UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Nur’aniyah NIM : 048114040

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh :

  Nur’aniyah NIM : 048114040

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

HALAMAN PERSEMBAHAN

  Sesungguhnya sesudah kesulit an it u ada kemudahan (Surat Al I nsyirah : 5) Anggaplah set iap st ep dalam hidup ini adalah proses unt uk mencapai suat u kebahagiaan

  Barang siapa berbuat kebaikan seberat benda yang t erkecilpun, maka ia akan melihat nya dan barang siapa berbuat keburukan seberat benda yang t erkecilpun, maka ia akan melihat nya (Surat Al Z alzalah : 7 & 8)

  Dan sesungguhnya akhir it u adalah lebih baik bagimu daripada permulaan (surat Ad Duha : 4) Kupersembahkan karya ini untuk : Tuhanku Allah SWT ( 4JJI )

  M ama, M imi, Teteh Romi, Teteh Tika tercinta atas kasih sayang, do’ a dan dukungannya Orang-orang yang menyayangiku Teman-teman dan Almamaterku

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Nur’aniyah Nomor Mahasiswa : 048114040

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Uni- versitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &

Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada).

  Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Yogyakarta, 19 Juli 2008 Yang menyatakan (Nur’aniyah)

  

PRAKATA

  Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul ”Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan.

  Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.

  4. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya.

  5. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S. J., M. Sc., yang telah memberikan bimbingan dalam pengolahan data statistik dan memberikan banyak masukan dan saran.

  6. Mbak Yuli dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik.

  7. Mama, mimi, teteh romi & mas wendy, teteh tika & mas arief, atas kasih sayang,

  8. Mas Ardiansyah yang senantiasa memberi dorongan motivasi, do’a, serta berbagi suka dan duka.

  9. Rissa, Tika, Nophie, Rinta, Rina, Made ayu, Wida, Anna, Atin, Amanda, dan Novi buat persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian semua.

  10. Ririt, Sisca, Meri, Eva, atas canda tawa, keluh kesah, kebersamaan dan kerjasamanya selama penelitian.

  11. Teman-teman kosku : Fitri, Nancy, Agnes, Nita, Presty, dan teman-teman kelas FKK 2004 buat kebersamaan yang indah selama ini.

  12. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

  Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, diharapkan kritik dan saran yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis bahwa skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa untuk berkarya lebih baik bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan kemajuan dunia farmasi di Indonesia.

  Penulis

  

INTISARI

  Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel SiHa.

  Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel dan harga LC yang

  50 kemudian diolah dengan analisis probit dan anova satu arah.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC yang diperoleh dari ekstrak etanolik

  50

  daun sirih merah adalah 200,6 µg/ml. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antikanker. Kata kunci: daun sirih merah, kanker, sel SiHa, sitotoksisitas, LC

  50

  

ABSTRACT

  Cancer is one of the most frightened disease because it causes death in all of the world. A lot of studies have been done to gain a new anticancer compound, one of them is the leaves of celebes pepper (Piper crocatum Ruiz & Pav). The objective of the research is to find out whether the ethanolic extract of celebes pepper leaves have cytotoxic against SiHa cells.

  This research is pure experimental with complete random and one way design. The cytotoxic test was obtained by applying a series concretation of ethanolic extract of celebes pepper leaves to SiHa cells. The cytotoxicity effect was determined using direct counting. The data were collected by counting the percentage of death cells and the LC

  50 value were analyzed using probit statistic analysis and one way Anova.

  The result indicated that the ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to SiHa cells. The LC

  50 value obtained from the ethanolic extract of

  celebes pepper leaves is 200,6 µg/ml. Therefore, the ethanolic extract of celebes pepper leaves might contains of compound that has anticancer activity. Keyword: celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, citotoxicity, LC 50 value.

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii

  HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ iii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iv

  HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... v PRAKATA..................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ viii

  INTISARI....................................................................................................... ix

  ABSTRACT

  ..................................................................................................... x DAFTAR ISI.................................................................................................. xi DAFTAR TABEL.......................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi

  DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii

  BAB I PENGANTAR ................................................................................... 1 A. Latar Belakang ...................................................................................... 1

  1. Permasalahan ............................................................................... 3

  2. Keaslian penelitian....................................................................... 4

  3. Manfaat penelitian........................................................................ 4

  B. Tujuan ................................................................................................... 4

  1. Tujuan umum…… ....................................................................... 4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................... 5 A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ............................... 5

  3. Maserasi ....................................................................................... 10

  G. Hipotesis ................................................................................................... 17

  F. Landasan Teori......................................................................................... 17

  2. Metode direct counting ................................................................ 16

  1. Metode MTT................................................................................ 15

  E. Uji Sitotoksisitas ...................................................................................... 14

  D. Sel SiHa………........................................................................................ 13

  C. Kanker……………. ................................................................................. 11

  2. Cairan pelarut ............................................................................... 10

  1. Keterangan botani ........................................................................ 5

  1. Definisi ekstrak ............................................................................ 9

  B. Metode Penyarian..................................................................................... 9

  7. Penelitian mengenai tanaman sirih merah ................................... 8

  6. Khasiat dan penggunaan .............................................................. 7

  5. Kandungan kimia ......................................................................... 6

  4. Deskripsi ...................................................................................... 5

  3. Nama daerah ................................................................................ 5

  2. Sinonim ........................................................................................ 5

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 18

  B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.......................................... 18

  2. Pengumpulan daun sirih merah.................................................... 21

  E. Analisis Hasil............................................................................................ 25

  8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah .................... 24

  7. Pembuatan larutan uji................................................................... 24

  6. Preparasi sel SiHa ........................................................................ 23

  5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ................. 22

  4. Sterilisasi alat dan bahan.............................................................. 22

  3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ............................. 21

  1. Determinasi tanaman.................................................................... 20

  1. Variabel bebas.............................................................................. 18

  D. Tata Cara Penelitian................................................................................. 20

  2. Bahan ........................................................................................... 20

  1. Alat ............................................................................................. 19

  C. Alat dan Bahan......................................................................................... 19

  4. Definisi operasional ..................................................................... 19

  3. Variabel pengacau terkendali....................................................... 18

  2. Variabel tergantung...................................................................... 18

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 27 A. Determinasi Tanaman.............................................................................. 27 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah.............................................................. 27

  D. Sterilisasi Alat dan Bahan........................................................................ 29

  E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa................. 30

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 42 A. Kesimpulan .............................................................................................. 42 B. Saran......................................................................................................... 42 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43 LAMPIRAN ................................................................................................... 47 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 68

  

DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Nilai absorbansi ekstrak etanolik daun sirih merah dengan metode MTT.........................................................

  33 Tabel II. Potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.................................................... 35 Tabel III. Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (Direct Counting) pada

  ............................................................... 48

  Haemocytometer

  Tabel IV. Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari masing- masing sumuran.................................................... 48 Tabel V. Persentase kematian sel SiHa.............................................. 49 Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% .....................................................

  59

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Reaksi pembentukan kristal formazan........................................ 31 Gambar 2. Foto kristal formazan di bawah mikroskop................................. 31 Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persen kematian sel SiHa penetapan I.......................... 35 Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan I ........................................................ 37 Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan II ....................................................... 37 Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan III.................................................... 38 Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran pada jam ke-24.............................................................................. 40 Gambar 8. Foto tanaman sirih merah............................................................. 47 Gambar 9. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit pada sel SiHa....................................................... 62 Gambar 10. Foto alat dan bahan...................................................................... 66

  DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)...... 47 Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

  (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa....... 48 Lampiran 3. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel SiHa dan Analisis Hasil dengan One Way

  Anova.................................................................................... 50 Lampiran 4. Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct

  )............................................................................... 51

  counting

  Lampiran 5. Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa………...…. 54 Lampiran 6. Cara perhitungan harga LC …………………………...…. 56

  50 Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi LC 50 ekstrak etanolik

  daun sirih merah terhadap sel SiHa pada taraf kepercayaan 95%………………………...…....... 59 Lampiran 8. Grafik hubunga n antara log kadar dengan angka probit……...........................................………………….…. 51 Lampiran 9. Harga probit sesuai dengan persentasenya......………….… 63 Lampiran 10. Foto alat dan bahan yang digunakan.....……………….… 64 Lampiran 11. Identifikasi tanaman………………………...…................

  67

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit

  disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit yang disebabkan karena adanya sel abnormal. Hingga kini penyebab pertumbuhan sel tubuh yang abnormal tersebut belum dapat diketahui secara pasti.

  Penderita kanker semakin meningkat setiap tahunnya. Di negara yang telah maju yang telah berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab utama kematian pada wanita antara 30-54 tahun dan anak-anak antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2007a).

  Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Jumlah penderita kanker cervix adalah 90 hingga 100 per 100.000 penduduk, atau sekitar 230.137 orang yang 63% diantaranya sudah berada di stadium 3-4 dan 50% diantaranya meninggal (Angel, 2008).

  Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat jumlah pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

  Karena itu sangat diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas selektif menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal. Untuk mencari pengobatan kanker yang selektivitas aksinya ini, maka dilakukan berbagai penelitian yang terus dikembangkan sampai ke tingkat molekuler. Pada tingkat molekuler kelainan atau kerusakan sel yang mengubah sel normal menjadi sel kanker yang ganas terlihat jelas (Sofyan, 2000).

  Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi hasil sintesis yang terkandung dalam obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan secara turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun telah disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998). Merebaknya kecenderunga n atau tren hidup kembali ke alam (back to nature) semakin menambah keingintahuan masyarakat tentang khasiat tanaman obat.

  Salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman sirih merah. Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan

  Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel kanker untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunya i aktivitas terhadap sel kanker. Jenis sel kanker yang berbeda dapat mempunyai sensitivitas dan selektivitas yang berbeda pula terhadap obat-obat antikanker, oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap berbagai sel kanker. Pada penelitian ini dilakukan uji efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

  Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa ini penting untuk mendapatkan informasi ilmiah tambahan tentang efek sitotoksik ekstrak daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa yang bisa mendukung pencarian obat antikanker dari bahan alam dan dapat digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker.

1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa? b. seberapa besar harga LC

  50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

  sel SiHa?

  2. Keaslian penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

  3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi ilmiah dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, kegunaan, dan efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

  b. Manfaaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pembuktian secara ilmiah penggunaan ekstrak etanolik daun sirih merah sebagai obat antikanker dari bahan alam.

B. Tujuan Penelitian

  1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik.

  2. Tujuan khusus Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga LC

  50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah 1. Keterangan botani Famili : Piperaceae Genus : Piper Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav.

  (Anonim, 2007b) 2.

   Sinonim N. E. Br.

  Piper ornatum 3.

   Nama daerah

  Sirih merah

4. Deskripsi

  Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar.

  Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu secara terus- menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005).

5. Kandungan Kimia

  Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). Flavonoid

  Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol yang umumnya ada dalam bentuk terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon. Yang terdapat pada tanaman biasanya merupakan bentuk kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C

  6 – C 3 – C 6 yang artinya

  kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C

  6 (cincin benzen tersubsitusi) disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon.

  Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai gugus OH dan gula, maka umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, dan air. Aktivitas flavonoid dalam sistem biologis sangat berarti antara lain sebagai antioksidan, antivirus, antihistamin, peluruh kemih, antihipertensi, dan bakterisida.

  Beberapa senyawa flavonoid juga dapat menghambat monoamin oksidase (MAO), protein kinase, DNA polimerase, dan hipoksigenase (Robinson, 1995). Flavonoid telah menunjukkan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator. Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk

  Alkaloid Istilah alkaloid pada umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik (Robinson, 1995).

6. Khasiat dan penggunaan

  Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker (Sudewo, 2005).

  Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit.

  Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).

7. Penelitian tanaman sirih merah

  Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

  Beberapa dari flavonoid terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker (Grotewold, 2006). Diet tinggi flavonoid, buah-buahan, dan sayuran melawan berbagai macam penyakit, terutama penyakit kadiovaskular dan beberapa tipe dari kanker (Ness and powles, 1997). Salah satu studi menunjukkan bahwa flavonoid menghambat karsiogenesis in vitro dan diindikasikan juga substansi

  (Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Genistein dan daidzein dapat

  in vivo

  menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia (Grotewold, 2006). Penghambatan proliferasi sel kanker payudara pada manusia dan keterlambatan dari tumorigenesis oleh flavonoid juga ditemukan (So et al., 1996).

  Flavonoid, diantaranya resveratrol dan quercetin pada kadar 100 µM mampu menghambat aspek-aspek angiogenesis (proliferasi, migrasi sel endotelial dan pembentukan pipa pembuluh darah) (Igura et al., 2001). Silymarin, suatu flavonoid antioksidan, sedang dikembangkan sebagai agen inhibitor terhadap enzim COX-2 (Tosetti et al., 2002). Beberapa penelitian mengenai flavonoid merekomendasikan kemungkinan aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan diantaranya melalui penghambatan angiogenesis.

  Fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera linn) diketahui dapat menghambat siklus pembelahan sel pada stadium metafase (Adyana, 2006). Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis. Alkaloid dari tanaman juga mempunyai kemampuan mengikat tubulin yaitu suatu protein yang menyusun mikrotubulus dengan menghambat atau memblokade polimerasi protein ke dalam mikrotubulus (Chabner et al., 2001).

  Golongan alkaloid tanaman dapat menyebabkan gangguan pada membran sel sehingga berakibat komponen penyusun membran akan berubah dan proses fisiologi membran akan terganggu dengan terjadi kerusakkan dan pengkerutan pada membran tersebut (Gill et al., 2001; Jujena et al., 2001).

B. Metode Penyarian

  Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan- lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986).

  1. Definisi ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

  2. Cairan pelarut Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik

  (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Anonim, 2000). Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).

  3. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain (Anonim, 1986).

C. Kanker

  Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (Anonim, 2007c). Kanker adalah suatu penyakit di mana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat, dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan sel-sel baru (Dalimartha, 2006).

  Dikenal beberapa jenis kanker, seperti karsinoma, sarkoma, limfoma (neoplasma sistem limfatik) atau leukemia (neoplasma ganas sel darah putih).

  Karsinoma merupakan tumor ganas yang berasal dari sel epitel, misalnya kanker payudara, kanker kulit, dan kanker lambung. Sarkoma merupakan tumor ganas yang berasal dari jaringan mesodermal, misalnya fibrosarkoma (tumor ganas jaringan ikat), limfosarkoma (tumor ganas sistem limfatik), dan osteosarkoma (tumor ganas pada tulang) (Dalimartha, 2006). Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak (benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997).

  Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan disekitarnya dan masuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas

  Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen dapat menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald and Ford, 1997). Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel-sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa menyebar ke seluruh tubuh. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali dengan kerusakan gen pada regulator siklus sel. Pertumbuhan kanker merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis di mana dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan membentuk satu koloni kecil dalam jaringan yang sama dan mengakibatkan terjadinya perubahan genetik (Sherr, 1996).

  Karsinogenesis merupakan proses terjadinya kanker yang berlangsung lama. Karsinogenesis dapat terjadi akibat salah satu atau kombinasi faktor karsinogen kimiawi, alami, radiasi, biologis dan genetik. Perubahan akibat rangsangan faktor karsinogen tersebut melibatkan perubahan gen dari sel neoplasia atau sel yang mengalami transformasi (Soeripto, 1998). Kanker terjadi karena pemaparan berulang- ulang oleh satu atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983). Sel kanker memiliki karakteristik sebagai berikut :

  a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri. Sinyal pertumbuhan diperlukan agar sel dapat terus membelah. Berbeda dari sel normal, sel kanker dapat tetap dan terus tumbuh.

  b. Tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan. Sel kanker tidak merespon adanya sinyal yang dapat menghentikan terjadinya pertumbuhan dan pembelahan sel, dengan demikian, sel kanker dapat terus membelah.

  c. Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis. Apoptosis merupakan program bunuh diri sel ketika sel tersebut mengalami kerusakan, baik struktural maupun fungsional, yang tidak dapat ditolerir lagi. Namun sel kanker dapat menghindar dari kematian dengan mengeblok jalur terjadinya apoptosis di dala m sel.

  d. Sel kanker memiliki potensi tak terbatas untuk mengadakan replikasi.

  e. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis untuk mencukupi kebutuhannya akan oksigen dan nutrisi. Akan terbentuk cabang baru pada pembuluh darah yang menuju sel kanker yang kemudian akan mensuplai kebutuhan nutrisi dan oksigen dari sel kanker.

  f. Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar.

  (Hanahan dan Weinberg, 2000) D.

   Sel SiHa

  Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip denga n sel epitelial dan sel ini me ngandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2007d).

  Kanker serviks berkembang secara bertahap, tetapi progresif. Proses terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi lalu berkembang menjadi sel displastik sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia (Dalimartha, 2006). Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa karsinoma yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai karsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor- faktor penyebab kanker cervix

  adenosquamosa

  antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi metastasis yang jauh (King, 2000).

E. Uji Sitotoksisitas

  Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986). Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000).

  Uji sitotoksisitas merupakan uji toksisitas secara in vitro pada suatu kultur yakni metode in vitro lebih ekonomis, lebih mudah dan ditinjau dari segi kemanusiaan atau moralitas percobaan, metode in vitro lebih manusiawi daripada in

  

vivo . Namun kerugian in vitro adalah kadang-kadang tidak memberikan efek senyawa

uji yang sama dengan bila diberikan secara in vivo (Freshney, 1986).

1. Metode MTT

  Uji sitotoksik dilakukan dengan metode mikrotitrasi yang merupakan metode uji yang efisien, dalam satu plate terdapat 96 sumuran sehingga lebih banyak

  2

  data yang didapatkan. Tiap sumuran memiliki luas 28 – 32 mm dengan kapasitas medium sebanyak 0,1 atau 0,2 ml. Dengan metode uji ini semua populasi sel terpapar sampel uji (Freshney, 2000).

  Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil- tiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel (Barille, 1997). Kemampuan sel untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel . Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate reader (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).

2. Metode Direct Counting

  Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien adalah denga n menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat dilakukan. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan. Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan replikasi yang tetap.

  Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode yang paling sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000).

  Jika suatu uji sitotoksisitas menghasilkan harga LC kurang dari 1000

  50

  µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan bersifat toksik dan bila lebih besar dari 1000 µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan tidak toksik terhadap senyawa uji (Meyer et al, 1982). Menurut NCI (National Cancer Institute) yang menyatakan suatu senyawa berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC

  50 = 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991).

  F.

  

Landasan Teori

  Penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri.

  Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia. Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis.

  Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas.

  G.

  

Hipotesis

  Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental

  crocatum murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

  1. Variabel

  a. Variabel bebas Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml.

  b. Variabel tergantung Persentase kematian sel SiHa.

  c. Variabel pengacau terkendali

  1. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

  2. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

  3. Kematian alami sel dapat dikendalikan dengan kontrol dan pemberian nutrisi.

  2. Definisi Operasional

  a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

  b. Ekstrak etanolik adalah ekstrak etanolik daun sirih merah dan dinyatakan dalam µg/ml.

  c. Sel SiHa adalah salah satu sel kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV- 16).

  d. LC ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu

  50

  membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas, autoklaf, alumunium foil, Waterbath, Oven, Blender, Ayakan, inkubator CO

  2

  (Memmer), timbangan analitik (Mettler Toledo), tissue, glove, masker, yellow tips,

  

blue tips , effendorf, tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), swing rotor

sentrifuge , mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell

  (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop

  counter (Olympus IMT-2), haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :

  a. Bahan utama : daun sirih merah segar

  b. Bahan untuk ekstraksi : etanol 70 %

  c. Uji sitotoksisitas :

  1. Kultur sel SiHa yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  2. Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Sigma), Natrium bikarbonat, dan hepes.

  3. Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Sigma), FBS (Fetal Bovine Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco).

  4. Pewarna Trypan blue (Sigma)

  5. DMSO (Dimetil Sulfoksidase)

  6. Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck)

  7. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma)

  8. Tripsin 0,5 %

  9. Aquabidest D.

  

Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman