Gambaran Ekspresi Reseptor Estrogen Beta (ER-β) pada Angiofibroma Nasofaring Juvenile di RSUP H. Adam Malik Medan Chapter III VI

BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan rancangan studi
potong lintang (cross sectional) untuk melihat gambaran ekspresi reseptor
estrogen β (ER# β) pada ANJ.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Divisi Onkologi – Bedah Kepala Leher
Departemen T.H.T.K.L FK USU / RSUP H. Adam Malik Medan. Sediaan
jaringan tumor ANJ pascaoperasi berupa blok parafin diambil dari Bagian
Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan dan pemeriksaan
imunohistokimia dikerjakan oleh Departemen Patologi Anatomi FK USU
Medan. Penelitian dilakukan mulai Juni 2016 sampai April 2017.

3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah seluruh penderita angiofibroma
nasofaring juvenile di Divisi Onkologi – Bedah Kepala Leher T.H.T.K.L FK
USU/RSUP H. Adam Malik Medan mulai Oktober 2010 – Juni 2016

dengan

hasil

pemeriksaan

histopatologi

jaringan

pascaoperasi

menunjukkan angiofibroma nasofaring, yaitu sebanyak 22 penderita.

3.3.2 Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah seluruh populasi.
a. Kriteria inklusi
Penderita dengan data rekam medik yang lengkap di RSUP H.
Adam Malik Medan, dengan identitas jelas dan tercatat hasil
pemeriksaan histopatologi pascaoperasi yaitu angiofibroma.

27

Universitas Sumatera Utara

Mempunyai blok parafin yang tersimpan di Bagian Patologi Anatomi
RSUP H. Adam Malik Medan.

b. Kriteria eksklusi
# Blok parafin rusak selama proses pewarnaan imunohistokimia

c.

Kriteria drop out
# Sediaan blok parafin setelah dilakukan pewarnaan imunohistokimia
ternyata tidak terbaca.
Berdasarkan kriteria di atas yang memenuhi kriteria untuk menjadi

sampel adalah 19 orang.

3.4 Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti yaitu : jenis kelamin, umur, intensitas pewarnaan,
jumlah sel yang mengandung ER# β dan ekspresi ER# β.

3.5 Definisi Operasional
a.

Angiofibroma Nasofaring Juvenile (ANJ)
Defenisi

: Tumor

fibrovaskular

nasofaring

yang

secara

histopatologi adalah jinak akan tetapi memiliki
kemampuan mendestruksi jaringan sekitarnya.
Alat ukur

: Sediaan jaringan tumor pascaoperasi

Cara ukur

: Hasil pemeriksaan histopatologi yang tercantum di
rekam medik

Hasil ukur

: 1 = Angiofibroma
0 = Bukan angiofibroma

b.

Jenis kelamin
Defenisi

:

Ciri biologis yang membedakan orang satu dengan
yang lain.

Alat ukur

: Jenis kelamin pasien ANJ

Universitas Sumatera Utara

c.

Cara ukur

: Rekam medik pasien

Hasil ukur

: Laki#laki atau perempuan

Umur
Defenisi

: Rentang waktu sejak penderita dilahirkan sampai
ulang tahun terakhir.

d.

Alat ukur

: Usia pasien ANJ

Cara ukur

: Rekam medik pasien

Hasil ukur

: Sakala numerik dalam satuan tahun

Ekspresi Reseptor Estrogen β
Defenisi

: Protein intraselular yang berada pada bagian inti sel.
Di bawah mikroskop tampak sebagai presipitasi
berwarna coklat pada stroma dan sel endotel
pembuluh darah.

Alat ukur

: Pemeriksaan imunohistokimia

Cara ukur

: Menilai tingkat imunoreaktivitas mouse monoklonal

antibody terhadap ER#β menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 100x pada 1000 sel yang

tersebar pada 10 lapangan pandang yang berbeda,
Ekspresi ER#β Untuk skor akhir digunakan skor
imunoreaktif. Skor imunoreaktif diperoleh dengan
mengalikan
mengandung

skor

luas

ER#β)

(jumlah
dengan

inti

sel

skor

yang

intensitas

pewarnaan.
(Tan & Putti 2005)
Hasil ukur

:
Ekspresi ER#β Negatif

:0–3

Ekspresi ER#β Positif / Overekspresi : 4 – 9

Universitas Sumatera Utara

a. Intensitas pewarnaan ER#β :
0 : Tidak ada reaktifitas

1 +: Lemah

2+ : Sedang

3+ : Kuat

Universitas Sumatera Utara

b. Jumlah sel tumor yang positif mengandung ER#β
(skor luas) :
0 : Tidak ada sel tumor yang positif mengandung
ER#β
1+ : Pewarnaan positif < 25% jumlah sel
2+ : Pewarnaan positif 25#50% jumlah sel
3+ : Pewarnaan positif > 50% jumlah sel

3.6 Alat dan Bahan Penelitian
3.6.1 Alat penelitian
#

Status penelitian

#

Sistem visualisasi immunohistokimia (Envision kit), mesin
pemotong jaringan (mikrotome), silanized slide, mikroskop
cahaya (Olympus CX21).

3.6.2 Bahan penelitian
#

Blok parafin angioibroma nasofaring yang tersimpan di
Bagian Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik Medan.

#

Untuk

pemeriksaan

immunohistokimia

Xylol,

alkohol

absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, H2O2
0,5% dalam methanol, Phosphat Buffer Saline (PBS),
antibodi ER#β (Mouse monoclonal estrogen receptor beta
antibody),

Envision,

Chromogen

Diamino

Benzidine

(CDB), Lathium Carbonat jenuh, Tris EBTA, Hematoxylin,
aqua destilata.

Universitas Sumatera Utara

3.7 Kerangka Kerja
Kerangka kerja penelitian dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

Data pasien ANJ berdasarkan rekam
medik di Divisi Onkologi – Bedah
Kepala Leher T.H.T.K.L FK USU /
RSUP H. Adam Malik Medan
Periode Oktober 2010 – Juni 2016

Rekam Medik
Lengkap

Data di bagian PA
RSUP HAM sesuai
dengan
blok parafin

Blok parafin
Ada / baik

Blok Parafin
Rusak

Pemeriksaan ER#β
dengan metode
imunohistokimia

Eksklusi

Jenis Kelamin
Umur
Intensitas
Jumlah sel (skor luas)
Ekspresi

Setelah pewarnaan
tidak terbaca dengan
mikroskop

Drop Out

Gambar 3.7. Kerangka kerja

Universitas Sumatera Utara

3.7.1 Alur penelitian
Penelitian dimulai dengan mengidentifikasi pasien#pasien yang telah
didiagnosis

angiofibroma

nasofaring

dan

telah

dilakukan

operasi

berdasarkan rekam medik di Divisi Onkologi – Bedah Kepala Leher
T.H.T.K.L FK USU/RSUP H. Adam Malik Medan dari Oktober 2010 – Juni
2016. Pasien dengan rekam medik lengkap, datanya disesuaikan dengan
blok parafin yang tersimpan di Bagian Patologi Anatomi RSUP H. Adam
Malik Medan. Kemudian blok parafin yang ada dan kondisinya masih baik
dilakukan pemeriksaan ER#β dengan menggunakan imunohistokimia.

3.7.2 Pewarnaan imunohistokimia sediaan blok parafin
1. Deparafinisasi slide (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3)

@ 5 menit

2. Rehidrasi (Alkoholabsolute, Alkohol 96%,

@ 4 menit

Alkohol 80%, Alkohol 70%)
3. Cuci dengan air mengalir

5 menit

4. Masukkan slide ke dalam PT Santa Cruz

± 1 jam

o

Epitope Retrieval : set up Preheat 65 C,
Running time 98 oC selama 15 menit
5. Pap Pen. Segera masukkan dalam Tris

5 menit

Buffered Saline (TBS) pH 7,4
6. Blocking dengan peroxidase block

5#10 menit

7. Cuci dengan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4

5 menit

8. Blocking dengan Normal Horse Serum (NHS) 3%
9. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4

15 menit
5 menit
1 jam

10. Inkubasi dengan Antibodi Mouse Antibodi

Monoklonal ER β dengan pengenceran 1: 100 Xl
11. Cuci dengan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4

5 menit

/Twen 20
12. Dako Real Envision Rabbit/ Mouse
13. Cuci dengan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4

30 menit
5#10 menit

/Twen 20

Universitas Sumatera Utara

14. DAB + Substrat Chromogen solution dengan

5 menit

Pengenceran 20XL DAB : 1000XL substrat
(tahan 5 hari di suhu 2#8 oC setelah dicampur)
15. Cuci dengan air mengalir

10 menit

16. Counterstain dengan Hematoxylin

3 menit

17. Cuci dengan air mengalir

5 menit

18. Lithium carbonat (5% dalam aqua)

2 menit

19. Cuci dengan air mengalir

5 menit

20. Dehidrasi (Alkohol 80%, Alkohol 96%, Alkohol

@ 5 menit

Absolute)
21. Clearing (Xylol1, Xylol2, Xylol3)

@ 5 menit

22. Mounting + cover glass

3.7.3 Penilaian ekspresi ER#β
1. Pewarnaan imunohistokimia pada masing#masing preparat gelas
objek dinilai berdasarkan persentase sel tumor yang positif
mengandung ER#β dan intensitas pewarnaan. Perhitungan
dilakukan pada 1000 sel yang tersebar pada 10 lapangan
pandang dilakukan oleh peneliti dan ahli Patologi Anatomi.
2. Sistem penderajatan (grading) yang dipakai adalah berdasarkan:
a. Intensitas pewarnaan ER#β :
0 = negatif; 1+ = lemah; 2+ = sedang; 3+ = kuat
b. Jumlah sel tumor yang mengandung ER#β (skor luas) :
0 = negatif; 1+ = 50%

3.8 Cara Pengumpulan Data
Data yang dikumpulkan adalah data penderita ANJ yang memenuhi
kriteria penerimaan sampel yaitu data rekam medik secara retrospektif di
Divisi Onkologi – Bedah Kepala Leher T.H.T.K.L FK USU/RSUP H. Adam
Malik Medan Oktober 2010 – Juni 2016 dan data primer yang diperoleh

Universitas Sumatera Utara

dari pemeriksaan langsung ekspresi ER#β ANJ dengan pemeriksaan
immunohistokimia.

3.9 Analisa Data
1.

Data skala kategorik nominal dan ordinal akan disajikan sebagai
sebaran frekuensi (n, %) yaitu dalam jumlah dan persentase.

2.

Data skala numerik akan dilakukan uji normalitas data dengan uji
(Shapiro#Wilk). Data dikatakan berdistribusi normal jika p>0,05
(disajikan dalam nilai mean dan standar deviasi) dan jika p50% (skor 3+). Sedangkan antara 25#50% (skor 2+)
ada 3 penderita (15,8%). Hanya 1 penderita dengan ekspresi sel yang
mengandung ER#β 50% (skor luas
3+). Tiga kasus termasuk ke dalam kelompok dengan jumlah sel antara
25#50% (skor luas 2+) dan 1 kasus termasuk kelompok 50% (3+), sedangkan 2 kasus lainnya dengan
jumlah sel antara 25#50% (2+) dan sisanya 1 kasus mempunyai jumlah sel
50% (3+) sedang 2 kasus lainnya masing masing termasuk
dalam kelompok dengan jumlah sel antara 25#50% (2+) dan < 25% (1+)
(Anggreani et al. 2011). Kedua penelitian di atas menunjukkan terdapat
sebaran ER#β pada jaringan tumor seluruh kasus dengan variasi
intensitas pewarnaan dan jumlah sel yang positif mengandung ER#β.
Deyrup et al (2004) dalam penelitiannya yang menilai ekspresi ER#β
pada 53 kasus tumor pembuluh darah baik jinak dan ganas. Hasil
penelitian tersebut menunjukkan ekspresi ER#β dijumpai pada sebagian
besar kasus (93%) dan termasuk ke dalam kelompok 2+ sampai 3+
(Deyrup, Tretiakova, Khramtsov & Montag 2004). Penelitian Deyrup et al.
berikutnya

tentang

ekspresi

ER#β

pada

40

kasus

fibromatosis

ekstraabdomen, ekspresi ER#β dijumpai pada seluruh kasus. Sebanyak
33 kasus (83%) menunjukkan ekspresi ER#β >50% (3+), pada 5 kasus
(12%) menunjukkan ekspresi ER#β 11#50% (2+) dan 2 kasus (5%)
menunjukkan ekspresi ER#β 50% (skor luas 3+).
5. Sebaran reseptor estrogen β dijumpai pada seluruh penderita
angiofibroma nasofaring juvenile. Namun sebanyak 89,5% dari
seluruh penderita mengalami ekspresi positif atau overekspresi.
Hasil ini menawarkan perspektif prediksi prognosis penggunaan
hormonal sebagai terapi alternatif.

6.2 Saran
Dengan mengetahui keberadaan ER#β pada jaringan tumor ANJ, maka
dapat dilakukan penelitian lebih lanjut, yaitu :
1.

Penggunaan terapi hormonal sebagai terapi sebelum operasi, kasus
rekurensi atau kasus yang tidak dapat di operasi.
50

Universitas Sumatera Utara

2.

Penelitian yang menilai hubungan skor imunoreaktif ER#β terhadap
berbagai

petanda

angiogenesis,

proliferasi

maupun

prediksi

prognosis pemerian terapi hormonal pada ANJ.

Universitas Sumatera Utara