading dye dan dihomogenkan.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v).
Agarose ditimbang 0,64 g kemudian dilarutkan kedalam 80 ml buffer TAE 1x.
Universitas Sumatera Utara
15
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening
dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume
dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan
kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan dan
bersamaan dengan itu, ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian
dihomogenkan dengan magnetik stirer, lalu didinginkan dengan cara, tabung
dialirkan pada air yang mengalir.
Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC), larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat
selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis
dan diberi larutan TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x ± 670 ml (hingga terendam).
Stok DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat
stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi
loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2μl dan stok DNA 5μl kemudian dicampur
dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur
gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running
elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA
yang
telah
dielektroforesis
dilakukan
dengan
UV
transluminator
dan
didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola
pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan
mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
16
Ampflifikasi
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer yang tersedia.
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 μl stok
DNA dan ditambah 50μl ddH2O sehingga diperoleh 50 μl aliquot DNA.
Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit
setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu
dengan mengambil 10-15 μl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR
yaitu paket PCR Go Taq Green Master Mix produksi Promega dalam kotak berisi
pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel
yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas: ddH20 9,5 μl x 5 = 47,5 μl,
Go Tag Green Master Mix 12,5 μl x 5 = 6,25 μl, aliquot primer 1 μl x 5 = 5 μl.
Dari tube diambil 23 μl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR
dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin
manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran masker dimasukkan dalam blok
sampel di mesin PCR dengan annealing 36º C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR
Applied Biosystem didesain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali yang
telah digunakan pada tanaman kelapa sawit, berdasarkan yang digunakan pada
penelitian Setyo (2001). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Siklus, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA daun kelapa sawit
No
Tahapan
Suhu
Waktu
Jumlah Siklus
1 Denaturasi awal
94ºC
2 menit
1
2 Denaturasi
94 ºC
1 menit
45
3 Annealing
36 ºC
1 menit
45
4 Ekstension
72 ºC
1 menit
45
5 Ekstension akhir
72 ºC
10 menit
1
Universitas Sumatera Utara
17
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 %
(b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi
bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan ditambah larutan
etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan
cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC) larutan dimasukkan
dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming
combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras.
Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang
telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur
pada gel. Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank
elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Elektroforesis dilakukan pada kondisi 65 volt
selama 90 menit. Setelah elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary
diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah
dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel
pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka
didokumentasikan.
Universitas Sumatera Utara
18
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring
berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan
sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel
pada gel dari masing- masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya
pita, profil pita diterjemahkan kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan -0 (tidak ada).
Penentuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA
yang digunakan yaitu 1 kb DNA ladder. Dengan menggunakan software UVITEC
Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA hasil amplifikasi dapat terukur.
Ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan dari ladder yang kita gunakan.
Program ini akan mengukur pita yang muncul berdasarkan ukuran ladder dimana
data ukurannya harus diinput terlebih dahulu melihat panduan ukuran ladder yang
digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk ini dengan pendar cahaya DNA
yang terbentuk saat proses elektroforesis dengan sinar UV.
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi
pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari
keragaman : (1) Principal Coordinates Analyisis (PCoA), suatu jenis analisis
faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan
(ii) Neighbor-Joining Tree (NJtree). Perhitungan dan analisis deskriptif ini
menggunakan software DARwin 6.0
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Materi DNA yang digunakan untuk analisis keragaman molekuler berasal
dari 30 tanaman Kelapa Sawit klon BTC 60 yang telah diisolasi dan sudah
tersedia dalam bentuk stok DNA. Sebagai informasi awal, berikut data sampel
terkait identitas, dan hasil uji kuantitas stok DNA.
Tabel 1. Identitas Sampel dan Hasil Uji Kuantitas Klon BTC 60
No. Kode Sampel
Klon
Å260/280
Konsentrasi (μl/mg)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
459
458
457
456
455
454
453
444
445
446
447
448
449
450
451
452
437
436
435
434
433
432
431
430
429
425
427
426
423
420
2,03
1,16
2,53
1,60
1,34
2,40
1,66
1,36
1,33
2,01
1,98
1,12
1,48
2,50
1,48
3,15
1,37
1,57
1,05
1,98
2,03
1,26
1,80
1,58
1,62
1,37
1,67
2,23
1,62
3,32
41,5
12,8
7,9
134,1
116,4
46,9
52,2
105,5
34,4
19,2
31,2
3,1
41,1
16,0
40,4
27,0
86,4
45,7
69,7
58,7
37,1
41,7
12,4
15,2
104,7
40,6
32,5
25,6
33,3
23,7
Berdasarkan data hasil uji kuantitas DNA (Tabel 1), tampak bahwa tingkat
absorbansi stok DNA
pada Å260/280 berkisar antara 1,05-3,32. Hal ini
Universitas Sumatera Utara
20
menunjukkan bahwa sampel masih mengandung kontaminan seperti polisakarida,
fenol dan protein (Fatchiyah, 2011). DNA hasil isolasi dinyatakan memiliki
tingkat kemurnian tinggi apabila nilai Å260/280 berada pada kisaran 1,80-2,00
seperti sampel nomor 11 dan 23. Tingkat kemurnian dapat menjadi salah satu
faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA.
Visualisasi Hasil Amplifikasi
No.
1.
2.
3.
Tabel 2. Hasil amplifikasi 3 primer RAPD
Nama
Urutan
Jumlah Aksesi Tidak
Primer
Basa (5’-3’)
Teramplifikasi
OPD-13 ACGCGCATGT
1
OPD-20 ACCCGGTCAC
OPM-01 GTTGGTGGCT
-
No. Aksesi
23
-
Amplifikasi terhadap 30 stok DNA tanaman kelapa sawit klon BTC 60
yang diuji dengan 3 primer RAPD yaitu OPD-13, OPD-20 dan OPM-01,
kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1,3%. Untuk beberapa sampel
yang tidak berhasil teramplifikasi telah dilakukan pengulangan prosedur PCRRAPD, dengan hasil akhir menunjukkan bahwa ada 1 sampel yang tidak
teramplikasi saat menggunakan primer OPD-13 yaitu sampel nomor 23/431
(Tabel 2).
Tabel 3. Persentase polimorfisme
Nama
Ukuran
Σ Pita
No.
Σ Pita
Primer
Pita (bp)
Polimorfis
7
3
1.
OPD-13 831-2268
635-971
2
1
2.
OPD-20
4
1
3.
OPM-01 405-1254
Rataan
4,33
1,67
Σ Pita
Monomorfis
4
1
3
2,67
% Polimorfis
42,86%
50%
25%
39.29%
Berdasarkan Tabel 3 pola pita yang muncul dari sampel yang berhasil
teramplikasi menunjukkan tingkat polimorfisme di bawah 50% dari total pola pita
sebanyak 13. Masing-masing mulai dari yang tertinggi ke yang paling rendah
adalah OPD-13 sebanyak 7 pola pita dengan persentase polimorfisme 42,86%,
Universitas Sumatera Utara
21
OPM-01 menghasilkan 4 pola pita dengan persentase polimorfisme 25% dan
primer OPD-20 dengan 2 pola pita serta tingkat polimorfisme 50%. Ukuran
panjang pasangan basa yang yang dihasilkan juga cukup bervariasi dengan
rentang antara 405 bp hingga 2586 bp.
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 1. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-13; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen), nx = sampel ke-n primer OPD-13
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
Gambar 2. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-13; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen), nx = sampel ke-n primer OPD-13
Pola pita paling banyak muncul saat materi DNA diuji dengan
menggunakan primer OPD-13 (Gambar 1 dan Gambar 2), 3 dari 7 pola pita yang
dihasilkan teridentikasi sebagai pita polimorfis dengan kisaran 831 bp-2268 bp.
Untuk beberapa pola pita ada yang hanya muncul disebagian kecil sampel saja,
Universitas Sumatera Utara
22
yaitu pola pita pada 634 bp hanya muncul pada sampel nomor 20 dan 22, pola pita
pada 557 bp muncul pada 3 sampel yanitu sampel nomor 2, 16, 22 dan 28.
Sementara untuk pola pita 461 bp yang merupakan pita terpendek pada OPD-13
muncul pada sampel nomor 16, 22 dan 28.
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 3. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-20; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen)
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 4. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-20; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen)
Untuk primer OPD-20 (Gambar 3 dan Gambar 4), jumlah pola pita yang
dihasilkan sangat rendah, yaitu 2 pola pita yang masing-masing 1 pita monomorfis
pada 971 bp dan 1 pita polimorfis pada 635 bp. Untuk sampel nomor 23
Universitas Sumatera Utara
23
(Gambar 4), tampak bahwa pita yang dihasilkan hanya 1 dan terlihat tipis bila
dibandingkan dengan sampel yang lainnya. Hal ini bisa mengarah ke beberapa
faktor penyebab seperti rendahnya konsentrasi DNA dan juga proses amplifikasi
yang tidak berjalan dengan sempurna.
Primer terakhir yang digunakan untuk menguji keragaman genetik pada
tanaman kelapa sawit klon BTC 60 ini adalah primer OPM-01 (Gambar 5).
Amplifikasi dengan primer ini mengasilkan 4 pola pita dengan persentase
monomorfisme 75% dan polimorfisme 25%. Pita polimorfis terdapat pada 1254
bp, dimana pada 10 sampel terdeteksi keberadaan pita sementara untuk 20 sampel
lainnya tidak.
4000
3000
2500
2000
1500
1000
750
500
250.253
Gambar 5. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPM-01; Keterangan : M = marker ladder 1kb
(Promega), nm = sampel ke-n primer OPM-01
Analisis Hubungan Genetik
Berdasarkan
analisis
PCoA
(Principal
Coordinates
Analysis)
menggunakan software DARwin 6.0, tampak bahwa keragaman molekuler pada
aksis 1 yaitu 36,11% dan aksis 2 sebesar 29,78%. Sehingga total keragaman pada
aksis 1 dan 2 adalah sebesar 65,89%.
Universitas Sumatera Utara
24
Dengan menggunakan data matrix dissimilarity simple matching,
dilakukan analisis untuk mendapatkan profil hubungan kekerabatan dan sebaran
30 klon tanaman kelapa sawit yang diuji. Data tersebut ditampilkan dalam bentuk
pohon filogenetik (Gambar 8) dan Radial Neighbour-Joining Tree (Gambar 7).
Dari kedua profil tersebut diketahui bahwa ada 3 kelompok utama yang terbentuk,
dimana masing-masing kelompok terdiri atas 9 klon pada kelompok I, kelompok
II 10 klon dan kelompok III meliputi 11 klon yang diuji.
Factorial analysis: (Axes 1 / 2)
22
.16
.14
.12
16
.1
23
.08
.06
28
20
.04
.02
2
-.14
-.12
-.1
-.08
-.06
-.04
-.02
30
7
1
9
15
19
21
26
.02
.06
.08
.1
.12
.14
6
8
12
11
25
27
30
-.02
14
18
17
24
29
13
5
.04
-.04
-.06
-.08
1
4
-.1
Gambar 6. Analisis Faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis) aksis 1
(horinzontal) dan aksis 2 (vertical) berdasarkan matrix dissimilarity
simple matching dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Berdasarkan data PCoA yang menunjukkan jarak genetik antar klon,
didapatkan bahwa nilai dissimilarity tertinggi adalah 0,24 antara klon 22/432
Universitas Sumatera Utara
25
dengan klon 1/459 dan klon 22/432 dengan klon 4/456 (Lampiran 4). Untuk nilai
terendah adalah 0 yang terdapat pada sebagian besar nilai dissimilarity antar klon
yang diuji. Angka 0 ini menujukkan bahwa berdasarkan marka yang digunakan
klon tersebut memiliki nilai keidentikan 100%.
Pada hasil analisis ini juga baik pada PCoA maupun profil kluster yang
dihasilkan, terdapat klon-klon yang bila diamati saling bertumpuk pada satu titik,
yang menunjukkan bahwa klon-klon yang berada pada titik tersebut memiliki
tingkat keidentikan yang sangat tinggi. Hal ini terjadi karena apabila materi yang
digunakan berasal dari klon yang pada kondisi normal dan tanpa gangguan akan
identik secara genetik satu dengan yang lainnya.
295
18
17
III
24
13
22
16
14
51
31
1
4
37
28
2
34
19
12
69
44
49
20
30
27
11
24
20
21
II
9
25
15
7
8
I
19
26
10
3
623
Gambar 7. Profil Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dari 30 klon kelapa
sawit BTC 60 berdasarkan matrix dissimilarity simple matching
dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Universitas Sumatera Utara
26
10
3
26
19
7
15
I
9
24
21
20
20
23
6
8
25
11
27
II
30
44
12
4
1
49
69
29
5
18
17
24
13
31
14
19
22
16
51
37
III
28
34
2
Gambar 8. Diagram filogenetik 30 klon kelapa sawit BTC-60 berdasarkan matrix
dissimilarity simple matching dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Pembahasan
Jarak genetik 30 klon kelapa sawit BTC-60 dengan menggunakan 3 primer
RAPD yaitu primer OPD-13, OPD-20 dan OPM-01 sebagai marka molekuler
berkisar antara 0,00-0,24 berdasarkan hasil perhitungan matrix dissimilarity
simple matching. Jarak terjauh terdapat pada klon 22/432 dengan klon 1/459 dan
klon 22/432 dengan klon 4/456 yang menunjukkan nilai 0,24. Jarak genetik materi
yang diuji tergolong cukup rendah yang menunjukkan bahwa secara umum antar
materi DNA yang digunakan memiliki hubungan yang cukup dekat satu dengan
yang lainnya. Keragaman molekuler klon BTC-60 menggunakan 3 primer RAPD
dapat dilihat dari hasil PCoA yang menunjukkan nilai 36,11% aksis I dan 29,78%
pada aksis 2, dengan total keragaman secara keseluruhan sebesar 65,89%. Sampel
terdistribusi pada ke-empat kuadran.
Universitas Sumatera Utara
27
Dari ketiga primer yang digunakan, terdapat perbedaan yang cukup jelas
berkaitan dengan jumlah pita yang dihasilkan dan nilai persentase polimorfisme
unruk masing-masing uprimer yang digunakan. Jumlah pita terbanyak terdapat
pada primer OPD-13 yaitu sebanyak 7 pita, dan terendah pada OPD-20 yang
menghasilkan 2 pita. Perbedaan jumlah pita yang dihasilkan ini berkaitan erat
dengan proses kerja primer dalam mengenali keberadaan situs penempelan pada
DNA template. Menurut Poerba dan Yuzammi (2008) semakin banyak situs
penempelan dari primer yang digunakan pada DNA cetakan, maka semakin
banyak jumlah pita DNA yang dihasilkan.
Ketiga primer RAPD yang digunakan menunjukkan rataan persentase
polimorfisme sebesar 39.29%, dimana masing-masing 42,86% untuk OPD-13,
50% untuk OPD-20 dan 25% untuk OPM-01. Nilai polimorfisme yang rendah ini
dapat memberikan informasi bahwa 30 klon kelapa sawit BTC-60 yang diuji
memiliki tingkat keragaman genetik yang rendah. Putri et al. (2011) menyatakan
bahwa tingkat polimorfisme yang didapatkan dari analisis marka molekuler
merupakan informasi yang sangat penting bagi pemulia tanaman untuk menjadi
acuan untuk melihat kekayaan diversitas gen. Tingkat polimorfisme yang tinggi
diduga terjadi apabila merupakan hasil dari persilangan tetua yang yang sangat
jauh berbeda dan masih sedikit mengalami penekanan seleksi. Dengan kata lain
nilai polimorfisme yang rendah menunjukkan hubungan kekerabatan yang
semakin dekat, mengingat bahwa materi DNA yang digunakan merupakan ‘klon’
dan sudah dibudidayakan (mengalami tekanan seleksi).
Pada ketiga kluster yang dihasilkan melalui analisis Radial Neighbour
Joining Tree (NJtree) (Gambar 7) tampak bahwa pada masing-masing kluster
Universitas Sumatera Utara
28
terdapat klon yang memiliki nilai keidentikan 100%, yang terlihat dari
penumpukkan sampel di satu titik pada profil NJtree. Pada kluster I terdapat 8
klon yang identik yaitu 21, 9, 15, 7, 19, 26, 10, dan 3. Sedangkan untuk kluster II
ada 8 klon yang meliputi klon 12, 30, 27, 11, 25, 8, 6 dan 23. Dan terakhir untuk
kluster 3 ada 7 klon yaitu kode sampel 5, 13, 14, 17, 18, 24 dan 29. Informasi ini
bisa digunakan untuk menduga dan menyeleksi sampel-sampel yang mengalami
perubahan genetik. Hanya saja karena tidak ada informasi tentang materi genetik
tetua yang digunakan sebagai sumber klon maka pada tahap ini yang bisa
dilakukan untuk tujuan seleksi hanya mengidentifikasi klon-klon yang tidak
masuk ke dalam 3 kelompok tersebut. Klon tersebut terdiri atas klon dengan kode
sampel 1, 2, 4, 16, 20, 22 dan 28. Menurut Mathius et al. (2001) dan Hetharie
(2010), dengan menggunakan primer RAPD yang berbeda dapat dilakukan
identifikasi antara genotip normal dan genotip abnormal. Prinsip dasarnya adalah
kesamaan genetik antar klon normal lebih tinggi dibandingkan dengan kesamaan
genetik genotip abnormal. Berdasarkan pernyataan tersebut maka untuk sementara
7 klon di atas untuk sementara sudah cukup memenuhi syarat untuk dimasukkan
ke dalam kelompok genotip abnormal.
Proses amplifikasi tidak selalu berhasil, untuk ketiga primer RAPD yang
digunakan telah dilakukan proses amplifikasi ulang untuk beberapa sampel. Untuk
klon dengan kode sampel 23 tetap tidak berhasil teramplifikasi setelah diulang
beberapa kali menggunakan primer OPD-13. Berdasarkan hasil uji kuantitas
(Tabel 1), klon nomor 23 memiliki absorbansi 1,80 dan konsentrasi 12,4 μl/mg
yang termasuk dalam kategori layak untuk digunakan. Meskipun faktor
konsentrasi DNA yang rendah cukup mempengaruhi tingkat keberhasilan
Universitas Sumatera Utara
29
amplikasi, namun untuk kedua primer lainnya yaitu OPD-20 dan OPM-01, pita
sampel DNA nomor 23 muncul setelah diulang beberapa kali. Hal ini
mengindikasikan bahwa ada faktor lain yang menjadi penyebabnya, seperti tidak
adanya sekuens DNA yang cocok sebagai situs penempelan primer pada DNA
template.
Mengingat bahwa sampel yang digunakan merupakan klon kelapa sawit,
maka seharusnya dalam keadaan normal nilai variasi genetik dan polimorfisme
adalah 0%. Namun, ternyata setelah diuji maka didapatkan nilai keragaman
molekuler 65,89% dan
rataan polimorfisme 39,29%. Hal ini menunjukkan
beberapa hal yang mungkin terjadi seperti variasi somaklonal pada tanaman yang
diuji. Variasi somaklonal ini bisa disebabkan oleh genotip bahan tanam (Soh et
al., 2011; Eeuwens et al., 2002), konsentrasi dan jenis zat pengatur tumbuh
(Duval et al., 1988; Sogeke, 1998), lama periode kultur (Corley et al., 1986;
Rohani et al., 2003), fase kultur kalus (Jaligot et al., 2000) dan media yang
digunakan (Evans et al., 2003; Morcillo et al., 2006).
Universitas Sumatera Utara
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Hasil amplifikasi DNA tanaman kelapa sawit klon BTC-60 dengan
menggunakan 3 primer RAPD (OPD-13, OPD-20 dan OPM-01) menghasilkan 13
pita, 5 pita (39,29) di antaranya bersifat polimorfis dan ukuran fragmen berkisar
antara 405 bp hingga 2268 bp. Keragaman molekuler dari 30 klon tersebut sebesar
65,89% yang terbagi atas 3 kluster, dengan jarak ketidaksamaan berkisar antara
0,0 - 0,24.
Saran
Perlu dilakukan pengujian dengan primer lain mengingat bahwa 3 primer
RAPD yang digunakan menunjukkan tingkat polimorfisme yang rendah. Selain
itu untuk pengujian keragaman genetik pada klon ada baiknya ditambahkan 1
sampel tetua (sumber klon) sebagai pembanding, sehingga bisa diidentifikasi
secara lebih jelas ada atau tidaknya perubahan genetik pada anakan.
Universitas Sumatera Utara
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas
Pertanian Universitas Sumatera. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Maret 2017 sampai bulan Juni 2017.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah stok DNA yang
diisolasi dari daun klon kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.) koleksi Pusat
Seleksi Bangun Bandar PT. SOCFINDO, Desa Martebing, Kecamatan Dolok
Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara. Alkohol 70 %, aquadest,
agarose LE Analytical Grade, Go Tag Green Master Mix, primer oligonukleotida
OPD-13, OPD-20, OPM-01, 100 bp DNA ladder, kertas tissue, sarung tangan.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital, hot
plate, freezer, tabung eppendorf 2,0 ml dan 1.5 ml, tabung PCR 0,2 ml,
mikropipet ukuran 10μl, 200μl dan 1000μl, sarung tangan karet, tip pipet (warna
kristal, kuning dan biru), autoklaf, kamera, pengaduk magnetik, alat-alat gelas
(baker glass, erlenmeyer, dll), UV-transilluminator, alat elektroforesis horizontal,
PCR (Therma Cycler), Gel-Doc, power supply, alat tulis.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan adalah Metode RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang mengamplifikasi sekuen DNA secara acak, dan data diolah dengan software
DARwin 6.0
Universitas Sumatera Utara
13
PELAKSANAAN PENELITIAN
Pengambilan Sampel Daun
Daun yang digunakan adalah daun klon kelapa sawit BTC 60, dipilih daun
tombak yang masih muda/lembut berwarna hijau cerah, kemudian disterilisasi
menggunakan alkohol dan dilap pakai tissue. Kemudian dimasukkan ke dalam
amplop/plastik yang telah diberi label.
Isolasi dan Pemurnian DNA
Pada penelitian ini, stok DNA klon kelapa sawit BTC 60 yang digunakan
untuk analisis merupajkan koleksi DNA dari penelitian Putri et al. (2017).
Sehingga untuk penelitian ini tidak dilakukan lagi kegiatan pengambilan sampel
dan isolasi DNA.
Namun secara umum, isolasi DNA meliputi tahapan berikut, yaitu : daun
kelapa sawit ditimbang masing-masing 0,1 gr sampai dengan 0,3 gr. Dan dipotong
halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam
mortar untuk digerus dan ditambahkan nitrogen cair sampai tergenang. Daun
digerus sampai halus melawan arah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g
PVPP sebagai antioksidan, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat.
Hasil gerusan dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer
ekstraksi CTAB dan 10μl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata.
Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan.
Tabung tersebut diinkubasi ke dalam pemanas air bersuhu 65º C selama 30 menit,
setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai
dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung
Universitas Sumatera Utara
14
dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm.
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat
jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan
ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan
adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih
sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4ºC selama 30 menit. Setelah 30 menit
cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung
ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan
100μl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan
buffer TE (Orozco-Castillo, et al., 1994)
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol
100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4ºC selama
30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000
rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah
100 μl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang
diperoleh disimpan pada suhu ± - 20ºC bila tidak digunakan.
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan
cara memasukkan 5μl stok DNA ditambah 2μl loading dye dan dihomogenkan.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v).
Agarose ditimbang 0,64 g kemudian dilarutkan kedalam 80 ml buffer TAE 1x.
Universitas Sumatera Utara
15
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening
dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume
dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan
kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan dan
bersamaan dengan itu, ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian
dihomogenkan dengan magnetik stirer, lalu didinginkan dengan cara, tabung
dialirkan pada air yang mengalir.
Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC), larutan dimasukkan dalam
cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat
selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam elektroforesis
dan diberi larutan TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x ± 670 ml (hingga terendam).
Stok DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat
stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi
loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2μl dan stok DNA 5μl kemudian dicampur
dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur
gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running
elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA
yang
telah
dielektroforesis
dilakukan
dengan
UV
transluminator
dan
didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola
pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan
mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
16
Ampflifikasi
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer yang tersedia.
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 μl stok
DNA dan ditambah 50μl ddH2O sehingga diperoleh 50 μl aliquot DNA.
Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit
setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu
dengan mengambil 10-15 μl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR
yaitu paket PCR Go Taq Green Master Mix produksi Promega dalam kotak berisi
pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel
yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas: ddH20 9,5 μl x 5 = 47,5 μl,
Go Tag Green Master Mix 12,5 μl x 5 = 6,25 μl, aliquot primer 1 μl x 5 = 5 μl.
Dari tube diambil 23 μl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR
dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin
manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran masker dimasukkan dalam blok
sampel di mesin PCR dengan annealing 36º C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR
Applied Biosystem didesain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali yang
telah digunakan pada tanaman kelapa sawit, berdasarkan yang digunakan pada
penelitian Setyo (2001). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Siklus, suhu dan waktu dalam amplifikasi DNA daun kelapa sawit
No
Tahapan
Suhu
Waktu
Jumlah Siklus
1 Denaturasi awal
94ºC
2 menit
1
2 Denaturasi
94 ºC
1 menit
45
3 Annealing
36 ºC
1 menit
45
4 Ekstension
72 ºC
1 menit
45
5 Ekstension akhir
72 ºC
10 menit
1
Universitas Sumatera Utara
17
Elektroforesis
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 %
(b/v). Agarose ditimbang 0,525 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 35
ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian
dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi
bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan ditambah larutan
etidium bromide 0,5 %. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan
cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC) larutan dimasukkan
dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming
combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras.
Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank
elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml
(hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang
telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur
pada gel. Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank
elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses
elektroforesis siap dijalankan. Elektroforesis dilakukan pada kondisi 65 volt
selama 90 menit. Setelah elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary
diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah
dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel
pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka
didokumentasikan.
Universitas Sumatera Utara
18
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Untuk menentukan keragaman genetik, produk PCR – RAPD diskoring
berdasarkan muncul tidaknya pita DNA. Pita yang muncul pada gel diasumsikan
sebagai alel RAPD. Keragaman alel RAPD ditentukan dari perbedaan migrasi alel
pada gel dari masing- masing individu sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya
pita, profil pita diterjemahkan kedalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan -0 (tidak ada).
Penentuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan
dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA
yang digunakan yaitu 1 kb DNA ladder. Dengan menggunakan software UVITEC
Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA hasil amplifikasi dapat terukur.
Ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan dari ladder yang kita gunakan.
Program ini akan mengukur pita yang muncul berdasarkan ukuran ladder dimana
data ukurannya harus diinput terlebih dahulu melihat panduan ukuran ladder yang
digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk ini dengan pendar cahaya DNA
yang terbentuk saat proses elektroforesis dengan sinar UV.
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi
pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari
keragaman : (1) Principal Coordinates Analyisis (PCoA), suatu jenis analisis
faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan
(ii) Neighbor-Joining Tree (NJtree). Perhitungan dan analisis deskriptif ini
menggunakan software DARwin 6.0
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Materi DNA yang digunakan untuk analisis keragaman molekuler berasal
dari 30 tanaman Kelapa Sawit klon BTC 60 yang telah diisolasi dan sudah
tersedia dalam bentuk stok DNA. Sebagai informasi awal, berikut data sampel
terkait identitas, dan hasil uji kuantitas stok DNA.
Tabel 1. Identitas Sampel dan Hasil Uji Kuantitas Klon BTC 60
No. Kode Sampel
Klon
Å260/280
Konsentrasi (μl/mg)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
459
458
457
456
455
454
453
444
445
446
447
448
449
450
451
452
437
436
435
434
433
432
431
430
429
425
427
426
423
420
2,03
1,16
2,53
1,60
1,34
2,40
1,66
1,36
1,33
2,01
1,98
1,12
1,48
2,50
1,48
3,15
1,37
1,57
1,05
1,98
2,03
1,26
1,80
1,58
1,62
1,37
1,67
2,23
1,62
3,32
41,5
12,8
7,9
134,1
116,4
46,9
52,2
105,5
34,4
19,2
31,2
3,1
41,1
16,0
40,4
27,0
86,4
45,7
69,7
58,7
37,1
41,7
12,4
15,2
104,7
40,6
32,5
25,6
33,3
23,7
Berdasarkan data hasil uji kuantitas DNA (Tabel 1), tampak bahwa tingkat
absorbansi stok DNA
pada Å260/280 berkisar antara 1,05-3,32. Hal ini
Universitas Sumatera Utara
20
menunjukkan bahwa sampel masih mengandung kontaminan seperti polisakarida,
fenol dan protein (Fatchiyah, 2011). DNA hasil isolasi dinyatakan memiliki
tingkat kemurnian tinggi apabila nilai Å260/280 berada pada kisaran 1,80-2,00
seperti sampel nomor 11 dan 23. Tingkat kemurnian dapat menjadi salah satu
faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA.
Visualisasi Hasil Amplifikasi
No.
1.
2.
3.
Tabel 2. Hasil amplifikasi 3 primer RAPD
Nama
Urutan
Jumlah Aksesi Tidak
Primer
Basa (5’-3’)
Teramplifikasi
OPD-13 ACGCGCATGT
1
OPD-20 ACCCGGTCAC
OPM-01 GTTGGTGGCT
-
No. Aksesi
23
-
Amplifikasi terhadap 30 stok DNA tanaman kelapa sawit klon BTC 60
yang diuji dengan 3 primer RAPD yaitu OPD-13, OPD-20 dan OPM-01,
kemudian dielektroforesis menggunakan agarose 1,3%. Untuk beberapa sampel
yang tidak berhasil teramplifikasi telah dilakukan pengulangan prosedur PCRRAPD, dengan hasil akhir menunjukkan bahwa ada 1 sampel yang tidak
teramplikasi saat menggunakan primer OPD-13 yaitu sampel nomor 23/431
(Tabel 2).
Tabel 3. Persentase polimorfisme
Nama
Ukuran
Σ Pita
No.
Σ Pita
Primer
Pita (bp)
Polimorfis
7
3
1.
OPD-13 831-2268
635-971
2
1
2.
OPD-20
4
1
3.
OPM-01 405-1254
Rataan
4,33
1,67
Σ Pita
Monomorfis
4
1
3
2,67
% Polimorfis
42,86%
50%
25%
39.29%
Berdasarkan Tabel 3 pola pita yang muncul dari sampel yang berhasil
teramplikasi menunjukkan tingkat polimorfisme di bawah 50% dari total pola pita
sebanyak 13. Masing-masing mulai dari yang tertinggi ke yang paling rendah
adalah OPD-13 sebanyak 7 pola pita dengan persentase polimorfisme 42,86%,
Universitas Sumatera Utara
21
OPM-01 menghasilkan 4 pola pita dengan persentase polimorfisme 25% dan
primer OPD-20 dengan 2 pola pita serta tingkat polimorfisme 50%. Ukuran
panjang pasangan basa yang yang dihasilkan juga cukup bervariasi dengan
rentang antara 405 bp hingga 2586 bp.
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 1. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-13; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen), nx = sampel ke-n primer OPD-13
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
Gambar 2. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-13; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen), nx = sampel ke-n primer OPD-13
Pola pita paling banyak muncul saat materi DNA diuji dengan
menggunakan primer OPD-13 (Gambar 1 dan Gambar 2), 3 dari 7 pola pita yang
dihasilkan teridentikasi sebagai pita polimorfis dengan kisaran 831 bp-2268 bp.
Untuk beberapa pola pita ada yang hanya muncul disebagian kecil sampel saja,
Universitas Sumatera Utara
22
yaitu pola pita pada 634 bp hanya muncul pada sampel nomor 20 dan 22, pola pita
pada 557 bp muncul pada 3 sampel yanitu sampel nomor 2, 16, 22 dan 28.
Sementara untuk pola pita 461 bp yang merupakan pita terpendek pada OPD-13
muncul pada sampel nomor 16, 22 dan 28.
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 3. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-20; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen)
5000
2000
1650
1000
850
650
500
400
300
200
100
Gambar 4. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPD-20; Keterangan : M = marker ladder 1kb+
(Invitrogen)
Untuk primer OPD-20 (Gambar 3 dan Gambar 4), jumlah pola pita yang
dihasilkan sangat rendah, yaitu 2 pola pita yang masing-masing 1 pita monomorfis
pada 971 bp dan 1 pita polimorfis pada 635 bp. Untuk sampel nomor 23
Universitas Sumatera Utara
23
(Gambar 4), tampak bahwa pita yang dihasilkan hanya 1 dan terlihat tipis bila
dibandingkan dengan sampel yang lainnya. Hal ini bisa mengarah ke beberapa
faktor penyebab seperti rendahnya konsentrasi DNA dan juga proses amplifikasi
yang tidak berjalan dengan sempurna.
Primer terakhir yang digunakan untuk menguji keragaman genetik pada
tanaman kelapa sawit klon BTC 60 ini adalah primer OPM-01 (Gambar 5).
Amplifikasi dengan primer ini mengasilkan 4 pola pita dengan persentase
monomorfisme 75% dan polimorfisme 25%. Pita polimorfis terdapat pada 1254
bp, dimana pada 10 sampel terdeteksi keberadaan pita sementara untuk 20 sampel
lainnya tidak.
4000
3000
2500
2000
1500
1000
750
500
250.253
Gambar 5. Elektroforesis hasil amplifikasi sampel DNA kelapa sawit klon BTC
60 dengan Primer OPM-01; Keterangan : M = marker ladder 1kb
(Promega), nm = sampel ke-n primer OPM-01
Analisis Hubungan Genetik
Berdasarkan
analisis
PCoA
(Principal
Coordinates
Analysis)
menggunakan software DARwin 6.0, tampak bahwa keragaman molekuler pada
aksis 1 yaitu 36,11% dan aksis 2 sebesar 29,78%. Sehingga total keragaman pada
aksis 1 dan 2 adalah sebesar 65,89%.
Universitas Sumatera Utara
24
Dengan menggunakan data matrix dissimilarity simple matching,
dilakukan analisis untuk mendapatkan profil hubungan kekerabatan dan sebaran
30 klon tanaman kelapa sawit yang diuji. Data tersebut ditampilkan dalam bentuk
pohon filogenetik (Gambar 8) dan Radial Neighbour-Joining Tree (Gambar 7).
Dari kedua profil tersebut diketahui bahwa ada 3 kelompok utama yang terbentuk,
dimana masing-masing kelompok terdiri atas 9 klon pada kelompok I, kelompok
II 10 klon dan kelompok III meliputi 11 klon yang diuji.
Factorial analysis: (Axes 1 / 2)
22
.16
.14
.12
16
.1
23
.08
.06
28
20
.04
.02
2
-.14
-.12
-.1
-.08
-.06
-.04
-.02
30
7
1
9
15
19
21
26
.02
.06
.08
.1
.12
.14
6
8
12
11
25
27
30
-.02
14
18
17
24
29
13
5
.04
-.04
-.06
-.08
1
4
-.1
Gambar 6. Analisis Faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis) aksis 1
(horinzontal) dan aksis 2 (vertical) berdasarkan matrix dissimilarity
simple matching dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Berdasarkan data PCoA yang menunjukkan jarak genetik antar klon,
didapatkan bahwa nilai dissimilarity tertinggi adalah 0,24 antara klon 22/432
Universitas Sumatera Utara
25
dengan klon 1/459 dan klon 22/432 dengan klon 4/456 (Lampiran 4). Untuk nilai
terendah adalah 0 yang terdapat pada sebagian besar nilai dissimilarity antar klon
yang diuji. Angka 0 ini menujukkan bahwa berdasarkan marka yang digunakan
klon tersebut memiliki nilai keidentikan 100%.
Pada hasil analisis ini juga baik pada PCoA maupun profil kluster yang
dihasilkan, terdapat klon-klon yang bila diamati saling bertumpuk pada satu titik,
yang menunjukkan bahwa klon-klon yang berada pada titik tersebut memiliki
tingkat keidentikan yang sangat tinggi. Hal ini terjadi karena apabila materi yang
digunakan berasal dari klon yang pada kondisi normal dan tanpa gangguan akan
identik secara genetik satu dengan yang lainnya.
295
18
17
III
24
13
22
16
14
51
31
1
4
37
28
2
34
19
12
69
44
49
20
30
27
11
24
20
21
II
9
25
15
7
8
I
19
26
10
3
623
Gambar 7. Profil Radial Neighbour-Joining Tree (NJtree) dari 30 klon kelapa
sawit BTC 60 berdasarkan matrix dissimilarity simple matching
dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Universitas Sumatera Utara
26
10
3
26
19
7
15
I
9
24
21
20
20
23
6
8
25
11
27
II
30
44
12
4
1
49
69
29
5
18
17
24
13
31
14
19
22
16
51
37
III
28
34
2
Gambar 8. Diagram filogenetik 30 klon kelapa sawit BTC-60 berdasarkan matrix
dissimilarity simple matching dengan menggunakan 3 marka RAPD.
Pembahasan
Jarak genetik 30 klon kelapa sawit BTC-60 dengan menggunakan 3 primer
RAPD yaitu primer OPD-13, OPD-20 dan OPM-01 sebagai marka molekuler
berkisar antara 0,00-0,24 berdasarkan hasil perhitungan matrix dissimilarity
simple matching. Jarak terjauh terdapat pada klon 22/432 dengan klon 1/459 dan
klon 22/432 dengan klon 4/456 yang menunjukkan nilai 0,24. Jarak genetik materi
yang diuji tergolong cukup rendah yang menunjukkan bahwa secara umum antar
materi DNA yang digunakan memiliki hubungan yang cukup dekat satu dengan
yang lainnya. Keragaman molekuler klon BTC-60 menggunakan 3 primer RAPD
dapat dilihat dari hasil PCoA yang menunjukkan nilai 36,11% aksis I dan 29,78%
pada aksis 2, dengan total keragaman secara keseluruhan sebesar 65,89%. Sampel
terdistribusi pada ke-empat kuadran.
Universitas Sumatera Utara
27
Dari ketiga primer yang digunakan, terdapat perbedaan yang cukup jelas
berkaitan dengan jumlah pita yang dihasilkan dan nilai persentase polimorfisme
unruk masing-masing uprimer yang digunakan. Jumlah pita terbanyak terdapat
pada primer OPD-13 yaitu sebanyak 7 pita, dan terendah pada OPD-20 yang
menghasilkan 2 pita. Perbedaan jumlah pita yang dihasilkan ini berkaitan erat
dengan proses kerja primer dalam mengenali keberadaan situs penempelan pada
DNA template. Menurut Poerba dan Yuzammi (2008) semakin banyak situs
penempelan dari primer yang digunakan pada DNA cetakan, maka semakin
banyak jumlah pita DNA yang dihasilkan.
Ketiga primer RAPD yang digunakan menunjukkan rataan persentase
polimorfisme sebesar 39.29%, dimana masing-masing 42,86% untuk OPD-13,
50% untuk OPD-20 dan 25% untuk OPM-01. Nilai polimorfisme yang rendah ini
dapat memberikan informasi bahwa 30 klon kelapa sawit BTC-60 yang diuji
memiliki tingkat keragaman genetik yang rendah. Putri et al. (2011) menyatakan
bahwa tingkat polimorfisme yang didapatkan dari analisis marka molekuler
merupakan informasi yang sangat penting bagi pemulia tanaman untuk menjadi
acuan untuk melihat kekayaan diversitas gen. Tingkat polimorfisme yang tinggi
diduga terjadi apabila merupakan hasil dari persilangan tetua yang yang sangat
jauh berbeda dan masih sedikit mengalami penekanan seleksi. Dengan kata lain
nilai polimorfisme yang rendah menunjukkan hubungan kekerabatan yang
semakin dekat, mengingat bahwa materi DNA yang digunakan merupakan ‘klon’
dan sudah dibudidayakan (mengalami tekanan seleksi).
Pada ketiga kluster yang dihasilkan melalui analisis Radial Neighbour
Joining Tree (NJtree) (Gambar 7) tampak bahwa pada masing-masing kluster
Universitas Sumatera Utara
28
terdapat klon yang memiliki nilai keidentikan 100%, yang terlihat dari
penumpukkan sampel di satu titik pada profil NJtree. Pada kluster I terdapat 8
klon yang identik yaitu 21, 9, 15, 7, 19, 26, 10, dan 3. Sedangkan untuk kluster II
ada 8 klon yang meliputi klon 12, 30, 27, 11, 25, 8, 6 dan 23. Dan terakhir untuk
kluster 3 ada 7 klon yaitu kode sampel 5, 13, 14, 17, 18, 24 dan 29. Informasi ini
bisa digunakan untuk menduga dan menyeleksi sampel-sampel yang mengalami
perubahan genetik. Hanya saja karena tidak ada informasi tentang materi genetik
tetua yang digunakan sebagai sumber klon maka pada tahap ini yang bisa
dilakukan untuk tujuan seleksi hanya mengidentifikasi klon-klon yang tidak
masuk ke dalam 3 kelompok tersebut. Klon tersebut terdiri atas klon dengan kode
sampel 1, 2, 4, 16, 20, 22 dan 28. Menurut Mathius et al. (2001) dan Hetharie
(2010), dengan menggunakan primer RAPD yang berbeda dapat dilakukan
identifikasi antara genotip normal dan genotip abnormal. Prinsip dasarnya adalah
kesamaan genetik antar klon normal lebih tinggi dibandingkan dengan kesamaan
genetik genotip abnormal. Berdasarkan pernyataan tersebut maka untuk sementara
7 klon di atas untuk sementara sudah cukup memenuhi syarat untuk dimasukkan
ke dalam kelompok genotip abnormal.
Proses amplifikasi tidak selalu berhasil, untuk ketiga primer RAPD yang
digunakan telah dilakukan proses amplifikasi ulang untuk beberapa sampel. Untuk
klon dengan kode sampel 23 tetap tidak berhasil teramplifikasi setelah diulang
beberapa kali menggunakan primer OPD-13. Berdasarkan hasil uji kuantitas
(Tabel 1), klon nomor 23 memiliki absorbansi 1,80 dan konsentrasi 12,4 μl/mg
yang termasuk dalam kategori layak untuk digunakan. Meskipun faktor
konsentrasi DNA yang rendah cukup mempengaruhi tingkat keberhasilan
Universitas Sumatera Utara
29
amplikasi, namun untuk kedua primer lainnya yaitu OPD-20 dan OPM-01, pita
sampel DNA nomor 23 muncul setelah diulang beberapa kali. Hal ini
mengindikasikan bahwa ada faktor lain yang menjadi penyebabnya, seperti tidak
adanya sekuens DNA yang cocok sebagai situs penempelan primer pada DNA
template.
Mengingat bahwa sampel yang digunakan merupakan klon kelapa sawit,
maka seharusnya dalam keadaan normal nilai variasi genetik dan polimorfisme
adalah 0%. Namun, ternyata setelah diuji maka didapatkan nilai keragaman
molekuler 65,89% dan
rataan polimorfisme 39,29%. Hal ini menunjukkan
beberapa hal yang mungkin terjadi seperti variasi somaklonal pada tanaman yang
diuji. Variasi somaklonal ini bisa disebabkan oleh genotip bahan tanam (Soh et
al., 2011; Eeuwens et al., 2002), konsentrasi dan jenis zat pengatur tumbuh
(Duval et al., 1988; Sogeke, 1998), lama periode kultur (Corley et al., 1986;
Rohani et al., 2003), fase kultur kalus (Jaligot et al., 2000) dan media yang
digunakan (Evans et al., 2003; Morcillo et al., 2006).
Universitas Sumatera Utara
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Hasil amplifikasi DNA tanaman kelapa sawit klon BTC-60 dengan
menggunakan 3 primer RAPD (OPD-13, OPD-20 dan OPM-01) menghasilkan 13
pita, 5 pita (39,29) di antaranya bersifat polimorfis dan ukuran fragmen berkisar
antara 405 bp hingga 2268 bp. Keragaman molekuler dari 30 klon tersebut sebesar
65,89% yang terbagi atas 3 kluster, dengan jarak ketidaksamaan berkisar antara
0,0 - 0,24.
Saran
Perlu dilakukan pengujian dengan primer lain mengingat bahwa 3 primer
RAPD yang digunakan menunjukkan tingkat polimorfisme yang rendah. Selain
itu untuk pengujian keragaman genetik pada klon ada baiknya ditambahkan 1
sampel tetua (sumber klon) sebagai pembanding, sehingga bisa diidentifikasi
secara lebih jelas ada atau tidaknya perubahan genetik pada anakan.
Universitas Sumatera Utara